FI64642C - Foerfarande foer framstaellning av en rikligt fruktos innehaollande sackaridprodukt - Google Patents

Description

f:,ίγ,r., kuulutusjulkaisu . Λ , . 0 ^ΒΙ *11) UTLÄGGNINGSSKRIFT 6 4 642 ?SS| c (45) ::: 13 1733 ' (51) Kv.ik.^int.ci.3 C 12 Ρ 19/18. C 12 Ν 9/10 // σ 13 κ 11/00 SUOMI — FINLAND (11) p»tw'«lt'»k«'nu* — P*t*nt»n»eicnlng T81911 (22) Hikemliptlvl — AmWuiln|tdag 25.06.78 (FI) (23) Alkupilvi—Glltlghetsdag 15-06. 78 (41) Tullut {ulklsukst — Bllvlt offtntllg 17-12.78

Patentti· la rekisterihallitus .... „_______ . , . , _ * (44) Nlhtmktlpanon I» kuul.|ulkatsun pvm.— _ 0

Patent-OCh registerttyrelsen An*ök*n uttigd och utl.jkrlften publkerad 31-0O-Ö3 (32)(33)(31) etuoikeus—Begird prlorltet 16.06.77 USA(US) 807289 (71) CPC International, Inc., International Plaza, Englewood Cliffs,

New Jersey 07632, USA(US) (72) Robert E. Heady, Argo, Illinois, USA(US) (7*0 Oy Kolster Ab (5*0 Menetelmä runsaasti fruktoosia sisältävän sakkaridituotteen valmistamiseksi - FÖrfarande för framställning av en rikligt fruktos in-nehällande sackaridprodukt Tämä keksintö koskee menetelmää vähintään 55 paino-% fruktoosia sisältävän sakkaridituotteen valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: 1) sakkaroosin käsittely glukoosia, fruktoosia ja polysakkarideja sisältävän seoksen muodostamiseksi, 2) kohdassa 1) muodostuneen seoksen mahdollinen käsittely isomeraasi-entsyymillä, jotta glukoosi isomeroituu fruktoosiksi, ja 3) kohdassa 1) muodostuneiden polysakkaridien hydrolyysi olosuhteissa, joissa ei ole läsnä aktiivia isomeraasientsyymiä.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että kohdassa 1) sakkaroosi, jonka alkupitoisuus on ainakin 10 % (paino/ tilavuus), käsitellään Pullularia pullulans-mikro-organismista saadulla fruktosyylitransferaasi-entsyymillä lämpötilassa 25 - 65°C

2 64642 ja pH:ssa 4f5 - 6,5, jotta saadaan glukoosia, fruktoosia ja polysakkarideja käsittävä tuote, jolloin polysakkarideissa on ainakin 66 paino-% fruktosyyliosaa, ja jolloin fruktosyyliosat on sidottu {2 -1) - /2>-sidoksilla.

Tämä menetelmä tarjoaa uuden entsymaattisen tavan runsaasti fruktoosia sisältävien siirappien valmistamiseksi, joiden fruktoo-sipitoisuus on merkittävästi korkeampi kuin on saavutettavissa tärk-keiyshydrolysaattien glukoosi-isomeroinnilla, tarvitsematta erottaa fysikaalisesti tuloksena muodostuvaa fruktoosilopputuotetta. Tämä menetelmä on erityisesti sopiva runsaasti fruktoosia sisältävien fruktoosisiirappien valmistamiseksi.

Keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan valmistaa lukuisia tuotteita. Näitä ovat pääasiassa tai runsaasti fruktoosia sisältävä siirappi sekä erilaiset välituotteet, kuten fruktoosipolymeeri, primäärinen fruktoosipolymeeriä (tai polysakkaridia) sisältävä substraatti, substraatti, josta polymeeri on poistettu ja substraatti (polymeerin kanssa tai ilman sitä) isomeroinnin jälkeen. Jokaisella näistä tuotteista on tavanomaisten sokerien ja siirappien ominaisuudet, ja tuotteita voidaan käyttää niiden tavanomaisissa sovellutuksissa. Näitä ovat esim. käyttö ruo'an makeutusaineina ja raaka-aineina farmaseuttisten aineiden valmistuksessa. Niitä voidaan myös käyttää valmistettaessa sideaineita, kostuttavia aineita, kiillotettua pergamiinipaperia, parkitsemisaineita, sähköeristimiä, valimon keernan sideaineita, hyönteismyrkkyjä, väriaineita ja sen kaltaisia, tai yleisimmin pehmentimiä, sakeutinaineita jne.

Määritelmät

Alalla yleisessä käytössä olevan vaihtelevan terminologian vuoksi annetaan seuraavat määritelmät käytettyjen termien merkityksestä.

Glukoosi ja dekstroosl

Termejä "glukoosi” ja "dekstroosi" käytetään molempia tässä hakemuksessa käsittämään tämän monosakkaridin missä tahansa muodossa liuoksessa tai kuivana.

Sakkaroosi

Termi "sakkaroosi" koskee tätä disakkaridia puhdistettuna tai käsittelemättömässä muodossa, liuoksessa tai kuivana, joka di-sakkaridi on peräisin mistä tahansa sakkaroosin raaka-ainelähteestä, 3 64642 esim. sokeriruo'öistä tai sokerijuurikkaista. Tätä keksintöä toteutettaessa sakkaroosilähtöainetta käytetään tyypillisesti vesipitoisessa väliaineessa.

Fruktoosi ja levuloosi

Termejä "fruktoosi" ja "levuloosi" käytetään yleisesti molempia alalla koskemaan sitä isomeeriä, joka on makeampaa kuin glukoosi. Fruktoosia tavataan hunajassa ja inverttisokerissa glukoosin kanssa, ja fruktoosi on arvokasta makeutensa vuoksi. Termejä levuloosi ja fruktoosi käytetään molempia tässä julkaisussa merkitsemään tätä monosakkaridia missä tahansa muodossa, liuoksessa tai kuivana.

Entsyymivalmiste

Termiä "entsyymivalmiste" käytetään tässä merkitsemään mitä tahansa ainekoostumusta, joka osoittaa haluttua entsymaattista aktiivisuutta. Termiä käytetään merkitsemään esim. eläviä kokonaisia soluja, kuivia soluja, solu-uutteita ja soluista ja viljel-mäliuoksista johdettuja puhdistettuja ja väkevöityjä valmisteita. Entsyymivalmisteita voidaan käyttää joko liuoksena tai immobili-soidussa muodossa toteutettaessa tätä keksintöä.

Isomeraasientsyymi

Jokaista entsyymivalmistetta, joka isomeroi glukoosin fruktoosiksi, kutsutaan tässä "isomeraasientsyymiksi". Nämä entsyymit ovat alalla hyvin tunnettuja ja niistä on käytetty nimityksiä deks-troosi-isomeraasi, ksyloosi-isomeraasi ja glukoosi-isomeraaSi. Näitä entsyymejä voidaan johtaa erilaisista sopivista mikro-organismeista, joista esimerkkejä ovat suvut Streptomyces, Bacillus, Arthrobacter, Actinoplanes ja Curtobacterium.

Tätä keksintöä toteutettaessa käyttökelpoinen edullisena pidetty isomeraasientsyymi johdetaan kannasta Streptomyces olivo-chromogenes ATCC n:o 21 713, ATCC n:o 21 714 tai ATCC n:o 21 715 (joista jälkimmäinen on ATCC n:o 21 713:n yksittäispesäkkeen iso-laatti), kuten esitetään US-patenttijulkaisussa 3 813 318 ja US-patenttijulkaisussa 3 957 587, erityisesti US-patenttijulkaisussa 3 770 589 tai US-patenttijulkaisussa 3 813 318 kuvatulla tavalla valmistettuna.

Viime aikoina on alalla alettu antaa arvoa menetelmille, joissa isomeraasientsyymi immobilisoidaan veteen liukenemattomaan 64642 4 inerttiin kantajaaineeseen. Immobilisoitu entsyymi on sitten sopiva käytettäväksi glukoosin jatkuvassa muuttamisessa runsaasti fruktoosia sisältäväksi siirapiksi. Sellaisten menetelmien esimerkkejä kuvataan US-patenttijulkaisuissa 3 708 397, 3 788 945, 3 850 751, 3 868 304, BE-patenttijulkaisussa 819 859 ja US-patenttijulkaisussa 3 960 663 (BE-patentti n:o 810 480).

IsomeraasiyksikkÖ "Isomeraasiyksikkö" määritellään entsyymiaktiiviteetin määränä^ joka tarvitaan tuottamaan yksi mikromooli fruktoosia minuutissa isomerointiolosuhteissa, joita kuvataan tämän jälkeen otsikon "Iso-meraasin aktiviteetin määritys" alla.

Isomeraasin aktiviteetin määritys Tässä käytettynä tämä termi merkitsee määritysmenettelyä, johon kuuluu glukoosiliuoksesta valmistetun ketoosin spektrofoto-metrisen määrityksen tekeminen standardisoiduissa olosuhteissa. Perusliuos tehdään seuraavalla tavalla: Määritystä varten tehty peruslluos

Komponentti Määrä 0,1 -m MgS04 . 7 H20 1 ml 0,001-m CoCl2. 6 H20 1 ml 1-m natriumfosfaattipuskuri, pH 7,5 0,5 ml vedetön D-glukoosi 1,44 g lisätään tislattua vettä kokonaistilavuuteen 7,5 ml Määritettävä entsyymivalmiste laimennetaan ensin sisältämään 1-6 isomeraasiyksikköä millilitraa kohti.

Entsymaattinen isomerointl suoritetaan lisäämällä 1 ml ent-syymivalmistetta 3 ml:aan perusliuosta ja inkuboimalla 30 minuuttia 60°C:ssa, Inkubointijakson lopussa otetaan 1 rol:n määräosa ja säilötään 9 ml:n tilavuuteen 0,5-n perkloorihappoa. Säilötty määräosa laimennetaan sitten 250 ml:n kokonaistilavuuteen. Tarkistuksena vertailun vuoksi tehdään myös glukoosin sokea koe korvaamalla liuoksessa olevan entsyymivalmisteen 1 ml veden 1 ml:11a inkubointi jakson alussa.

5 64642

Ketoosi määritetään sitten kysteiinirikkihappomenetel-mällä, Tämän määrityksen tarkoituksia varten yksi isomeraasiyk-sikkö määritellään entsyymiaktiviteetin määränä,joka tarvitaan tuottamaan yksi mikromoolilevuloosia kuvatuissa isomerointiolo-suhteissa.

Transfruktosylointi Tämä termi tässä käytettynä merkitsee fruktosyyliosan siirtymistä luovuttajalta, esim, sakkaroosilta, vastaanottajalle, esim. polysakkaridille,

Fruktosyylitransferaasientsyymi Tässä käytettynä tämä termi merkitsee mitä tahansa entsyymiä, joka katalysoi transfruktosylointia ja sisältää kannasta Pullularia pullulans ATCC 9348 (synonyymi kannalle Aureobasidium pullulans) johdetun entsyymivalmisteen.

Fruktosyylitransferaasiyksikkö Tässä käytettynä yksi fruktosyylitransferaasiyksikkö määritellään entsyymiaktiviteetin määränä, joka tarvitaan tuottamaan yksi mikromooli pelkistävää sokeria, glukoosiksi laskettuna, minuutissa seuraavissa olosuhteissa: (a) pH 5,5, (b) lämpötila 55°C ja (c) substraatin väkevyys 60 g elintarvikelaatuista sakkaroosia 100 ml kohden vesipitoista reaktioseosta,

Pelkistävän sokerin määritykset (glukoosiksi laskettuna) suoritetaan käyttäen laitetta "Technicon Autoanalyzer II" (Tech-nicon, Inc,, Tarrytown, New York), Analyysi suoritetaan tällä laitteella käytettäväksi muokatulla tavanomaisella alkalinen-fer-risyanidi-menetelmällä, Analytical Biochemistry 45, n:o 2, s. 517-524 (1972), Ellei toisin ole mainittu, entsyymiaktiviteetin määritykset suoritetaan jatkuvasti tarkkailemalla seuraavan koostumuksen omaavaa reaktioseosta: 7,5 ml 8C % (paino/tilavuus) elintarvikelaatuista sakkaroo-sivesiliuosta 2,3 ml 0,1-m sitraattipuskuria, pH 5,5 0,2 ml:n entsyyminäyte, joka sisältää sen määrän fruktosyylitransf eraasientsyymiä, joka tuottaa 5-25 yug pelkistävää sokeria (glukoosiksi laskettuna) minuutissa 1 ml reaktioseota koh- -f- -L-_ ·

Primaarinen substraatti Tässä käytettynä termi " primaarinen substraatti" merkit- # * 64642 see niitä sakkarideja, jotka ovat sopivassa muodossa ja joiden fruktosyyliosa on käytettävissä osallistumaan transfruktosyloin-tiin, nimittäin sakkaroosin vesipitoiset liuokset.

Sekundaarinen substraatti Tässä käytettynä termi ” sekundaarinen substraatti” on reaktiotuote, joka on tuloksena, kun primaariseen substraattiin annetaan vaikuttaa edellä määritellyn fruktosyylitransferaasient-syymin valmisteen.

Osat ja prosentit Tässä hakemuksessa kaikki osat ilmaisevat painoa ja kaikki prosentit ovat painoa tilavuudessa (paino/tilavuus) , ellei nimenomaan ole toisin mainittu,

Korkeapainenestekromatografia

Termi tässä käytettynä määrittelee menettelyn, jossa ;kek--sinnön mukaiset siirapit analysoidaan käyttäen korkeapaineneste-kromatografiaa seuraavan menettelytavan mukaan. Komponentit eristetään kromatografisesti eluoimalla vedellä kalsium-muodossa olevasta kationinvaihtohartsista. Eluoidut komponentit havaitaan differentiaalirefraktometrin avulla, Muut hiilihydraatit kuin dekstroosi määritetään kvantitatiivisesti käyttäen elektronista integraattoria, ja dekstroosi saadaan erotuksena. Yleinen menettelytapa on esitetty julkaisussa "Analysis of Carbohydrate Mixtures by Liquid Chromatography”, Am, Soc, Brew. Chem, Proc., 1973, s. 43-*+6. Käytetty hartsi on kalsium-muodossa oleva "Aminex Q" 15-5, toimittaja Bio-Rad Laboratories, Richmond, California.

Keksinnön mukainen menetelmä siirappien valmistamiseksi käsittää sen, että primaariseen substraattiin, nimittäin sakkaroosiin, annetaan vaikuttaa fruktosyylitransferaasientsyymin valmisteen, joka kykenee muuttamaan sakkaroosin tuotteeksi, joka koostuu suurehkon määrän glukoosia ja pienehkön määrän fruktoosia sisältävästä monosakkaridifraktiosta ja vähintään 66 paino-% fruktosyy-liosia sisältävistä polysakkarideista. Tuote on tämän keksinnön sekundaarinen substraatti. Sekundaarisen substraatin polysakkarideja ovat kaikki fruktoosia sisältävät polymeerit (muu kuin sakkaroosi), joissa on kaksi tai useampia monosakkaridiosia, Näiden polymeerien voidaan edelleen luonnehtia olevan polysakkarideja, jotka sisältävät (7—^ ]) -^-sidoksilla sidottuja frukto-ryy 1 lomia. Kuten jäljempänä kuva taan , trans f ruktosy'! oinn i.n olosuhteita säätämällä voidaan valmistaa haluttuja polysakkurideja. Niinpä voidaan valmistaa esim, sekundaarinen substraatti, jossa 7 64642 useimmat (esim. vähintään 60 % moolisuhteena) polysakkarideista ovat 2-10 (so, OP 2--10), tavallisimmin 3-6 (so, DP 3-6) monosnk-karidiosaa sisältäviä oligomeereja. Sen jälkeen mainittu glukoosi isomeroidaan (isomeraasientsyymin vaikutuksen avulla) fruktoosiksi mainitun polysakkaridin läsnäollessa, mitä seuraa mainittujen polysakkaridien hydrolyysi olosuhteessa, jossa aktiivista iso-meraasientsyymiä ei ole läsnä, Hydrolyysi voidaan suorittaa entsymaattisesti käyttäen ir.vertaasia tai hapolla hydrolysoimalla lievissä olosuhteissa.

Keksinnön lisätoteutusmuodossa polysakkaridit voidaan erottaa glukoosista ja fruktoosista ja sen jälkeen hydrolysoida, kuten edellä kuvattiin, erittäin paljon fruktoosia sisältävän, esim. fruktoosipitoisuuden yli 66 paino-% ja edullisesti yli 90 pai-no-% omaavan siirapin valmistamiseksi suoraan tämän keksinnön mukaisesta sekundaarisesta substraatista tarvitsematta isomeroida substraatissa olevaa glukoosia.

Erotus voidaan suorittaa mukavasti tavanomaisella molekyy-likokoon perustuvalla fysikaalisella erotustekniikalla, kuten esimerkiksi membraanitekniikalla (esim. ultrasuodatus, dialyysi), liuotinsaostus, hiiliabsorptio ja sen kaltainen.Esimerkkejä mem-braaniteknologian käytöstä ovat amerikkalaiset patenttijulkaisut 3 173 867, Re 26 097, 3 541 006 ja 3 691 068,

Edullisena pidetty toteutusmuoto on menetelmä runsaasti fruktoosia sisältävien siirappien valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää sen, että sakkaroosiin annetaan vaikuttaa fruktosyyli-transferaasientsyymin valmisteen, joka on johdettu Pullularia pullulans-mikro-organismista, - kuten ATCC 9348, ATCC 12 53 5 , NRRL 1573, NRRL Y2311, NRRL YB3892, NRRL YB3861, NRRL 3937 ja ATCC 15223. Tuloksena muodostuvaan tuotteeseen tai sekundaariseen substraattiin, annetaan vaikuttaa isomeraasientsyymin. Sen jälkeen isomeroitu tuote hydrolysoidaan, niin että läsnä ei ole aktiivista isomeraasientsyymiä, Tämän keksinnön mukaisen menetelmän mukaan valmistettu sekundaarinen substraatti on uusi tuote. Tämä substraatti on ainutlaatuisen sopiva isomerointiin ja sitä seuraavaan hydrolyysiin yli 55 % fruktoosia sisältävän siirapin tuottamiseksi, ja substraatti valmistetaan antamalla fruktosyylitransferaasientsyymin 8 64642 valmisteen vaikuttaa sakkaroosiin, Substraatit sopivat entsy-maattiseen isom.erointiin ja sitä seuraavaan hydrolyysiin yli 55 % fruktcosisiiraopia sisältäviksi siirapeiksi, jotka substraatit sisältävät (1) noin 20 - noin 60 paino-% suurehkolta osaltaan glukoosia ja pienemmän määrän fruktoosia sisältäviä mo-nosakkariceja, ja (2) noin 70 - noin 40 % yli 66 paino-% frukto-syyliosia sisältäviä polysakkarideja.

Erityisen edullisina pidettyjä ovat sekundaarisetsubs-traati4-, jotka on johdettu sakkaroosista transfruktosyloimalla, kun läsnä on tehokas määrä kannasta Pullularia pullulans ATCC 9348 johdettua fruktosyylitransferaasientsyymin valmistetta lämpötilassa, joka vaihtelee noin 25°C:sta noin 60°C:een ja pH:ssa, joka vaihtelee noin 4,5:stä noin S,5:een, ja edullisesti noin 5,4 - 5,6. Alussa käytetyt sakkaroosin pitoisuudet voivat olla niin pieniä kuin 10 g 100 ml vettä kohti. Kuitenkin käytetään mieluummin mahdollisimman korkeaa kuiva-aineen pitoisuutta, edullisesti noin 30 - 60 g 100 ml kohti.

' Minimimäärä 0,5 fruktosyylitransferaasi yksikköä 1 g sak karoosia kohti voidaan käyttää tuottamaan uutta substraattia. Yleensä käytetyn entsyymin määrä ei ylitä 50 yksikköä 1 g sakkaroosia kohti, entsyymin kustannusten takia. Erityisesti pidetään edullisena saada haluttu sekundaarinen substraatti riittävän lyhyessä ajassa, joten käytännössä entsyymimäärä on 30 yksikköä . 1 g sakkaroosia kohti.

Fruktosyylitransferaasi valmistetaan tavanomaisella fer-mentointitekniikalla, ks. esim. US-patenttijulkaisut 3 565 756, 3 806 419 ja 3 535 123 sekä artikkeli S, Ueda et ai., Applied Microbiology, 11, 211-215 (1963), Edullisesti käytetään erotusta! puhdistusmenettelyjä, joita on kuvattu yksityiskohtaisemmin jäljempänä. Seuraava esimerkki on tyypillinen fermentointimenet-tely, jota käytetään entsyymin valmistamiseksi kannasta Pullularia pullulans ATCC 9348.

Esimerkki 1

Fruktosyylitransferaasientsyymin tuotanto

Valmiste - Celite-kantoalne A. Entsyymin valmistamiseksi käytetty fermentointimenette- ΰχ

Entuyymi n valmistamiseksi tarvittavan siirrosteen vi lje- f g 64642 lyyn ja fermentointiin käytetty väliaine on seuraava; 0,5 % kaksiemäksisistä kaliumfosfaattia 0,1 % natriumkloridia 0,02 % magnesiumsulfaattiheptahydraattia 0,05 % diammoniumsulfaattia 0,3 % hiivauutetta (Difco Laboratories) 7,5 % sakkaroosia (elintarvikelaatu) väliaineen pH on säädetty arvoon 6,8 100 ml steriiliä väliainetta sisältäviin 500 ml:n Erlen-meyer-pulloihin siirrostetaan mustahiivan Pullularia pulluians viistopintaviljelmää. Käytetty hiivakanta on merkitty luettelossa the American Type Culture Collection (Rockville, Maryland) tunnuksella ATCC 9348, Näitä siemenpulloja pidetään edestakaisin liikkuvassa ravistelulaitteessa 48 tuntia 32°C:ssa, käytetään ymppäämään 1 litra fermentointiseosta Erlenmeyer-pullossa, joka sisältää 200 ml edellä määriteltyä väliainetta. Käytetty ymppi-pitoisuus on 0,5 % paino/tilavuus. Fermentointi suoritetaan edestakaisin liikkuvassa ravistelulaitteessa 32°C:ssa seitsemän päivän ajan, B, Entsyymin talteenotto fermentointiliemestä Neljästäkymmenestä 1 litran ravistuspullosta peräisin olevat fermentointiliemet yhdistetään, ja pullot huuhdellaan vedellä, joka myös lisätään yhdistettyyn liemeen. Liemen lopullinen tilavuus laimennuksen jälkeen on 12 litraa, Liemen alkuperäinen tilavuus on noin 8 litraa. 12 litraa fermentointilientä johdetaan jatkuvatoimisen Sharples-sentrifugin läpi hiivasolujen ja solu-maisen jätteen poistamiseksi. Sakan päällä oleva aines, joka on musta viskoosiliuos, säädetään sitten kalsiumkloridin avulla 0,5 %:n (paino/tilavuus) pitoisuuteen ja tuloksena muodostuvan liuoksen pH säädetään arvoon 7,0 natriumhydroksidilla. Toinen vaihe tehdään sitten Sharples^sentrifugilla, jotta saadaan viskoosi sakan päällä oleva liuos, jolla on heikko väri. Värittömäksi tehdyn sakan päällä olevan liuoksen pH säädetään arvoon 5,5 suolahapolla, ja lisätään 1 000 yksikköä pullulanaasia (kuten määritellään US-patenttijulkaisussa 3 806 419), Näin saatu liemi säilötään to-lueenilla (jota lisätään kyllästymiseen saakka) ja pullulanaasin annetaan reagoida huoneen lämpötilassa yli yön. Yön yli kestäneen 10 64 64 2 pullulanaasilla suoritetun hajottamisen jälkeen lietetään liemeen 1 % suodatusapuainetta Grefco J&fc 503 Celite piimaata, jota valmistaa Johns-'Manville Products Corporation, Lompoc, Kalifornia, minkä jälkeen lisätään asetonia 2 tilavuusmäärässä (24 litraa). Muodostuu sakka ja se kerätään suodattamalla, suodoskak-ku pestään asetonilla ja kuivataan ympäristön lämpötilassa. Kerätty suodoskakku sisältää immobilisoidun fruktosyylitransferaasi-entsyynin.

Esimerkissä 1 on merkittävää, että kalsiumkloridin lisäys fermentointiliemeen sekä liemen pH:n säätäminen antaa tuloksena mustan pigmentin ja läsnäolevien happamien polysakkaridien poiston (ks. Acta Chem. Scan, 16 (1962)). Lopullinen entsyymituote saadaan siten suhteellisen puhtaan, värittömän valmisteen muodossa. Tämä puhdistusmenetelmä mahdollistaa yksinkertaiset puhdistusmenette-lyt, so. sentrifugoinnin, suodatuksen ja saostuksen lopputuotteen saamiseksi.

; On myös toivottavaa poistaa luontaisesti fermentointilie- : messä läsnäoleva pullulaanipolysakkaridi, koska kuten musta pig mentti ja happamet polysakkaridit sekin kerasaostuu fruktosyylitransf eraasientsyymin kanssa lisättäessä liuosta fermentointilie-; meen. Sen vuoksi sakan päällä olevaa liuosta, joka on saatu kal- siumkloridillä käsittelystä ja pH-säädöstä, voidaan edelleen käsitellä hyvin tunnetulla hydrolysointientsyymillä, pullulanaasilla. Pullulanaasientsyymi hydrolysoi umpimähkäisesti pullulaanin tuottaen alhaisen molekyylipainon omaavaa polymeeriä, ja täten vältetään liuotekäsittelyn (esim, asetoni, alkoholi ja sen kal-' täinen) aikana fruktosyylitransferaasientsyymin valmisteen kera- ; saostuminen ja siihen liittyvä saastuminen.

ί Saatua fruktosyylitransferaasientsyymiä voidaan käyttää il- i * man pullulaanin poistamista. Niinpä tätä keksintöä voidaan tote uttaa ilman pullulanaasilla suoritettua pullulaanin hydrolyysiä, jossa tapauksessa pullulaani toimii fruktcsyyli-transferaasientsyy-min kantoaineena,

Seuraava esimerkki havainnollistaa pullulaanin käyttöä kan-: toaineena.

Esimerkki 2

Sekundaarisen substraatin valmistus käyttäen pullulaani-kan- 11 64642 toaineella olevaa fruktosyylitransferaasientsyymiä, 20 ί: iseen sakkaroosin liuokseen,, joka on puskuroitu 0,05-m sitraattipuskurilla ρΗτ-arvoon 5,5. lisätään 1 %;n pitoisuus kuivaa pullulaania, joka on valmistettu esimerkin 1 menettelytavan mukaan, paitsi, että pullulaani ei ole hydrolysoitu pullulanaa-silla ja sen vuoksi toimii kantoaineena, eikä käytetä ainetta Ce-lite. Fruktosyylitransferaasin aktiviteetti on 577 yksikköä/g pullulaania. Reaktio toteutetaan ympäristön lämpötilassa, kunnes seos tulee sameaksi. Näyte tästä seoksesta analysoitiin korkeapai-nenestekromatografiaa käyttäen ja saatiin seuraavat tulokset:

Korkeapainenestekromatograafisella analyysillä määritetty sakkaridijakauma

Fruktoosi Glukoosi DP^ DP^ DP^ + 6,9% 40,6% 6,2% 11,1 % 35,2%

Seuraavat esimerkit luonnehtivat edelleen esimerkissä 1 valmistettua entsyymiä.

Esimerkki 3

Entsymaattisen vaikutuksen omaavat tuotteet ja entsyymin lämpöstabiilisuus

Kierretulpilla varustettuihin reaktiopulloihin lisätään 60 g elintarvikelaatuista sakkaroosia ja fruktosyylitransferaasient-syymivalmistetta. Entsyymivalmiste saadaan esimerkin 1 entsyymi-tuotteesta dispergoimalla kiinteän entsyymituotteen sopivat määräosat mitattuihin vesimääriin sopivan väkevän entsyymiliuoksen valmistamiseksi. Suodatusapuaine poistetaan sitten suodattamalla. Suodos lisätään reaktioseokseen määrässä 10, 20 ja 30 yksikköä entsyymiä 1 g sakkaroosisubstraattia kohti. Jokainen seoksista laimennetaan sitten 100 ml;n lopputilavuuteen vedellä, Muutosreak-tiot suoritetaan pH-arvossa 5,5 55°C;ssa tai 60°C:ssa vastaavasti, Näytteitä otetaan 24, 43 ja 66 tunnin kuluttua pelkistävän sokerin määrityksiä varten, jotta varmistettaisiin entsymaattisen aktiviteetin läsnäolo. Sen jälkeen, kun pelkistävän sokerin määritykset näytteistä on tehty, jäljelle jäävät reaktioseokset jäähdytetään entsymaattisen vaikutuksen pysäyttämiseksi ja näytteille tehdään hii1ihydraattikoostumuksen määritys korkeapaineneste-kromatografiällä. Saatiin seuraavat tulokset: 12 64642 ^ :(0

<—( CO

E tn

:<ϋ V CD

Φ M "U

> e ϊ'Ό Ci) 4-J C * -μ

CD CO-T-OCNOCDO _C

•h Li ro i cd o cd rv «d- (N >.

o: *i i f\imm r\i m *3- r-^ -μ e D d d r ro

CL CC 3 P

——* i—!

CD

CD -p

CD O LT; LT UT O O O LH »H

.; X COOJCNir-COrvCncn U

Π, ·»·.«.·» ^ «v lp en en cn^r^r^f :o ^ e ^ :o E χ • (Ό v—( :<c &3 en

> E -XL

:u w in >,

-P T « *H

tn -r-i ro r- o T- (V) co σ tn r- -h C ·ρ i m r-^ en «a- cd cr> ro -P JiL CU 4-> N ·Ν tn N N tn (Ό CU r-H _* C e-

1 tn CU D 3 CU

I XXL CL tn -P <+.

i >1 tn •p m e •p «3-aoonnono to

P X cc'a-'^rmrvy-i-tM P

1 :(0 Q. ·>*>*«·«« -P

:to nnnntnnnn .h e +j •p x:

, C ^ r-t O

( -H rS V X

t-. E >, Q) m \ tn to

MM O (O

O > E ro rV -PE

tn :io ·ρ » ne. g -pro-p T-CMtDQOCnCM 03 ro e tn ·ι-. e icncn·^ o^-co p p :(0 τ-ι P CD tr-^-ΓΜ ENI CM ΓνΙ q- (jo

> X O -P

E :<0 rP nC >, C

> -P <E O -p .h tn a. tn cnj -p en

P 0) Q

, -PO

I I -HP

; cu -p tn ro • cl o cu x r P ne ‘ ·ρ e: ro cl o tn ' ·γΗ E -.(0 :to

>i £ *P

>CM OOOOOOOO H E

-u tn r- cnj m t- cni tn qj > -p n -P >, n -i cu ό x tn e -p CU e E en 1-1 -p :o «. -H -P pc

l P CU PC

1 o — -U *H

o. cj en o tn

Ec tn to :to pc ;r> ^ V >-

—1 T- CNJ

13 64642 ω + 0 <3- oococo'S-Tj-Ot-CD tnOLncNim^mcnm E CL·-' » - * * * « 1 o o\° r in m *3· co co cn^rv cd en N cncom to o «s-

-*-1 '-'mmcncncnmencncM mcncncncncncnmCM

CO

o 0 en ocnoiv.T-coLr)r3-Ln mCMO<p-mp-<— co*— *(—t Q_ ,—v ·> «\ «s * * ·, * * * ^ <t »s * «l +3 Qo\0Cnr^CrionCNOCNJ^-T- 'J-COtOr^CMT-CMT-p- "L ·—' CM *— r- r— r— t— τ— r- N r- r— r— r“ p- τ— p“ r- o:· .•o

L

tn cm o^uDcocnri-T-coo r-co'd-’^’CDcn^-rn'^ >, CL ·—· ... ... ... ... ...

-LL Qo\° o en ID ID K N DvCOrv. CO CT) CO CO CO n. Γν rv IV

•H -_· p-

f—4 • H

•t—(

-e -H

tn >1 u □ u -l>o o n (M o co cm m o en tn o co o «3· cooto en r- cm +1 UI ... ... .««o ... ... ...

OJ tn oo\° n n n cm ^j· <- un rv to cm <3· un m in to in n en -p > —· •p <0 CD (0 L .—I _I l—l

:t0 *h -H

:Ώ +j +j E :θ *H :0

CL en CL

:<o £ o n in n m <f in <3- co p- E cm o iv lo *3- m o rv co ·—1 :ro o pp ... ... *..:ro ... ... ...

1-1.-1 pc 0\° p- <3- co en lv o iv r- co ph cm ui id in o r en en iv •Po o·-^ menen m m <· en *3· *3- o mmm enenet m ^ tn -p 1—1 ·ι—(

> -P LD -P

>1 PC PC

p-1 tu 10 ^ cd to ω

C CL LL CL

CD ·ρ 1 o pp to o to •p -p-ppi-rncopi-cncopi-ento i-mto^mcorrmco

tp -P -P CM ^3" CO CM'fl-CD CM ^ ID CM *3· CO CM -3- U0 CM <3" CO

(0 PC C

Ci (0 o

M Q -P

o CL '—'

-P

<0 E i

O PC

C-t »H ' ' pc tn to

CD PC -P

-l> >1 tn tn ·—· o cd tn o e o Li ω e to

e e PC

p to PC CO O O O CD CD

(D-PtOi— cm m t— cm m a E tn to >

CD >1 M

pc tn \ L -P :ro

O C : O

Mi LLI PC

i4 64642

Esimerkki 3 osoittaa entsyymin lämpöstabiilisuutta substraatin läsnäollessa 55°C:ssa ja 60°C:ssa 66 tunnin jakson aikana pH-arvossa 5,5; tuloksista ilmenee, että entsyymin on kaupallisesti käyttökölooinen, Sitä paitsi uudella fruktosyylitransferaa-sivalmisteella sakkaroosia entsymaattisesti muuttamalla tuetetun sekundaarisen substraatin osoitetaan hiilihydraattianalyysillä olevan ooter.tiaalisesti arvokas tuote, joka sopii runsaasti sakkaroosia sisältävien siirappien valmistamiseen sakkaroosista, koska tärkeimpien aineosien osoitetaan olevan glukoosi ja polymeerit, jotka seuraavassa hydrolyysissä antavat fruktoosia tärkeimpänä mo-nosakkaridina. Tämä esimerkki osoittaa myös, että keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetty uusi entsyymi on tehokas 60 %:n (paino /tilavuus ) sakkaroosin pitoisuudella. Myös osoitetaan entsyymin toimivuus suurien glukoosi pitoisuuksien läsnäollessa.

Esimerkki 4 Lämpötilan vaikutus entsyymin aktiviteettiin Lämpötilan vaikutus fruktosyylitransferaasientsyymin reaktionopeuteen määritetään käyttäen laitetta "Technicon Autcanaly-zer" seuraavasti:

Reaktioseos muodostuu 7,5 ml:sta 80-% (paino/tilavuus)sak-karoosiliuosta, 2,3 ml:sta 0,1-m sitraattipuskuria pH-arvossa 5,5 ja 0,2 ml:sta 2-%(paino/tilavuus) pullulaanientsyymin liuosta (esimerkin 2 entsyymivalmiste). Sakkaroosin lopullinen pitoisuus on 60 % (paino/tilavuus). Näytteitä pidetään seuraavissa lämpötiloissa ja analysoidaan 10 minuuttia laitteella " Technicon Auto-analyzer II". Tulokset osoittavat, että 40°C:ssa reaktion entsy-maattinen nopeus on 1,89 kertaa nopeus 30°C:ssa, 50°C:ssa 1,29 kertaa suurempi kuin 40°C:ssa ja 60°C:ssa 1,48 kertaa suurempi kuin 5Q°C:ssa.. Tämä osoittaa kohoavan lämpötilan mukana kasvavaa reaktionopeutta.

Esimerkki 5

Fruktosyylitransferaasientsyymin Michaelis-Menten-vakion (K ) havainnollistaminen m

Entsyymin Kjr merkitsee substraatin pitoisuutta, jolla tuotteen muodos turr' snopous on puolet arvosta V Seuraava menette-

Ly'i käy t.e-1 i ! r, fruk toayy litrancferaas ientsyymin vakion K saarni-:;nkn i .

15 64642 Käyttäen sakkaroosin 90-% (paino/tilavuus) perusliuos-ta, jonka pH oli säädetty arvoon 5,5 0,1-m sitraattipuskurilla, valmistetaan 9,8 ml:n määräosissa olevat sakkaroosin asianmukaiset pitoisuudet, jotka antavat 5, 10, 30, 40, 50, 50 ja 70 %:n sakkaroo-sipitoisuudet 10 ml:n lopputilavuudella. 1,1 yksikköä fruktosyyli-transferaasientsyymiä sisältävä 0,2 ml:n entsyymi 1iuos lisätään temoero ituihin näytteisiin. Sitten näytteet analysoidaan välittömästi 55"C:ssa laitteella "Technicon Autoanalyzer II”, kuten aikaisemmin kuvattiin (ks. fruktosyylitransferaasiyksikkö). Glukoosi-standardi (kalibroitu yksiköissä /jg/ml) liitetään mukaan vertailukokeena .

Seuraavassa on glukoosin muodostumisnopeus ilmaistuna yksiköissä >jg/ml/minuutti erilaisilla substraatin pitoisuuksilla käyttäen vakioannostelua (1,1 yksikkö) esimerkin 1 fruktosyylitrans-fe-raas i entsyymi valmistetta .· % substraattia jjg/ml/min pg/ml/mina^ 5 8,0 8,0 10 11,8 11,6 20 15,7 15,2 30 18,0 17,6 40 18,6 18,2 50 19,2 17,2 60 17,8 18,2 70 15,6 a) Ajettu uudestaan seuraavana päivänä käyttäen 60-% sakkaroosipe-rusliuosta.

K on 0,27-m sakkaroosipitoisuus. Reaktion maksiminopeus esiintyi substraatin pitoisuudella 1,374 molaarinen sakkaroosin suhteen, pH-arvossa 5,5 ja 55°C:ssa.

Esimerkki 6

Sekundaarisen substraatin valmistus ja isomerointi sakkaroosista .

A. Sekundaarisen substraatin valmistus

Elintarvikelaatuista sakkaroosia 600 g liuotetaan veteen 800 ml: n tilavuuteen. Tämän liuoksen pH säädetään arvoon 5,5 laimealla is 6 4 64 2 - 1 Ί-Ί I "i*i '“'---s. 1 i g kuivaa C e 1 it e - entsyym i n valmistetta, jonka ak- 'iVitgs-l-J.; CC'- I , cn y^sxkkoa/g ja joka on valmistettu kuten esimer- ^ J. o S ^ ^ ^ ^ · # ·« * luetetaan JOG ml-.aan vettä. Liete suodatetaan vakuumilla λ a t m g -> 1 η ’· o 1 sucdat inpaperia käyttäen Bdchnsr-suppilossa. Suodos-'Sstään vielä IQo ml:11a vettä. 200 ml suodosta lisätään sit-,en -9\karcosiliuokseen, jcka cn kierretulpelia varustetussa 1,9 l:n "-5· Pu.lo sij’oitetaan sitten 58°C lämpöiseen vesihauteeseen ,v^-on annetaan jatkua 20 tuntia, jonka jälkeen reaktiotuotteen Γ. 3 V t P -¾ , , -Pöiy soidaan KcrkRaoa i n en es 12 kr oma tograf ia 1 la hiilihydraatti-*0- s -Umj ksen määrittämiseksi ja saadaan se ura av at tulokset.

Hiilihydraatti koostumus

Fruktoosi 2,4 %

Glukoosi 32,8 % 0p2 10,6 % 0P3 22,9 % 0P4 31,3% Oäljelle jäävään reaktiotuotteeseen (so. sekundaarinen substraatti) lisätään magnesiumkloridia pitoisuuteen 5 millimolaa-rinen saakka, ja pH säädetään arvoon 8,4 laimealla natriumhydroksi-di 1la .

B. Sekundaarisen substraatin jatkuva isomerointi

Kannasta Streptomyces o 1ivochromogenes ATCC 21 715 (ks. US-patenttiju1kaisu Pe 29 152) johdettu glukoosi-isomeraasi immoöili-soidaan huokoiseen alumiinioksidiin valmistaja Corning Glass Co., Corning, Dew York,(ks. US-patenttijulkaisu n:o 3 992 329) seuraavasti : 1. K.antcaine pestään kahdesti vedellä 2. Kantoainetta inkuboidaan 0,1-m ^atriumsitraatin kanssa yhden tunnin ajan sekoittaen, 3. Natriurnsitreat ti nestään kantoaineesta kunnes pesuliuok-s e n "ohtoky^y on 1 0 0 u /u o h m .

4. Kantoainetta inkuboidaan U,05-m magnesiumkloridin kanssa vksi tunti ja magn esiumk1 oridi1iuos riekantoidaan.

5. lmnätään 1 t .i lovuunusa Π, 0B-m magn os Iumklorid ia , jolloin un t ; y ym ! n I «nu 1 ! ! n ti kr. : p to ί nootinko i tulon 4ΡΠ yku:kköä/ml, 17 64 64 2 6. Isomeraasientsyymin väkevöite lisätään kantoaineeseen pitoisuutena 494 yksikköä/ml 7. Kantoainetta ja entsyymiä pidetään kontaktissa 22-24 tuntia ja sitoutumaton entsyymi pestään kantoaineelta tislatulle vedellä.

Vaipalla varustettu lasikolonni (3 cm x 18 cm), joka on varustettu syöttösäiliöön yhdistetyllä pumpulla, panostetaan näin valmistetulla immobilisoidulla entsyymillä. Panostamisen jälkeen en entsyymikerroksen tilavuus 45 ml. Kolonni toimii B0°C:ssa kaikissa isomeroinneissa. Panostetun kolonnin toiminta aloitetaan glukoosisiirapilla [50 % paino/paino) sekä 0,005-m magnesiurnklcri-dilia, pH:ssa 8,4, ja todetaan, että kolonni on'aktiivinen.Virtausnopeus säädetään arvoon 292 ml/tunti. Sitten kolonnista poistetaan liuosta kerroksen tasolle. Sekundaarisen substraatin sisään johtaminen suoritetaan käsin, kunnes 20 ml ulosvirtaavaa ainetta on kerääntynyt, ja sitten sekundaarisen substraatin virtausnopeus säädetään arvoon 292 ml/tunti. Ensimmäiset 100 ml kerääntynyttä siirappia hylätään substraatin muuttumisen mahdollistamiseksi. Jäljelle jäävä sekundaarinen substraatti ( noin Θ50 ml ) johdetaan sitten kolonnin läpi. Tunnin kuluttua virtausnopeus nousee arvoon 570 ml/tunti. Virtausmäärä säädetään ja pidetään arvossa 300 ml/tunti ajon loppuun saakka. Sekundaarisella substraatilla loppuun suoritetun ajon jälkeen kolonni kytketään takaisin glukoosille, ja tode-’ taan, että isomeraasiaktiivisuus on, säilynyt. Seuraavassa taulukossa on vertailtu lähtöaineena olevan sekundaarisen substraatin ja iso-merointikolonnin lopputuotteen korkeapainenestekromatografia-ana- -lyys i ä:

Sekundaarinen substraatti (A) Lopputuote (B)

Fruktoosi 2,4 % 15,7 %

Glukoosi 32,8% 18,9% DP2 10,6 % 11,0 % DP3 22,9 % 22,9 % DP4+ 31,3 % 31,5 % 18 64642 Nämä tulokset osoittavat, että 42,38 % sekundaarisen substraatin vapaasta glukoosista isomeroituu kolonnissa fruktoosiksi. Myöskään sekundaarisessa substraatissa läsnäoleviin fruktoosipolymee-reihio ei näyttänyt vaikuttavan glukoosin isomerointi fruktoosiksi eivätkä nämä polymeerit vaikuttaneet isomerointiin. Mainittakoon, että monosakkaridien kokonaisjakauma muodostuu noin 45-%:isesti fruktoosista ja 55-%:sesti glukoosista.

Seuraavassa esimerkissä käytetään kahta tapaa sekundaarisessa substraatissa ja myös siitä valmistetussa isomerointituottees-sa läsnäolevien polysakkaridien hajoittamiseksi. Toinen taoa on entsymaattinen ja toinen lievä happohydrolyysi.

Esimerkki 7

Runsaasti fruktoosia sisältävän siirapin valmistus hydrolyy- s i 1 lä A. Enteymaattinen hydrolyysi 100 ml:aan esimerkistä 5 peräisin olevaa tuotetta sekoitetaan lajista Candida utilis peräisin olevaa puhdistettua invertaa-sia. Tämän seoksen (tolueenilla säilöttynä) annetaan reagoida yön yli ympäristön lämpötilassa, minkä jälkeen otetaan näyte ja analysoidaan korkeapainenestekromatografiällä. Jä1jelle'jäävän näytteen 3 annetaan reagoida vielä kuusi päivää ja analysoidaan toinen näyte samalla menettelytavalla seuraavin tuloksins Lähtömateriaali Invertaasin vai- Kuuden lisäpäi-(tuote B) kutuksen jälkeen vän jälkeen

Fruktoosi 15,7 % 41,9 % 62,4 %

Glukoosi 18,9 % 29,4 % 36,2 % 0p2 11,0% 1,9% 0 DP3 22,9 % 12,9 % 0,5 % ΠΡ4+ 31,S % 13,9 % 0,9 % Käytetty invertaasi on yhtiön Siekagu Kogyo Co., Ltd., Tokio, Jaoani, valmistama entsyymivalmiste, jonka spesifinen aktiivisuus on 123 yksikköe/mg proteiinia, ja yksi invertaasiyksikkö katalysoi sakkaroosin lohkaisua muodostaen 1 mikromoolin glukoosia ja 1 mikromoclir fruktoosia minuutissa standardoiduissa olosuhteissa.

19 64642 B. Tuotteen B happohydrolyysi

Esimerkin 6 tuotteesta otetun näytteen happohydrolyysi suoritettiin lisäämällä rikkihappoa pitoisuuteen 0,05-n ja kuumentamalla 75-8Q°C: seen. Näytteet otetaan yhden ja kahden tunnin hydro-lyysin jälkeen ja analysoidaan korkeapaineisella nestekromatogra-fialla. Tulokset ovat seuraavat: Lähtömateriaali (tuote B) 1 tunti 2 tuntia

Fruktoosi 15,7 % 60,3 % 59,1 %

Glukoosi 18,9 % 38,7% 37,9 % DP2 11,0 % 1,9 % 2,6 % DP3 22,9 % 0,4 % 0,3 % DP4+ 31,5 % 0 % 0,2 %

Edellä olevat vaiheen A tulokset osoittavat vallitsevana olevan fruktoosin saannon nousun ja vähäisemmän glukoosin saannon nousun, joka ilmenee DP2:n, DP^:n ja DP4+:n fraktioiden vastaavan vähenemisen yhteydessä näin osoittaen fruktoosipolymeerin läsnäoloa.

Vaiheen B happohydrolyysin tulokset ovat yhtäpitäviä vaiheesta A saatujen tulosten kanssa näin myös osoittaen fruktoosipo-lymeerien pirstoutumista.

Edellä oleva tarkastelu on suunnattu primaarista substraattia käyttäen tapahtuvaan transfruktosylointiin, jossa lähtöaineena olevan sakkaroosin kuiva-aineen pitoisuus ei ylitä ky 1lästyspistettä annetuissa reaktion olosuhteissa. Seuraava esimerkki osoittaa primaarisen substraatin käyttöä, jolla substraatilla on sakkaroosin alkuperäinen pitoisuus yli kyllästymisen ja joka fruktosyylitrans-feraasientsyymin vaikutuksen alaisena antaa tulokseksi tuotteen, joka sisältää DP^-materiaalin (so. fruktosyyli-sakkaroösin) kohenneita määriä ja DP4+-tuotteiden alentuneen pitoisuuden. Myös osoitetaan sekundaarisen substraatin kuiva-aineen pitoisuuden (paino/ tilavuus) nousu verrattuna fruktosyy1itransferaasientsyymin puuttuessa saatuun kuiva-aineen pitoisuuteen. Sitä paitsi osoitetaan, että primaarisen substraatin kuiva-ainepitoisuuden noustessa sekundaarisen substraatin fruktoosipolymeerin polymerointiaste laskee ja DP^+-materiaalia on läsnä pienempinä määrinä.

20 64642 Tämä on merkittävä vastakohtaisuus edellisissä esimerkeissä alle kyllästymisen olleita sakkaroosisubstraatteja käyttäen saaduille tuloksille. Niissä esimerkeissä DP^+^raateriaali on tärkein tuote. Esimerkki 8

Sekundaarisen substraatin valmistus sakkaroosilietteistä, joiden pitoisuus on yli kyllästymispisteen

Eliotarvikelaatuista sakkaroosia (200 g:n erinä sijoitetaan kierretulpalla varustettuihin 0,5 l:n astioihin. Vertailu, 50 ml vettä lisätään yhteen astiaan, ja jokaiseen muuhun lisätään 50 ml vettä, joka sisältää kohoavia määriä fruktosyylitransferaasientsyy-mi-valmistetta ( valmistettu esimerkin 1 mukaisesti), jäljessä seu-raavan taulukon mukaan. Jokainen astia suljetaan ja sijoitetaan sekoittavaan vesihauteeseen, joka on säädetty 54-55°C: seen, Astioita ravistellaan 24 tuntia sekoittaen toisinaan käsin. Jokaisesta pullosta otetaan näyte sakan päällä olevasta nesteestä ja sijoitetaan kierretulpalla varustettuun koeputkeen kiehuvaan vesihauteeseen entsyymin inaktivoimiseksi, Näytteet analysoidaan sitten korkeapaine-nestekromatografiällä ja sakan päällä olevan nesteen kuiva-aineen määritykset tehdään K. Fischerin menetelmää käyttäen/ (ks.Kirk-Oth-mer, Encyclopedia of Chemical Technology, voi,2, 2. painos, 1963, sivut 673 ja 674, ja Angewandte Chemie 48 ,(1935), sivu 394)· Saadut tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa.

21 64642 - -Ξ Ρ Ο ε ε + ο ρ ^ c\j r^^-aDT-coo'a-r^T- r\’ -Pr D-X'''*''-'·' x o _2 c ujo^-T-tNCMrnmm^· lu o -, o r, ^ ,- c o mcnrvtDoacn«r-^-o«i GO CL ***·»******Γν!

•rH Z CD COrnCDCn-^-r-Cn^fLOLD X

-P rr-^[NJ!Nf\!NN(N UJ

^ rc D -.

P CO

L r OvJCnCsJCOUDLnOCnCNJOCD rv TJ ./ CL * * * * * * * * * * * >) "7 CD1 0(NCDC\JaOCOnC\JOCO CD Γ?

JT ,-. CCr^COCDLDLDLnLnLn^- CD "Z

L -2 o PO — . -* •r-ί ^ uDr^unr^cnococncDCD ,m -C5 ^ tN ^ j] „ -- cncvjii-Lni^cococDcno x Tt

C -H r-l U UJ

“ O ^ . > “ «P 4j

o -_I ^ cDr^ocn^-mT-omrn m JH

^ (Γ m Cl “* ,, •r-i p- L OOt— Or“r— T“r-“T— r— O |_|

—1 5 Μ E

CO

I cn .*: cn 0 3 o

coo -P

ra ή > -p pc I—( <d m ID I—I -p

CO D *H .H

cn -p O

LncOrOT-f^^-r-OOiD r\

^-untorvr^cocoocoCT) cn -rH

iNr-^tNtv.rNrv.rv.actv.1^ tv. ^ •h o cl :o 0

1 JlD *rH

ID --1 Ή . OD

> <—I LO

·<-» :□ -0 >> d :id ω ^ d co c

•rH

^ · E

:θ H :ra C1 E SO £

>iPi OCOCOCOOtOCDOOO P

>1-*: ooocotoococooo r.

tn-ρ -r-fMm-vrLnujr^cocjjo i ~ u * Jg tn ω •H πιο oo

o c -P

P OOOCOOOOOOO O P "P

P „ coaoooocoooco co Oj'm

_^ω ΓΜΝΝΝΝΙΜίΜΝΝΝ CM

-½ — .—t ro

Ό . >, JO

cn ' >,

Ρ ω —I

C -H ° “ ° <a £ --t ^-CNjto^-cncorvcocno-p "z -—I O r- C 03 O -T- l c “5x5

rH (N

22 6 4 6 4 2

Mainittakoon, että edellä olevassa esimerkissä vertailu-aine kiteytyy jäähdytettäessä ympäristön lämpötilaan ( noin 25°C), kun taas entsymaattisesti valmistetut sekundaariset substraatit pysyvät liuoksessa ja niillä on erinomainen varastointistabiili-suus (eivät kiteydy).

'Jutta sekundaarista substraattia voidaan käyttää hyvin stabiilina, ei-kiteytyvänä siirappina elintarvikesovellutuksissa. Se on ainutlaatuisen runsaasti kuiva-ainetta sisältävä koostumus, joka on vastustuskykyinen mikrobien aiheuttamaan kontaminöltumiseen ja väriaineen muodostumiseen nähden.

Uusi erittäin runsaasti kuiva-ainetta sisältävä sekundaarinen substraatti voidaan hydrolysoida, kuten esitetään esimerkissä 7 i.overttisokeriseoksen saamiseksi, jolla on toivottu makeustaso; tämän substraatin kuiva-ainepitoisuus on noin 70 - 82 % (paino/pai-no) ja substraatti koostuu olennaisesti glukoosista ja polysakkari-dipolymeereistä, D?2:ta ja DP^tta. Pienehkö määrä (4,1 % ja alle ) DP^-polymeerejä on myös läsnä.

Vaikka tämän keksinnön mukaista transfruktosylointivaihetta on kuvattu panoksittaan tapahtuvien yksikköprosessien muodossa,ammattimiehelle on selvää, että voidaan käyttää samoin jatkuvatoimisia yksikköprosesseja. Toteutettaessa sellaista jatkuvaa transfrukto-sylointia transfruktosylaasi-entsyymi tavanomaisesti immobilisoi-daan käyttäen tekniikkaa, jota tarkasteltiin aikaisemmin immobili-soidun entsyymin määritelmän kohdalla ja käyttäen tällöin kuvattua jatkuvaa menetelmää.

Claims (5)

23 64642

1. Menetelmä vähintään 55 paino-% fruktoosia sisältävän sakkaridituotteen valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää seuraa-vat vaiheet: 1. sakkaroosin käsittely glukoosia, fruktoosia ja polysakkarideja sisältävän seoksen muodostamiseksi, 2. kohdassa 1) muodostuneen seoksen mahdollinen käsittely isomeraasi-entsyymillä, jotta glukoosi isomeroituu fruktoosiksi, ja 3. kohdassa 1) muodostuneiden polysakkaridien hydrolyysi olosuhteissa, joissa ei ole läsnä aktiivia isomeraasientsyymiä, tunnettu siitä, että kohdassa 1) sakkaroosi, jonka alkupitoisuus on ainakin 10 % (paino/tilavuus), käsitellään Pullu-laria pullulans-raikro-organismista saadulla fruktosyylitransferaa-si-entsyymillä lämpötilassa 25 - 65°C ja pH:ssa 4,5 - 6,5, jotta saadaan glukoosia, fruktoosia ja polysakkarideja käsittävä tuote, jolloin polysakkarideissa on ainakin 66 paino-% fruktosyyliosaa, ja jolloin fruktosyyliosat on sidottu (2-1)-/5-sidoksilla.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että käsiteltävän sakkaroosin pitoisuus on vähintään noin 20 % (paino/tilavuus).

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isomerointi suoritetaan käyttäen immobili-soitua glukoosi-isomeraasi-entsyymiä.

4. Patenttivaatimusten 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polysakkaridit erotetaan fysikaalisesti glukoosista ja fruktoosista ennen hydrolyysiä.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että polysakkaridit erotetaan ultrasuodattamalla.