DK172373B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af sukkerforbindelser - Google Patents

Description

DK 172373 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af sukkerforbindelser, ved hvilken fremgangsmåde glucose og en sukkeralkohol bindes sammen i narværelse af en α-glucosidase. Mere specifikt angår opfindelsen en fremgangsmåde til let og effektivt at 5 danne en sukkerforbindelse, der består af glucose og en sukkeralkohol bundet til hinanden ved en enzymreaktion ved at bringe glucose og en sukkeralkohol såsom sorbitol, mannitol, erythritol, xylito, inositol eller lignende sammen og tillade, at en α-glucosidase indvirker derpå.

10 Sukkerforbindelser bestående af glucose og en sukkeralkohol bundet til hinanden fremstilles industrielt ved kemisk at reducere stivelse-afledte sukkere såsom maltose eller sukkersirup.

For eksempel fremstilles α-D-glucopyranosyl-l,4-sorbitol ved kemisk at reducere maltose (maltose: 4-0-a-D-glucopyranosyl-D-glycopyranose) 15 til omdannelse af glucose i en strukturenhed til sorbitol.

Endvidere kan a-D-glucosepyranosyl-l,6-sorbitol fremstilles ved kemisk at reducere isomaltose (6-0-a-D-glucopyranosyl-D-glucopyrano-se); men eftersom isomaltose som sådan er meget dyrt, er det ikke altid egnet som udgangsmateriale til industriel fremstilling af a-D-20 glucopyranosyl-1,6-sorbitol.

På den anden side kan a-D-glucopyranosyl-1,6-sorbitol og a-D-gluco-pyranosyl-1,6-mannitol også fremstilles ved kemisk at reducere et isomalturoseudgangsmateriale (α-D-glucopyranosyl-l,6-fructose) (japansk behandlet patentpublikation; KOKOKU, nr. 57-9472 og 59-36694), 25 men eftersom α-D-glucopyranosyl-l,6-fructose som udgangsmateriale dannes ud fra sucrose (a-D-glucopyranosyl-/5-D-fructofuranosid), vil en industriel proces ifølge de kendte processer behøve 2 trin begyndende med sucrose. Under sædvanlige reduktionsbetingelser vil produktet endvidere omfatte en blanding af α-D-glucopyranosyl-1,6-30 sorbitol og α-D-glucopyranosyl-l,6-mannitol, og disse processer er derfor ikke altid effektive som processer til fremstilling af α-D-glucopyranosyl-l , 6-sorbitol og a-D-glycopyranosyl-1,6-mannitol.

DK 172373 B1 2 I en proces til fremstilling af en sukkerforbindelse ved kemisk binding af sukkere til hinanden er det på den anden side i almindelighed vanskeligt selektivt at styre bindingsstedet og molekylvægten af et reaktionsprodukt. Som felge heraf er en proces til fremstilling 5 af sukkerforbindelser ved en kemisk bindingsreaktion ikke altid effektiv ud fra et industrielt produktionssynspunkt.

For tiden er processer til fremstilling af sukkerforbindelser under anvendelse af enzymer almindeligt anvendt inden for stivelsesindustrien. For eksempel fremstilles høj fructose-majssirup ved isomeri -10 sering med glucoseisomerase; fructooligosaccharider fremstilles ved /3-fructofuranosidases transferasevirkning; isomaltulose fremstilles ved glucosyltransferases transferasevirkning; og galactooligo-saccharider fremstilles ved β-galactosidases transferasevirkning.

Omend der kendes forskellige processer til fremstilling af sukkerfor-15 bindeiser, som er produkter dannet ved binding af glucose og en sukkeralkohol, har disse som beskrevet ovenfor ulemper såsom dyre udgangsmaterialer, høje omkostninger for at opnå et højoprenset produkt fordi reaktionsproduktet er en blanding, og lignende, og sådanne processer er derfor ikke altid industrielt fordelagtige.

20 Den foreliggende opfindelse er tænkt til at tilvejebringe en helt ny fremgangsmåde, som ikke har de ovennævnte ulemper, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at glucose omsættes med en sukkeralkohol i nærværelse af en a-glucosidase.

Ifølge den foreliggende opfindelse er udgangsmaterialerne glucose og 25 en sukkeralkohol såsom sorbitol, mannitol, erythritol, xylitol, inositol eller lignende, hvilke forbindelser er relativt billige og almindeligt tilgængelige. Eftersom der ved den foreliggende opfindelse, der er karakteriseret ved binding af glucose med en sukkeralkohol under anvendelse af α-glucosidase, endvidere hovedsageligt fås en 30 sukkerforbindelse svarende til den sukkeralkoho1, der anvendes som udgangsmateriale, fås den ønskede sukkerforbindelse let i ren form.

Ved den foreliggende fremgangsmåde kan der som udgangssukkeralkoholer anvendes forskellige reducerede monosaccharider såsom sorbitol, DK 172373 B1 3 mannitol, eryhtritol, xylitol, inositol og lignende, og svarende til disse alkoholer fås der slutforbindelser såsom henholdsvis a-D-gluco-pyranosyl-1,6-sorbitol, a-D-glucopyranosyl-1,6-mannitol, a-D-gluco-pyranosylerythr itol, a -D-glucopyranosylxy1itol, cc -D-glucopyranosy1-5 inositol.

Den glucose og de sukkeralkoholer, som anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, behøver ikke nødvendigvis at være af høj renhed; for eksempel kan glucosen indeholde urenheder såsom forskellige oligosaccharider, som dannes under saccharificering af stivelse.

10 Endvidere fremstilles sukkeralkoholer såsom sorbitol og lignende sædvanligvis ved at reducere saccharose, glucose, sukkersirup, xylose og lignende, og anvendelsen af høj toprensede materialer er således ikke nødvendig ved den foreliggende opfindelse.

Som den α-glucosidase, der anvendes ved den foreliggende fremgangs -15 måde, kan der anvendes et hvilket som helst enzym, som spalter en a- I, 4-glycosidbinding til dannelse af glucose, og der kendes for eksempel enzymer dannet af microorganismer hørende til slægterne Strep-tomyces, Saccharomyces eller Bacillus, [J. Jpn. Soc. Starch Sci. Vol 31 (2), side 67, 1984; J. Jpn. Soc. Starch Sci. Vol 34 (4), side 292, 20 1987, Applied and Environmental Microbiology, side 1096, 1979; Can.

J. Microbiol. Vol 33, 1987; Biotechnology Letters Vol 5 (5), side 289; J. Jpn. Soc. Starch Sci. Vol 35 (1), side 69, 1988]. Det bemærkes dog, at de typer enzymer, der anvendes ved den foreliggende opfindelse, ikke er begrænset til de ovennævnte enzymer.

25 Ved fremstilling af en sukkerforbindelse ud fra glucose og en sukkeralkohol ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, fremstilles der først en reaktionsblanding indeholdende glucose og en sukkeralkohol i relativt høj koncentration. Et koncentrationsområde for udgangsmaterialerne i reaktionsblandingen er fra 5 til 100Z efter vægt, for-30 trinsvis fra 20 til 100Z efter vægt, med henblik på at forøge mængden af dannet sukkerforbindelse. Et forhold mellem en sukkeralkohol og glucose i reaktionsblandingen er fra ca. 100:1 til ca. 1:100 efter vægt, fortrinsvis fra 1:10 til 10:1, med henblik på at øge mængden af dannet sukkerforbindelse. Efterhånden som mængden af det enzym, som DK 172373 B1 4 indføres i reaktionsblandingen, øges, øges den mængde sukkerforbindelse, som dannes i eksemplet ifølge opfindelsen.

Reaktionsbetingelser såsom pH, temperatur og lignende ifølge den foreliggende opfindelse kan være såledés, at α-glucosidasen 'oprethol -5 der sin enzymatiske aktivitet; for eksempel kan reaktionsblandingens pH-værdi justeres til fra 4 til 10, især fra 6 til 8. Med hensyn til reaktionstemperaturen udføres reaktionen fortrinsvis ved relativt høj temperatur, så længe enzymets stabilitet ikke går tabt; for eksempel fortrinsvis ved fra 20°C til 70eC. Men hvis der anvendes et termore-10 sistent enzym eller et alkalisk enzym eller surt enzym, er reaktions -betingelserne ikke begrænset til de ovenfor nævnte intervaller.

Ved den foreliggende opfindelse klassificeres reaktionen, der anvender en α-glucosidase, på følgende måde. Et batchsystem, hvor enzymet eller mikrobielle celler indeholdende enzymet indføres direk-15 te i en reaktionsblanding, og et system, hvor enzymet eller mikrobielle celler indeholdende enzymet er immobiliseret, og en reaktions-blanding påføres derpå.

Hvis for eksempel a-D-glucopyranosyl-1,6-sorbitol dannes ud fra glucose og sorbitol under anvendelse af batch-systernet ifølge op-20 findelsen, fastlægges koncentrationen af glucose og sorbitol i reaktionsblandingen til fra 10 til 100X efter vægt, fortrinsvis fra 40 til 100Z efter vægt. Forholdet mellem sorbitol og glucose er fra 1:4 til 4:1 efter vægt, fortrinsvis fra 2:3 til 3:2 efter vægt. Reaktionsblandingens pH-værdi justeres til fra 4 til 10, fortrinsvis fra 25 6 til 8, og der tilsættes for eksempel et kommercielt tilgængeligt a- glucosidaseenzym direkte til blandingen med henblik på at udføre den syntetiske reaktion. I dette tilfælde justeres reaktionstemperaturen på forhånd til fra 20 til 70eC, fortrinsvis fra 40 til 60eC.

Ϊ den i eksemplerne beskrevne enzymreaktion vil den dannede mængde 30 sukkerforbindelse, for eksempel repræsenteret ved a-D-glucopyranosyl-1,6-sorbitol, øges med længere reaktionstid, så længe enzymets aktivitet vedligeholdes.

DK 172373 B1 5

Overraskende nok danner den ovennævnte reaktion endvidere selektivt en sukkerforbindelse såsom α-D-glucopyranosyl-1,6-sorbitol.

Dette betyder, at sukkerforbindelser såsom a-D-glucopyranosyl-1,6-sorbitol kan fremstilles meget let og selektivt ud fra glucose og en 5 sukkeralkohol ved at anvende en enzymreaktion med en α-glucosidase.

En ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen vunden sukkerforbindelse kan let og effektivt udvindes ved at eliminere enzymet, for eksempel under anvendelse af et membranfilter etc., og separere for eksempel a-D-glucosyl-1,6-sorbitol fra udgangsmaterialer såsom glucose og 10 sorbitol etc. under anvendelse af aktivt kul eller en ionbytterhar-piks.

Opfindelsen illustreres nærmere ved nedenstående ikke-begrænsende eksempler.

EKSEMPEL 1 15 En reaktionsblanding omfattende 45 vægtZ glucose, 45 vægtX sorbitol, 25 mM KH2PO4-K2HPO4 buffer (pH 7,4), og 5 mM Ca(N03>2 blev fremstillet i et reagensglas, som derefter blev anbragt i en inkubator, der på forhånd var justeret til 45eC, hvorefter et kommercielt tilgængeligt α-glucosidaseenzym (Sigma) blev sat til reaktionsblandingen 20 indtil en proteinkoncentration på 0,1-500 mg/ml med henblik på at starte reaktionen.

Der blev med mellemrum udtaget prøver, og mængden af a-D-glucopyrano-syl-1,6-sorbitol blev bestemt. Et resultat blev, at når proteinkoncentrationen var 0,8 mg/ml, blev der dannet 2,5 vægtX af produktet 25 efter 20 timer fra reaktionens begyndelse og 5,3 vægtX 80 timer derefter. Hvis på den anden side proteinkoncentrationen var 5,0 mg/ml, blev der dannet en produktmængde på 15,5 vægtX 20 timer fra reaktionens begyndelse og 32,0 vægtX 80 timer derefter.

I den ovenfor nævnte måling blev de udtagne prøver af reaktionsblan-30 ding opvarmet for at standse enzymreaktionen og filtreret med et membranfilter ved centrifugering for at eliminere enzymet. Den pro- DK 172373 B1 6 teinfri reaktionsblanding blev analyseret ved højtryksvæskekromatografi (HPLC) og tyndtlagskromatografi (TLC), og resultatet heraf blev, at produktet blev bekræftet at være det samme som en kommercielt tilgængelig eller kemisk syntetiseret standardforbindelse.

5 Endvidere blev produktets struktur analyseret under anvendelse af NMR, og det blev bekræftet, at det var det samme som en kommercielt tilgængelig eller kemisk syntetiseret standardforbindelse.

I de nedenstående eksempler blev produkterne analyseret på samme måde som beskrevet ovenfor.

10 EKSEMPEL 2

Der blev anvendt de samme betingelser som i eksempel 1 med undtagelse af, at der i stedet for glucose og sorbitol blev anvendt 27 vægtX glucose og 27 vægtX mannitol, og at mængden af a-glucopyranosyl-1,6-mannitol blev målt. Ved en proteinkoncentration på 0.2 mg/ml var 15 mængden 0,5% efter 20 timer og 2,0% efter 80 timer.

EKSEMPEL 3

Der blev anvendt de samme betingelser som i eksempel 1 med undtagelse af, at der i stedet for glucose og sorbitol blev anvendt glucose (40%) og erythritol (40%), glucose (40%) og xylitol (40%) eller 20 glucose (25%) og inositol (25%), og at mængderne af de dannede sukkerforbindelser blev målt. Ved en proteinkoncentration på 1,0 mg/ml blev der 80 timer efter reaktionens begyndelse dannet henholdsvis glucopyranosylerythritol (7,0%), glucopyranosylxylitol (6,0%) og glucopyranosylinositol (4,5%). Tallene i parentes angiver procentkon-25 centrationer efter vægt.

Som sukkerforbindelser dannet ved binding af glucose og en sukkeralkohol ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan der nævnes a-D-gluco-pyranosyl-l,6-sorbitol og a-D-glucopyranosyl-1,6-mannitol. Disse forbindelser udmærker sig ved, at de har anti-karies-effekt (lav 30 kariesdannende evne) og modstandsdygtighed over for fordøjelse (lav kalorieindhold) og derfor er nyttige som sødemidler.

DK 172373 B1 7

Ud over de ovennævnte egenskaber er forbindelserne, eftersom de er mindre hygroskopiske, endvidere egnede til anvendelse i chokolade, småkager, kiks og "tabletted cake". I modsætning til sukkersirup, maltose og lignende er de endvidere fordelagtige ved, at bearbejde-5 ligheden kan forbedres, eftersom sukkerforbindelserne er terinostabi-le, og tidspunktet for tilsætning samt opvarmningstemperaturen ikke er begrænset.

Som det kan ses af det ovenstående, har sukkerforbindelserne bestående af glucose og en sukkeralkohol, der er bundet til hinanden, for-10 skellige nyttige egenskaber ud fra et industrielt synspunkt sammenlignet med fra stivelse afledte sukkere såsom glucose, sukkersirup, maltose, pulveriseret maltdextrin, højfructose-majssirup og lignende. Eftersom disse sukkerforbindelser endvidere er mindre assimiler-bare for svampe (Penicillium, gul Aspergillus, sort Aspergillus, 15 Mucor) og gærarter samt enzymer, når de anvendes i mælkesyreholdige drikkevarer, fermenterede fødevarer samt våde fødevarer såsom pickles, kager og lignende, kan de inhibere fermentering, forlænge produktets holdbarhed og forbedre produktets lagerstabilitet.

Claims (4)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en sukkerforbindelse, kendetegnet ved, at glucose og en sukkeralkohol bindes til hinanden i nærværelse af en a-glucosidase. DK 172373 B1

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at sukkerforbindelsen er en a-D-gluco-pyranosyl-sukkeralkoholforbindelse.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der som sukkeralkohol anvendes sorbi-10 tol, mannitol, erythritol, xylitol eller inositol, og at der tilsvarende dannes henholdsvis a-D-glucopyranosyl-l,6-sorbitol, a-D-glucopyranosy1-1,6-mannitol, α-D-glucopyranosylerythritol, α-D-gluco-pyranosylxylitol eller α-D-glucopyranosylinositol.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 15 kendetegnet ved, at α-glucosidasen er en, som dannes af en mikroorganisme hørende til slægten Streptomyces, Saccharomyces eller Bacillus.