JP3512623B2 - エチル−α−Ｄ−グルコシドの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はエチル−α−Ｄ−グ
ルコシドの効率的な高純度製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】エチル−α−Ｄ−グルコシドは調理食品
のうまみや濃厚味に関与する呈味成分であり、グルコー
ス様のさわやかな甘味と独特の苦味を有しており、清酒
やみりん中にも微量に含まれている成分である。従来、
エチル−α−Ｄ−グルコシドの製造法として、シゾサッ
カロミセス・ポンベを、糖質を含有するエタノール溶液
に作用させる方法（特公平５−５６９５８号）または、
アスペルギルス・ニガー由来のα−グルコシダーゼを糖
質含有するエタノール溶液に作用させる方法（特公平６
−３０６０８号）が知られている。しかしながら、これ
らの方法で得られたエチル−α−Ｄ−グルコシドの純度
言い換えれば、糖組成に対する含量は、いずれも低く、
高純度にするためにはさらに分離操作が必要である。例
えば、マルトースを基質として使用した場合には、比較
的高純度のエチル−α−Ｄ−グルコシドが得られるが、
その場合においても糖組成に対する含量は５０％以下で
ある。また、いずれの方法においてもエチル−α−Ｄ−
グルコシドの製造に際しては、糖質を含有するエタノー
ル溶液の調製が必要不可欠である。一般に、エタノール
に対する糖質の溶解度は低く、従ってエタノール濃度が
高くなればなるほど、基質として利用可能な糖質濃度は
低下するという欠点を有している。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、アル
コール発酵能を有する微生物と、基質として使用する糖
質に応じた酵素剤を使用することにより、従来の方法の
欠点を克服した高純度で効率的なエチル−α−Ｄ−グル
コシドの新規製造方法を提供するものである。

【０００４】

【課題を解決する手段】本発明者らは、エタノールと、
糖質、例えば、マルトースにα−グルコシダーゼを作用
させたときに生じるエチル−α−Ｄ−グルコシドの生成
機構を詳細に検討した結果、従来言われていたマルトー
ス１分子から、１分子のグルコースと、エタノールのグ
ルコース転移によりエチル−α−Ｄ−グルコシド１分子
が直接生成されるのではなく、マルトースから、α−グ
ルコシダーゼのα−１,６−グルコシル転移活性によ
り、一度イソマルトースが生成された後、このイソマル
トースからグルコースと、エタノールのグルコース転移
により、エチル−α−Ｄ−グルコシドが生成されるとい
う新事実を見出した。そこで、α−グルコシダーゼによ
るエチル−α−Ｄ−グルコシドの効率的で、高純度な製
造方法について鋭意研究を重ねた結果、酵素反応溶液中
でアルコール発酵能を有する微生物、例えば、醸造用酵
母を嫌気的に培養することにより、酵素反応により生じ
たグルコースを消費させると共に、アルコール発酵を行
い、生じたエタノールと酵母によって資化されずに残存
するイソマルトース等のオリゴ糖から酵素反応により、
エチル−α−Ｄ−グルコシドを生成させることに成功し
た。さらに、この過程で生じるグルコース等は、共存す
る酵母が資化することによって、夾雑する糖類の非常に
少ない高純度のエチル−α−Ｄ−グルコシド製造技術を
確立し、本発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち、本発明は、アルコール発酵能を
有する微生物の共存下で糖類、デンプンまたは、その分
解物にα−１,６−グルコシル転移活性を有する酵素、
または、この酵素とアミラーゼ剤を作用させることを特
徴とするエチル−α−Ｄ−グルコシドの製造方法であ
る。好ましくは、該アルコール発酵能を有する微生物が
醸造用酵母であり、α−１,６−グルコシル転移活性を
有する酵素がα−グルコシダーゼである。糖類、デンプ
ンまたは、その分解物としては、グルコース、マルトー
ス、イソマルトース、その他オリゴ糖またはそれらを含
む物質が挙げられる。本発明には、本発明の方法で得ら
れたエチル−α−Ｄ−グルコシド含有物も包含される。

【０００６】

【発明の実施の形態】用いる糖類、デンプンまたはその
分解物としては、グルコース、マルトース、イソマルト
ース、パノース、その他オリゴ糖または、それらの混合
液、例えば、市販のオリゴ糖混合液（商品名：イソマル
ト５００ 昭和産業株式会社製，商品名：イソマルト９
００ 昭和産業株式会社製）や、水飴等が使用できる。
また、清酒醸造で通常よく使用される米粉糖化液も好適
に使用される。場合によっては、本発明の方法を実施す
る反応液中にデンプンとアミラーゼ剤等の液化および糖
化酵素を加え、糖化液を該反応液中で直接調製してもよ
い。

【０００７】本発明における微生物は、アルコール発酵
能を有するものであれば特に限定されないが、アルコー
ル発酵能の高さ、アルコール耐性の強さの観点からみて
醸造用酵母、例えば、清酒酵母、ワイン酵母、ビール酵
母等が望ましい。本発明の反応に使用できる酵素は、α
−１,６−グルコシル転移活性を有する酵素であるが、
中でも糸状菌由来のα−グルコシダーゼ、例えば、アス
ペルギルス・オリゼまたは、アスペルギルス・ニガー由
来の酵素がアルコール耐性および安定性の観点からみて
好適である。酵素は当該糸状菌を液体培養または固体培
養することにより得られる粗酵素を直接使用することも
可能である。ただし、グルコアミラーゼは収率低下の原
因になる可能性があるため、あまり多く含有しない方が
望ましい。よって、酵素は精製された酵素の方が望まし
い。また、市販のα−グルコシダーゼ酵素剤（商品名：
α−グルコシダーゼ「アマノ」 天野製薬株式会社製）
を用いてもよい。さらに、可能であればα−グルコシダ
ーゼ遺伝子が組み込まれた糸状菌の形質転換体、例え
ば、アスペルギルス・オリゼのα−グルコシダーゼをセ
ルフクローニングした組換体（特開平９−９９６８号）
を利用することにより、１００倍以上の効率的な酵素の
調製が期待できる。また、利用する糖類がオリゴ糖混合
液または米粉糖化液などのように比較的重合度の高いオ
リゴ糖、例えば、５糖類以上の糖を含有する場合にはα
−グルコシダーゼ単独よりもむしろ、α−アミラーゼを
共存させる方が、α−グルコシダーゼが作用しやすい２
糖類、３糖類の含量が増加するため、エチル−α−Ｄ―
グルコシドの収率が増加する。

【０００８】作用条件は特定ではないが、例えば、醸造
用酵母とα−グルコシダーゼを使用した場合、反応温度
は酵母が生育しうる範囲、すなわち、１０〜３７℃であ
り、好適には２５〜３０℃である。反応液のpＨは、酵
母培養と酵素反応のいずれに関してもpＨ４.０〜７.０
であり、好ましくはpＨ４.５〜５.５である。また、酵
母培養は、酵素添加に先立って行ってもよいし、酵素反
応と同時に行ってもエチル−α−Ｄ−グルコシドの生成
効率には影響を与えない。ここで酵母培養に際して、次
の点に注意しなければならない。すなわち、米粉糖化液
等のように、糖化液中に酵母の生育に必須な窒素源およ
び微量成分が含まれている場合には、酵母をそのまま反
応液中に植菌してもよいが、生育に必要な成分を含まな
い基質、例えば、高純度のマルトース等を用いる場合に
は、必要に応じて窒素源、例えば、酵母エキス、ポリペ
プトン等や、無機塩類、例えばリン酸、のマグネシウ
ム、カリウム、カルシウム等を反応液中に添加すること
が望ましい。反応液中の基質濃度は、例えば、マルトー
スを基質とした場合には、５〜３０％（重量％、以下同
じ）であり、好ましくは１０〜２０％である。米粉糖化
液を使用する場合にも糖成分含量は、１０〜２０％が好
ましい。さらに基質添加は１回とは限らない。エチル−
α−Ｄ−グルコシドの生成量、グルコース残存量あるい
はイソマルトース残存量等をＨＰＬＣを用いて分析モニ
タリングすることにより、適宜例えば、２〜３日間隔で
添加することにより、高純度のエチル−α−Ｄ−グルコ
シドを維持したまま生成量を増加することが可能とな
る。酵素添加量は、キッコーマン社製のα−グルコシダ
ーゼ測定キットを用いた活性単位（Ｕ）によると、基質
（マルトース）グラムあたり０.５〜２.５Ｕを添加した
結果、１.０Ｕ／ｇ・マルトースで十分効率的にエチル
−α−Ｄ−グルコシドを生成しうることが判明した。

【０００９】反応終了後の溶液中には、糖質の濃度また
は添加回数にもよるが２〜８％濃度で、純度９０％以上
のエチル−α−Ｄ−グルコシドが含まれている。この溶
液から通常使用されている遠心分離等の操作により、酵
母を除去することにより、高純度エチル−α−Ｄ−グル
コシド含有発酵液が得られる。この発酵液は、食品の呈
味剤としてそのまま使用できる。また、蒸留、エバポレ
ーター、濃縮遠心等を行うことにより、簡単にエタノー
ルを除去したエチル−α−Ｄ−グルコシド含有液が得ら
れる。さらに必要に応じて活性炭処理、イオン交換クロ
マトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、濃縮等の操
作を適宜組み合わせることにより、高純度エチル−α−
Ｄ−グルコシド高含有シロップが調製できる。このシロ
ップを食品、飲料、酒類に添加することにより甘味、苦
味、風味の呈味性改良に利用することができる。例え
ば、清酒にこのシロップを添加したサンプルのきき酒試
験を行ったところ、速効性の甘味と遅効性の苦味、渋味
を指摘する意見が得られ、従来のグルコースの甘味とは
明らかに異なるさわやかな甘味、苦味を合わせ持つ清酒
が提供できることが判明した。

【００１０】基質として１０％マルトース、酵母生育の
窒素源として０.５％ポリペプトンを含む溶液に、アス
ペルギルス・オリゼ由来のα−グルコシダーゼを１.０
Ｕ／ｇ−マルトースの濃度で酵素反応させたときの糖成
分の消長について経時的分析をＨＰＬＣで行った。その
結果を図１〜４に示す。反応前の糖質は、図１に示すよ
うにマルトースのみである。まず、酵素のα−１,４加
水分解によりグルコースが、また、α−１,６転移反応
によりイソマルトース，パノース等がすみやかに生成さ
れる（図２）。この反応は、はじめからエタノールが共
存する場合においても、エチル−α−Ｄ−グルコシドの
生成に先だって行われることが判明した。つぎに、生じ
たグルコースを炭素源として酵母の生育およびアルコー
ル発酵が行われるため、グルコースが消費されてくる。
この時イソマルトース、パノース等は酵母の資化能がな
いため減少しない。グルコースの減少に伴いアルコール
が生成されてくると、ついで酵素作用によりイソマルト
ースからエタノールへの１分子配糖化が起こり、１分子
のエチル−α−Ｄ−グルコシドと、グルコース１分子が
同時に生成される（図３）。ここで生じたグルコースも
また酵母のアルコール発酵に利用されて減少してくる。
以上の作用が、本発明の反応液中で同時に並行して行わ
れた結果、図４に示すように、高純度のエチル−α−Ｄ
−グルコシドが製造できる。

【００１１】

【実施例】つぎに、実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。 実施例１ 米粉糖化液を原料としたエチル−α−Ｄ−グルコシドの
製造 原料に用いた米粉糖化液は以下のようにして調製した。
米粉糖化液を１リットル調製する場合、１.２リットル
の蒸留水に、３ｇのＣａＣｌ₂を溶解し、その溶液に６
００ｇの米粉を加えて米粉懸濁液を調製した。この米粉
懸濁液に、コクゲン（大和化成株式会社製）を４ｇ添加
し、９５℃３０分の条件で液化を行った。放冷後、α−
グルコシダーゼ「アマノ」（天野製薬株式会社製）を７
０mgとビオザイムＭ（天野製薬株式会社製）を１３０mg
添加し、５８℃で１晩糖化を行った。この糖化液を８,
０００ｒｐｍ，１０分遠心分離し、上清を得た。得られ
た上清をさらに濾紙（商品名：Ｎｏ.５Ｃ アドバンテ
ック東洋株式会社製）で濾過を行い、１２１℃、１５分
間オートクレーブして酵素を失活させて、今回原料とし
て用いた米粉糖化液とした。この米粉糖化液の糖成分を
ＨＰＬＣを用いて分析したところ、グルコース３６ｍｇ
／ｍｌ、マルトース４１ｍｇ／ｍｌ、イソマルトース２
６ｍｇ／ｍｌ、マルトトリオース１９ｍｇ／ｍｌ、パノ
ース３４ｍｇ／ｍｌを含んだものであった。

【００１２】エチル−α−Ｄ−グルコシド製造に用いた
酵素製剤の調製方法を以下に示す。上記したアスペルギ
ルス・オリゼのα−グルコシダーゼをセルフクローニン
グした組換体（特開平９−９９６８号）を３０℃で３日
間フスマ培養（２００ｇフスマ）を行った。フスマ培養
物を１リットルの温水に浸して３０℃で３時間振とう
し、これを圧搾機にかけてフスマ抽出液を調製した。こ
の抽出液をポアサイズ０.４５μmのフィルターで濾過
し、限外濾過濃縮後、凍結乾燥を行って、粗酵素製剤を
調製した。この方法により粗酵素製剤を６ｇ取得した。
この粗酵素製剤のα−グルコシダーゼ活性をキッコーマ
ン社製のα−グルコシダーゼ測定キットを用いて測定し
たところ、２.２１Ｕ／ｇ−フスマであった。上記の米
粉糖化液１リットルに対して、酵素製剤を１.０Ｕ／ｇ
・マルトースとなるように添加し、さらにあらかじめ培
養しておいた醸造用酵母（協会７号酵母）を２×１０⁷
個／mlになるように添加して３０℃で静置培養を行っ
た。図５に、反応液中の糖成分の消長をＨＰＬＣによっ
て分析した結果と、全糖組成に対するエチル−α−Ｄ−
グルコシド純度の推移を示す。図５から明らかなよう
に、米粉糖化液を基質としてアスペルギルス・オリゼ由
来のα−グルコシダーゼを酵母共存下で作用させたとき
に、１３日目で４２.６６mg／mlの濃度のエチル−α−
Ｄ−グルコシドを含んだ溶液を取得することができた。
また、その溶液は、全糖組成に対して純度９８.１％と
極めて高純度にエチル−α−Ｄ−グルコシドを含むもの
であった。

【００１３】実施例２ マルトースを基質としたエチル−α−Ｄ−グルコシドの
製造 ５％グルコース、０.５％イーストエキス（ＤＩＦＣＯ
社製）ならびに１％バクトペプトン（ＤＩＦＣＯ社製）
を含む培地５リットルに、あらかじめ培養していた清酒
酵母（協会７号酵母）を１×１０⁶個／mlになるように
植菌し、２５℃で２日間静置培養した。培養後の培地
に、５００ｇのマルトース１水和物（和光純薬工業株式
会社製）と、実施例１で用いた粗酵素製剤を１.０Ｕ／
ｇ−マルトースになるように添加し、２５℃で静置培養
を行った。製造期間中は、培養液中の糖成分をＨＰＬＣ
を用いて分析し、エチル−α−Ｄ−グルコシドの生成
量、グルコース残存量あるいはイソマルトース残存量等
を指標に、３、５、８日目に５００ｇのマルトース１水
和物を添加した。図６に、反応液中の糖成分の消長をＨ
ＰＬＣによって分析した結果と、全糖組成に対するエチ
ル−α−Ｄ−グルコシド純度の推移を示す。図６から明
らかなように、マルトースを基質としてアスペルギルス
・オリゼ由来のα−グルコシダーゼを酵母共存下で作用
させ基質のマルトースを適宜加えていくと、エチル−α
−Ｄ−グルコシドの生産量が平衡化することなく良好に
増加し、１８日目で５４.４２mg／mlの濃度のエチル−
α−Ｄ−グルコシドを含んだ溶液を取得することができ
た。また、その溶液は、全糖組成に対して純度９３.７
３％と極めて高純度にエチル−α−Ｄ−グルコシドを含
むものであった。また、この反応液にさらに基質である
マルトースを添加していくと、酵母の生育が極端に低下
しない限りさらなるエチル−α−Ｄ−グルコシドの生産
が期待できる。

【００１４】

【発明の効果】以上記載したごとく、本発明によれば、
エチル−α−Ｄ−グルコシドを安価で多量にしかも非常
に高純度で工業生産が可能となる。また、特別な反応装
置も必要としないで製造できる。エチル−α−Ｄ−グル
コシドは、記述通り甘味と苦味を合わせ持つ特徴的な呈
味成分であるにもかかわらず、有効な高純度大量生産法
がなかったため、これまでほとんど食品、飲料、酒類に
利用されていなかったが、今後本発明により広く食品、
酒類全般に利用されることが期待できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 基質として１０％マルトース、酵母生育の窒
素源として０.５％ポリペプトンを含む溶液に、アスペ
ルギルス・オリゼ由来のα−グルコシダーゼを１.０Ｕ
／ｇ−マルトースの濃度で酵素反応させたときの糖成分
の消長について経時的分析をＨＰＬＣで行った時の、反
応前の基質の状態を示すクロマトグラムである。

【図２】 上記ＨＰＬＣ分析におけるα−１,４加水分
解、α−１,６転移反応による糖成分の消長を示すクロ
マトグラムである。

【図３】 上記ＨＰＬＣ分析におけるイソマルトースか
らエタノールへの１分子配糖化を示すクロマトグラムで
ある。

【図４】 上記ＨＰＬＣ分子における最終段階のクロマ
トグラムである。

【図５】 実施例１における、反応液中の糖成分の消長
をＨＰＬＣによって分析した結果と、全糖組成に対する
エチル−α−Ｄ−グルコシド純度の推移を示すグラフで
ある。

【図６】 実施例２における、反応液中の糖成分の消長
をＨＰＬＣによって分析した結果と、全糖組成に対する
エチル−α−Ｄ−グルコシド純度の推移を示すグラフで
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 熊谷 知栄子 兵庫県西宮市今津出在家町４番９号 大 関株式会社総合研究所内 (56)参考文献 特開 昭54−157897（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−58488（ＪＰ，Ａ) 特開 平11−243940（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 19/00 - 19/64 C12G 3/00 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) 食品関連文献情報（食ネット) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アルコール発酵能を有する微生物の共存
   下で糖類、デンプンまたはその分解物にα−１,６−グ
   ルコシル転移活性を有する酵素または、この酵素とアミ
   ラーゼ剤を作用させることを特徴とするエチル−α−Ｄ
   −グルコシドの製造方法。
2. 【請求項２】 アルコール発酵能を有する微生物が醸造
   用酵母である請求項１記載のエチル−α−Ｄ−グルコシ
   ドの製造方法。
3. 【請求項３】 α−１,６−グルコシル転移活性を有す
   る酵素がα−グルコシダーゼである請求項１記載のエチ
   ル−α−Ｄ−グルコシドの製造方法。
4. 【請求項４】 糖類、デンプンまたは、その分解物とし
   て、グルコース、マルトース、イソマルトース、その他
   オリゴ糖またはそれらを含む物質を使用する請求項１記
   載のエチル−α−Ｄ−グルコシドの製造方法。
5. 【請求項５】 請求項１、２、，３または４記載の方法
   で得られたエチル−α−Ｄ−グルコシド含有物。