FI64642C - FRAMEWORK FOR FRUIT PROCESSING IN ENCLOSURE FRUIT INSIDE PRODUCTS - Google Patents
FRAMEWORK FOR FRUIT PROCESSING IN ENCLOSURE FRUIT INSIDE PRODUCTS Download PDFInfo
- Publication number
- FI64642C FI64642C FI781911A FI781911A FI64642C FI 64642 C FI64642 C FI 64642C FI 781911 A FI781911 A FI 781911A FI 781911 A FI781911 A FI 781911A FI 64642 C FI64642 C FI 64642C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- enzyme
- fructose
- glucose
- sucrose
- polysaccharides
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
- C08B37/0051—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Fructofuranans, e.g. beta-2,6-D-fructofuranan, i.e. levan; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C13—SUGAR INDUSTRY
- C13K—SACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
- C13K11/00—Fructose
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Jellies, Jams, And Syrups (AREA)
- Storage Of Fruits Or Vegetables (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
f:,ίγ,r., kuulutusjulkaisu . Λ , . 0 ^ΒΙ *11) UTLÄGGNINGSSKRIFT 6 4 642 ?SS| c (45) ::: 13 1733 ' (51) Kv.ik.^int.ci.3 C 12 Ρ 19/18. C 12 Ν 9/10 // σ 13 κ 11/00 SUOMI — FINLAND (11) p»tw'«lt'»k«'nu* — P*t*nt»n»eicnlng T81911 (22) Hikemliptlvl — AmWuiln|tdag 25.06.78 (FI) (23) Alkupilvi—Glltlghetsdag 15-06. 78 (41) Tullut {ulklsukst — Bllvlt offtntllg 17-12.78f:, ίγ, r., advertisement publication. Λ,. 0 ^ ΒΙ * 11) UTLÄGGNINGSSKRIFT 6 4 642? SS | c (45) ::: 13 1733 '(51) Kv.ik. ^ int.ci.3 C 12 Ρ 19/18. C 12 Ν 9/10 // σ 13 κ 11/00 FINLAND - FINLAND (11) p »tw '« lt' »k« 'nu * - P * t * nt »n» eicnlng T81911 (22) Hikemliptlvl - AmWuiln | tdag 25.06.78 (FI) (23) Alkupilvi — Glltlghetsdag 15-06. 78 (41) Tullut {ulklsukst - Bllvlt offtntllg 17-12.78
Patentti· la rekisterihallitus .... „_______ . , . , _ * (44) Nlhtmktlpanon I» kuul.|ulkatsun pvm.— _ 0Patent · la Registry Board .... „_______. ,. , _ * (44) Nlhtmktlpanon I »heard | date of appearance— _ 0
Patent-OCh registerttyrelsen An*ök*n uttigd och utl.jkrlften publkerad 31-0O-Ö3 (32)(33)(31) etuoikeus—Begird prlorltet 16.06.77 USA(US) 807289 (71) CPC International, Inc., International Plaza, Englewood Cliffs,Patent Office of the United States of America Patent Application No. 31-0O-Ö3 (32) (33) (31) Privilege — Begird Prlorltet 16.06.77 U.S. Pat. No. 807,289 (71) CPC International, Inc., International Plaza, Englewood Cliffs,
New Jersey 07632, USA(US) (72) Robert E. Heady, Argo, Illinois, USA(US) (7*0 Oy Kolster Ab (5*0 Menetelmä runsaasti fruktoosia sisältävän sakkaridituotteen valmistamiseksi - FÖrfarande för framställning av en rikligt fruktos in-nehällande sackaridprodukt Tämä keksintö koskee menetelmää vähintään 55 paino-% fruktoosia sisältävän sakkaridituotteen valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: 1) sakkaroosin käsittely glukoosia, fruktoosia ja polysakkarideja sisältävän seoksen muodostamiseksi, 2) kohdassa 1) muodostuneen seoksen mahdollinen käsittely isomeraasi-entsyymillä, jotta glukoosi isomeroituu fruktoosiksi, ja 3) kohdassa 1) muodostuneiden polysakkaridien hydrolyysi olosuhteissa, joissa ei ole läsnä aktiivia isomeraasientsyymiä.New Jersey 07632, USA (72) Robert E. Heady, Argo, Illinois, USA (7 * 0 Oy Kolster Ab (5 * 0 Method for preparing a fructose-rich saccharide product - Förrarande för framställning av en rikligt fruktos in This invention relates to a process for preparing a saccharide product containing at least 55% by weight of fructose, which process comprises the following steps: 1) treating sucrose to form a mixture containing glucose, fructose and polysaccharides, 2) optionally treating the mixture formed in 1) with an isomerase enzyme, glucose isomerizes to fructose, and 3) hydrolysis of the polysaccharides formed in 1) under conditions in which no active isomerase enzyme is present.
Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että kohdassa 1) sakkaroosi, jonka alkupitoisuus on ainakin 10 % (paino/ tilavuus), käsitellään Pullularia pullulans-mikro-organismista saadulla fruktosyylitransferaasi-entsyymillä lämpötilassa 25 - 65°CThe process according to the invention is characterized in that in step 1) sucrose with an initial content of at least 10% (w / v) is treated with the enzyme fructosyltransferase obtained from the microorganism Pullularia pullulans at a temperature of 25 to 65 ° C
2 64642 ja pH:ssa 4f5 - 6,5, jotta saadaan glukoosia, fruktoosia ja polysakkarideja käsittävä tuote, jolloin polysakkarideissa on ainakin 66 paino-% fruktosyyliosaa, ja jolloin fruktosyyliosat on sidottu {2 -1) - /2>-sidoksilla.2,64642 and at pH 4f5 to 6.5 to obtain a product comprising glucose, fructose and polysaccharides, wherein the polysaccharides contain at least 66% by weight of fructosyl moieties and wherein the fructosyl moieties are linked by {2 -1) - / 2> bonds.
Tämä menetelmä tarjoaa uuden entsymaattisen tavan runsaasti fruktoosia sisältävien siirappien valmistamiseksi, joiden fruktoo-sipitoisuus on merkittävästi korkeampi kuin on saavutettavissa tärk-keiyshydrolysaattien glukoosi-isomeroinnilla, tarvitsematta erottaa fysikaalisesti tuloksena muodostuvaa fruktoosilopputuotetta. Tämä menetelmä on erityisesti sopiva runsaasti fruktoosia sisältävien fruktoosisiirappien valmistamiseksi.This method provides a new enzymatic way to prepare fructose-rich syrups with a significantly higher fructose content than is achievable by glucose isomerization of starch hydrolysates without having to physically separate the resulting fructose end product. This method is particularly suitable for the preparation of fructose-rich fructose syrups.
Keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan valmistaa lukuisia tuotteita. Näitä ovat pääasiassa tai runsaasti fruktoosia sisältävä siirappi sekä erilaiset välituotteet, kuten fruktoosipolymeeri, primäärinen fruktoosipolymeeriä (tai polysakkaridia) sisältävä substraatti, substraatti, josta polymeeri on poistettu ja substraatti (polymeerin kanssa tai ilman sitä) isomeroinnin jälkeen. Jokaisella näistä tuotteista on tavanomaisten sokerien ja siirappien ominaisuudet, ja tuotteita voidaan käyttää niiden tavanomaisissa sovellutuksissa. Näitä ovat esim. käyttö ruo'an makeutusaineina ja raaka-aineina farmaseuttisten aineiden valmistuksessa. Niitä voidaan myös käyttää valmistettaessa sideaineita, kostuttavia aineita, kiillotettua pergamiinipaperia, parkitsemisaineita, sähköeristimiä, valimon keernan sideaineita, hyönteismyrkkyjä, väriaineita ja sen kaltaisia, tai yleisimmin pehmentimiä, sakeutinaineita jne.Numerous products can be prepared by the method according to the invention. These include predominantly or high fructose syrup and various intermediates such as fructose polymer, primary fructose polymer (or polysaccharide) -containing substrate, polymer-depleted substrate, and substrate (with or without polymer) after isomerization. Each of these products has the properties of conventional sugars and syrups and can be used in their conventional applications. These include, for example, use as food sweeteners and raw materials in the manufacture of pharmaceuticals. They can also be used in the manufacture of binders, wetting agents, polished parchment paper, tanning agents, electrical insulators, foundry core binders, insecticides, dyes and the like, or most commonly plasticizers, thickeners, etc.
MääritelmätDefinitions
Alalla yleisessä käytössä olevan vaihtelevan terminologian vuoksi annetaan seuraavat määritelmät käytettyjen termien merkityksestä.Due to the varying terminology commonly used in the art, the following definitions of the meaning of the terms used are given.
Glukoosi ja dekstrooslGlucose and dextrose
Termejä "glukoosi” ja "dekstroosi" käytetään molempia tässä hakemuksessa käsittämään tämän monosakkaridin missä tahansa muodossa liuoksessa tai kuivana.The terms "glucose" and "dextrose" are both used in this application to include this monosaccharide in any form in solution or dry.
Sakkaroosisucrose
Termi "sakkaroosi" koskee tätä disakkaridia puhdistettuna tai käsittelemättömässä muodossa, liuoksessa tai kuivana, joka di-sakkaridi on peräisin mistä tahansa sakkaroosin raaka-ainelähteestä, 3 64642 esim. sokeriruo'öistä tai sokerijuurikkaista. Tätä keksintöä toteutettaessa sakkaroosilähtöainetta käytetään tyypillisesti vesipitoisessa väliaineessa.The term "sucrose" refers to this disaccharide, in purified or untreated form, in solution or dry, which disaccharide is derived from any source of sucrose raw material, 3,646,442 e.g. sugar cane or sugar beet. In the practice of this invention, the sucrose starting material is typically used in an aqueous medium.
Fruktoosi ja levuloosiFructose and levulose
Termejä "fruktoosi" ja "levuloosi" käytetään yleisesti molempia alalla koskemaan sitä isomeeriä, joka on makeampaa kuin glukoosi. Fruktoosia tavataan hunajassa ja inverttisokerissa glukoosin kanssa, ja fruktoosi on arvokasta makeutensa vuoksi. Termejä levuloosi ja fruktoosi käytetään molempia tässä julkaisussa merkitsemään tätä monosakkaridia missä tahansa muodossa, liuoksessa tai kuivana.The terms "fructose" and "levulose" are both commonly used in the art to refer to an isomer that is sweeter than glucose. Fructose is found in honey and invert sugar with glucose, and fructose is valuable because of its sweetness. The terms levulose and fructose are both used in this publication to denote this monosaccharide in any form, solution or dry.
EntsyymivalmisteThe enzyme preparation
Termiä "entsyymivalmiste" käytetään tässä merkitsemään mitä tahansa ainekoostumusta, joka osoittaa haluttua entsymaattista aktiivisuutta. Termiä käytetään merkitsemään esim. eläviä kokonaisia soluja, kuivia soluja, solu-uutteita ja soluista ja viljel-mäliuoksista johdettuja puhdistettuja ja väkevöityjä valmisteita. Entsyymivalmisteita voidaan käyttää joko liuoksena tai immobili-soidussa muodossa toteutettaessa tätä keksintöä.The term "enzyme preparation" is used herein to mean any composition of matter that exhibits the desired enzymatic activity. The term is used to denote, e.g., living whole cells, dry cells, cell extracts, and purified and concentrated preparations derived from cells and culture solutions. Enzyme preparations can be used either in solution or in immobilized form in the practice of this invention.
Isomeraasientsyymiisomerase enzymes
Jokaista entsyymivalmistetta, joka isomeroi glukoosin fruktoosiksi, kutsutaan tässä "isomeraasientsyymiksi". Nämä entsyymit ovat alalla hyvin tunnettuja ja niistä on käytetty nimityksiä deks-troosi-isomeraasi, ksyloosi-isomeraasi ja glukoosi-isomeraaSi. Näitä entsyymejä voidaan johtaa erilaisista sopivista mikro-organismeista, joista esimerkkejä ovat suvut Streptomyces, Bacillus, Arthrobacter, Actinoplanes ja Curtobacterium.Any enzyme preparation that isomerizes glucose to fructose is referred to herein as an "isomerase enzyme." These enzymes are well known in the art and are referred to as dextrose isomerase, xylose isomerase, and glucose isomerase. These enzymes can be derived from a variety of suitable microorganisms, examples of which are the genera Streptomyces, Bacillus, Arthrobacter, Actinoplanes, and Curtobacterium.
Tätä keksintöä toteutettaessa käyttökelpoinen edullisena pidetty isomeraasientsyymi johdetaan kannasta Streptomyces olivo-chromogenes ATCC n:o 21 713, ATCC n:o 21 714 tai ATCC n:o 21 715 (joista jälkimmäinen on ATCC n:o 21 713:n yksittäispesäkkeen iso-laatti), kuten esitetään US-patenttijulkaisussa 3 813 318 ja US-patenttijulkaisussa 3 957 587, erityisesti US-patenttijulkaisussa 3 770 589 tai US-patenttijulkaisussa 3 813 318 kuvatulla tavalla valmistettuna.A preferred isomerase enzyme useful in the practice of this invention is derived from Streptomyces Olivo-chromogenes strain ATCC No. 21,713, ATCC No. 21,714, or ATCC No. 21,715 (the latter being an isolate of a single colony of ATCC No. 21,713). , as disclosed in U.S. Patent No. 3,813,318 and U.S. Patent No. 3,957,587, especially as described in U.S. Patent No. 3,770,589 or U.S. Patent No. 3,813,318.
Viime aikoina on alalla alettu antaa arvoa menetelmille, joissa isomeraasientsyymi immobilisoidaan veteen liukenemattomaan 64642 4 inerttiin kantajaaineeseen. Immobilisoitu entsyymi on sitten sopiva käytettäväksi glukoosin jatkuvassa muuttamisessa runsaasti fruktoosia sisältäväksi siirapiksi. Sellaisten menetelmien esimerkkejä kuvataan US-patenttijulkaisuissa 3 708 397, 3 788 945, 3 850 751, 3 868 304, BE-patenttijulkaisussa 819 859 ja US-patenttijulkaisussa 3 960 663 (BE-patentti n:o 810 480).Recently, methods for immobilizing an isomerase enzyme on a water-insoluble 64642 4 inert carrier have begun to be valued in the art. The immobilized enzyme is then suitable for use in the continuous conversion of glucose to a fructose-rich syrup. Examples of such methods are described in U.S. Patent Nos. 3,708,397, 3,788,945, 3,850,751, 3,868,304, BE Patent No. 819,859, and U.S. Patent No. 3,960,663 (BE Patent No. 810,480).
IsomeraasiyksikkÖ "Isomeraasiyksikkö" määritellään entsyymiaktiiviteetin määränä^ joka tarvitaan tuottamaan yksi mikromooli fruktoosia minuutissa isomerointiolosuhteissa, joita kuvataan tämän jälkeen otsikon "Iso-meraasin aktiviteetin määritys" alla.Isomerase Unit An "isomerase unit" is defined as the amount of enzyme activity required to produce one micromole of fructose per minute under isomerization conditions, hereinafter described under the heading "Determination of Isomerase Activity".
Isomeraasin aktiviteetin määritys Tässä käytettynä tämä termi merkitsee määritysmenettelyä, johon kuuluu glukoosiliuoksesta valmistetun ketoosin spektrofoto-metrisen määrityksen tekeminen standardisoiduissa olosuhteissa. Perusliuos tehdään seuraavalla tavalla: Määritystä varten tehty peruslluosDetermination of Isomerase Activity As used herein, this term refers to an assay procedure involving the spectrophotometric determination of ketose prepared from a glucose solution under standardized conditions. The stock solution is prepared as follows: Stock solution for analysis
Komponentti Määrä 0,1 -m MgS04 . 7 H20 1 ml 0,001-m CoCl2. 6 H20 1 ml 1-m natriumfosfaattipuskuri, pH 7,5 0,5 ml vedetön D-glukoosi 1,44 g lisätään tislattua vettä kokonaistilavuuteen 7,5 ml Määritettävä entsyymivalmiste laimennetaan ensin sisältämään 1-6 isomeraasiyksikköä millilitraa kohti.Component Amount 0.1 -m MgSO 4. 7 H 2 O 1 mL 0.001-m CoCl 2. 6 H 2 O 1 ml 1-m sodium phosphate buffer, pH 7,5 0,5 ml anhydrous D-glucose 1.44 g of distilled water is added to a total volume of 7,5 ml. The enzyme preparation to be determined is first diluted to 1 to 6 isomerase units per ml.
Entsymaattinen isomerointl suoritetaan lisäämällä 1 ml ent-syymivalmistetta 3 ml:aan perusliuosta ja inkuboimalla 30 minuuttia 60°C:ssa, Inkubointijakson lopussa otetaan 1 rol:n määräosa ja säilötään 9 ml:n tilavuuteen 0,5-n perkloorihappoa. Säilötty määräosa laimennetaan sitten 250 ml:n kokonaistilavuuteen. Tarkistuksena vertailun vuoksi tehdään myös glukoosin sokea koe korvaamalla liuoksessa olevan entsyymivalmisteen 1 ml veden 1 ml:11a inkubointi jakson alussa.Enzymatic isomerization is performed by adding 1 ml of enzyme preparation to 3 ml of stock solution and incubating for 30 minutes at 60 ° C. At the end of the incubation period, an aliquot of 1 mol is taken and stored in a volume of 9 ml of 0.5% perchloric acid. The stored aliquot is then diluted to a total volume of 250 ml. As a check for comparison, a blank test for glucose is also performed by replacing the incubation of the enzyme preparation in solution with 1 ml of water with 1 ml at the beginning of the period.
5 646425,64642
Ketoosi määritetään sitten kysteiinirikkihappomenetel-mällä, Tämän määrityksen tarkoituksia varten yksi isomeraasiyk-sikkö määritellään entsyymiaktiviteetin määränä,joka tarvitaan tuottamaan yksi mikromoolilevuloosia kuvatuissa isomerointiolo-suhteissa.Ketose is then determined by the cysteine sulfuric acid method. For purposes of this assay, one unit of isomerase is defined as the amount of enzyme activity required to produce one micromole of levulose under the isomerization conditions described.
Transfruktosylointi Tämä termi tässä käytettynä merkitsee fruktosyyliosan siirtymistä luovuttajalta, esim, sakkaroosilta, vastaanottajalle, esim. polysakkaridille,Transfructosylation As used herein, the term refers to the transfer of a fructosyl moiety from a donor, e.g., sucrose, to a recipient, e.g., a polysaccharide,
Fruktosyylitransferaasientsyymi Tässä käytettynä tämä termi merkitsee mitä tahansa entsyymiä, joka katalysoi transfruktosylointia ja sisältää kannasta Pullularia pullulans ATCC 9348 (synonyymi kannalle Aureobasidium pullulans) johdetun entsyymivalmisteen.Fructosyltransferase Enzyme As used herein, the term refers to any enzyme that catalyzes transfructosylation and includes an enzyme preparation derived from the strain Pullularia pullulans ATCC 9348 (synonymous with the strain Aureobasidium pullulans).
Fruktosyylitransferaasiyksikkö Tässä käytettynä yksi fruktosyylitransferaasiyksikkö määritellään entsyymiaktiviteetin määränä, joka tarvitaan tuottamaan yksi mikromooli pelkistävää sokeria, glukoosiksi laskettuna, minuutissa seuraavissa olosuhteissa: (a) pH 5,5, (b) lämpötila 55°C ja (c) substraatin väkevyys 60 g elintarvikelaatuista sakkaroosia 100 ml kohden vesipitoista reaktioseosta,Fructosyltransferase unit As used herein, one fructosyltransferase unit is defined as the amount of enzyme activity required to produce one micromole of reducing sugar, calculated as glucose, per minute under the following conditions: (a) pH 5.5, (b) temperature 55 ° C and (c) substrate concentration 60 g per ml of aqueous reaction mixture,
Pelkistävän sokerin määritykset (glukoosiksi laskettuna) suoritetaan käyttäen laitetta "Technicon Autoanalyzer II" (Tech-nicon, Inc,, Tarrytown, New York), Analyysi suoritetaan tällä laitteella käytettäväksi muokatulla tavanomaisella alkalinen-fer-risyanidi-menetelmällä, Analytical Biochemistry 45, n:o 2, s. 517-524 (1972), Ellei toisin ole mainittu, entsyymiaktiviteetin määritykset suoritetaan jatkuvasti tarkkailemalla seuraavan koostumuksen omaavaa reaktioseosta: 7,5 ml 8C % (paino/tilavuus) elintarvikelaatuista sakkaroo-sivesiliuosta 2,3 ml 0,1-m sitraattipuskuria, pH 5,5 0,2 ml:n entsyyminäyte, joka sisältää sen määrän fruktosyylitransf eraasientsyymiä, joka tuottaa 5-25 yug pelkistävää sokeria (glukoosiksi laskettuna) minuutissa 1 ml reaktioseota koh- -f- -L-_ ·Reducing sugar assays (calculated as glucose) are performed using a Technicon Autoanalyzer II (Tech-Nicon, Inc., Tarrytown, NY). The analysis is performed by a conventional alkaline-ferricyanide method modified for use with this instrument, Analytical Biochemistry 45, n: o 2, pp. 517-524 (1972). Unless otherwise stated, determinations of enzyme activity are carried out by continuous monitoring of a reaction mixture having the following composition: 7.5 ml of 8C% (w / v) food grade sucrose-aqueous solution 2.3 ml of 0.1- m citrate buffer, pH 5.5 A 0.2 ml enzyme sample containing the amount of fructosyltransferase enzyme that produces 5-25 ug of reducing sugar (calculated as glucose) per minute per 1 ml of reaction mixture per- -f- -L-_ ·
Primaarinen substraatti Tässä käytettynä termi " primaarinen substraatti" merkit- # * 64642 see niitä sakkarideja, jotka ovat sopivassa muodossa ja joiden fruktosyyliosa on käytettävissä osallistumaan transfruktosyloin-tiin, nimittäin sakkaroosin vesipitoiset liuokset.Primary Substrate As used herein, the term "primary substrate" refers to those saccharides that are in a suitable form and whose fructosyl moiety is available to participate in transfructosylation, namely, aqueous solutions of sucrose.
Sekundaarinen substraatti Tässä käytettynä termi ” sekundaarinen substraatti” on reaktiotuote, joka on tuloksena, kun primaariseen substraattiin annetaan vaikuttaa edellä määritellyn fruktosyylitransferaasient-syymin valmisteen.Secondary Substrate As used herein, the term “secondary substrate” is a reaction product that results from the action of a fructosyltransferase enzyme preparation as defined above on the primary substrate.
Osat ja prosentit Tässä hakemuksessa kaikki osat ilmaisevat painoa ja kaikki prosentit ovat painoa tilavuudessa (paino/tilavuus) , ellei nimenomaan ole toisin mainittu,Parts and percentages In this application, all parts are by weight and all percentages are by weight (w / v), unless explicitly stated otherwise,
Korkeapainenestekromatografiahigh pressure
Termi tässä käytettynä määrittelee menettelyn, jossa ;kek--sinnön mukaiset siirapit analysoidaan käyttäen korkeapaineneste-kromatografiaa seuraavan menettelytavan mukaan. Komponentit eristetään kromatografisesti eluoimalla vedellä kalsium-muodossa olevasta kationinvaihtohartsista. Eluoidut komponentit havaitaan differentiaalirefraktometrin avulla, Muut hiilihydraatit kuin dekstroosi määritetään kvantitatiivisesti käyttäen elektronista integraattoria, ja dekstroosi saadaan erotuksena. Yleinen menettelytapa on esitetty julkaisussa "Analysis of Carbohydrate Mixtures by Liquid Chromatography”, Am, Soc, Brew. Chem, Proc., 1973, s. 43-*+6. Käytetty hartsi on kalsium-muodossa oleva "Aminex Q" 15-5, toimittaja Bio-Rad Laboratories, Richmond, California.The term as used herein defines a procedure in which the syrups of the invention are analyzed using high performance liquid chromatography according to the following procedure. The components are isolated by chromatography eluting with water from a cation exchange resin in the form of calcium. The eluted components are detected by a differential refractometer. Carbohydrates other than dextrose are quantified using an electronic integrator, and dextrose is obtained by separation. The general procedure is described in "Analysis of Carbohydrate Mixtures by Liquid Chromatography", Am, Soc, Brew. Chem. Proc., 1973, pp. 43 - * + 6. The resin used is "Aminex Q" in the form of calcium 15-5 , edited by Bio-Rad Laboratories, Richmond, California.
Keksinnön mukainen menetelmä siirappien valmistamiseksi käsittää sen, että primaariseen substraattiin, nimittäin sakkaroosiin, annetaan vaikuttaa fruktosyylitransferaasientsyymin valmisteen, joka kykenee muuttamaan sakkaroosin tuotteeksi, joka koostuu suurehkon määrän glukoosia ja pienehkön määrän fruktoosia sisältävästä monosakkaridifraktiosta ja vähintään 66 paino-% fruktosyy-liosia sisältävistä polysakkarideista. Tuote on tämän keksinnön sekundaarinen substraatti. Sekundaarisen substraatin polysakkarideja ovat kaikki fruktoosia sisältävät polymeerit (muu kuin sakkaroosi), joissa on kaksi tai useampia monosakkaridiosia, Näiden polymeerien voidaan edelleen luonnehtia olevan polysakkarideja, jotka sisältävät (7—^ ]) -^-sidoksilla sidottuja frukto-ryy 1 lomia. Kuten jäljempänä kuva taan , trans f ruktosy'! oinn i.n olosuhteita säätämällä voidaan valmistaa haluttuja polysakkurideja. Niinpä voidaan valmistaa esim, sekundaarinen substraatti, jossa 7 64642 useimmat (esim. vähintään 60 % moolisuhteena) polysakkarideista ovat 2-10 (so, OP 2--10), tavallisimmin 3-6 (so, DP 3-6) monosnk-karidiosaa sisältäviä oligomeereja. Sen jälkeen mainittu glukoosi isomeroidaan (isomeraasientsyymin vaikutuksen avulla) fruktoosiksi mainitun polysakkaridin läsnäollessa, mitä seuraa mainittujen polysakkaridien hydrolyysi olosuhteessa, jossa aktiivista iso-meraasientsyymiä ei ole läsnä, Hydrolyysi voidaan suorittaa entsymaattisesti käyttäen ir.vertaasia tai hapolla hydrolysoimalla lievissä olosuhteissa.The process for preparing syrups according to the invention comprises reacting a primary substrate, namely sucrose, with a fructosyltransferase enzyme preparation capable of converting sucrose into a product consisting of a monosaccharide fraction containing a higher amount of glucose and a lower amount of fructose fructose and at least 66%. The product is a secondary substrate of this invention. Secondary substrate polysaccharides are all fructose-containing polymers (other than sucrose) having two or more monosaccharide moieties. These polymers can be further characterized as polysaccharides containing (7-4) -β-linked fructose groups. As described below, trans f ruktosy '! By adjusting the conditions of oinn i., the desired polysaccharides can be prepared. Thus, for example, a secondary substrate can be prepared in which 7,64642 most (e.g. at least 60% in molar ratio) of the polysaccharides are 2-10 (i.e., OP 2--10), most usually 3-6 (i.e., DP 3-6) monosnk carid moieties containing oligomers. Said glucose is then isomerized (by the action of an isomerase enzyme) to fructose in the presence of said polysaccharide, followed by hydrolysis of said polysaccharides under a condition in which no active isomerase enzyme is present. The hydrolysis can be carried out enzymatically using ir.
Keksinnön lisätoteutusmuodossa polysakkaridit voidaan erottaa glukoosista ja fruktoosista ja sen jälkeen hydrolysoida, kuten edellä kuvattiin, erittäin paljon fruktoosia sisältävän, esim. fruktoosipitoisuuden yli 66 paino-% ja edullisesti yli 90 pai-no-% omaavan siirapin valmistamiseksi suoraan tämän keksinnön mukaisesta sekundaarisesta substraatista tarvitsematta isomeroida substraatissa olevaa glukoosia.In a further embodiment of the invention, the polysaccharides can be separated from glucose and fructose and then hydrolyzed, as described above, to prepare a syrup with a high fructose content, e.g. more than 66% by weight and preferably more than 90% by weight, directly from the secondary substrate of this invention without isomerization. glucose in the substrate.
Erotus voidaan suorittaa mukavasti tavanomaisella molekyy-likokoon perustuvalla fysikaalisella erotustekniikalla, kuten esimerkiksi membraanitekniikalla (esim. ultrasuodatus, dialyysi), liuotinsaostus, hiiliabsorptio ja sen kaltainen.Esimerkkejä mem-braaniteknologian käytöstä ovat amerikkalaiset patenttijulkaisut 3 173 867, Re 26 097, 3 541 006 ja 3 691 068,The separation can be conveniently performed by conventional molecular size-based physical separation techniques, such as membrane techniques (e.g., ultrafiltration, dialysis), solvent precipitation, carbon absorption, and the like. Examples of the use of membrane technology include U.S. Patent Nos. 3,177,867; 3,691,068,
Edullisena pidetty toteutusmuoto on menetelmä runsaasti fruktoosia sisältävien siirappien valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää sen, että sakkaroosiin annetaan vaikuttaa fruktosyyli-transferaasientsyymin valmisteen, joka on johdettu Pullularia pullulans-mikro-organismista, - kuten ATCC 9348, ATCC 12 53 5 , NRRL 1573, NRRL Y2311, NRRL YB3892, NRRL YB3861, NRRL 3937 ja ATCC 15223. Tuloksena muodostuvaan tuotteeseen tai sekundaariseen substraattiin, annetaan vaikuttaa isomeraasientsyymin. Sen jälkeen isomeroitu tuote hydrolysoidaan, niin että läsnä ei ole aktiivista isomeraasientsyymiä, Tämän keksinnön mukaisen menetelmän mukaan valmistettu sekundaarinen substraatti on uusi tuote. Tämä substraatti on ainutlaatuisen sopiva isomerointiin ja sitä seuraavaan hydrolyysiin yli 55 % fruktoosia sisältävän siirapin tuottamiseksi, ja substraatti valmistetaan antamalla fruktosyylitransferaasientsyymin 8 64642 valmisteen vaikuttaa sakkaroosiin, Substraatit sopivat entsy-maattiseen isom.erointiin ja sitä seuraavaan hydrolyysiin yli 55 % fruktcosisiiraopia sisältäviksi siirapeiksi, jotka substraatit sisältävät (1) noin 20 - noin 60 paino-% suurehkolta osaltaan glukoosia ja pienemmän määrän fruktoosia sisältäviä mo-nosakkariceja, ja (2) noin 70 - noin 40 % yli 66 paino-% frukto-syyliosia sisältäviä polysakkarideja.A preferred embodiment is a process for the preparation of fructose-rich syrups, which process comprises reacting sucrose with a preparation of the enzyme fructosyltransferase derived from the microorganism Pullularia pullulans, - such as ATCC 9348, ATCC 12 53 5, NRRL 1573, NRRL Y2311 , NRRL YB3892, NRRL YB3861, NRRL 3937 and ATCC 15223. The resulting product or secondary substrate is allowed to act on the isomerase enzyme. The isomerized product is then hydrolyzed so that no active isomerase enzyme is present. The secondary substrate prepared by the process of this invention is a novel product. This substrate is uniquely suited for isomerization and subsequent hydrolysis to produce a syrup containing more than 55% fructose, and the substrate is prepared by reacting a preparation of fructosyltransferase enzyme 8,64642 with sucrose. Substrates are suitable for contain (1) from about 20% to about 60% by weight of monosaccharides containing a higher proportion of glucose and a lower amount of fructose, and (2) from about 70% to about 40% of polysaccharides containing more than 66% by weight of fructosyl moieties.
Erityisen edullisina pidettyjä ovat sekundaarisetsubs-traati4-, jotka on johdettu sakkaroosista transfruktosyloimalla, kun läsnä on tehokas määrä kannasta Pullularia pullulans ATCC 9348 johdettua fruktosyylitransferaasientsyymin valmistetta lämpötilassa, joka vaihtelee noin 25°C:sta noin 60°C:een ja pH:ssa, joka vaihtelee noin 4,5:stä noin S,5:een, ja edullisesti noin 5,4 - 5,6. Alussa käytetyt sakkaroosin pitoisuudet voivat olla niin pieniä kuin 10 g 100 ml vettä kohti. Kuitenkin käytetään mieluummin mahdollisimman korkeaa kuiva-aineen pitoisuutta, edullisesti noin 30 - 60 g 100 ml kohti.Particularly preferred are secondary cesubstrate4- derived from sucrose by transfructosylation in the presence of an effective amount of a fructosyltransferase enzyme preparation derived from Pullularia pullulans ATCC 9348 at a temperature ranging from about 25 ° C to about 60 ° C and at a pH of ranges from about 4.5 to about 5.5, and preferably from about 5.4 to 5.6. The concentrations of sucrose initially used can be as low as 10 g per 100 ml of water. However, it is preferred to use the highest possible dry matter content, preferably about 30 to 60 g per 100 ml.
' Minimimäärä 0,5 fruktosyylitransferaasi yksikköä 1 g sak karoosia kohti voidaan käyttää tuottamaan uutta substraattia. Yleensä käytetyn entsyymin määrä ei ylitä 50 yksikköä 1 g sakkaroosia kohti, entsyymin kustannusten takia. Erityisesti pidetään edullisena saada haluttu sekundaarinen substraatti riittävän lyhyessä ajassa, joten käytännössä entsyymimäärä on 30 yksikköä . 1 g sakkaroosia kohti.A minimum amount of 0.5 fructosyltransferase units per 1 g of sucrose can be used to produce new substrate. In general, the amount of enzyme used does not exceed 50 units per 1 g of sucrose, due to the cost of the enzyme. In particular, it is preferred to obtain the desired secondary substrate in a sufficiently short time, so that in practice the amount of enzyme is 30 units. 1 g per sucrose.
Fruktosyylitransferaasi valmistetaan tavanomaisella fer-mentointitekniikalla, ks. esim. US-patenttijulkaisut 3 565 756, 3 806 419 ja 3 535 123 sekä artikkeli S, Ueda et ai., Applied Microbiology, 11, 211-215 (1963), Edullisesti käytetään erotusta! puhdistusmenettelyjä, joita on kuvattu yksityiskohtaisemmin jäljempänä. Seuraava esimerkki on tyypillinen fermentointimenet-tely, jota käytetään entsyymin valmistamiseksi kannasta Pullularia pullulans ATCC 9348.Fructosyltransferase is prepared by conventional fermentation techniques, cf. e.g., U.S. Patent Nos. 3,565,756, 3,806,419, and 3,535,123, and S, Ueda et al., Applied Microbiology, 11, 211-215 (1963). cleaning procedures described in more detail below. The following example is a typical fermentation procedure used to prepare an enzyme from Pullularia pullulans strain ATCC 9348.
Esimerkki 1Example 1
Fruktosyylitransferaasientsyymin tuotantoProduction of the enzyme fructosyltransferase
Valmiste - Celite-kantoalne A. Entsyymin valmistamiseksi käytetty fermentointimenette- ΰχPreparation - Celite-kantoalne A. Fermentation method used to prepare the enzyme ΰχ
Entuyymi n valmistamiseksi tarvittavan siirrosteen vi lje- f g 64642 lyyn ja fermentointiin käytetty väliaine on seuraava; 0,5 % kaksiemäksisistä kaliumfosfaattia 0,1 % natriumkloridia 0,02 % magnesiumsulfaattiheptahydraattia 0,05 % diammoniumsulfaattia 0,3 % hiivauutetta (Difco Laboratories) 7,5 % sakkaroosia (elintarvikelaatu) väliaineen pH on säädetty arvoon 6,8 100 ml steriiliä väliainetta sisältäviin 500 ml:n Erlen-meyer-pulloihin siirrostetaan mustahiivan Pullularia pulluians viistopintaviljelmää. Käytetty hiivakanta on merkitty luettelossa the American Type Culture Collection (Rockville, Maryland) tunnuksella ATCC 9348, Näitä siemenpulloja pidetään edestakaisin liikkuvassa ravistelulaitteessa 48 tuntia 32°C:ssa, käytetään ymppäämään 1 litra fermentointiseosta Erlenmeyer-pullossa, joka sisältää 200 ml edellä määriteltyä väliainetta. Käytetty ymppi-pitoisuus on 0,5 % paino/tilavuus. Fermentointi suoritetaan edestakaisin liikkuvassa ravistelulaitteessa 32°C:ssa seitsemän päivän ajan, B, Entsyymin talteenotto fermentointiliemestä Neljästäkymmenestä 1 litran ravistuspullosta peräisin olevat fermentointiliemet yhdistetään, ja pullot huuhdellaan vedellä, joka myös lisätään yhdistettyyn liemeen. Liemen lopullinen tilavuus laimennuksen jälkeen on 12 litraa, Liemen alkuperäinen tilavuus on noin 8 litraa. 12 litraa fermentointilientä johdetaan jatkuvatoimisen Sharples-sentrifugin läpi hiivasolujen ja solu-maisen jätteen poistamiseksi. Sakan päällä oleva aines, joka on musta viskoosiliuos, säädetään sitten kalsiumkloridin avulla 0,5 %:n (paino/tilavuus) pitoisuuteen ja tuloksena muodostuvan liuoksen pH säädetään arvoon 7,0 natriumhydroksidilla. Toinen vaihe tehdään sitten Sharples^sentrifugilla, jotta saadaan viskoosi sakan päällä oleva liuos, jolla on heikko väri. Värittömäksi tehdyn sakan päällä olevan liuoksen pH säädetään arvoon 5,5 suolahapolla, ja lisätään 1 000 yksikköä pullulanaasia (kuten määritellään US-patenttijulkaisussa 3 806 419), Näin saatu liemi säilötään to-lueenilla (jota lisätään kyllästymiseen saakka) ja pullulanaasin annetaan reagoida huoneen lämpötilassa yli yön. Yön yli kestäneen 10 64 64 2 pullulanaasilla suoritetun hajottamisen jälkeen lietetään liemeen 1 % suodatusapuainetta Grefco J&fc 503 Celite piimaata, jota valmistaa Johns-'Manville Products Corporation, Lompoc, Kalifornia, minkä jälkeen lisätään asetonia 2 tilavuusmäärässä (24 litraa). Muodostuu sakka ja se kerätään suodattamalla, suodoskak-ku pestään asetonilla ja kuivataan ympäristön lämpötilassa. Kerätty suodoskakku sisältää immobilisoidun fruktosyylitransferaasi-entsyynin.The medium used for the inoculation and fermentation of the inoculum required for the preparation of the enzyme is as follows; 0.5% dibasic potassium phosphate 0.1% sodium chloride 0.02% magnesium sulphate heptahydrate 0.05% diammonium sulphate 0.3% yeast extract (Difco Laboratories) 7.5% sucrose (food grade) The pH of the medium is adjusted to 6.8 per 100 ml of sterile medium 500 ml Erlen-Meyer flasks are inoculated with an oblique culture of black yeast Pullularia pulluians. The yeast strain used is designated ATCC 9348 in the American Type Culture Collection (Rockville, Maryland). The inoculum content used is 0.5% w / v. The fermentation is carried out on a reciprocating shaker at 32 ° C for seven days, B, Enzyme recovery from the fermentation broth The fermentation broths from the forty 1 liter shake flasks are combined and the flasks are rinsed with water, which is also added to the combined broth. The final volume of the broth after dilution is 12 liters, the initial volume of the broth is about 8 liters. 12 liters of fermentation broth are passed through a continuous Sharples centrifuge to remove yeast cells and cellular debris. The supernatant, which is a black viscous solution, is then adjusted to 0.5% (w / v) with calcium chloride and the pH of the resulting solution is adjusted to 7.0 with sodium hydroxide. The second step is then performed with a Sharples centrifuge to obtain a viscous solution on the precipitate with a faint color. The pH of the solution on the decolorized precipitate is adjusted to 5.5 with hydrochloric acid, and 1,000 units of pullulanase (as defined in U.S. Patent 3,806,419) are added. The broth thus obtained is stored with toluene (added until saturation) and the pullulanase is reacted at room temperature. overnight. After overnight digestion with 10 64 64 2 pullulanase, 1% filtration aid Grefco J & fc 503 Celite diatomaceous earth, manufactured by Johns-'Manville Products Corporation, Lompoc, California, is slurried in broth, followed by the addition of acetone 2 (24 liters). A precipitate forms and is collected by filtration, the filter cake is washed with acetone and dried at ambient temperature. The collected filter cake contains immobilized fructosyltransferase enzyme.
Esimerkissä 1 on merkittävää, että kalsiumkloridin lisäys fermentointiliemeen sekä liemen pH:n säätäminen antaa tuloksena mustan pigmentin ja läsnäolevien happamien polysakkaridien poiston (ks. Acta Chem. Scan, 16 (1962)). Lopullinen entsyymituote saadaan siten suhteellisen puhtaan, värittömän valmisteen muodossa. Tämä puhdistusmenetelmä mahdollistaa yksinkertaiset puhdistusmenette-lyt, so. sentrifugoinnin, suodatuksen ja saostuksen lopputuotteen saamiseksi.In Example 1, it is significant that the addition of calcium chloride to the fermentation broth and the adjustment of the pH of the broth result in the removal of the black pigment and the acidic polysaccharides present (see Acta Chem. Scan, 16 (1962)). The final enzyme product is thus obtained in the form of a relatively pure, colorless preparation. This cleaning method allows simple cleaning procedures, i. centrifugation, filtration and precipitation to obtain the final product.
; On myös toivottavaa poistaa luontaisesti fermentointilie- : messä läsnäoleva pullulaanipolysakkaridi, koska kuten musta pig mentti ja happamet polysakkaridit sekin kerasaostuu fruktosyylitransf eraasientsyymin kanssa lisättäessä liuosta fermentointilie-; meen. Sen vuoksi sakan päällä olevaa liuosta, joka on saatu kal- siumkloridillä käsittelystä ja pH-säädöstä, voidaan edelleen käsitellä hyvin tunnetulla hydrolysointientsyymillä, pullulanaasilla. Pullulanaasientsyymi hydrolysoi umpimähkäisesti pullulaanin tuottaen alhaisen molekyylipainon omaavaa polymeeriä, ja täten vältetään liuotekäsittelyn (esim, asetoni, alkoholi ja sen kal-' täinen) aikana fruktosyylitransferaasientsyymin valmisteen kera- ; saostuminen ja siihen liittyvä saastuminen.; It is also desirable to remove the pullulan polysaccharide naturally present in the fermentation broth because, like the black pigment and acidic polysaccharides, it co-precipitates with the enzyme fructosyltransferase when the solution is added to the fermentation broth; unit. Therefore, the supernatant solution obtained by treatment with calcium chloride and pH adjustment can be further treated with a well-known hydrolysis enzyme, pullulanase. The pullulanase enzyme randomly hydrolyzes pullulan to produce a low molecular weight polymer, and thus avoids fructosyltransferase with the preparation of the fructosyltransferase enzyme during solvent treatment (e.g., acetone, alcohol, and the like); precipitation and related contamination.
ί Saatua fruktosyylitransferaasientsyymiä voidaan käyttää il- i * man pullulaanin poistamista. Niinpä tätä keksintöä voidaan tote uttaa ilman pullulanaasilla suoritettua pullulaanin hydrolyysiä, jossa tapauksessa pullulaani toimii fruktcsyyli-transferaasientsyy-min kantoaineena,The resulting fructosyltransferase enzyme can be used without removing pullulan. Accordingly, the present invention can be practiced without the hydrolysis of pullulanase by pullulanase, in which case pullulan acts as a carrier for the enzyme fructyltransferase,
Seuraava esimerkki havainnollistaa pullulaanin käyttöä kan-: toaineena.The following example illustrates the use of pullulan as a carrier.
Esimerkki 2Example 2
Sekundaarisen substraatin valmistus käyttäen pullulaani-kan- 11 64642 toaineella olevaa fruktosyylitransferaasientsyymiä, 20 ί: iseen sakkaroosin liuokseen,, joka on puskuroitu 0,05-m sitraattipuskurilla ρΗτ-arvoon 5,5. lisätään 1 %;n pitoisuus kuivaa pullulaania, joka on valmistettu esimerkin 1 menettelytavan mukaan, paitsi, että pullulaani ei ole hydrolysoitu pullulanaa-silla ja sen vuoksi toimii kantoaineena, eikä käytetä ainetta Ce-lite. Fruktosyylitransferaasin aktiviteetti on 577 yksikköä/g pullulaania. Reaktio toteutetaan ympäristön lämpötilassa, kunnes seos tulee sameaksi. Näyte tästä seoksesta analysoitiin korkeapai-nenestekromatografiaa käyttäen ja saatiin seuraavat tulokset:Preparation of secondary substrate using fructosyltransferase enzyme on pullulan carrier 11,64642 in 20 μl of sucrose solution buffered with 0.05 m citrate buffer to ρΗτ 5.5. a 1% concentration of dry pullulan prepared according to the procedure of Example 1 is added, except that the pullulan is not hydrolyzed by pullulanase and therefore acts as a carrier and Ce-lite is not used. The fructosyltransferase activity is 577 units / g pullulan. The reaction is carried out at ambient temperature until the mixture becomes cloudy. A sample of this mixture was analyzed using high performance liquid chromatography to give the following results:
Korkeapainenestekromatograafisella analyysillä määritetty sakkaridijakaumaSaccharide distribution determined by high performance liquid chromatographic analysis
Fruktoosi Glukoosi DP^ DP^ DP^ + 6,9% 40,6% 6,2% 11,1 % 35,2%Fructose Glucose DP ^ DP ^ DP ^ + 6.9% 40.6% 6.2% 11.1% 35.2%
Seuraavat esimerkit luonnehtivat edelleen esimerkissä 1 valmistettua entsyymiä.The following examples further characterize the enzyme prepared in Example 1.
Esimerkki 3Example 3
Entsymaattisen vaikutuksen omaavat tuotteet ja entsyymin lämpöstabiilisuusEnzymatic products and thermal stability of the enzyme
Kierretulpilla varustettuihin reaktiopulloihin lisätään 60 g elintarvikelaatuista sakkaroosia ja fruktosyylitransferaasient-syymivalmistetta. Entsyymivalmiste saadaan esimerkin 1 entsyymi-tuotteesta dispergoimalla kiinteän entsyymituotteen sopivat määräosat mitattuihin vesimääriin sopivan väkevän entsyymiliuoksen valmistamiseksi. Suodatusapuaine poistetaan sitten suodattamalla. Suodos lisätään reaktioseokseen määrässä 10, 20 ja 30 yksikköä entsyymiä 1 g sakkaroosisubstraattia kohti. Jokainen seoksista laimennetaan sitten 100 ml;n lopputilavuuteen vedellä, Muutosreak-tiot suoritetaan pH-arvossa 5,5 55°C;ssa tai 60°C:ssa vastaavasti, Näytteitä otetaan 24, 43 ja 66 tunnin kuluttua pelkistävän sokerin määrityksiä varten, jotta varmistettaisiin entsymaattisen aktiviteetin läsnäolo. Sen jälkeen, kun pelkistävän sokerin määritykset näytteistä on tehty, jäljelle jäävät reaktioseokset jäähdytetään entsymaattisen vaikutuksen pysäyttämiseksi ja näytteille tehdään hii1ihydraattikoostumuksen määritys korkeapaineneste-kromatografiällä. Saatiin seuraavat tulokset: 12 64642 ^ :(0To the reaction flasks with screw caps are added 60 g of food grade sucrose and the fructosyltransferase enzyme preparation. The enzyme preparation is obtained from the enzyme product of Example 1 by dispersing appropriate aliquots of the solid enzyme product in measured amounts of water to prepare a suitable concentrated enzyme solution. The filter aid is then removed by filtration. The filtrate is added to the reaction mixture in an amount of 10, 20 and 30 units of enzyme per 1 g of sucrose substrate. Each of the mixtures is then diluted to a final volume of 100 ml with water. The conversion reactions are performed at pH 5.5 at 55 ° C or 60 ° C, respectively. Samples are taken after 24, 43 and 66 hours for reducing sugar determinations to ensure the presence of enzymatic activity. After the reducing sugar determinations of the samples are made, the remaining reaction mixtures are cooled to stop the enzymatic action, and the samples are assayed for the carbohydrate composition by high performance liquid chromatography. The following results were obtained:
<—( CO<- (CO
E tnE tn
:<ϋ V CD: <ϋ V CD
Φ M "UΦ M "U
> e ϊ'Ό Ci) 4-J C * -μ> e ϊ'Ό Ci) 4-J C * -μ
CD CO-T-OCNOCDO _CCD CO-T-OCNOCDO _C
•h Li ro i cd o cd rv «d- (N >.• h Li ro i cd o cd rv «d- (N>.
o: *i i f\imm r\i m *3- r-^ -μ e D d d r roo: * i i f \ imm r \ i m * 3- r- ^ -μ e D d d r ro
CL CC 3 PCL CC 3 P
——* i—!—— * i—!
CDCD
CD -pCD -p
CD O LT; LT UT O O O LH »HCD O LT; LT UT O O O LH »H
.; X COOJCNir-COrvCncn U.; X COOJCNir-COrvCncn U
Π, ·»·.«.·» ^ «v lp en en cn^r^r^f :o ^ e ^ :o E χ • (Ό v—( :<c &3 enΠ, · »·.«. · »^« V lp en en cn ^ r ^ r ^ f: o ^ e ^: o E χ • (Ό v— (: <c & 3 en
> E -XL> E -XL
:u w in >,: u w in>,
-P T « *H-P T «* H
tn -r-i ro r- o T- (V) co σ tn r- -h C ·ρ i m r-^ en «a- cd cr> ro -P JiL CU 4-> N ·Ν tn N N tn (Ό CU r-H _* C e-tn -ri ro r- o T- (V) co σ tn r- -h C · ρ im r- ^ en «a- cd cr> ro -P JiL CU 4-> N · Ν tn NN tn (Ό CU rH _ * C e-
1 tn CU D 3 CU1 tn CU D 3 CU
I XXL CL tn -P <+.I XXL CL tn -P <+.
i >1 tn •p m e •p «3-aoonnono toi> 1 tn • p m e • p «3-aoonnono to
P X cc'a-'^rmrvy-i-tM PP X cc'a - '^ rmrvy-i-tM P
1 :(0 Q. ·>*>*«·«« -P1: (0 Q. ·> *> * «·« «-P
:to nnnntnnnn .h e +j •p x:: to nnnntnnnn .h e + j • p x:
, C ^ r-t O, C ^ r-t O
( -H rS V X(-H rS V X
t-. E >, Q) m \ tn tot. E>, Q) m \ tn to
MM O (OMM O (O
O > E ro rV -PEO> E ro rV -PE
tn :io ·ρ » ne. g -pro-p T-CMtDQOCnCM 03 ro e tn ·ι-. e icncn·^ o^-co p p :(0 τ-ι P CD tr-^-ΓΜ ENI CM ΓνΙ q- (jotn: io · ρ »ne. g -pro-p T-CMtDQOCnCM 03 ro e tn · ι-. e icncn · ^ o ^ -co p p: (0 τ-ι P CD tr - ^ - ΓΜ ENI CM ΓνΙ q- (jo
> X O -P> X O -P
E :<0 rP nC >, CE: <0 rP nC>, C
> -P <E O -p .h tn a. tn cnj -p en> -P <E O -p .h tn a. Tn cnj -p en
P 0) QP 0) Q
, -PO, -PO
I I -HPI I -HP
; cu -p tn ro • cl o cu x r P ne ‘ ·ρ e: ro cl o tn ' ·γΗ E -.(0 :to; cu -p tn ro • cl o cu x r P ne ‘· ρ e: ro cl o tn’ · γΗ E -. (0: to
>i £ *P> i £ * P
>CM OOOOOOOO H E> CM OOOOOOOO H E
-u tn r- cnj m t- cni tn qj > -p n -P >, n -i cu ό x tn e -p CU e E en 1-1 -p :o «. -H -P pc-u tn r- cnj m t- cni tn qj> -p n -P>, n -i cu ό x tn e -p CU e E en 1-1 -p: o «. -H -P pc
l P CU PCl P CU PC
1 o — -U *H1 o - -U * H
o. cj en o tno. cj en o tn
Ec tn to :to pc ;r> ^ V >-Ec tn to: to pc; r> ^ V> -
—1 T- CNJ—1 T- CNJ
13 64642 ω + 0 <3- oococo'S-Tj-Ot-CD tnOLncNim^mcnm E CL·-' » - * * * « 1 o o\° r in m *3· co co cn^rv cd en N cncom to o «s-13 64642 ω + 0 <3- oococo'S-Tj-Ot-CD tnOLncNim ^ mcnm E CL · - '»- * * *« 1 oo \ ° r in m * 3 · co co cn ^ rv cd en N cncom to o «s-
-*-1 '-'mmcncncnmencncM mcncncncncncnmCM- * - 1 '-'mmcncncnmencncM mcncncncncncnmCM
COC/O
o 0 en ocnoiv.T-coLr)r3-Ln mCMO<p-mp-<— co*— *(—t Q_ ,—v ·> «\ «s * * ·, * * * ^ <t »s * «l +3 Qo\0Cnr^CrionCNOCNJ^-T- 'J-COtOr^CMT-CMT-p- "L ·—' CM *— r- r— r— t— τ— r- N r- r— r— r“ p- τ— p“ r- o:· .•oo 0 en ocnoiv.T-coLr) r3-Ln mCMO <p-mp - <- co * - * (- t Q_, —v ·> «\« s * * ·, * * * ^ <t »s * «L +3 Qo \ 0Cnr ^ CrionCNOCNJ ^ -T- 'J-COtOr ^ CMT-CMT-p-" L · -' CM * - r- r— r— t— τ— r- N r- r— r - r “p- τ— p“ r- o: ·. • o
LL
tn cm o^uDcocnri-T-coo r-co'd-’^’CDcn^-rn'^ >, CL ·—· ... ... ... ... ...tn cm o ^ uDcocnri-T-coo r-co'd - '^' CDcn ^ -rn '^>, CL · - · ... ... ... ... ...
-LL Qo\° o en ID ID K N DvCOrv. CO CT) CO CO CO n. Γν rv IV-LL Qo \ ° o en ID ID K N DvCOrv. CO CT) CO CO CO n. Γν rv IV
•H -_· p-• H -_ · p-
f—4 • Hf — 4 • H
•t—(• t (
-e -H-e -H
tn >1 u □ u -l>o o n (M o co cm m o en tn o co o «3· cooto en r- cm +1 UI ... ... .««o ... ... ...tn> 1 u □ u -l> oon (M o co cm mo en tn o co o «3 · cooto en r- cm +1 UI ... ....« «o ... ... .. .
OJ tn oo\° n n n cm ^j· <- un rv to cm <3· un m in to in n en -p > —· •p <0 CD (0 L .—I _I l—lOJ tn oo \ ° n n n cm ^ j · <- and rv to cm <3 · and m in to in n en -p> - · • p <0 CD (0 L. — I _I l — l
:t0 *h -H: t0 * h -H
:Ώ +j +j E :θ *H :0: Ώ + j + j E: θ * H: 0
CL en CLCL en CL
:<o £ o n in n m <f in <3- co p- E cm o iv lo *3- m o rv co ·—1 :ro o pp ... ... *..:ro ... ... ...: <o £ on in nm <f in <3- co p- E cm o iv lo * 3- mo rv co · —1: ro o pp ... ... * ..: ro ... .. ...
1-1.-1 pc 0\° p- <3- co en lv o iv r- co ph cm ui id in o r en en iv •Po o·-^ menen m m <· en *3· *3- o mmm enenet m ^ tn -p 1—1 ·ι—(1-1.-1 pc 0 \ ° p- <3- co en lv o iv r- co ph cm ui id in or en en iv • Po o · - ^ menen mm <· en * 3 · * 3- o mmm enenet m ^ tn -p 1—1 · ι— (
> -P LD -P> -P LD -P
>1 PC PC> 1 PC PC
p-1 tu 10 ^ cd to ωp-1 tu 10 ^ cd to ω
C CL LL CLC CL LL CL
CD ·ρ 1 o pp to o to •p -p-ppi-rncopi-cncopi-ento i-mto^mcorrmcoCD · ρ 1 o pp to o to • p -p-ppi-rncopi-cncopi-ento i-mto ^ mcorrmco
tp -P -P CM ^3" CO CM'fl-CD CM ^ ID CM *3· CO CM -3- U0 CM <3" COtp -P -P CM ^ 3 "CO CM'fl-CD CM ^ ID CM * 3 · CO CM -3- U0 CM <3" CO
(0 PC C(0 PC C
Ci (0 oCi (0 o
M Q -PM Q -P
o CL '—'o CL '-'
-P-P
<0 E i<0 E i
O PCO PC
C-t »H ' ' pc tn toC-t »H '' pc tn to
CD PC -PCD PC -P
-l> >1 tn tn ·—· o cd tn o e o Li ω e to-l>> 1 tn tn · - · o cd tn o e o Li ω e to
e e PCe e PC
p to PC CO O O O CD CDp to PC CO O O O CD CD
(D-PtOi— cm m t— cm m a E tn to >(D-PtOi— cm m t— cm m a E tn to>
CD >1 MCD> 1 M
pc tn \ L -P :ropc tn \ L -P: ro
O C : OO C: O
Mi LLI PCWe LLI PC
i4 64642i4 64642
Esimerkki 3 osoittaa entsyymin lämpöstabiilisuutta substraatin läsnäollessa 55°C:ssa ja 60°C:ssa 66 tunnin jakson aikana pH-arvossa 5,5; tuloksista ilmenee, että entsyymin on kaupallisesti käyttökölooinen, Sitä paitsi uudella fruktosyylitransferaa-sivalmisteella sakkaroosia entsymaattisesti muuttamalla tuetetun sekundaarisen substraatin osoitetaan hiilihydraattianalyysillä olevan ooter.tiaalisesti arvokas tuote, joka sopii runsaasti sakkaroosia sisältävien siirappien valmistamiseen sakkaroosista, koska tärkeimpien aineosien osoitetaan olevan glukoosi ja polymeerit, jotka seuraavassa hydrolyysissä antavat fruktoosia tärkeimpänä mo-nosakkaridina. Tämä esimerkki osoittaa myös, että keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetty uusi entsyymi on tehokas 60 %:n (paino /tilavuus ) sakkaroosin pitoisuudella. Myös osoitetaan entsyymin toimivuus suurien glukoosi pitoisuuksien läsnäollessa.Example 3 shows the thermal stability of the enzyme in the presence of a substrate at 55 ° C and 60 ° C for a period of 66 hours at pH 5.5; In addition, the new fructosyltransferase preparation by enzymatic modification of sucrose shows in hydrolysis give fructose as the major monosaccharide. This example also demonstrates that the novel enzyme used in the method of the invention is effective at a sucrose content of 60% (w / v). The activity of the enzyme in the presence of high glucose concentrations is also demonstrated.
Esimerkki 4 Lämpötilan vaikutus entsyymin aktiviteettiin Lämpötilan vaikutus fruktosyylitransferaasientsyymin reaktionopeuteen määritetään käyttäen laitetta "Technicon Autcanaly-zer" seuraavasti:Example 4 Effect of temperature on enzyme activity The effect of temperature on the reaction rate of the fructosyltransferase enzyme is determined using a Technicon Autcanalyzer as follows:
Reaktioseos muodostuu 7,5 ml:sta 80-% (paino/tilavuus)sak-karoosiliuosta, 2,3 ml:sta 0,1-m sitraattipuskuria pH-arvossa 5,5 ja 0,2 ml:sta 2-%(paino/tilavuus) pullulaanientsyymin liuosta (esimerkin 2 entsyymivalmiste). Sakkaroosin lopullinen pitoisuus on 60 % (paino/tilavuus). Näytteitä pidetään seuraavissa lämpötiloissa ja analysoidaan 10 minuuttia laitteella " Technicon Auto-analyzer II". Tulokset osoittavat, että 40°C:ssa reaktion entsy-maattinen nopeus on 1,89 kertaa nopeus 30°C:ssa, 50°C:ssa 1,29 kertaa suurempi kuin 40°C:ssa ja 60°C:ssa 1,48 kertaa suurempi kuin 5Q°C:ssa.. Tämä osoittaa kohoavan lämpötilan mukana kasvavaa reaktionopeutta.The reaction mixture consists of 7.5 ml of 80% (w / v) sucrose solution, 2.3 ml of 0.1 M citrate buffer at pH 5.5 and 0.2 ml of 2% (w / v) / volume) of pullulan enzyme solution (enzyme preparation of Example 2). The final sucrose content is 60% (w / v). Samples are maintained at the following temperatures and analyzed for 10 minutes on a Technicon Auto-Analyzer II. The results show that at 40 ° C the enzymatic rate of the reaction is 1.89 times the rate at 30 ° C, at 50 ° C 1.29 times higher than at 40 ° C and 60 ° C 1, 48 times higher than at 50 ° C. This indicates an increasing reaction rate with increasing temperature.
Esimerkki 5Example 5
Fruktosyylitransferaasientsyymin Michaelis-Menten-vakion (K ) havainnollistaminen mIllustration of the Michaelis-Menten constant (K) of the fructosyltransferase enzyme m
Entsyymin Kjr merkitsee substraatin pitoisuutta, jolla tuotteen muodos turr' snopous on puolet arvosta V Seuraava menette-The Kjr of the enzyme denotes the concentration of the substrate at which the Turr 'snopous form of the product is half the value of V.
Ly'i käy t.e-1 i ! r, fruk toayy litrancferaas ientsyymin vakion K saarni-:;nkn i .Ly'i ty-1 i! r, fruk toayy litrancferase enzyme constant K ash - :; nkn i.
15 64642 Käyttäen sakkaroosin 90-% (paino/tilavuus) perusliuos-ta, jonka pH oli säädetty arvoon 5,5 0,1-m sitraattipuskurilla, valmistetaan 9,8 ml:n määräosissa olevat sakkaroosin asianmukaiset pitoisuudet, jotka antavat 5, 10, 30, 40, 50, 50 ja 70 %:n sakkaroo-sipitoisuudet 10 ml:n lopputilavuudella. 1,1 yksikköä fruktosyyli-transferaasientsyymiä sisältävä 0,2 ml:n entsyymi 1iuos lisätään temoero ituihin näytteisiin. Sitten näytteet analysoidaan välittömästi 55"C:ssa laitteella "Technicon Autoanalyzer II”, kuten aikaisemmin kuvattiin (ks. fruktosyylitransferaasiyksikkö). Glukoosi-standardi (kalibroitu yksiköissä /jg/ml) liitetään mukaan vertailukokeena .15 64642 Using a 90% (m / v) stock solution of sucrose adjusted to pH 5,5 with 0,1 m citrate buffer, prepare appropriate concentrations of sucrose in 9.8 ml aliquots to give 5, 10, 30, 40, 50, 50 and 70% sucrose contents in a final volume of 10 ml. A 0.2 ml enzyme solution containing 1.1 units of fructosyltransferase enzyme is added to the separated samples. The samples are then immediately analyzed at 55 ° C on a Technicon Autoanalyzer II as previously described (see fructosyltransferase unit). The glucose standard (calibrated in units / μg / ml) is included as a control.
Seuraavassa on glukoosin muodostumisnopeus ilmaistuna yksiköissä >jg/ml/minuutti erilaisilla substraatin pitoisuuksilla käyttäen vakioannostelua (1,1 yksikkö) esimerkin 1 fruktosyylitrans-fe-raas i entsyymi valmistetta .· % substraattia jjg/ml/min pg/ml/mina^ 5 8,0 8,0 10 11,8 11,6 20 15,7 15,2 30 18,0 17,6 40 18,6 18,2 50 19,2 17,2 60 17,8 18,2 70 15,6 a) Ajettu uudestaan seuraavana päivänä käyttäen 60-% sakkaroosipe-rusliuosta.The following is the rate of glucose formation expressed in units> μg / ml / minute at various substrate concentrations using the standard dosage (1.1 units) of the fructosyltransferase enzyme preparation of Example 1. ·% substrate μg / ml / min pg / ml / min ^ 5 8 .0 8.0 10 11.8 11.6 20 15.7 15.2 30 18.0 17.6 40 18.6 18.2 50 19.2 17.2 60 17.8 18.2 70 15, 6 a) Run again the next day using 60% sucrose stock solution.
K on 0,27-m sakkaroosipitoisuus. Reaktion maksiminopeus esiintyi substraatin pitoisuudella 1,374 molaarinen sakkaroosin suhteen, pH-arvossa 5,5 ja 55°C:ssa.K is the 0.27 m sucrose content. The maximum reaction rate occurred at a substrate concentration of 1.374 molar with respect to sucrose, at pH 5.5 and 55 ° C.
Esimerkki 6Example 6
Sekundaarisen substraatin valmistus ja isomerointi sakkaroosista .Preparation and isomerization of secondary substrate from sucrose.
A. Sekundaarisen substraatin valmistusA. Preparation of Secondary Substrate
Elintarvikelaatuista sakkaroosia 600 g liuotetaan veteen 800 ml: n tilavuuteen. Tämän liuoksen pH säädetään arvoon 5,5 laimealla is 6 4 64 2 - 1 Ί-Ί I "i*i '“'---s. 1 i g kuivaa C e 1 it e - entsyym i n valmistetta, jonka ak- 'iVitgs-l-J.; CC'- I , cn y^sxkkoa/g ja joka on valmistettu kuten esimer- ^ J. o S ^ ^ ^ ^ · # ·« * luetetaan JOG ml-.aan vettä. Liete suodatetaan vakuumilla λ a t m g -> 1 η ’· o 1 sucdat inpaperia käyttäen Bdchnsr-suppilossa. Suodos-'Sstään vielä IQo ml:11a vettä. 200 ml suodosta lisätään sit-,en -9\karcosiliuokseen, jcka cn kierretulpelia varustetussa 1,9 l:n "-5· Pu.lo sij’oitetaan sitten 58°C lämpöiseen vesihauteeseen ,v^-on annetaan jatkua 20 tuntia, jonka jälkeen reaktiotuotteen Γ. 3 V t P -¾ , , -Pöiy soidaan KcrkRaoa i n en es 12 kr oma tograf ia 1 la hiilihydraatti-*0- s -Umj ksen määrittämiseksi ja saadaan se ura av at tulokset.Dissolve 600 g of food grade sucrose in water to a volume of 800 ml. The pH of this solution is adjusted to 5.5 with dilute is 6 4 64 2 - 1 Ί-Ί I "i * i '“' --- p. 1 ig dry C e 1 it e - enzyme preparation with ak- 'iVitgs -J .; CC'- I, cn y ^ sxkkoa / g and prepared as exemplified by ^ J. o S ^ ^ ^ ^ # # · «* is read as JOG per ml of water The slurry is filtered off with suction λ atmg - > 1 η '· o 1 using sucdat paper in a Bdchnsr funnel. Add a further IQo ml of water to the filtrate. Add 200 ml of the filtrate to a solution of sit-, en -9 \ carcose in a 1.9 l screw-capped 5 · Pu.lo is then placed in a water bath at 58 ° C, allowed to continue for 20 hours, after which the reaction product Γ. 3 V t P -¾,, -Pöiy is used to determine KcrkRaoa i n en es 12 kr chromatograph 1 la carbohydrate- * 0- s -Umj and to obtain the results obtained.
Hiilihydraatti koostumusCarbohydrate composition
Fruktoosi 2,4 %Fructose 2.4%
Glukoosi 32,8 % 0p2 10,6 % 0P3 22,9 % 0P4 31,3% Oäljelle jäävään reaktiotuotteeseen (so. sekundaarinen substraatti) lisätään magnesiumkloridia pitoisuuteen 5 millimolaa-rinen saakka, ja pH säädetään arvoon 8,4 laimealla natriumhydroksi-di 1la .Glucose 32.8% 0p2 10.6% 0P3 22.9% 0P4 31.3% Magnesium chloride is added to the remaining reaction product (i.e., secondary substrate) to a concentration of 5 millimolar, and the pH is adjusted to 8.4 with dilute sodium hydroxide. .
B. Sekundaarisen substraatin jatkuva isomerointiB. Continuous isomerization of the secondary substrate
Kannasta Streptomyces o 1ivochromogenes ATCC 21 715 (ks. US-patenttiju1kaisu Pe 29 152) johdettu glukoosi-isomeraasi immoöili-soidaan huokoiseen alumiinioksidiin valmistaja Corning Glass Co., Corning, Dew York,(ks. US-patenttijulkaisu n:o 3 992 329) seuraavasti : 1. K.antcaine pestään kahdesti vedellä 2. Kantoainetta inkuboidaan 0,1-m ^atriumsitraatin kanssa yhden tunnin ajan sekoittaen, 3. Natriurnsitreat ti nestään kantoaineesta kunnes pesuliuok-s e n "ohtoky^y on 1 0 0 u /u o h m .Glucose isomerase derived from Streptomyces oivochromogenes ATCC 21,715 (see U.S. Pat. No. Pe 29,152) is immobilized on porous alumina by Corning Glass Co., Corning, Dew York, (see U.S. Patent No. 3,992,329). as follows: 1. The carrier is washed twice with water. 2. The carrier is incubated with 0.1 M sodium citrate for one hour with stirring.
4. Kantoainetta inkuboidaan U,05-m magnesiumkloridin kanssa vksi tunti ja magn esiumk1 oridi1iuos riekantoidaan.4. Incubate the vehicle with U, 05-m magnesium chloride for one hour and pellet the magnesium chloride solution.
5. lmnätään 1 t .i lovuunusa Π, 0B-m magn os Iumklorid ia , jolloin un t ; y ym ! n I «nu 1 ! ! n ti kr. : p to ί nootinko i tulon 4ΡΠ yku:kköä/ml, 17 64 64 2 6. Isomeraasientsyymin väkevöite lisätään kantoaineeseen pitoisuutena 494 yksikköä/ml 7. Kantoainetta ja entsyymiä pidetään kontaktissa 22-24 tuntia ja sitoutumaton entsyymi pestään kantoaineelta tislatulle vedellä.5. 1 t .i lunnusa Π .0B-m magn os Iumklorid ia, wherein un t; y ym! n I «nu 1! ! n ti kr. : p to ί nootinko i inlet 4ΡΠ yku: kkö / ml, 17 64 64 2 6. The isomerase enzyme concentrate is added to the support at a concentration of 494 units / ml 7. The carrier and the enzyme are kept in contact for 22-24 hours and the unbound enzyme is washed with distilled water from the support.
Vaipalla varustettu lasikolonni (3 cm x 18 cm), joka on varustettu syöttösäiliöön yhdistetyllä pumpulla, panostetaan näin valmistetulla immobilisoidulla entsyymillä. Panostamisen jälkeen en entsyymikerroksen tilavuus 45 ml. Kolonni toimii B0°C:ssa kaikissa isomeroinneissa. Panostetun kolonnin toiminta aloitetaan glukoosisiirapilla [50 % paino/paino) sekä 0,005-m magnesiurnklcri-dilia, pH:ssa 8,4, ja todetaan, että kolonni on'aktiivinen.Virtausnopeus säädetään arvoon 292 ml/tunti. Sitten kolonnista poistetaan liuosta kerroksen tasolle. Sekundaarisen substraatin sisään johtaminen suoritetaan käsin, kunnes 20 ml ulosvirtaavaa ainetta on kerääntynyt, ja sitten sekundaarisen substraatin virtausnopeus säädetään arvoon 292 ml/tunti. Ensimmäiset 100 ml kerääntynyttä siirappia hylätään substraatin muuttumisen mahdollistamiseksi. Jäljelle jäävä sekundaarinen substraatti ( noin Θ50 ml ) johdetaan sitten kolonnin läpi. Tunnin kuluttua virtausnopeus nousee arvoon 570 ml/tunti. Virtausmäärä säädetään ja pidetään arvossa 300 ml/tunti ajon loppuun saakka. Sekundaarisella substraatilla loppuun suoritetun ajon jälkeen kolonni kytketään takaisin glukoosille, ja tode-’ taan, että isomeraasiaktiivisuus on, säilynyt. Seuraavassa taulukossa on vertailtu lähtöaineena olevan sekundaarisen substraatin ja iso-merointikolonnin lopputuotteen korkeapainenestekromatografia-ana- -lyys i ä:A jacketed glass column (3 cm x 18 cm) equipped with a pump connected to the feed tank is charged with the immobilized enzyme thus prepared. After loading, the volume of the enzyme layer is 45 ml. The column operates at B0 ° C for all isomerizations. The charged column is started with glucose syrup [50% w / w) and 0.005 M magnesium chloride, pH 8.4, and the column is found to be active. The flow rate is adjusted to 292 ml / hour. The solution is then removed from the column to the bed level. The introduction of the secondary substrate is performed manually until 20 ml of effluent has accumulated, and then the flow rate of the secondary substrate is adjusted to 292 ml / hour. The first 100 ml of accumulated syrup is discarded to allow the substrate to change. The remaining secondary substrate (about Θ50 ml) is then passed through the column. After one hour, the flow rate rises to 570 ml / hour. The flow rate is adjusted and maintained at 300 ml / hour until the end of the run. After the run on the secondary substrate, the column is switched back to glucose and it is found that the isomerase activity is maintained. The following table compares the high pressure liquid chromatography analysis of the starting secondary substrate and the final product of the isomerization column:
Sekundaarinen substraatti (A) Lopputuote (B)Secondary substrate (A) End product (B)
Fruktoosi 2,4 % 15,7 %Fructose 2.4% 15.7%
Glukoosi 32,8% 18,9% DP2 10,6 % 11,0 % DP3 22,9 % 22,9 % DP4+ 31,3 % 31,5 % 18 64642 Nämä tulokset osoittavat, että 42,38 % sekundaarisen substraatin vapaasta glukoosista isomeroituu kolonnissa fruktoosiksi. Myöskään sekundaarisessa substraatissa läsnäoleviin fruktoosipolymee-reihio ei näyttänyt vaikuttavan glukoosin isomerointi fruktoosiksi eivätkä nämä polymeerit vaikuttaneet isomerointiin. Mainittakoon, että monosakkaridien kokonaisjakauma muodostuu noin 45-%:isesti fruktoosista ja 55-%:sesti glukoosista.Glucose 32.8% 18.9% DP2 10.6% 11.0% DP3 22.9% 22.9% DP4 + 31.3% 31.5% 18,64642 These results show that 42.38% of the free substrate of the secondary substrate from glucose isomerized in the column to fructose. Also, the fructose polymer preform present in the secondary substrate did not appear to be affected by the isomerization of glucose to fructose and these polymers did not affect the isomerization. It should be noted that the total distribution of monosaccharides consists of about 45% fructose and 55% glucose.
Seuraavassa esimerkissä käytetään kahta tapaa sekundaarisessa substraatissa ja myös siitä valmistetussa isomerointituottees-sa läsnäolevien polysakkaridien hajoittamiseksi. Toinen taoa on entsymaattinen ja toinen lievä happohydrolyysi.In the following example, two methods are used to decompose the polysaccharides present in the secondary substrate and also in the isomerization product prepared therefrom. One tao is enzymatic and the other is mild acid hydrolysis.
Esimerkki 7Example 7
Runsaasti fruktoosia sisältävän siirapin valmistus hydrolyy- s i 1 lä A. Enteymaattinen hydrolyysi 100 ml:aan esimerkistä 5 peräisin olevaa tuotetta sekoitetaan lajista Candida utilis peräisin olevaa puhdistettua invertaa-sia. Tämän seoksen (tolueenilla säilöttynä) annetaan reagoida yön yli ympäristön lämpötilassa, minkä jälkeen otetaan näyte ja analysoidaan korkeapainenestekromatografiällä. Jä1jelle'jäävän näytteen 3 annetaan reagoida vielä kuusi päivää ja analysoidaan toinen näyte samalla menettelytavalla seuraavin tuloksins Lähtömateriaali Invertaasin vai- Kuuden lisäpäi-(tuote B) kutuksen jälkeen vän jälkeenPreparation of a fructose-rich syrup by hydrolysis A. Enzymatic hydrolysis 100 ml of the product from Example 5 are mixed with purified invertase from Candida utilis. This mixture (preserved with toluene) is allowed to react overnight at ambient temperature, after which a sample is taken and analyzed by high performance liquid chromatography. The remaining sample 3 is allowed to react for a further six days and the second sample is analyzed by the same procedure with the following results: Starting material After inversion of the invertase after six days (product B).
Fruktoosi 15,7 % 41,9 % 62,4 %Fructose 15.7% 41.9% 62.4%
Glukoosi 18,9 % 29,4 % 36,2 % 0p2 11,0% 1,9% 0 DP3 22,9 % 12,9 % 0,5 % ΠΡ4+ 31,S % 13,9 % 0,9 % Käytetty invertaasi on yhtiön Siekagu Kogyo Co., Ltd., Tokio, Jaoani, valmistama entsyymivalmiste, jonka spesifinen aktiivisuus on 123 yksikköe/mg proteiinia, ja yksi invertaasiyksikkö katalysoi sakkaroosin lohkaisua muodostaen 1 mikromoolin glukoosia ja 1 mikromoclir fruktoosia minuutissa standardoiduissa olosuhteissa.Glucose 18.9% 29.4% 36.2% 0p2 11.0% 1.9% 0 DP3 22.9% 12.9% 0.5% ΠΡ4 + 31, S% 13.9% 0.9% Used invertase is an enzyme preparation manufactured by Siekagu Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Jaoani, with a specific activity of 123 units / mg protein, and one invertase unit catalyzes the cleavage of sucrose to form 1 micromole of glucose and 1 micromole of fructose per minute under standardized conditions.
19 64642 B. Tuotteen B happohydrolyysi19 64642 B. Acid hydrolysis of product B.
Esimerkin 6 tuotteesta otetun näytteen happohydrolyysi suoritettiin lisäämällä rikkihappoa pitoisuuteen 0,05-n ja kuumentamalla 75-8Q°C: seen. Näytteet otetaan yhden ja kahden tunnin hydro-lyysin jälkeen ja analysoidaan korkeapaineisella nestekromatogra-fialla. Tulokset ovat seuraavat: Lähtömateriaali (tuote B) 1 tunti 2 tuntiaAcid hydrolysis of a sample of the product of Example 6 was performed by adding sulfuric acid to a concentration of 0.05 n and heating to 75-8 ° C. Samples are taken after one and two hours of hydrolysis and analyzed by high pressure liquid chromatography. The results are as follows: Starting material (product B) 1 hour 2 hours
Fruktoosi 15,7 % 60,3 % 59,1 %Fructose 15.7% 60.3% 59.1%
Glukoosi 18,9 % 38,7% 37,9 % DP2 11,0 % 1,9 % 2,6 % DP3 22,9 % 0,4 % 0,3 % DP4+ 31,5 % 0 % 0,2 %Glucose 18.9% 38.7% 37.9% DP2 11.0% 1.9% 2.6% DP3 22.9% 0.4% 0.3% DP4 + 31.5% 0% 0.2%
Edellä olevat vaiheen A tulokset osoittavat vallitsevana olevan fruktoosin saannon nousun ja vähäisemmän glukoosin saannon nousun, joka ilmenee DP2:n, DP^:n ja DP4+:n fraktioiden vastaavan vähenemisen yhteydessä näin osoittaen fruktoosipolymeerin läsnäoloa.The above results of step A show an increase in the prevailing fructose yield and a smaller increase in glucose yield, which occurs with a corresponding decrease in the fractions of DP2, DP1 and DP4 +, thus indicating the presence of the fructose polymer.
Vaiheen B happohydrolyysin tulokset ovat yhtäpitäviä vaiheesta A saatujen tulosten kanssa näin myös osoittaen fruktoosipo-lymeerien pirstoutumista.The results of the acid hydrolysis of step B are in agreement with the results of step A, thus also showing the fragmentation of the fructose polymers.
Edellä oleva tarkastelu on suunnattu primaarista substraattia käyttäen tapahtuvaan transfruktosylointiin, jossa lähtöaineena olevan sakkaroosin kuiva-aineen pitoisuus ei ylitä ky 1lästyspistettä annetuissa reaktion olosuhteissa. Seuraava esimerkki osoittaa primaarisen substraatin käyttöä, jolla substraatilla on sakkaroosin alkuperäinen pitoisuus yli kyllästymisen ja joka fruktosyylitrans-feraasientsyymin vaikutuksen alaisena antaa tulokseksi tuotteen, joka sisältää DP^-materiaalin (so. fruktosyyli-sakkaroösin) kohenneita määriä ja DP4+-tuotteiden alentuneen pitoisuuden. Myös osoitetaan sekundaarisen substraatin kuiva-aineen pitoisuuden (paino/ tilavuus) nousu verrattuna fruktosyy1itransferaasientsyymin puuttuessa saatuun kuiva-aineen pitoisuuteen. Sitä paitsi osoitetaan, että primaarisen substraatin kuiva-ainepitoisuuden noustessa sekundaarisen substraatin fruktoosipolymeerin polymerointiaste laskee ja DP^+-materiaalia on läsnä pienempinä määrinä.The above discussion is directed to transfructosylation using a primary substrate in which the dry matter content of the starting sucrose does not exceed the boiling point under the given reaction conditions. The following example demonstrates the use of a primary substrate which has an initial sucrose content above saturation and which, under the influence of the enzyme fructosyltransferase, results in a product containing improved amounts of DP4 material (i.e. fructosyl sucrose) and reduced DP4 + products. An increase in the dry matter content (w / v) of the secondary substrate compared to the dry matter content obtained in the absence of the enzyme fructosyltransferase is also shown. In addition, it is shown that as the dry matter content of the primary substrate increases, the degree of polymerization of the fructose polymer of the secondary substrate decreases and the DP 2+ material is present in smaller amounts.
20 64642 Tämä on merkittävä vastakohtaisuus edellisissä esimerkeissä alle kyllästymisen olleita sakkaroosisubstraatteja käyttäen saaduille tuloksille. Niissä esimerkeissä DP^+^raateriaali on tärkein tuote. Esimerkki 820 64642 This is a significant contrast to the results obtained in the previous examples using sucrose substrates under saturation. In those examples, DP ^ + ^ material is the main product. Example 8
Sekundaarisen substraatin valmistus sakkaroosilietteistä, joiden pitoisuus on yli kyllästymispisteenPreparation of secondary substrate from sucrose slurries with a concentration above saturation point
Eliotarvikelaatuista sakkaroosia (200 g:n erinä sijoitetaan kierretulpalla varustettuihin 0,5 l:n astioihin. Vertailu, 50 ml vettä lisätään yhteen astiaan, ja jokaiseen muuhun lisätään 50 ml vettä, joka sisältää kohoavia määriä fruktosyylitransferaasientsyy-mi-valmistetta ( valmistettu esimerkin 1 mukaisesti), jäljessä seu-raavan taulukon mukaan. Jokainen astia suljetaan ja sijoitetaan sekoittavaan vesihauteeseen, joka on säädetty 54-55°C: seen, Astioita ravistellaan 24 tuntia sekoittaen toisinaan käsin. Jokaisesta pullosta otetaan näyte sakan päällä olevasta nesteestä ja sijoitetaan kierretulpalla varustettuun koeputkeen kiehuvaan vesihauteeseen entsyymin inaktivoimiseksi, Näytteet analysoidaan sitten korkeapaine-nestekromatografiällä ja sakan päällä olevan nesteen kuiva-aineen määritykset tehdään K. Fischerin menetelmää käyttäen/ (ks.Kirk-Oth-mer, Encyclopedia of Chemical Technology, voi,2, 2. painos, 1963, sivut 673 ja 674, ja Angewandte Chemie 48 ,(1935), sivu 394)· Saadut tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa.Protein-grade sucrose (200 g aliquots are placed in 0.5 l containers with screw caps. For comparison, 50 ml of water is added to one vessel and 50 ml of water containing increasing amounts of fructosyltransferase enzyme (prepared according to Example 1) is added to each other. ), followed by the following table: Each vessel is sealed and placed in a stirring water bath set at 54 to 55 ° C, shaken for 24 hours with occasional agitation, and each bottle is sampled with the supernatant and placed in a boiling test tube with a screw cap. in a water bath to inactivate the enzyme. The samples are then analyzed by high pressure liquid chromatography and the dry matter of the liquid on the precipitate is determined using the method of K. Fischer / (see Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, Vol. 2, 2nd ed. pages 673 and 674, and Angewandte Chemie 48, (1935), page 394) · Results obtained are shown in the following table.
21 64642 - -Ξ Ρ Ο ε ε + ο ρ ^ c\j r^^-aDT-coo'a-r^T- r\’ -Pr D-X'''*''-'·' x o _2 c ujo^-T-tNCMrnmm^· lu o -, o r, ^ ,- c o mcnrvtDoacn«r-^-o«i GO CL ***·»******Γν!21 64642 - -Ξ Ρ Ο ε ε + ο ρ ^ c \ jr ^^ - aDT-coo'a-r ^ T- r \ '-Pr D-X' '' * '' - '·' xo _2 c shy ^ -T-tNCMrnmm ^ · lu o -, or, ^, - co mcnrvtDoacn «r - ^ - o« i GO CL *** · »****** Γν!
•rH Z CD COrnCDCn-^-r-Cn^fLOLD X• rH Z CD COrnCDCn - ^ - r-Cn ^ fLOLD X
-P rr-^[NJ!Nf\!NN(N UJ-P rr - ^ [NJ! Nf \! NN (N UJ
^ rc D -.^ rc D -.
P COP CO
L r OvJCnCsJCOUDLnOCnCNJOCD rv TJ ./ CL * * * * * * * * * * * >) "7 CD1 0(NCDC\JaOCOnC\JOCO CD Γ?L r OvJCnCsJCOUDLnOCnCNJOCD rv TJ ./ CL * * * * * * * * * * *) "7 CD1 0 (NCDC \ JaOCOnC \ JOCO CD Γ?
JT ,-. CCr^COCDLDLDLnLnLn^- CD "ZJT, -. CCr ^ COCDLDLDLnLnLn ^ - CD "Z
L -2 o PO — . -* •r-ί ^ uDr^unr^cnococncDCD ,m -C5 ^ tN ^ j] „ -- cncvjii-Lni^cococDcno x TtL -2 o PO -. - * • r-ί ^ uDr ^ unr ^ cnococncDCD, m -C5 ^ tN ^ j] „- cncvjii-Lni ^ cococDcno x Tt
C -H r-l U UJC -H r-l U UJ
“ O ^ . > “ «P 4j“O ^. > “« P 4j
o -_I ^ cDr^ocn^-mT-omrn m JHo -_I ^ cDr ^ ocn ^ -mT-omrn m JH
^ (Γ m Cl “* ,, •r-i p- L OOt— Or“r— T“r-“T— r— O |_|^ (Γ m Cl “* ,, • r-i p- L OOt— Or“ r— T “r-“ T— r— O | _ |
—1 5 Μ E—1 5 Μ E
COC/O
I cn .*: cn 0 3 oI cn. *: Cn 0 3 o
coo -Pcoo -P
ra ή > -p pc I—( <d m ID I—I -pra ή> -p pc I— (<d m ID I — I -p
CO D *H .HCO D * H .H
cn -p Ocn -p O
LncOrOT-f^^-r-OOiD r\LncOrOT-f ^^ - r-OOiD r \
^-untorvr^cocoocoCT) cn -rH^ -untorvr ^ cocoocoCT) cn -rH
iNr-^tNtv.rNrv.rv.actv.1^ tv. ^ •h o cl :o 0iNr- ^ tNtv.rNrv.rv.actv.1 ^ tv. ^ • h o cl: o 0
1 JlD *rH1 JlD * rH
ID --1 Ή . ODID --1 Ή. OD
> <—I LO> <—I LO
·<-» :□ -0 >> d :id ω ^ d co c· <- »: □ -0 >> d: id ω ^ d co c
•rH• rH
^ · E^ · E
:θ H :ra C1 E SO £: θ H: ra C1 E SO £
>iPi OCOCOCOOtOCDOOO P> iPi OCOCOCOOtOCDOOO P
>1-*: ooocotoococooo r.> 1- *: ooocotoococooo r.
tn-ρ -r-fMm-vrLnujr^cocjjo i ~ u * Jg tn ω •H πιο ootn-ρ -r-fMm-vrLnujr ^ cocjjo i ~ u * Jg tn ω • H πιο oo
o c -Po c -P
P OOOCOOOOOOO O P "PP OOOCOOOOOOO O P "P
P „ coaoooocoooco co Oj'mP „coaoooocoooco co Oj'm
_^ω ΓΜΝΝΝΝΙΜίΜΝΝΝ CM_ ^ ω ΓΜΝΝΝΝΙΜίΜΝΝΝ CM
-½ — .—t ro-½ -. — T ro
Ό . >, JOΌ. >, JO
cn ' >,cn '>,
Ρ ω —IΡ ω —I
C -H ° “ ° <a £ --t ^-CNjto^-cncorvcocno-p "z -—I O r- C 03 O -T- l c “5x5C -H ° “° <a £ --t ^ -CNjto ^ -cncorvcocno-p" z -—I O- C 03 O -T- l
rH (NrH (N
22 6 4 6 4 222 6 4 6 4 2
Mainittakoon, että edellä olevassa esimerkissä vertailu-aine kiteytyy jäähdytettäessä ympäristön lämpötilaan ( noin 25°C), kun taas entsymaattisesti valmistetut sekundaariset substraatit pysyvät liuoksessa ja niillä on erinomainen varastointistabiili-suus (eivät kiteydy).It should be noted that in the above example, the reference substance crystallizes on cooling to ambient temperature (about 25 ° C), while the enzymatically prepared secondary substrates remain in solution and have excellent storage stability (do not crystallize).
'Jutta sekundaarista substraattia voidaan käyttää hyvin stabiilina, ei-kiteytyvänä siirappina elintarvikesovellutuksissa. Se on ainutlaatuisen runsaasti kuiva-ainetta sisältävä koostumus, joka on vastustuskykyinen mikrobien aiheuttamaan kontaminöltumiseen ja väriaineen muodostumiseen nähden.The secondary substrate can be used as a very stable, non-crystallizing syrup in food applications. It is a uniquely high-dry composition that is resistant to microbial contamination and dye formation.
Uusi erittäin runsaasti kuiva-ainetta sisältävä sekundaarinen substraatti voidaan hydrolysoida, kuten esitetään esimerkissä 7 i.overttisokeriseoksen saamiseksi, jolla on toivottu makeustaso; tämän substraatin kuiva-ainepitoisuus on noin 70 - 82 % (paino/pai-no) ja substraatti koostuu olennaisesti glukoosista ja polysakkari-dipolymeereistä, D?2:ta ja DP^tta. Pienehkö määrä (4,1 % ja alle ) DP^-polymeerejä on myös läsnä.The new very dry secondary secondary substrate can be hydrolyzed as shown in Example 7 to give i. An overt sugar mixture with the desired level of sweetness; this substrate has a dry matter content of about 70-82% (w / w) and the substrate consists essentially of glucose and polysaccharide dipolymers, D 2 and D 2. A smaller amount (4.1% and less) of DP 2 polymers is also present.
Vaikka tämän keksinnön mukaista transfruktosylointivaihetta on kuvattu panoksittaan tapahtuvien yksikköprosessien muodossa,ammattimiehelle on selvää, että voidaan käyttää samoin jatkuvatoimisia yksikköprosesseja. Toteutettaessa sellaista jatkuvaa transfrukto-sylointia transfruktosylaasi-entsyymi tavanomaisesti immobilisoi-daan käyttäen tekniikkaa, jota tarkasteltiin aikaisemmin immobili-soidun entsyymin määritelmän kohdalla ja käyttäen tällöin kuvattua jatkuvaa menetelmää.Although the transfructosylation step of this invention has been described in the form of batch unit processes, it will be apparent to those skilled in the art that continuous unit processes may be used as well. In carrying out such continuous transfrucosylation, the transfructosylase enzyme is conventionally immobilized using the technique previously considered for the definition of immobilized enzyme and using the continuous method described therein.
Claims (5)
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US80728977A | 1977-06-16 | 1977-06-16 | |
US80728977 | 1977-06-16 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI781911A FI781911A (en) | 1978-12-17 |
FI64642B FI64642B (en) | 1983-08-31 |
FI64642C true FI64642C (en) | 1983-12-12 |
Family
ID=25196025
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI781911A FI64642C (en) | 1977-06-16 | 1978-06-15 | FRAMEWORK FOR FRUIT PROCESSING IN ENCLOSURE FRUIT INSIDE PRODUCTS |
Country Status (36)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6013677B2 (en) |
AR (1) | AR223648A1 (en) |
AT (1) | AT364657B (en) |
AU (1) | AU3669278A (en) |
BE (1) | BE868122A (en) |
BR (1) | BR7803835A (en) |
CA (1) | CA1117047A (en) |
CH (1) | CH648059A5 (en) |
CS (1) | CS241460B2 (en) |
CU (1) | CU34936A (en) |
DD (1) | DD140415A5 (en) |
DE (1) | DE2826111A1 (en) |
DK (1) | DK269778A (en) |
ES (1) | ES470766A1 (en) |
FI (1) | FI64642C (en) |
FR (1) | FR2394253A1 (en) |
GB (1) | GB2000144B (en) |
GR (1) | GR73593B (en) |
HU (1) | HU181413B (en) |
IE (1) | IE46985B1 (en) |
IL (1) | IL54857A (en) |
IT (1) | IT1098335B (en) |
LU (1) | LU79816A1 (en) |
NL (1) | NL7806475A (en) |
NO (1) | NO145641C (en) |
NZ (1) | NZ187436A (en) |
OA (1) | OA05986A (en) |
PH (1) | PH14418A (en) |
PL (1) | PL121700B1 (en) |
PT (1) | PT68167A (en) |
RO (1) | RO78764B (en) |
SE (1) | SE439928B (en) |
SU (1) | SU1230469A3 (en) |
TR (1) | TR20267A (en) |
YU (1) | YU40830B (en) |
ZA (1) | ZA783102B (en) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB2072679B (en) * | 1980-03-31 | 1983-11-09 | Meiji Seika Kaisha | Sweetener |
JPS56154967A (en) * | 1980-03-31 | 1981-11-30 | Meiji Seika Kaisha Ltd | Sweetening agent and its preparation |
US4309505A (en) * | 1980-05-19 | 1982-01-05 | Cpc International Inc. | Process for the production of fructose transferase enzyme |
US4335207A (en) | 1980-06-03 | 1982-06-15 | Cpc International Inc. | Process for the production of high fructose syrups and ethanol |
US4317880A (en) | 1980-06-03 | 1982-03-02 | Cpc International Inc. | Process for the production of fructose polymers and high fructose syrups |
JPS5840065A (en) * | 1981-09-01 | 1983-03-08 | Meiji Seika Kaisha Ltd | Low-caloric sweetening agent and preparation of low- caloric food and drink with the same |
JPS6034134A (en) * | 1983-08-05 | 1985-02-21 | Meiji Seika Kaisha Ltd | Feed containing fructoligosaccharide and feeding of domestic animals therewith |
CA1246556A (en) * | 1984-07-24 | 1988-12-13 | Hiroshi Yamazaki | Production of fructose syrup |
JPS6214792A (en) * | 1985-07-10 | 1987-01-23 | Meiji Seika Kaisha Ltd | Production of composition containing large amount of fructooligosaccharide |
JPS63313128A (en) * | 1987-06-17 | 1988-12-21 | Hitachi Ltd | Liquid crystal display device |
US5215905A (en) * | 1989-12-29 | 1993-06-01 | Miwon Co., Ltd. | Immobilization of fructosyltransferase on a basic, porous anion-exchange resin |
FR2766333B1 (en) * | 1997-07-25 | 1999-10-01 | Roquette Freres | NOVEL SWEETENING COMPOSITION, PROCESS FOR PRODUCING THE SAME AND USES THEREOF |
CN108077882A (en) * | 2017-12-18 | 2018-05-29 | 南宁纵联科技有限公司 | A kind of method that functional form seasoning syrup is prepared using biological fermentation process |
-
1978
- 1978-05-30 ZA ZA783102A patent/ZA783102B/en unknown
- 1978-05-31 NZ NZ187436A patent/NZ187436A/en unknown
- 1978-05-31 AU AU36692/78A patent/AU3669278A/en active Pending
- 1978-06-01 GR GR56418A patent/GR73593B/el unknown
- 1978-06-02 IE IE1120/78A patent/IE46985B1/en unknown
- 1978-06-05 IL IL54857A patent/IL54857A/en unknown
- 1978-06-06 TR TR20267A patent/TR20267A/en unknown
- 1978-06-14 SE SE7806844A patent/SE439928B/en not_active IP Right Cessation
- 1978-06-14 DE DE19782826111 patent/DE2826111A1/en not_active Ceased
- 1978-06-14 ES ES470766A patent/ES470766A1/en not_active Expired
- 1978-06-14 PT PT68167A patent/PT68167A/en unknown
- 1978-06-14 RO RO94360A patent/RO78764B/en unknown
- 1978-06-14 CA CA000305458A patent/CA1117047A/en not_active Expired
- 1978-06-14 LU LU79816A patent/LU79816A1/en unknown
- 1978-06-15 AR AR272619A patent/AR223648A1/en active
- 1978-06-15 BR BR7803835A patent/BR7803835A/en unknown
- 1978-06-15 IT IT24618/78A patent/IT1098335B/en active
- 1978-06-15 CH CH6544/78A patent/CH648059A5/en not_active IP Right Cessation
- 1978-06-15 PL PL1978207653A patent/PL121700B1/en unknown
- 1978-06-15 PH PH21263A patent/PH14418A/en unknown
- 1978-06-15 BE BE2057061A patent/BE868122A/en unknown
- 1978-06-15 CS CS783948A patent/CS241460B2/en unknown
- 1978-06-15 DK DK269778A patent/DK269778A/en not_active Application Discontinuation
- 1978-06-15 GB GB7827046A patent/GB2000144B/en not_active Expired
- 1978-06-15 NO NO782083A patent/NO145641C/en unknown
- 1978-06-15 FI FI781911A patent/FI64642C/en not_active IP Right Cessation
- 1978-06-15 HU HU78CE1168A patent/HU181413B/en unknown
- 1978-06-15 NL NL7806475A patent/NL7806475A/en not_active Application Discontinuation
- 1978-06-15 YU YU1424/78A patent/YU40830B/en unknown
- 1978-06-15 AT AT0435878A patent/AT364657B/en not_active IP Right Cessation
- 1978-06-15 DD DD78206028A patent/DD140415A5/en unknown
- 1978-06-15 JP JP53071561A patent/JPS6013677B2/en not_active Expired
- 1978-06-15 SU SU782626705A patent/SU1230469A3/en active
- 1978-06-16 CU CU7834936A patent/CU34936A/en unknown
- 1978-06-16 FR FR7818074A patent/FR2394253A1/en active Granted
- 1978-06-16 OA OA56530A patent/OA05986A/en unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Mahoney | Galactosyl-oligosaccharide formation during lactose hydrolysis: a review | |
US4335207A (en) | Process for the production of high fructose syrups and ethanol | |
FI64642C (en) | FRAMEWORK FOR FRUIT PROCESSING IN ENCLOSURE FRUIT INSIDE PRODUCTS | |
US4276379A (en) | Preparation of high fructose syrups from sucrose | |
US4356262A (en) | Process for the production of high fructose syrups and ethanol | |
Wiederschain et al. | Two forms of α-L-fucosidase from pig kidney and their action on natural oligosaccharides | |
FI58513B (en) | REFERENCE TO A FRUIT FRAMSTAELLNING AV ETT STABILT GLUCOSISOMERASENZYMKONCENTRAT | |
US4317880A (en) | Process for the production of fructose polymers and high fructose syrups | |
US4423150A (en) | Preparation of high fructose syrups from sucrose | |
DK172373B1 (en) | Process for Preparing Sugar Compounds | |
US11970691B2 (en) | Immobilized thermostable trehalose synthase and method for producing trehalose and trehalulose by using same | |
US5296360A (en) | Process for producing ganglioside GM1 | |
JP3163437B2 (en) | Preparation method of new mannose | |
US4774183A (en) | Process for producing fructose | |
Ueda et al. | Polysaccharide Produced by the Genus Pullularia: II. Trans-α-Glucosidation by Acetone Cells of Pullularia | |
WO2019035482A1 (en) | Protein exhibiting epimerization activity | |
Charles et al. | Preparation and use of enzymatic material from P. lilacinum to yield clinical dextran | |
EP4276181A1 (en) | Methods for producing d-mannose isomerase and d-fructose | |
JP3630378B2 (en) | Method for producing galactosylglycerols | |
EP0110574A2 (en) | Process for preparing high-dextrose starch hydrolysates with immobilized glucoamylase | |
GB2048887A (en) | Saccharification of starch hydrolyzates using glucoamylase immobilized on porous alumina | |
KR810001443B1 (en) | Preparation of high fructose syrups from sucrose | |
JP4819240B2 (en) | Process for producing purified N-acetyllactosamine | |
JPH0568239B2 (en) | ||
JPH03188093A (en) | Novel saccharide and production thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM | Patent lapsed |
Owner name: CPC INTERNATIONAL INC. |