CS241460B2 - Method of fructose containing product preparation from saccharase - Google Patents
Method of fructose containing product preparation from saccharase Download PDFInfo
- Publication number
- CS241460B2 CS241460B2 CS783948A CS394878A CS241460B2 CS 241460 B2 CS241460 B2 CS 241460B2 CS 783948 A CS783948 A CS 783948A CS 394878 A CS394878 A CS 394878A CS 241460 B2 CS241460 B2 CS 241460B2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- fructose
- enzyme
- sucrose
- product
- preparation
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 79
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 title claims abstract description 56
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 title claims abstract description 49
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 title claims abstract description 49
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 48
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 title claims description 9
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 title description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims abstract description 57
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims abstract description 57
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims abstract description 57
- 108010042889 Inulosucrase Proteins 0.000 claims abstract description 37
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 48
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 45
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 45
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 45
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 claims description 30
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 23
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 23
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 claims description 22
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 claims description 22
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 17
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 17
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 17
- 241000223678 Aureobasidium pullulans Species 0.000 claims description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 61
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 18
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract description 18
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract description 18
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 abstract description 18
- 230000006099 transfructosylation Effects 0.000 abstract description 10
- 229920001218 Pullulan Polymers 0.000 abstract description 9
- 235000021433 fructose syrup Nutrition 0.000 abstract description 9
- 235000019423 pullulan Nutrition 0.000 abstract description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract 1
- 229960002737 fructose Drugs 0.000 description 50
- 239000000047 product Substances 0.000 description 49
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 44
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 14
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 13
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 13
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 13
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 11
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 10
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000004373 Pullulan Substances 0.000 description 8
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 8
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 5
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 5
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 description 4
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 229920001284 acidic polysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 150000004805 acidic polysaccharides Chemical class 0.000 description 4
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 229960004903 invert sugar Drugs 0.000 description 3
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 241001480003 Chaetothyriales Species 0.000 description 2
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 208000007976 Ketosis Diseases 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 229940077731 carbohydrate nutrients Drugs 0.000 description 2
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 2
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 150000002584 ketoses Chemical class 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000011169 microbiological contamination Methods 0.000 description 2
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187844 Actinoplanes Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000008733 Citrus aurantifolia Nutrition 0.000 description 1
- 241000203813 Curtobacterium Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000187134 Streptomyces olivochromogenes Species 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- 235000011941 Tilia x europaea Nutrition 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000012511 carbohydrate analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- -1 dextrose carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229940111685 dibasic potassium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 230000009229 glucose formation Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011810 insulating material Substances 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 238000003600 isomerase activity assay Methods 0.000 description 1
- 239000004571 lime Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 1
- 239000011088 parchment paper Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000004014 plasticizer Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000012088 reference solution Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 229920001864 tannin Polymers 0.000 description 1
- 239000001648 tannin Substances 0.000 description 1
- 235000018553 tannin Nutrition 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
- C08B37/0051—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Fructofuranans, e.g. beta-2,6-D-fructofuranan, i.e. levan; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C13—SUGAR INDUSTRY
- C13K—SACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
- C13K11/00—Fructose
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Jellies, Jams, And Syrups (AREA)
- Storage Of Fruits Or Vegetables (AREA)
Abstract
Description
Postup · podle vynálezu se provádí zpracováním vodného· roztoku sacharózy · a hmotnostní koncentraci 10 až 80 % pomocí fruktosyltransferázového enzymu odvozeného od Pullularia pullulans při teplotě 25 až 65 °C. a při hodnotě pH 4,5 až 6,5. Takto· vzniklý produkt obsahuje dextrózu, fruktózu a po· lysacharidy s obsahem přinejmenším 66 ·%' hmotnostních fruktosylových zbytků, které jsou · · .-spojeny (2-l)-beta vazbami. Tento· produkt· · se případně zpracovává ve druhém stupni · pomocí izomerázového enzymu za účelem izomerizace části· dextrózy na fruktózu. · Ve třetím stupni se provádí hydrolýza pomocí invertázového enzymu nebo kyseliny v nepřítomnosti izomerázového enzymu.......The process according to the invention is carried out by treating an aqueous sucrose solution and a concentration of 10 to 80% by weight with a fructosyltransferase enzyme derived from Pullularia pullulans at a temperature of 25 to 65 ° C. and at a pH of 4.5 to 6.5. The product thus obtained contains dextrose, fructose and polysaccharides containing at least 66% by weight of fructosyl residues which are linked by (2-l) -beta bonds. This product is optionally treated in the second step with an isomerase enzyme to isomerize a portion of the dextrose to fructose. · In the third step, hydrolysis is carried out using an invertase enzyme or an acid in the absence of an isomerase enzyme .......
Tímto postupem se získá sirup s vysokým obsahem fruktózy, aniž by bylo . nutné provádět · fyzikální oddělování výsledného ' fruktózového produktu.By this process a high fructose syrup is obtained without. physical separation of the resulting fructose product is necessary.
Vynález se týká způsobu přípravy produktu obsahujícího fruktózu ze sacharózy, přičemž se vychází ze substrátu, který obsahuje fruktózový polymer. Obecně náleží postup podle vynálezu к postupům enzymatické transfruktosylace sacharózy.The invention relates to a process for preparing a fructose-containing product from sucrose starting from a substrate comprising a fructose polymer. In general, the process of the invention belongs to enzymatic transfructosylation processes of sucrose.
Vzhledem к tomu, že se v daném oboru používá mnoho termínů, a rovněž i v popisu uvedeného vynálezu bude použito větší množství různých termínů, jsou v následujícím textu uvedeny definice některých základních termínů, které budou i nadále použity v celém dalším textu.Since many terms are used in the art, and many different terms will also be used in the description of the present invention, definitions of some basic terms will be used in the following, which will continue to be used throughout.
Glukóza a dextrózaGlucose and dextrose
Termínem ,,glukóza“ a ,,dextróza“ se míní v tomto vynálezu stejný produkt, který je používán zaměnitelně a zahrnuje tento uvedený monosacharid v jakékoliv formě v roztoku nebo v suché formě.The terms " glucose " and " dextrose " refer to the same product as used interchangeably herein and include the monosaccharide in any form in solution or in dry form.
Sacharóza.Sucrose.
Termínem „sacharóza“ se míní v uvedeném textu tento uvedený disacharid v rafinované nebo surové formě, v roztoku nebo v suché formě, který se získá z jakéhokoliv zdroje sacharózového surového materiálu, jakým je například cukrová třtina nebo cukrová řepa. Při praktickém provádění postupu podle uvedeného vynálezu se tento výchozí sacharózový materiál obyčejně používá ve formě vodného roztoku.The term "sucrose" as used herein refers to said disaccharide in refined or crude form, in solution or in dry form, obtained from any source of sucrose raw material, such as sugar cane or sugar beet. In practice, the starting sucrose material is typically used in the form of an aqueous solution.
Fruktóza a levulóza.Fructose and levulose.
Termínem „fruktóza“ a „levulóza“ se v tomto textu míní stejný uvedený produkt, navzájem zaměnitelný, který znamená izomer dextrózy, který je sladší než dextróza. Fruktóza se nalézá v medu a v invertním cukru, společně s dextrózou, přičemž tento produkt je cenným materiálem z hlediska jeho sladkosti. Termínem fruktóza a levulóza, jak již bylo uvedeno, se míní stejný vzájemně zaměnitelný produkt vztahující se к uvedenému monosacharidu, který se může vyskytovat v jakékoliv formě, jako například v roztoku nebo v suché formě.The terms "fructose" and "levulose" are used herein to refer to the same product, interchangeable, which is a dextrose isomer that is sweeter than dextrose. Fructose is found in honey and invert sugar, along with dextrose, which is a valuable material in terms of its sweetness. The term fructose and levulose, as mentioned above, refers to the same interchangeable product relating to said monosaccharide, which may be present in any form, such as in solution or in dry form.
Enzymatický přípravek.Enzymatic preparation.
Výše uvedeným termínem „enzymatický přípravek“ se míní v tomto textu jakákoliv směs hmoty, která projevuje požadovanou enzymatickou aktivitu. Tímto termínem se například míní nativní celé buňky, buněčné extrakty a koncentrované přípravky, které se připraví z buněk a z kultivačního prostředí. Uvedené enzymatické přípravky mohou být použity buďto ve formě roztoku nebo v immobilizované formě při praktickém provádění postupu podle vynálezu.As used herein, the term "enzyme preparation" refers to any mixture of matter which exhibits the desired enzymatic activity. For example, the term refers to native whole cells, cell extracts, and concentrated preparations that are prepared from cells and from the culture medium. Said enzyme preparations may be used either in solution or immobilized form in the practice of the invention.
Izomerázový enzym.Isomerase enzyme.
Enzymatický přípravek, který je schopen izomerizovat dextrózu na levulózu, se v uvedeném textu označuje jako „izomerázový enzym“. Tyto uvedené enzymy jsou dostatečně známy z dosavadního stavu techniky, přičemž se označují jako dextrózoizomeráza, xylózoizomeráza a glukózoizomeráza. Tyto enzymy mohou být získány od mnoha různých vhodných mikroorganismů. Jako- příklad těchto vhodných mikroorganismů je možno uvést mikroorganismy rodu Streptomyces, Bacillus, Arthrobacter, Actinoplánes, Curtobacterium a jiné další mikroorganismy.An enzyme preparation capable of isomerizing dextrose to levulose is referred to herein as an "isomerase enzyme". These enzymes are well known in the art and are referred to as dextrose isomerase, xylose isomerase, and glucose isomerase. These enzymes can be obtained from many different suitable microorganisms. Examples of suitable microorganisms include microorganisms of the genera Streptomyces, Bacillus, Arthrobacter, Actinoplanes, Curtobacterium and other microorganisms.
Ve výhodném provedení postupu podle uvedeného vynálezu se jako izomerázového enzymu používá při praktickém provádění produktu odvozeného od mikroorganismu Streptomyces olivochromogenes ATCC No. 21713, ATCC No. 21714 nebo ATCC No. 21715 [poslední z uvedených je izolátem z kolonie vypěstované z jedné buňky ATCC 21713), jak je to uvedeno v patentu Spojených států amerických č. 3 813 318 a v patentu Spojených . států amerických číslo 3 957 587 ž 23. června 1975, a zvláště jestliže se postupuje podle postupu, který je popsán v patentu Spojených států amerických č. 3 770 589 nebo v patentu Spojených států amerických č. 3 813 318.In a preferred embodiment of the process of the present invention, the use of the product derived from the microorganism Streptomyces olivochromogenes ATCC No. 5 is used as an isomerase enzyme. ATCC No. 21713 21714 or ATCC No. 21715 [the latter being an isolate from a colony grown from a single cell of ATCC 21713), as disclosed in U.S. Patent 3,813,318 and U.S. Pat. No. 3,957,587 to Jun. 23, 1975, and especially when the procedure described in U.S. Patent No. 3,770,589 or U.S. Patent No. 3,813,318 is followed.
V nedávné době byly vyvinuty postupy, při kterých se izomerázový enzym immobi. lizuje na inertním nosičovém materiálu, který je nerozpustný ve vodě. Výše uvedený immobilizovaný enzym je potom vhodný к použití při kontinuální konverzi glukózy na sirup s vysokým obsahem fruktózy. Příklady těchto postupů je možno nalézt v patentech Spojených států amerických číslo 3 708 397, 3 788 945, 3 850 751, 3 868 304; v belgickém patentu č. 819 859 a v patentu Spojených států amerických č. 3 960 663 (belgický patent č. 810 480).Recently, processes have been developed in which the isomerase enzyme is immobi. It is formed on an inert carrier material which is insoluble in water. The above immobilized enzyme is then suitable for use in the continuous conversion of glucose to high fructose syrup. Examples of such procedures can be found in U.S. Patent Nos. 3,770,397, 3,788,945, 3,850,751, 3,868,304; in Belgian Patent No. 819,859 and in United States Patent No. 3,960,663 (Belgian Patent No. 810,480).
Izomerázová jednotka.Isomerase unit.
„Izomerázová jednotka“ je definována jako množství enzymatické aktivity, které je potřebné к přípravě jednoho mikromolu levulózy za minutu za izomerizačních podmínek, které budou dále uvedeny pod odstavcem „zjišťování izomerázové aktivity“.An "isomerase unit" is defined as the amount of enzymatic activity that is required to prepare one micromole of levulose per minute under isomerization conditions, which will be referred to below under "isomerase activity assay".
Zjišťování izomerázové aktivity.Detection of isomerase activity.
Pod tímto termínem se míní v tomto textu testovací postup, který zahrnuje provádění spektrofotometrického stanovení ketózy produkované z roztoku glukózy za standardních podmínek.By this term is meant a test procedure that includes performing spectrophotometric determination of ketose produced from a glucose solution under standard conditions.
Zásobní roztok se připraví následujícím způsobem:Stock solution is prepared as follows:
Zásobní roztok pro výše uvedený test:Stock solution for the above test:
Složka MnožstvíComponent Quantity
0,1 M MgSOd. 7 HžO 1 ml0.1 M MgSO4. 7 H2O 1 ml
0,001 M C0CI2.6 H2O 1 ml0.001 M COCl2.6 H2O 1 ml
M fosforečnan sodný jako tlumič, pH 7,5 0,5 ml bezvodá D-glukóza 1,44 gM sodium phosphate buffer, pH 7.5 0.5 ml anhydrous D-glucose 1.44 g
К těmto složkám se přidá destilovaná voda v množství, odpovídajícímu celkovému objemu 7,5 mililitru.Distilled water is added to these components in an amount corresponding to a total volume of 7.5 milliliters.
Enzymatický přípravek, který je určen к testování, se nejprve zředí tak, aby obsahoval 1 až 6 izomerázových jednotek na mililitr.The enzyme preparation to be tested is first diluted to contain 1 to 6 isomerase units per milliliter.
Enzymatická izomerace se podle uvedeného vynálezu provede tak, že se přidá 1 mililitr enzymatického přípravku ke 3 mililitrům zásobního roztoku a inkubace probíhá po dobu 30 minut při teplotě 60 °C. Ke konci tohoto inkubačního období se odebere 1 mililitr alikvotního podílu a prudce se zchladí v objemu 9 mililitrů 0,5 N kyseliny chloristé. Takto získaný rychle zchlazený alikvotní podíl se potom zředí na celkový objem 250 mililitrů. Jako kontrolní vzorek pro srovnávací účely se připraví glukózový srovnávací roztok, přičemž v tomto roztoku se nahradí 1 mililitr enzymatického přípravku 1 mililitrem vody na počátku inkubačního období. 'The enzymatic isomerization according to the invention is carried out by adding 1 ml of the enzyme preparation to 3 ml of the stock solution and incubating for 30 minutes at 60 ° C. At the end of this incubation period, 1 ml aliquot was removed and quenched in a volume of 9 ml of 0.5 N perchloric acid. The rapidly cooled aliquot was then diluted to a total volume of 250 mL. A glucose reference solution is prepared as a reference for comparison, replacing 1 ml of the enzyme preparation with 1 ml of water at the beginning of the incubation period. '
Obsah ketózy se potom stanoví metodou s cysteinem a kyselinou sírovou. Pro účely tohoto testu se jedna izomerázová jednotka definuje jako množství enzymatické aktivity, které je potřebné к vyprodukování jednoho mikromolu levulózy za minutu za uvedených stanovených izomerizačních podmínek.The ketose content is then determined by the cysteine and sulfuric acid method. For the purposes of this assay, one isomerase unit is defined as the amount of enzymatic activity required to produce one micromole of levulose per minute under the stated isomerization conditions.
Transfruktosylace.Transfructosylation.
Tímto termínem se míní v uvedeném textu převedení fruktosylové části z donoru, to znamená ze sacharózy, na akceptor, to znamená na polysacharid.By this term is meant the conversion of the fructosyl moiety from a donor, i.e. from sucrose, to an acceptor, i.e. to a polysaccharide.
Fruktosyltransferáza.Fructosyltransferase.
Tímto výše uvedeným termínem se v textu uvedeného vynálezu míní jakýkoliv enzym, který katalyzuje transfruktosylaci a zahrnuje enzymatický přípravek odvozený od Pullularia pullulans ATCC 9 348 (synonym s Aureobasidium pullulans).As used herein, any enzyme that catalyzes transfructosylation and includes an enzyme preparation derived from Pullularia pullulans ATCC 9 348 (synonymous with Aureobasidium pullulans).
Fruktosyltransferázová jednotka.Fructosyltransferase unit.
V textu uvedeného vynálezu je jedna fruktosyltransferázová jednotka definována jako množství enzymatické aktivity, které je potřebné к vyprodukování jednoho mikromolu redukujícího cukru, vyjádřeno jako glukóza, za minutu za dále uvedených podmínek:In the present invention, one fructosyltransferase unit is defined as the amount of enzymatic activity required to produce one micromole of reducing sugar, expressed as glucose, per minute under the following conditions:
— pH 5,5 — teplota 55 °C — koncentrace substrátu činí 60 gramů sacharózy potravinářské jakosti na 100 mililitrů vodné reakční směsi.- pH 5.5 - temperature 55 ° C - substrate concentration is 60 grams of food grade sucrose per 100 milliliters of aqueous reaction mixture.
Stanovení obsahu redukujícího cukru (vyjádřeno jako glukóza) se provede na běžně používaném zařízení. Analýza se provádí běžnou alkalickou ferrokyanidovou metodou, viz např.: Analytical Biochemistry 45, No. 2, str. 517—524 (1972), která se přizpůsobí na výše uvedené zařízení. Pokud nebude jinak uvedeno, provádí se všechna stanovení enzymatické aktivity kontinuálním sledováním reakční směsi, která je tvořena následujícími složkami:The determination of the reducing sugar content (expressed as glucose) is carried out on a commonly used apparatus. The analysis is carried out by the conventional alkaline ferrocyanide method, see, for example: 2, pp. 517-524 (1972), which adapts to the aforementioned device. Unless otherwise indicated, all determinations of enzymatic activity are carried out by continuously monitoring the reaction mixture, which consists of the following components:
— 7,5 mililitru 80% vodného roztoku sacharózy potravinářské jakosti (hmot./ /obj.) — 2,3 mililitru citronanového tlumiče o koncentraci 0,1 M a pH 5,5 — 0,2 mililitru enzymatického vzorku, obsahující takové množství fruktosyltransferázy, které je schopné vyprodukovat 5—25 mikrogramů redukujícího cukru (vyjádřeno jako glukóza) za minutu na jeden mililitr reakční směsi.- 7,5 milliliters of a 80% aqueous solution of food grade sucrose (w / v) - 2,3 milliliters of 0,1 M citrate buffer at pH 5,5-0,2 milliliters of an enzymatic sample containing such an amount of fructosyltransferase capable of producing 5-25 micrograms of reducing sugar (expressed as glucose) per minute per milliliter of reaction mixture.
Primární substrát.Primary substrate.
Termínem „primární substrát“, který je použit v textu tohoto vynálezu, se míní takové sacharidy ve vhodné formě, které obsahují fruktosylovou část, která je к dispozici účastnit se transfruktosylace, jako je například vodný roztok sacharózy.The term "primary substrate" as used herein refers to such carbohydrates in a suitable form that contain a fructosyl moiety that is available to participate in transfructosylation, such as an aqueous solution of sucrose.
Sekundární substrát.Secondary substrate.
Termínem „sekundární substrát“, který je použit v tomto textu, se míní reakční produkt, který se získá tak, že se podrobí primární substrát působení fruktosyltransferázového přípravku, jak bylo uvedeno výše.The term "secondary substrate" as used herein refers to a reaction product obtained by subjecting the primary substrate to a fructosyltransferase preparation as described above.
Díly a procenta.Parts and percentages.
V tomto textu jsou všechny díly uváděny jako díly hmotnostní a všechna procenta jako procenta hmotnostní na objem (hmot./ /obj.), pokud nebude výslovně uvedeno jinak.Throughout this text, all parts are by weight and all percentages are by weight by volume (w / v) unless explicitly stated otherwise.
Analýza vysokotlakou kapalinovou chromatografií.Analysis by high pressure liquid chromatography.
Tímto výše uvedeným termínem se míní postup, při kterém se sirupy získané postupem podle uvedeného vynálezu analyzují za použití vysokotlaké kapalinové chromatografické metody, která se provede následu241460 jícím · způsobem. Složky se chromatografují elucí vodou z kationtové výměnné pryskyřice ve vápenné formě. Eluované složky se stanoví za pomoci diferenciálního refraktometru. Množství nedextrózních sacharidů se stanoví elektronickým integrátorem, a obsah dextrózy se stanoví z rozdílu. Obecný postup této metody · je· uveden v článku: Analisis of Carbohydrate Mixtures by liquid Chromatography, Am. Soc. Brew. . Chem. Proč., 1973, str. · 43—46.By the aforementioned term is meant a process in which the syrups obtained by the process of the present invention are analyzed using a high pressure liquid chromatography method which is carried out in the following manner. The components are chromatographed by eluting with water from the cation exchange resin in lime form. The eluted components are determined using a differential refractometer. The amount of non-dextrose carbohydrates is determined by an electronic integrator, and the dextrose content is determined by difference. The general procedure for this method is given in: Analisis of Carbohydrate Mixtures by Liquid Chromatography, Am. Soc. Brew. . Chem. Proc., 1973, pp. 43-46.
Podstata ·způsobu přípravy produktu obsahujícího fruktózu ze sacharózy spočívá podle · uvedeného vynálezu v tom, že se zpracovává· vodný roztok sacharózy o hmotnostní · koncentraci v rozmezí od 10 % do 80 % pomocí fruktosyltransferázového enzymu odvozeného · · od · · Pullularia pullulans, při teplotě · · pohybující · se v rozmezí · · od 25 do 65 °C a při hodnotě pH v rozmezí od 4,5 do 6,5, za vzniku produktu obsahujícího dextrózu, fruktózu - a polysacharidy, s obsahem přinejmenším 66 % hmotnostních · fruktosylových zbytků, přičemž tyto· fruktosylové zbytky · jsou · spojeny · · [2-l-)beta vazbami, přičemž se případně zpracovává získaný produkt v prvním stupni · k ízomerizaci · části dextrózy na · fruktózu · pomocí izpmerázového enzymu, a · · ve třetím stupni · se provádí hydrolýza pomocí · · invertázového enzymu nebo· kyseliny v nepřítomnosti · izomerázového enzymu.According to the present invention, a process for preparing a fructose-containing product from sucrose consists in treating an aqueous sucrose solution having a concentration in the range of 10% to 80% by the fructosyltransferase enzyme derived from Pullularia pullulans at a temperature of Ranging from 25 to 65 ° C and at a pH of from 4.5 to 6.5 to produce a product containing dextrose, fructose - and polysaccharides, containing at least 66% by weight of fructosyl residues wherein the fructosyl residues are linked by [2-l-) beta bonds, optionally processing the product obtained in the first step to isomerize a portion of dextrose to fructose by an ispmerase enzyme, and in the third step · Hydrolysis is carried out by · · invertase enzyme or · acid in the absence of · isomerase enzyme.
Ve výhodném provedení postupu podle uvedeného vynálezu se uvedená sacharóza použije v koncentraci alespoň 20 % hmotnostních.Preferably, the sucrose is used at a concentration of at least 20% by weight.
Podle uvedeného· vynálezu je dále výhodné, · jestliže se produkt získaný v prvním stupni zpracuje · ve druhém stupni mobilizovaným glukózoizomerázovým enzymem.According to the invention it is further preferred that the product obtained in the first step is treated in the second step with a mobilized glucose isomerase enzyme.
Rovněž je výhodné podle vynálezu, jestliže se před provedením hydrolýzy polysacharidy fyzikálně oddělí od dextrózy a fruktózy. Výhodné je jestliže se uvedené polysacharidy oddělí ultrafiltrací.It is also advantageous according to the invention if the polysaccharides are physically separated from dextrose and fructose prior to hydrolysis. Preferably, said polysaccharides are separated by ultrafiltration.
Výhody postupu podle uvedeného vynálezu spočívají v tom, že se enzymatickým způsobem připraví sirupy s vysokým obsahem fruktózy, přičemž tento· obsah fruktózy je podstatně vyšší než u produktů · získaných glukózovou izomerizací škrobových hydrolyzátů podle dosavadního stavu techniky, aniž by bylo· nutné provádět fyzikální oddělování výsledného fruktózového koncového produktu. Postup podle uvedeného vynálezu se dá částečně · aplikovat na postup přípravy fruktózových sirupů, které obsahují více · než 55 % fruktózy.The advantages of the process according to the invention are that syrups with a high fructose content are prepared in an enzymatic manner, the fructose content being substantially higher than the products obtained by glucose isomerization of the prior art starch hydrolysates without the need for physical separation. the resulting fructose end product. The process of the present invention may be partially applied to a process for the preparation of fructose syrups containing more than 55% fructose.
Postupem podle uvedeného· vynálezu je možno získat četné · produkty. Tyto produkty zahrnují jednak konečnou fruktózu nebo sirup s vysokým obsahem fruktózy, · a rovněž · i různé přechodné produkty, jako· je například fruktózový polymer, substrát obsahující počáteční fruktózový polymer [nebo polysacharid), substrát · ze · kterého byl odstraněn · polymer a substrát obsahující nebo neobsahující polymer po izomerizaci.Numerous products can be obtained by the process of the present invention. These products include, on the one hand, a final fructose or high fructose syrup, as well as various intermediate products, such as a fructose polymer, a substrate containing a fructose starting polymer (or polysaccharide), a substrate from which the polymer and the substrate have been removed containing or not containing polymer after isomerisation.
Každý · z těchto uvedených produktů je možno přímo použít podle jejich · vlastností.Each of these products can be used directly according to their properties.
Každý · z těcbto produktů má · vlastnosti běžných cukrů a sirupů a · tyto· produkty mohou být použity · podle jejich obvyklých účelů použití. Tyto možnosti použití zahrnují například · použití jako sladících přísad a jako surového materiálu pro potravinářský průmysl a pro přípravu farmaceutických přípravků. Kromě toho· mohou být uvedené produkty použity pro běžné průmyslové účely, které jsou známé pro cukry a sirupy. · Například je možno· uvést, že tyto produkty je možno použít při výrobě lepidel, stabilizátorů vlhkosti potravin, při přípravě pergamenového· papíru, při výrobě třísliv, elektrických izolačníčh materiálů, při · přípravě pojiv· na jádra ve slévárenství, při · přípravě insekticidních přípravků, barviv a podobných jiných produktů a obecně je možno je použít · jako· plastifikátorů, zahušťovacích činidel · atd. Krátce řečeno, tyto produkty je možno použít ve · všech případech, kde se používají analogické produkty.Each of these products has the properties of conventional sugars and syrups, and these products can be used according to their normal purpose of use. Such applications include, for example, use as sweeteners and as raw material for the food industry and for the preparation of pharmaceutical preparations. In addition, the products can be used for common industrial purposes known for sugars and syrups. For example, these products can be used in the manufacture of adhesives, food moisture stabilizers, in parchment paper, in the manufacture of tannins, electrical insulating materials, in the preparation of binders for foundry cores, in the preparation of insecticidal products , dyes and the like and generally can be used as plasticizers, thickeners, etc. In short, these products can be used in all cases where analogous products are used.
Sekundární substrát, získaný při provádění postupu podle uvedeného vynálezu, může být použit jako· vysoce stabilní, nekrystalující sirup při různých · aplikacích v potravinářském průmyslu. Produkt získaný postupem podle · uvedeného vynálezu · je zároveň jedinečnou směsí s vysokým obsahem sušiny, přičemž je tento produkt odolný k mikrobiologickému znečištění · a k tvorbě barevných částic, a současně je možno· tento · produkt použít pro skladování nebo· na lodích nebo při obou těchto možnostech, jako cukerný koncentrát o koncentraci, která byla dříve · nedosažitelná se zachováním výše uvedených vlastností. Kromě toho je třeba uvést, že tento nový sekundární substrát s vysokým obsahem suché složky může být podroben hydrolýze, za účelem získání invertní cukrové směsi, která má požadovanou sladící schopnost. Tento nový sekundární substrát, získaný postupem podle uvedeného· vynálezu má obsah suché · složky pohybující se · v rozmezí od 70 % do asi 82 · % hmot./hmot., a obsahuje monosacharidickou frakci, která · sestává v podstatě z dextrózy a polysacharidových polymerů, s přebytkem DPž, sestávající převážně z DPs produktu. Rovněž je přítomno malé · množství DP4+· polymerů (4,1 % a méně).The secondary substrate obtained in the process of the present invention can be used as a highly stable, non-crystalline syrup in various applications in the food industry. At the same time, the product obtained by the process of the present invention is a unique high dry matter composition which is resistant to microbiological contamination and to the formation of colored particles and can also be used for storage or on ships or both options such as a sugar concentrate at a concentration that was previously unreachable while maintaining the above properties. In addition, the novel high dry component secondary substrate may be hydrolyzed to provide an invert sugar blend having the desired sweetening ability. The novel secondary substrate obtained by the process of the present invention has a dry component content ranging from 70% to about 82% w / w and comprises a monosaccharide fraction consisting essentially of dextrose and polysaccharide polymers. , with an excess of DPz consisting mainly of DPs of the product. Small amounts of DP4 + polymers (4.1% or less) are also present.
Při provádění postupu ·podle uvedeného vynálezu se · podrobí primární substrát, · ' to· znamená sacharóza, působení fruktosyltransferázového přípravku, který je schopen převést sacharózu na produkt obsahující frakci monosacharidů, která obsahuje jako hlavní podíl flúktózu a dále obsahuje· menší podíl fruktózy, · na polysacharidy, které obsahují přinejmenším 66 % hmotnostních fruktosylových částí.. Tento produkt tvoří sekundární substrát podle uvedeného vynálezu. Tyto výše uvedené polysacharidy sekundárního substrátu zahrnují všechny δIn carrying out the process of the present invention, the primary substrate, i.e. sucrose, is subjected to a fructosyltransferase preparation which is capable of converting sucrose into a product containing a monosaccharide fraction containing a major proportion of flucose and a minor proportion of fructose. to polysaccharides containing at least 66% by weight of fructosyl moieties. This product constitutes the secondary substrate of the present invention. The above-mentioned secondary substrate polysaccharides include all δ
polymery obsahující fruktózu (na rozdíl od sacharózy), které obsahují dvě nebo více monosacharidických částí. Tyto výše uvedené polymery mohou být dále charakterizovány tím, že zahrnují polysacharidy obsahující fruktosylové části spojené (2->l)-beta vazbami. Jak bude uvedeno v dalším textu, polysacharidy získané za daných podmínek transfruktosylace je možno podle uvedeného vynálezu ovlivnit tak, že budou mít převážně předem stanovený charakter, v určitých mezích. Tak je možno například uvést, že je možno připravit sekundární substrát, ve kterém bude větší množství (to znamená přinejmenším 60 % molárních) polysacharidů oligomery, které obsahují 2 až 10 (to znamená DP 2—10), a běžně 3 až 6 (to znamená DP 3—6) monosacharidických částí. Potom se uvedená glukóza izomeruje (pomocí působení izomerázového enzymu) na fruktózu v přítomnosti uvedených polysacharidů, přičemž potom následuje hydrolýza Uvedených polysacharidů v nepřítomnosti aktivního izomerázového enzymu. Výše uvedenou hydrolýzu je možno provést enzymaticky, přičemž se použije invertázy, nebo se provede kyselá hydrolýza za mírných podmínek.fructose-containing polymers (as opposed to sucrose) containing two or more monosaccharide moieties. The above polymers can be further characterized by including polysaccharides containing fructosyl moieties linked by (2-> 1) -beta linkages. As described below, the polysaccharides obtained under the given transfructosylation conditions can be influenced according to the present invention to be predetermined in nature, within certain limits. For example, a secondary substrate may be prepared in which a greater amount (i.e. at least 60 mole%) of polysaccharides will contain oligomers containing 2 to 10 (i.e. DP 2-10), and typically 3 to 6 (e.g. means DP 3-6) monosaccharide moieties. Thereafter, said glucose isomerized (by the action of an isomerase enzyme) to fructose in the presence of said polysaccharides, followed by hydrolysis of said polysaccharides in the absence of an active isomerase enzyme. The above hydrolysis may be carried out enzymatically using invertase or acid hydrolysis under mild conditions.
Při provádění tohoto postupu mohou být výše uvedené polysacharidy odděleny od uvedené glukózy a uvedené fruktózy, a potom se provede hydrolýza stejným způsobem, jak již bylo předem uvedeno za vzniku sirupu s ultravysokým obsahem fruktózy, to znamená, že se získá sirup s obsahem fruktózy větším, než je 66 % hmotnostních a ve výhodném provedení je obsah větší než 90 % hmotnostních, přičemž tento produkt se získá přímo ze sekundárního substrátu podle uvedeného vynálezu, aniž by bylo zapotřebí provést izomerizaci dextrózy v uvedeném substrátu. Toto uvedené oddělení polysacharidů je možno provést běžným způsobem za pomoci běžných prostředků fyzikálního oddělování na bázi molekulárního oddělování, jako je například běžně prováděné membránové oddělování (to je například ultrafiltrace. dialýza), dále vysrážení z roztoku, absorpce na uhlíku a podobné další metody. Jako příklad těchto postupů membránového oddělování je možno uvést postupy v patentech Spojených států amerických č. 3 173 867, Re 26 097, 3 541 006 a 3 691 068.In carrying out the process, the above polysaccharides may be separated from said glucose and said fructose, and then hydrolyzed in the same manner as previously described to form an ultra-high fructose syrup, i.e. a fructose-containing syrup is obtained, %, and is preferably greater than 90% by weight, which product is obtained directly from the secondary substrate of the present invention without the need for isomerization of dextrose in the substrate. The separation of the polysaccharides can be carried out in a conventional manner using conventional means of physical separation based on molecular separation, such as conventional membrane separation (e.g., ultrafiltration, dialysis), solution precipitation, carbon absorption and the like. Examples of such membrane separation processes include those disclosed in U.S. Patent Nos. 3,173,867, Re 26,097, 3,541,006 and 3,691,068.
Výhodným způsobem přípravy podle uvedeného vynálezu je postup, při kterém se získává sirup s vysokým obsahem fruktózy. Při tomto postupu se podrobí sacharóza působení fruktosyltransferázového přípravku, jako je například přípravek odvozený od Pullularia pullulans, jako jsou ATCC 9 348, ATCC 12 535, NRRL 1 673, NRRL Y2 311, NRRL Y83 892, NRRL YB 3 861, NRRL 3 937 a ATCC 15 223. Získaný výsledný produkt, nebo sekundární substrát se podrobí působení izomerázového enzymu. Potom se izomerázový produkt hydrolyzuje v nepřítomnosti aktivního izomerázového enzymu.A preferred method of preparation of the present invention is a process wherein a high fructose syrup is obtained. In this procedure, sucrose is treated with a fructosyltransferase preparation, such as a preparation derived from Pullularia pullulans such as ATCC 9,348, ATCC 12,535, NRRL 1,673, NRRL Y2,311, NRRL Y83,892, NRRL YB 3,861, NRRL 3,937 and ATCC 15 223. The resulting product or secondary substrate is treated with an isomerase enzyme. Then, the isomerase product is hydrolyzed in the absence of an active isomerase enzyme.
Předpokládá se, že sekundární substrát, získaný při provádění postupu podle uvedeného vynálezu, získaný shora uvedeným způsobem, je novým produktem. Tento substrát je jedinečným způsobem vhodný pro izomerizaci a následnou hydrolýzu к přípravě sirupu, který obsahuje více než 55 % fruktózy, přičemž tento sirup se připraví tak, že se sacharóza podrobí působení fruktosyltransferázového přípravku.It is believed that the secondary substrate obtained by the process of the present invention obtained by the above process is a novel product. This substrate is uniquely suitable for isomerization and subsequent hydrolysis to produce a syrup containing more than 55% fructose, which syrup is prepared by subjecting sucrose to a fructosyltransferase preparation.
Postup podle uvedeného vynálezu probíhá přes substráty, které jsou vhodné pro enzymatickou izomerizaci a následnou hydrolýzu na sirupy, které obsahují více než 55 % fruktóžového sirupu, obsahující:The process of the present invention proceeds through substrates which are suitable for enzymatic isomerization and subsequent hydrolysis to syrups containing more than 55% fructose syrup, comprising:
— od asi 20 % do asi 60 % hmotnostních monosacharidů, které obsahují velké množství glukózy a malé množství fruktózy, a — od asi 70 °/o do asi 40 % polysacharidů, které obsahují více než 66 % hmotnostních fruktosylových částí.From about 20% to about 60% by weight of monosaccharides containing a large amount of glucose and a small amount of fructose, and from about 70% to about 40% polysaccharides containing more than 66% by weight of fructosyl moieties.
Zvláště výhodnými jsou sekundární substráty odvozené od sacharózy, připravené transfruktosylací v přítomnosti účinného množství fruktosyltransferázového přípravku, který je odvozen od rodu Pullularia pullulans ATCC '9 348, při těplotě pohybující se v rozmezí od 25 do 65 CC, a ve výhodném provedení postupu podle uvedeného vynálezu od 50 do 60 °C, a při hodnotě pH pohybující se v rozmezí od 4,5 do 6,5, a vé výhodném provedení postupu podle uvedeného vynálezu od 5,4 do 5,6. Výchozí použitá koncentrace sacharózy se může pohybovat dokonce na tak nízké hranici, jako je například 10 gramů na 100 mililitrů vody. Je ovšem výhodné používat při provádění postupu podle uvedeného vynálezu tak vysokou koncentraci suché složky, jak je to jenom možné, ve výhodném provedení postupu podle uvedeného vynálezu se tato koncentrace pohybuje v rozmezí od 30 gramů do 60 gramů na 100 mililitrů (za účelem dosažení maximální reakční rychlosti), až do bodu nasycení roztoku sacharózou (a až do vyšších koncentrací, jak ještě bude v dalším blíže objasněno).Particularly preferred are sucrose-derived secondary substrates prepared by transfructosylation in the presence of an effective amount of a fructosyltransferase preparation derived from the genus Pullularia pullulans ATCC '9 348 at a temperature ranging from 25 to 65 ° C, and preferably at a temperature of 25-65 ° C. of the invention at 50 to 60 ° C, and at a pH ranging from 4.5 to 6.5, and preferably from 5.4 to 5.6. The starting sucrose concentration used may be as low as 10 grams per 100 milliliters of water. However, it is preferred to use as high a concentration of dry component as possible in the process of the present invention, preferably in the range of 30 grams to 60 grams per 100 milliliters (for maximum reaction velocity), up to the saturation point of the solution with sucrose (and up to higher concentrations, as will be explained in more detail below).
К získání substrátu podle uvedeného vynálezu může být použito minimálně 0,5 jednotky fruktosyltransferázy na gram sacharózy. Obyčejně množství použitého enzymu nepřevyšuje 50 jednotek na gram sacharózy, neboť se berou v úvahu ekonomické důvody. Zvláště výhodné je při přípravě požadovaného sekundárního substrátu používat běžných provozních časů, a do výše uvedených provozních parametrů je možno zahrnout rozmezí 2 až 30 jednotek na gram sacharózy.At least 0.5 units of fructosyltransferase per gram of sucrose may be used to obtain the substrate of the present invention. Generally, the amount of enzyme used does not exceed 50 units per gram of sucrose, since economic considerations are taken into account. It is particularly preferred to use conventional operating times in the preparation of the desired secondary substrate, and a range of 2 to 30 units per gram of sucrose may be included in the above operating parameters.
Výše uvedené znaky postupu podle uvedeného vynálezu a další detailní provedení tohoto postupu budou zřejmá z následujících příkladů provedení.The foregoing features of the process of the present invention and further detailed embodiments thereof will be apparent from the following examples.
Postup přípravy fruktosyltransferázy, která je novým produktem, může probíhat tak, že se využije běžných fermentačních způsobů, které jsou například uvedeny v patentech Spojených států amerických číslo 3 565 756, 3 806 419, 3 535 123, a dále v článku S. Uedy a kol. Applied Microbiology, 11, 211—215 (1963). Ve výhodných provedeních postupu podle uvedeného vynálezu se používá nových separačních a čistících metod, které budou detailněji uvedeny v následujících příkladech.The process for preparing the fructosyltransferase, which is a novel product, can be carried out using conventional fermentation methods such as those disclosed in U.S. Patent Nos. 3,565,756, 3,806,419, 3,535,123, and S. Uedy, and col. Applied Microbiology, 11, 211-215 (1963). In preferred embodiments of the process of the present invention, new separation and purification methods are used, which will be described in more detail in the following examples.
Dále uvedený příklad je typickým fermentačním postupem přípravy enzymu z Pullularia pullulans ATCC 9 348.The following example is a typical fermentation process for preparing an enzyme from Pullularia pullulans ATCC 9,348.
PřikladlHe did
Příprava fruktosyltransferázového přípravku — celitový nosičPreparation of fructosyltransferase preparation - celite carrier
A. Fermentační postup použitý к přípravě enzymuA. Fermentation procedure used to prepare the enzyme
Médium použité pro přípravu inokula a к provedení fermentace za účelem přípravy enzymu má následující složení:The medium used for preparing the inoculum and for carrying out the fermentation to prepare the enzyme has the following composition:
0,5 % dvojsytný fosforečnan draselný0.5% dibasic potassium phosphate
0,1 % chlorid sodný0.1% sodium chloride
0,02 % heptahydrát síranu horečnatého 0,06 % síran amonný0.02% magnesium sulfate heptahydrate 0.06% ammonium sulfate
0,3 °/o kvasinkový extrakt0.3% yeast extract
7,5 % sacharóza (potravinářská jakost) hodnota pH média se upraví na 6,8.The pH of the medium is adjusted to 6.8 with 7.5% sucrose (food grade).
Zákvasné nádoby, což jsou Erlenmeyerovy láhve obsahující 100 mililitrů sterilního média, se inokulují kulturou černých kvasinek, Pullularia pullulans, ze šikmého agaru. Vybraný druh kvasinek, který se použije к provedení tohoto postupu podle uvedeného vynálezu je označen v katalogu Američan Type Culture Collection (Rockville, Maryland) pod číslem ATCC 9 348. Žákvasné nádoby se po zpracování na vratné třepačce, které probíhá po dobu 48 hodin při teplotě 32 °C, použijí к inokulaci jednolitrových Erlenmeyerových nádob, přičemž každá obsahuje 200 mililitrů předem definovaného média (viz výše). Koncentrace inokula je 0,5 % hmot./obj. Fermentace se provádí na vratné třepačce při teplotě 32 °C po dobu 7 dní.Fermentation flasks, which are Erlenmeyer flasks containing 100 ml of sterile medium, are inoculated with a culture of black yeast, Pullularia pullulans, from slant agar. The type of yeast that is used to carry out the process of the present invention is designated ATCC 9 348 in the American Type Culture Collection (Rockville, Maryland). After fermentation, the fermentation jars are processed for 48 hours at temperature 32 ° C, used to inoculate one liter Erlenmeyer flasks, each containing 200 ml of a predefined medium (see above). The inoculum concentration is 0.5% w / v. Fermentation is carried out on a reciprocating shaker at 32 ° C for 7 days.
B. Získání enzymu z fermentační živné půdyB. Recovery of enzyme from fermentation broth
Vzorky fermentační živné půdy ze čtyřiceti jednolitrových třepaných nádob se nalijí do společného prostoru a nádoby se opláchnou vodou, která se rovněž přidá к spojené živné půdě. Celkový konečný objem živné půdy po zředění je 12 litrů. Původní objem živné půdy je přibližně 8 litrů. Výše uvedený objem 12 litrů fermentační živné půdy se nechá projít Sharplovou kontinuální odstředivkou za účelem odstranění buněk kvasnic a buněčného odpadu. Kapalina nad usazeninou, která má podobu černého viskózního roztoku, se potom nadávkuje chloridem vápenatým do koncentrace 0,5 % hmot./obj. a hodnota pH roztoku takto získaného se upraví na 7,0 za pomoci hydroxidu sodného. Po tomto opatření se provede další zpracování pomocí výše uvedené Sharplesovy kontinuální odstředivky, přičemž se získá viskózní kapalina, která má světlejší barvu. Hodnota pH takto získané odbarvené kapaliny se potom upraví na hodnotuSamples of fermentation broth from forty 1 liter shake flasks are poured into a common space and the vessels are rinsed with water, which is also added to the combined broth. The total final volume of the broth after dilution is 12 liters. The original volume of culture medium is approximately 8 liters. The above volume of 12 liters of fermentation broth is passed through a Sharpl continuous centrifuge to remove yeast cells and cell debris. The supernatant, which is in the form of a black viscous solution, is then metered in with calcium chloride to a concentration of 0.5% w / v. and adjusting the pH of the solution so obtained to 7.0 with sodium hydroxide. After this, further processing is carried out with the aforementioned Sharples continuous centrifuge to give a viscous liquid having a lighter color. The pH of the bleached liquid thus obtained is then adjusted to pH
5,5 za pomoci kyseliny chlorovodíkové, a potom se do této kapalina nadávkuje 1 000 jednotek (jak je definováno v patentu Spojených států amerických č. 3 806 419) pullulanasy. Takto získaná výsledná živná půda se konzervuje toluenem (který je přidán až do nasycení) a přidaná pullulanaza se ponechá reagovat při teplotě okolí po dobu přes noc. Po digesci s pullulaliázou přes noc se do tohoto roztoku přidá 1% Grefco 503 Celíte a do této živné půdy se potom přidá aceton v množství dvou objemů (to znamená 24 litry). Po tomto opatření se vytvoří sraženina, která se oddělí filtrací a takto získaný filtrační koláč se promyje acetonem a usuší se při teplotě okolí. Takto oddělený filtrační koláč obsahuje nerozpustný fruktosyltransferázový enzym.5.5 with hydrochloric acid, and then 1000 units (as defined in U.S. Pat. No. 3,806,419) of pullulanase are metered into the liquid. The resulting broth is preserved with toluene (which is added until saturation) and the added pullulanase is allowed to react at ambient temperature overnight. After digestion with pullulalase overnight, 1% Grefco 503 Celite was added to this solution and then two volumes (i.e. 24 liters) of acetone was added to the broth. After this, a precipitate forms which is collected by filtration and the filter cake thus obtained is washed with acetone and dried at ambient temperature. The filter cake thus separated contains an insoluble fructosyltransferase enzyme.
Pokud se týče tohoto provedení podle příkladu 1, je třeba poznamenat, že přídavek chloridu vápenatého к výše uvedenému fermentačnímu prostředí, společně s úpravou hodnoty pH, se projeví v odstranění černého pigmentu a přítomných acidických polysacharidů. (Blíže o těchto acidických polysacharidech viz: Acta: Chem. Scand., 16, 615—622, 1962). Konečný enzymatický produkt je tímto к dispozici ve formě relativně čistého, bezbarvého přípravku. Tato výše uvedená čistící metoda tvoří charakteristický rys postupu podle uvedeného vynálezu,, přičemž umožňuje provádět poměrně jednoduchý čistící postup, za pomoci například odstřeďování, filtrace nebo vysrážení, za vzniku konečného produktu. Je tedy možno sumárně uvést, že podle tohoto výše uvedeného provedení postupu podle uvedeného vynálezu je možno oddělit acidické polysacharidy a černý pigment, které tvoří vedlejší produkty, z konečného fermentačního média černých kvasinek, Pullularia pullulans. Touto výše uvedenou metodou podle uvedeného vynálezu je možno připravit konečný enzymatický přípravek, který neobsahuje nežádoucí pigment a acidické polysacharidické vedlejší produkty, které vznikají během provádění fermentačního postupu. Pokud by se tyto vedlejší produkty neodstranily, potom dochází к současnému vysrážení těchto látek spolu s enzymem během přídavku rozpouštědla к fermentačnímu prostředí.With respect to this embodiment of Example 1, it should be noted that the addition of calcium chloride to the above fermentation broth, together with pH adjustment, results in the removal of the black pigment and the acidic polysaccharides present. (For more on these acidic polysaccharides, see: Acta: Chem. Scand., 16, 615-622, 1962). The final enzyme product is thus available in the form of a relatively pure, colorless preparation. This purification method is a feature of the process of the present invention, making it possible to carry out a relatively simple purification process, for example by centrifugation, filtration or precipitation, to give the final product. In summary, the acidic polysaccharides and the black pigment forming the by-products can be separated from the final fermentation medium of the black yeast, Pullularia pullulans. By the above method of the invention, a final enzyme preparation can be prepared which does not contain undesired pigment and acidic polysaccharide by-products formed during the fermentation process. If these byproducts were not removed, they co-precipitate with the enzyme during the addition of the solvent to the fermentation broth.
241480241480
Dále ’ se jeví jako nutné provést při výrobě enzymatického přípravku podle · uvedeného· vynálezu čištění tohoto přípravku · od pululanových polysacharidů, které jsou · inherentně přítomné ve fermentační živné půdě, neboť rovněž dochází k současnému vysrážení těchto· složek společně s fruktosyltransferázou během přídavku rozpouštědla do fermentačního prostředí. Z tohoto· důvodu je nutno kapalinu nad usazeninou získanou během přidávání a zpracovávání s chloridem · vápenatým, a úpravy hodnoty pH roztoku, zpracovat s běžně známými hydrolyzačními enzymy, jako je pullulanáza. Výše uvedená pullulanáza hydrolyzuje pullulan za vzniku nízkomolekulárních polymerů, čímž je možno se vyhnout současnému vysrážení a následnému znečištění fruktosyltransferázového přípravku během zpracovávání s rozpouštědlem (jako je například aceton, alkohol a podobné · jiné sloučeniny). Výše uvedené čištění fruktosyltransferázového přípravku tvoří další nové provedení postupu podle uvedeného vynálezu a další charakteristický znak tohoto postupu.Furthermore, it appears necessary in the preparation of the enzyme preparation of the present invention to purify the preparation of pululanic polysaccharides which are inherently present in the fermentation broth, since they also co-precipitate with the fructosyltransferase during the addition of the solvent to the fermentation environment. For this reason, the supernatant obtained during the addition and treatment with calcium chloride and the pH adjustment of the solution must be treated with commonly known hydrolysis enzymes such as pullulanase. The aforementioned pullulanase hydrolyzes pullulan to form low molecular weight polymers, thereby avoiding the simultaneous precipitation and subsequent contamination of the fructosyltransferase preparation during treatment with a solvent (such as acetone, alcohol and the like). The above purification of the fructosyltransferase preparation constitutes a further new embodiment of the process of the present invention and another feature of the process.
Fruktosyltransferázový přípravek podle uvedeného· vynálezu může být použit v daném · stavu, aniž by bylo nutno odstraňovat pullulan. Z výše uvedeného · je patrné, že postup podle uvedeného vynálezu je možno· prakticky provést bez hydrolýzy pullulanu pullulanázou, přičemž v tomto'· případě pullulan slouží jako nosič pro fruktosyltransferázu.The fructosyltransferase preparation of the present invention can be used as it is without removing pullulan. It can be seen from the above that the process according to the invention can be practically carried out without hydrolysis of pullulan by pullulanase, in which case pullulan serves as a carrier for fructosyltransferase.
Další příklad · praktického· · provedení postupu podle vynálezu demonstruje použití pullulanu jako nosiče.Another example of a practical embodiment of the process of the invention demonstrates the use of pullulan as a carrier.
Příklad 2Example 2
Příprava sekundárního substrátu za použití fruktosyltransferázy na pullulanovém · nosičiPreparation of a secondary substrate using a fructosyltransferase on a pullulan carrier
Podle tohoto příkladu provedení · se postupuje tak, že se do 20% roztoku sacharózy, který je tlumen pomocí 0,05 M roztoku citrónanového tlumiče na hodnotu pH · 5,5, přidá suchý · pullulan o koncentraci 1 %, který byl · připraven postupem podle příkladu 1, s tou výjimkou, že zde použitý pullulan není hydrolyzován pullulanázou a z· tohoto výše uvedeného důvodu slouží jako nosičovy materiál, přičemž v tomto případě není použit Celit. · Fruktosyltransferázová aktivita činí 677 jednotek/gram pullulanu. Reakce podle tohoto příkladu se provede při teplotě okolí, dokud se směs · nezakalí. Potom se vzorek takto· získaného materiálu analyzuje pomocí· vysokotlaké kapalinové chromatografie · s následujícími výsledky:The procedure is carried out by adding dry 1% pullulan in a 20% sucrose solution, which is buffered with a 0.05 M citrate buffer solution to a pH value of 5.5, prepared according to the process. according to Example 1, except that the pullulanine used herein is not hydrolyzed by pullulanase and for this reason serves as a carrier, in which case Celite is not used. · Fructosyltransferase activity is 677 units / gram pullulan. The reaction of this example is carried out at ambient temperature until the mixture becomes cloudy. Then a sample of the material thus obtained is analyzed by means of high pressure liquid chromatography with the following results:
Rozdělení sacharidů zjištěné analýzou vysokotlakou · kapalinovou chromatografiíCarbohydrate distribution as determined by HPLC analysis
Fruktóza Dextróza DPz DP3 DP4+ Fructose Dextrose DPz DP3 DP 4+
6,9 40,66.9 40.6
Následující příklad provedení podle vynálezu dále charakterizuje enzym produkovaný postupem podle příkladu 1.The following exemplary embodiment of the invention further characterizes the enzyme produced by the process of Example 1.
P ř í k 1 a d 3Example 1 a d 3
Produkty enzymatického· působení · a tepelná stabilita enzymuEnzyme action products and enzyme thermal stability
Podle tohoto provedení se postupuje tak, že se do reakčních nádob, které jsou opatřeny šroubovacími víčky, · přidá · 60 gramů sacharózy potravinářské jakosti a dále fruktosyltransferázový přípravek. Tento enzymatický přípravek byl získán z enzymatického produktu, připraveného postupem podle · příkladu 1, dispergováním vhodných alikvotních podílů tohoto enzymatického přípravku, který obsahuje pevný celit, do předem změřených množství vody, za účelem 'přípravy vhodně koncentrovaných roztoků enzymu, Obsažený celit se potom odstraní z roztoků filtrací. Takto získaný filtrát se po6,2 11,1 35,2 tom použije k dávkování do reakční směsi, přičemž se vytvoří koncentrace 10, 20 a 30 jednotek enzymu na gram sacharózového substrátu. Tyto· výše uvedené směsi se potom všechny zředí na konečný objem 100 mililitrů · pomocí vody. V dalším postupu podle tohoto příkladu se provedou požadované konverze, přičemž doba · konverze činí ’ 66 hodin, a podmínky, konverze zahrnují hodnotu pH 5,5 a teplotu · pohybující se v rozmezí od · 55 do 60°C (resp. obě tyto hodnoty, jak plyne z dále uvedené tabulky). Vzorky jsou odebírány v intervalu 24 hodin, 43 hodin a 66 hodin, přičemž se provádí stanovení obsahu redukčního cukru za účelem potvrzení enzymatické aktivity. Po· provedených analýzách na redukční cukr se · zbývající reakční · směsi zmrazí za účelem zastavení enzymatické aktivity · a vzorky se podrobí analýze na složení sacharidů za · pomoci vysokotlaké kapalinové chromatografie. Byly získány následující výsledky:In this embodiment, 60 grams of food grade sucrose and a fructosyltransferase preparation are added to the reaction vessels provided with screw caps. The enzyme preparation was obtained from the enzyme product prepared according to Example 1 by dispersing appropriate aliquots of the solid celite containing enzyme preparation into predetermined amounts of water to prepare suitably concentrated enzyme solutions. solutions by filtration. The filtrate thus obtained is used for dosing into the reaction mixture after 6.2, 11.1 and 35.2 m, producing concentrations of 10, 20 and 30 units of enzyme per gram of sucrose substrate. The above mixtures were then all diluted to a final volume of 100 mL with water. The desired conversions are carried out with a conversion time of 66 hours and the conversion conditions include a pH of 5.5 and a temperature of between 55 and 60 ° C (or both). as shown in the table below). Samples are taken at 24 hour, 43 hour and 66 hour intervals to determine the reducing sugar content to confirm enzymatic activity. After the analysis for reducing sugar, the remaining reaction mixtures were frozen in order to stop the enzymatic activity and the samples were analyzed for carbohydrate composition by means of high pressure liquid chromatography. The following results were obtained:
41'4 6 041'4 6 0
PH hodinPH hours
Test na redukční cukr1 Assay reducing sugar 1
Teplota (°C)Temperature (° C)
Enzymatické jednotky^Enzymatic units ^
Redukční cukr (mg/ml) 24 hodinReducing sugar (mg / ml) 24 hours
Redukční cukr (mg/ml)Reducing sugar (mg / ml)
PH hodinPH hours
Redukční cukr (mg/ml)Reducing sugar (mg / ml)
. Použitá metoda je uvedena pod definicí fruktosyltransferázové jednotky. The method used is given under the definition of the fructosyltransferase unit
Enzymatické jednotky na gram sacharózyEnzyme units per gram of sucrose
Reakční teplota 55 °CReaction temperature 55 ° C
Výše uvedený příklad č. 3 demonstruje tepelnou stabilitu substrátu enzymu při teplotě 55 °C a 60 °C během - 66hodinového testu při hodnotě pH 5,5, což -dokumentuje značný obchodní význam uvedeného- enzymu. Kromě toho je třeba uvést, že sekundární substrát, který se připraví enzymatickou konverzí sacharózy společně s novým fruktosyltransferázovým přípravkem podle uvedeného vynálezu, představují na základě provedené analýzy na sacharidy potenciálně cenný produkt . -vhodný pro přípravu sirupů s vysokým- obsahem fruktózy ze sacharózy, neboť bylo zjištěno, že převážnou část tvoří dextróza - a polymery, které po následně provedené hydrolýze poskytují fruktózu, jako převažující monosacharid ve výsledném produktu. Postup podle tohoto- příkladu provedení - rovněž demonstruje, že nový - enzym podle uvedeného vynálezu je účinný při koncentraci sacharózy 60 % ' [hmot./obj.J. Rovněž je v tomto příkladu demonstrována funkčnost enzymu v přítomnosti vysokých koncentrací glukózy.Example 3 above demonstrates the thermal stability of the enzyme substrate at 55 ° C and 60 ° C during a 66-hour test at pH 5.5, illustrating the considerable commercial importance of the enzyme. In addition, the secondary substrate, which is prepared by enzymatic conversion of sucrose together with the novel fructosyltransferase preparation of the present invention, is a potentially valuable product based on carbohydrate analysis. Suitable for the preparation of syrups with a high fructose content from sucrose, since it has been found that dextrose is the major part - and polymers which, after subsequent hydrolysis, yield fructose as the predominant monosaccharide in the final product. The process of this embodiment also demonstrates that the novel enzyme of the present invention is effective at a sucrose concentration of 60% w / v. This example also demonstrates the functionality of the enzyme in the presence of high glucose concentrations.
Příklad 4Example 4
Vliv teploty na aktivitu enzymuInfluence of temperature on enzyme activity
Vliv teploty - na reakční rychlost fruktosyltransferázy - se zjistí následujícím způsobem, při kterém se využije autoanalyzér:The effect of temperature - on the reaction rate of fructosyltransferase - is determined as follows using an autoanalyzer:
Reakční směs je tvořena 7,5 ml 80% roztoku sacharózy [hmot./obj.], 2,3 ml 0,1 M citronanového- tlumiče o hodnotě pH 5,5 aThe reaction mixture consists of 7.5 ml of an 80% w / v sucrose solution, 2.3 ml of a 0.1 M citrate buffer at pH 5.5, and
0,2 ml 2% enzymatického- roztoku pyllulanu [hmot./ob].], což je enzymatický přípravek podle příkladu 2. Konečná koncentrace sacharózy činí 60 % hmot./obj. Jednotlivé vzorky jsou udržovány při následujících teplotách a analyzovány po 10 minutách na autoanalyzéru. Z uvedených výsledků plyne, že při teplotě 40 °C je enzymatická reakční rychlost l,89krát větší než při teplotě 30 °C, při teplotě 50 °C je l,29krát větší než při teplotě 40 °C a při teplotě 60 °C je l,8krát větší než při teplotě 50 °C. Z těchto výsledků je zřejmé, že reakční rychlost vzrůstá se zvyšující se teplotou.0.2 ml of a 2% enzyme solution of pyllulan [w / v], which is the enzyme preparation of Example 2. The final sucrose concentration is 60% w / v. Individual samples are maintained at the following temperatures and analyzed after 10 minutes on an autoanalyzer. The results show that at 40 ° C the enzymatic reaction rate is 1.8 times greater than at 30 ° C, at 50 ° C is 1.29 times greater than at 40 ° C and at 60 ° C is 1 , 8 times greater than at 50 ° C. From these results, it is apparent that the reaction rate increases with increasing temperature.
Příklad 5Example 5
Demonstrování M.ichaelis-Mentenovy konstanty (K1T1 ] fruktosyltransferázyDemonstration of M.ichaelis-Menten constant (K 1T1 ) fructosyltransferase
Hodnota Km enzymu znamená koncentraci substrátu, při které je rychlost tvorby produktu poloviční vzhledem к Vmax. Ke zjištění hodnoty Km fruktosyltransferázy byla použita následující metoda.The enzyme K m value means the concentration of the substrate at which the rate of product formation is half relative to k V max . The following method was used to determine the K m of fructosyltransferase.
Podle tohoto provedení se použije 90 % hmot. obj. zásobního roztoku sacharózy, jehož hodnota pH se upraví na 5.5 za pomoci 0,1 M citronanového tlumiče, přičemž se dále připraví vhodné koncentrace sacharózy v 9,8mililitrových alikvotních podílech, čímž se získají jednotlivé koncentrace: 5, 10, 30, 40, 50, 60 a 70 % sacharózy v konečném objemu 10 mililitrů. К takto naředěným vzorkům se potom přidá 0,2 ml roztoku, který obsahuje 1,1 jednotky fruktosyltransferázy. Potom se tyto výše uvedené vzorky okamžitě analyzují při teplotě 55 °C na autoanalyzéru, jak již bylo dříve uvedeno (viz fruktosyltransferázová jednotka). Pro daný případ se použije glukózový standard (kalibrováno v ^g/ml) jako kontrolní vzorek.In this embodiment, 90 wt. The volume of the sucrose stock solution was adjusted to pH 5.5 using a 0.1 M citrate buffer, further preparing suitable sucrose concentrations in 9.8 ml aliquots to give single concentrations: 5, 10, 30, 40, 50, 60 and 70% sucrose in a final volume of 10 ml. 0.2 ml of a solution containing 1.1 units of fructosyltransferase is then added to the diluted samples. Thereafter, the above samples were immediately analyzed at 55 ° C on an autoanalyzer as previously described (see fructosyltransferase unit). For this case, a glucose standard (calibrated in µg / ml) is used as a control.
V následující tabulce je rychlost tvorby glukózy vyjádřena jako ^g/ml/min při různých koncentracích substrátu, přičemž se použije konstantní dávky (1,1 jednotky) fruktosyltransferázového přípravku podle příkladu 1.In the following table, the rate of glucose formation is expressed as µg / ml / min at different substrate concentrations using a constant dose (1.1 units) of the fructosyltransferase preparation of Example 1.
Příklad 6Example 6
Příprava a isomerizace sekundárního substrátu ze sacharózyPreparation and isomerization of secondary substrate from sucrose
A. Příprava sekundárního substrátuA. Preparation of secondary substrate
Podle tohoto provedení se sacharóza potravinářské jakosti, v množství 600 gramů, rozpustí ve vodě na celkový objem 800 ml. Hodnota pH tohoto roztoku se potom, upraví na 5,5 za pomoci zředěného roztoku kyseliny chlorovodíkové. Potom se suchý přípravek obsahující celit a enzym v množství 11 gramů, jehož aktivita je 550 jednotek/gram, připravený postupem podle příkladu 1, rozředí ve 100 ml vody. Takto připravená směs se potom zfiltruje ve vakuu za použití Whatmanova filtračního papíru č. 1 v Buchnerově nálevce. Takto získaný filtrační koláč se potom promyje dalším lOOmililitrovým množstvím vody. Takto získaných 200 ml filtrátu se potom přidá к roztoku sacharózy, který je v l,691itrové nádobě vybavené šroubovacím víčkem. Tato nádoba se potom umístí ve vodní lázni o teplotě 58 CC a reakce potom pokračuje po dobu 20 hodin, přičemž po proběhnutí této periody se vzorek reakčního produktu analyzuje vysokotlakou kapalinovou chromatografii za účelem stanovení složení sacharidů. Získaný výsledek je následující:According to this embodiment, food grade sucrose, in an amount of 600 grams, is dissolved in water to a total volume of 800 ml. The pH of this solution is then adjusted to 5.5 with dilute hydrochloric acid. Thereafter, the dry preparation containing celite and the enzyme in an amount of 11 grams, whose activity is 550 units / gram, prepared according to the procedure of Example 1, is diluted in 100 ml of water. The mixture is then vacuum filtered using Whatman No. 1 filter paper in a Buchner funnel. The filter cake is washed with an additional 100 ml of water. The 200 ml of filtrate thus obtained is then added to a sucrose solution, which is in a 1 L, 69 liter vessel equipped with a screw cap. The vessel was placed in a 58 ° C water bath and the reaction continued for 20 hours, after which time a sample of the reaction product was analyzed by high pressure liquid chromatography to determine the carbohydrate composition. The result obtained is as follows:
Složení sacharidůCarbohydrate composition
Fruktóza 2,4 %Fructose 2.4%
Dextrcza 32,8 %Dextrcza 32,8%
DP2 10,6 %DP2 10,6%
DP3 22,9 %DP3 22,9%
DP4.k 31,3 %DP4. k 31,3%
Ke zbývajícímu reakčnímu produktu4 se se potom přidá chlorid hořečnatý (to znamená к sekundárnímu substrátu) na koncentraci 5 milimolů, a hodnota pH se upraví na 8,4 za pomoci zředěného roztoku hydroxidu sodného,Magnesium chloride (i.e., to the secondary substrate) is then added to the remaining reaction product 4 to a concentration of 5 millimoles, and the pH is adjusted to 8.4 with dilute sodium hydroxide,
B. Kontinuální isomerizace sekundárního substrátuB. Continuous isomerization of secondary substrate
Podle tohoto provedení se glukózová isomeráza odvozená od druhu Streptomyces ohvochromogenes ATCC 21715 (viz patent Spojených států amerických č. Re: 29 152) imobilizuje na porézní alumině (porézní nosičový materiál s kontrolovanou velikostí pórů, viz například patent Spojených států amerických č. 3 992 329) následujícím způsobem:According to this embodiment, glucose isomerase derived from Streptomyces ohvochromogenes ATCC 21715 (see U.S. Patent No. Re: 29,152) is immobilized on a porous alumina (porous carrier with controlled pore size, see, for example, U.S. Patent No. 3,992,329) ) as follows:
1. Nosičový materiál se promyje dvakrát vodou.1. Wash the support material twice with water.
2. Nosič se inkubuje 0,1 M roztokem citronanu sodného po dobu 1 hodiny za míchání.2. Incubate the carrier with 0.1 M sodium citrate for 1 hour with stirring.
3. Citronan sodný se smyje od nosičové- a) výsledky získané znovu následující den ze 60% zásobního roztoku sacharózy.3. Sodium citrate is washed away from the carrier a) results obtained again the following day from a 60% sucrose stock solution.
Hodnota Km je 0,27 molární koncentrace sacharózy. Maximální reakční rychlost se vyskytne při koncentraci substrátu 1,374 molů sacharózy, při hodnotě pH 5,5 a při teplotě 55 °C.The K m value is 0.27 molar sucrose concentration. The maximum reaction rate occurs at a substrate concentration of 1.374 moles of sucrose, at a pH of 5.5 and at a temperature of 55 ° C.
ho materiálu, dokud vodivost promývacího· roztoku nedosáhne 1000 mikroohmů.until the conductivity of the washing solution reaches 1000 microohms.
4. Nosič se inkubuje 0,05 M chloridem horečnatým po dobu jedné hodiny a roztok -chloridu hořečnatého se dekantuje.4. Incubate the support with 0.05 M magnesium chloride for one hour and decant the magnesium chloride solution.
5. Objem 0,05 M chloridu hořečnatého se potom použije к přípravě konečné koncentrace enzymu 400 jednotek/mililitr.5. A volume of 0.05 M magnesium chloride is then used to prepare a final enzyme concentration of 400 units / ml.
6. Isomerázový koncentrát se potom přidá к nosičovému materiálu, přičemž výsledná koncentrace je 14 miliónů jednotek na6. The isomerase concentrate is then added to the support material to a final concentration of 14 million units per
28,3 litru.28,3 liter.
7. Nosič a enzym se kontaktují po dobu 22 až 24 hodin a potom se nevázaný enzym smyje z nosičového materiálu za pomoci destilované vody.7. The carrier and enzyme are contacted for 22-24 hours and then unbound enzyme is washed off the carrier material with distilled water.
Do skleněné kolony, opatřené pláštěm (3 cm x 18 cm) a vybavené čerpadlem připojeným к zásobní nádrži nástřikové suroviny, se potom vloží imobilizovaný enzym, připravený shora uvedeným postupem. Objem lože kolony po zatížení činí 45 mililitrů. Tato uvedená kolona pracuje při teplotě 60 °C při všech isomerizačních postupech. Zatížená kolona se spustí na dextrózový sirup (o koncentraci 50 % hmot./obj.) s 5 milimoly chloridu hořečnatého a hodnota pH se upraví na 8,4, za účelem zjištění, zda je kolona aktivní. Množství protékající kolonou se upraví na 292 milílitrů/hod. Potom se obsah kolony vypustí až na objem lože. Přivedení sekundárního substrátu se potom provede ručním způsobem, přičemž množství tohoto substrátu je takové, že odteče z lože 20 ml vytékajícího proudu a toto množství se shromáždí stranou, a potom se protékající množství sekundárního substrátu kolonou upraví na 292 mllilitrů/hod. Prvních 100 mí sebraného sirupu se odvede stranou a ponechá se v klidu к převedení substrátu. Zbývající sekundární substrát (v množství asi 850 ml) se potom vede kolonou. Asi po jedné hodině se průtokové množství zvýší na 570 mllilitrů/hod. Ke konci provádění tohoto postupu se průtokové množství upraví a udržuje na 300 ml/hod. Po dokončení tohoto pochodu se sekundárním substrátem se kolona přepojí zpět na dextrózu za účelem ukázání toho, že isomerázová aktivita se stále ještě projevuje. V následující tabulce jsou porovnány výsledky získané vysokotlakou kapalinovou chromatografií s výchozím sekundárním substrátem a výsledky s konečným produktem z uvedené isomerizační kolony:An immobilized enzyme prepared as described above was then loaded into a glass column equipped with a jacket (3 cm x 18 cm) and equipped with a pump connected to the feed tank. The column bed volume after loading is 45 milliliters. This column is operated at 60 ° C for all isomerization procedures. The loaded column is loaded onto dextrose syrup (50% w / v) with 5 millimoles of magnesium chloride and the pH is adjusted to 8.4 to determine if the column is active. The amount flowing through the column is adjusted to 292 milliliters / hour. The contents of the column are then discharged up to the bed volume. The secondary substrate is then fed by hand, the amount of substrate being such that it flows out of the bed of 20 ml of effluent stream and is collected aside, and then the amount of secondary substrate flowing through the column is adjusted to 292 ml / h. The first 100 ml of the collected syrup is drained aside and allowed to stand to transfer the substrate. The remaining secondary substrate (about 850 mL) is then passed through the column. After about one hour, the flow rate was increased to 570 ml / h. At the end of this procedure, the flow rate was adjusted and maintained at 300 ml / hr. Upon completion of this process with the secondary substrate, the column is switched back to dextrose to show that the isomerase activity is still present. The following table compares the results obtained by high pressure liquid chromatography with the starting secondary substrate and the final product from the isomerization column:
Sekundární substrát (A) Konečný produkt (B)Secondary substrate (A) End product (B)
Tyto výše uvedené výsledky ukazují, že 42,38 % volné dextrózy v sekundárním substrátu se isomerizuje ve výše uvedené koloně na fruktózu. Rovněž je nutno uvést, že fruktózové polymery přítomné v sekundárním substrátu nejsou zjevně ovlivňovány nebo neovlivňují isomerizaci dextrózy na fruktózu. Z výše uvedených výsledků je zvláště pozoruhodné to, že celkové rozdělení monosacharidů tvoří asi 45 % fruktó· zy a 55 % dextrózy.These above results show that 42.38% of free dextrose in the secondary substrate is isomerized in the above fructose column. It should also be noted that the fructose polymers present in the secondary substrate are not obviously affected or do not affect the isomerization of dextrose to fructose. Of the above results, it is particularly noteworthy that the total distribution of monosaccharides is about 45% fructose and 55% dextrose.
V následujícím příkladu provedení jsou uvedeny dva postupy týkající se rozštěpení polysacharidů přítomných v sekundárním substrátu a rovněž isomerizačního produktu. V prvém postupu se využívá enzymatického zpracování a ve druhém kyselé hydrolýzy za mírných podmínek.In the following exemplary embodiment, two procedures are described regarding the cleavage of the polysaccharides present in the secondary substrate as well as the isomerization product. The first method uses enzymatic treatment and the second acid hydrolysis under mild conditions.
Příklad 7Example 7
Příprava sirupu s vysokým obsahem fruktózy hydrolýzouPreparation of high fructose syrup by hydrolysis
A. Enzymatická hydrolýzaA. Enzymatic hydrolysis
Podle tohoto provedení se ke 100 ml produktu B, připraveného podle příkladu 6, přidá 10 mg čištěné invertázy odvozené od Candida utllis. Takto připravená směs (která je konzervovaná toluenem) se ponechá reagovat přes noc při teplotě okolí a potom se takto získaný vzorek analyzuje za pomoci vysokotlaké kapalinové chromatografické metody. Zbývající produkt В se ponechá kontinuálně reagovat po dobu dalších 6 dní a potom se odejme takto· získaný vzorek, který se analyzuje stejným uvedeným způsobem, přičemž se získají následující výsledky:In this embodiment, 10 mg of purified Candida utllis-derived invertase is added to 100 ml of product B prepared according to Example 6. The mixture thus prepared (which is conserved with toluene) is allowed to react overnight at ambient temperature, and then the sample is analyzed by means of a high pressure liquid chromatography method. The remaining product (V) is allowed to react continuously for a further 6 days and then the sample thus obtained is taken and analyzed in the same manner as indicated, giving the following results:
Výcho-zí materiál Po působení invertázy Po dalších šesti (produkt B) dnechStarting material after invertase treatment After another six (product B) days
Použitá invertáza je enzymatický přípravek, přičemž tento přípravek má aktivitu 123 jednotek/miligram. Jedna jednotka této invertázy katalyzuje rozštěpení sacharózy za vzniku 1 mikromolu glukózy a 1 mikromolu ’ fruktózy za minutu za stanovených podmínek.The invertase used is an enzyme preparation which has an activity of 123 units / milligram. One unit of this invertase catalyzes the cleavage of sucrose to produce 1 micromole of glucose and 1 micromole of fructose per minute under the specified conditions.
B. Kyselá hydrolýza produktu BB. Acid hydrolysis of product B
Podle tohoto provedení se kyselá . hydro lýza vzorku produktu B, který se získá podle postupu v příkladu 6, provede přidavkem kyseliny sírové až na koncentraci 0,05 N a potom - se ’ provede zahřívání na teplotu pohybující se v rozmezí od 75 do 80 °C. Potom se z této směsi . odeberou vzorky po jedné hodině a po dvou hodinách hydrolýzy, a tyto vzorky se analyzují vysokotlakou kapalinovou chromatografickou metodou. Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:According to this embodiment, it is acidic. hydrolysis of the sample of product B obtained according to the procedure of Example 6 is carried out by adding sulfuric acid to a concentration of 0.05 N and then heating to a temperature in the range of 75 to 80 ° C. Then take out this mixture. samples are taken after one hour and two hours of hydrolysis, and these samples are analyzed by high pressure liquid chromatography. The results are shown in the following table:
Výše uvedené výsledky v postupu A ukazují - na - vzrůst převážně obsahu fruktózy, - a vzrůst glukózy je menší, - přičemž současně poklesne -obsah DPz, DP3 a DP4+ frakcí, což naznačuje přítomnost fruktózového polymeru..The above results in process A show - an increase in predominantly fructose content, - and an increase in glucose is less, - while the content of DPz, DP3 and DP4 + fractions decreases, indicating the presence of fructose polymer.
Výsledky získané při - provádění kyselé hydrolýzy v postupu B jsou v souhlase s výsledky, získanými při provádění hydrolýzy postupem A, a rovněž - ukazují na štěpení fruktózového polymeru.The results obtained in the process of acid hydrolysis in process B are in accordance with the results obtained in the process of hydrolysis in process A, and also indicate the cleavage of the fructose polymer.
Výše uvedené - diskuse se týkají provádění transfruktosylace, při které se používá primárního substrátu, ve kterém obsah suché složky výchozí sacharózy - nepřevyšuje bod nasycení za daných - reakčních podmínek - - .Následující příklad provedení demonstruje použití primárního' substrátu, jehož počáteční koncentrace sacharózy je vyšší než je -bod - nasycení, přičemž tento materiál se podrobí působení fruktosyltransferázy a výsledkem je produkt, obsahující vyšší obsah - DPs frakce (to znamená fruktosyl-sacharózy) a zmenšený obsah DPí+ produktů. Rovněž je - v- tomto příkladu poukázáno* na zvýšenou koncentraci suché složky (hmot./ /hmot.) sekundárního substrátu oproti koncentraci suché - složky, dosažené v nepřítomnosti působení fruktosyltransferázy. Kromě toho je v tomto příkladu ukázáno, že v případě, kdy koncentrace suché složky v primárním substrátu vzrůstá, potom stupeň polymerace fruktózového polymeru v sekundárním substrátu klesá a frakce DPdŤ materiálu je přítomna - pouze v malých množstvích.The above discussions relate to the performance of transfructosylation using a primary substrate in which the dry sucrose starting material content does not exceed the saturation point under the given reaction conditions. than the saturation point, the material being treated with fructosyltransferase, resulting in a product containing a higher DPs fraction (i.e. fructosyl sucrose) and a reduced DPi + content. Also, in this example, the increased concentration of dry component (w / w) of the secondary substrate compared to the concentration of dry component achieved in the absence of fructosyltransferase is pointed out. Furthermore, in this example show that when the concentration of the dry components in the primary substrate increases, and the degree of polymerization of the fructose polymer in the secondary substrate decreases and the DPD fraction t of the material is present - only in small quantities.
Toto je markantní rozdíl ve srovnání s výsledky získanými v předchozích příkladech, při kterých bylo použito sacharózových substrátů - o* koncentraci - nižší než je bod nasycení. - V těchto příkladech je DP- + materiál primárním produktem.This is a marked difference compared to the results obtained in the previous examples, in which sucrose substrates - at a concentration below the saturation point - were used. In these examples, DP- + material is the primary product.
Příklad 8Example 8
Příprava sekundárního substrátu ze sacharózových. směsí o- koncentraci vyšší než - je bod nasyceníPreparation of secondary substrate from sucrose. mixture with a concentration higher than - is the saturation point
Podle tohoto provedení se postupuje tak, že se umístí sacharóza potravinářské jakosti ve formě 200gramových alikvotních’ podílů v 0,4711irových skleněných nádobách se šroubovacími uzávěry. Pro kontrolní účely - se do jedné skleněné nádoby vloží 50 ml vody, přičemž do ostatních se vloží 50 ml vody -obsahující vzrůstající množství fruktosyltransferázového přípravku s celitem (tenoo' přípravek byl připraven postupem podle příkladu - 1), jak je to- uvedeno v - následující tabulce. Každá z uvedených nádob se uzavře a potom se všechny umístí do třepačky, ve které jsou dále umístěny na vodní lázni, přičemž teplota této vodní lázně se upraví -na hodnotu pohybující se z rozmezí od 54 do< 55 °C. Výše uvedené nádoby se potom protřepávají po- dobu 24 hodin, přičemž příležitostně se rovněž promíchají manuálním způsobem. Z každé nádoby se potom po provedení výše uvedeného zpracovávání při dané teplotě odeberou vzorky kapaliny nad usazeninou a tyto vzorky seAccording to this embodiment, food grade sucrose is placed in the form of 200-gram aliquots in 0.47 µl glass containers with screw caps. For control purposes, 50 ml of water is placed in one glass container, while 50 ml of water is placed in the other containing an increasing amount of the cellucose fructosyltransferase preparation (this preparation was prepared according to Example 1) as described in - the following table. Each of the vessels is sealed and then placed in a shaker, which is then placed on a water bath, the temperature of the water bath being adjusted to a value ranging from 54 to <55 ° C. The aforementioned containers are then shaken for 24 hours, occasionally also mixed manually. Samples of the supernatant fluid are then taken from each vessel after the above treatment at a given temperature and collected
2424
umístí do testovací trubice se šroubovacím uzávěrem, přičemž tyto trubice se umístí do lázně s vroucí vodou za účelem inaktivování enzymu. Potom se tyto vzorky nalyzují za pomoci vysokotlaké kapalinové chromaVýsledky příkladu č. 8placed in a test tube with a screw cap, which tubes are placed in a boiling water bath to inactivate the enzyme. Then, these samples were analyzed using high pressure liquid chroma. Results of Example 8
1 celkový počet . jednotek fruktosyltransferázy v 50 ml vody 2 ND = nestanoveno 1 total number. units of fructosyltransferase in 50 ml of water 2 ND = not determined
V tomto bodě je nutno poznamenat, že je pozoruhodné, že při provádění postupu podle shora uvedeného· ' příkladu krystaluje kontrolní . vzorek v případě ochlazení na teplotu okolí (asi 25 °C), přičemž enzymatickým postupem vznikající sekundární substrát zůstává v roztoku a projevuje vynikající stabilitu při skladování, aniž by nastala krystalizace.It should be noted at this point that it is noteworthy that in carrying out the process of the above example, the control crystallizes. a sample when cooled to ambient temperature (about 25 ° C), wherein the secondary substrate formed by the enzymatic process remains in solution and exhibits excellent storage stability without crystallization occurring.
I přesto, že v postupu podle výše uvedeného příkladu 8 bylo použito 200 gramů sacharózy na 50 ml vody, to znamená 80 '°/o hmot./hmot., může být koncentrace suché složky sacharózového · výchozího materiálu zvýšena.Although 200 grams of sucrose per 50 ml of water, i.e. 80% w / w, were used in the procedure of Example 8 above, the concentration of the dry component of the sucrose starting material may be increased.
Takto získaný . sekundární substrát · podle výše uvedeného· provedení postupu podle uvedeného · vynálezu, který je novým produktem, může být použit jako vysoce stabilní, nekrystalující sirup při různých aplikacích v potravinářském průmyslu. Produkt získaný postupem podle uvedeného vynálezu je zároveň jedinečnou směsí s vysokým obsahem sušiny, přičemž je tento· produkt odolný k mikrobiologickému znečištění a k tvorbě barevných částic, a současně ' je možno tento produkt použít při skladování nebo· na lodích nebo při obou těchto mož tografické metody a stanoví se obsah suché složky v kapalině nad usazeninou (K. Fischerovou metodou), přičemž výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:Thus obtained. The secondary substrate according to the above embodiment of the process of the present invention, which is a novel product, can be used as a highly stable, non-crystalline syrup in various applications in the food industry. At the same time, the product obtained by the process of the present invention is a unique high dry matter composition which is resistant to microbiological contamination and to the formation of colored particles and can also be used in storage or on ships or both. and determine the dry component content of the supernatant (K. Fischer method), the results are shown in the following table:
nostech jako cukerný koncentrát o koncentraci, která byla dříve nedosažitelná, se zachováním výše uvedených vlastností. Kromě toho je třeba uvést, že tento nový sekundární substrát s vysokým obsahem suché složky může být podroben hydrolýze, ' · jak je to uvedeno· v příkladu 7, za účelem získání invertní cukrové směsi, která · má požadovanou sladící schopnost. ' Tento' nový· sekundární substrát, získaný postupem podle uvedeného· vynálezu, má obsah suché složky pohybující se v rozmezí od · 70 % do asi 82 % hmot./hmot., a obsahuje monosacharidickou frakci, která sestává v podstatě · z dextrózy a polysacharidové polymery, s přebytkem DP2, sestávající převážně z DP3 produktu. Rovněž je přítomno malé množství DPd.(. polymerů (4,1 % a méně).such as sugar concentrate at a concentration that was previously unattainable, while maintaining the above characteristics. In addition, the novel high dry component secondary substrate may be subjected to hydrolysis, as shown in Example 7, to obtain an invert sugar blend having the desired sweetening ability. The novel secondary substrate obtained by the process of the present invention has a dry component content ranging from 70% to about 82% w / w and comprises a monosaccharide fraction consisting essentially of dextrose and polysaccharide polymers, with an excess of DP2, consisting mainly of the DP3 product. A small amount of DPd (polymers (4.1% or less)) is also present.
Ačkoliv fáze transfruktosylace byla · · demonstrována jako vsázkový pochod, je zřejmé, že je rovněž možno použít podobným způsobem kontinuálního postupu. Při provádění kontinuální transfruktosylace se transfruktosyláza vhodným způsobem· imobilizuje, přičemž se použije způsobu, který byl již uveden pod definicí zmobilizovaného enzymu, · a rovněž se použije kontinuálního postupu, který je zde popsán.Although the transfructosylation phase has been demonstrated as a batch process, it is obvious that it is also possible to use a similar continuous process. In carrying out continuous transfructosylation, the transfructosylase is suitably immobilized using the method already outlined in the definition of the mobilized enzyme, and also using the continuous process described herein.
Claims (5)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US80728977A | 1977-06-16 | 1977-06-16 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS394878A2 CS394878A2 (en) | 1985-06-13 |
| CS241460B2 true CS241460B2 (en) | 1986-03-13 |
Family
ID=25196025
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS783948A CS241460B2 (en) | 1977-06-16 | 1978-06-15 | Method of fructose containing product preparation from saccharase |
Country Status (36)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6013677B2 (en) |
| AR (1) | AR223648A1 (en) |
| AT (1) | AT364657B (en) |
| AU (1) | AU3669278A (en) |
| BE (1) | BE868122A (en) |
| BR (1) | BR7803835A (en) |
| CA (1) | CA1117047A (en) |
| CH (1) | CH648059A5 (en) |
| CS (1) | CS241460B2 (en) |
| CU (1) | CU34936A (en) |
| DD (1) | DD140415A5 (en) |
| DE (1) | DE2826111A1 (en) |
| DK (1) | DK269778A (en) |
| ES (1) | ES470766A1 (en) |
| FI (1) | FI64642C (en) |
| FR (1) | FR2394253A1 (en) |
| GB (1) | GB2000144B (en) |
| GR (1) | GR73593B (en) |
| HU (1) | HU181413B (en) |
| IE (1) | IE46985B1 (en) |
| IL (1) | IL54857A (en) |
| IT (1) | IT1098335B (en) |
| LU (1) | LU79816A1 (en) |
| NL (1) | NL7806475A (en) |
| NO (1) | NO145641C (en) |
| NZ (1) | NZ187436A (en) |
| OA (1) | OA05986A (en) |
| PH (1) | PH14418A (en) |
| PL (1) | PL121700B1 (en) |
| PT (1) | PT68167A (en) |
| RO (1) | RO78764B (en) |
| SE (1) | SE439928B (en) |
| SU (1) | SU1230469A3 (en) |
| TR (1) | TR20267A (en) |
| YU (1) | YU40830B (en) |
| ZA (1) | ZA783102B (en) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56154967A (en) * | 1980-03-31 | 1981-11-30 | Meiji Seika Kaisha Ltd | Sweetening agent and its preparation |
| GB2072679B (en) * | 1980-03-31 | 1983-11-09 | Meiji Seika Kaisha | Sweetener |
| US4309505A (en) * | 1980-05-19 | 1982-01-05 | Cpc International Inc. | Process for the production of fructose transferase enzyme |
| US4356262A (en) | 1980-06-03 | 1982-10-26 | Cpc International Inc. | Process for the production of high fructose syrups and ethanol |
| US4317880A (en) * | 1980-06-03 | 1982-03-02 | Cpc International Inc. | Process for the production of fructose polymers and high fructose syrups |
| US4335207A (en) | 1980-06-03 | 1982-06-15 | Cpc International Inc. | Process for the production of high fructose syrups and ethanol |
| JPS5840065A (en) * | 1981-09-01 | 1983-03-08 | Meiji Seika Kaisha Ltd | Low-caloric sweetening agent and preparation of low- caloric food and drink with the same |
| JPS6034134A (en) * | 1983-08-05 | 1985-02-21 | Meiji Seika Kaisha Ltd | Feed containing fructoligosaccharide and feeding of domestic animals therewith |
| CA1246556A (en) * | 1984-07-24 | 1988-12-13 | Hiroshi Yamazaki | Production of fructose syrup |
| JPS6214792A (en) * | 1985-07-10 | 1987-01-23 | Meiji Seika Kaisha Ltd | Production of composition containing large amount of fructooligosaccharide |
| JPS63313128A (en) * | 1987-06-17 | 1988-12-21 | Hitachi Ltd | Liquid crystal display device |
| US5215905A (en) * | 1989-12-29 | 1993-06-01 | Miwon Co., Ltd. | Immobilization of fructosyltransferase on a basic, porous anion-exchange resin |
| FR2766333B1 (en) * | 1997-07-25 | 1999-10-01 | Roquette Freres | NOVEL SWEETENING COMPOSITION, PROCESS FOR PRODUCING THE SAME AND USES THEREOF |
| CN108077882A (en) * | 2017-12-18 | 2018-05-29 | 南宁纵联科技有限公司 | A kind of method that functional form seasoning syrup is prepared using biological fermentation process |
-
1978
- 1978-05-30 ZA ZA783102A patent/ZA783102B/en unknown
- 1978-05-31 NZ NZ187436A patent/NZ187436A/en unknown
- 1978-05-31 AU AU36692/78A patent/AU3669278A/en active Pending
- 1978-06-01 GR GR56418A patent/GR73593B/el unknown
- 1978-06-02 IE IE1120/78A patent/IE46985B1/en unknown
- 1978-06-05 IL IL54857A patent/IL54857A/en unknown
- 1978-06-06 TR TR20267A patent/TR20267A/en unknown
- 1978-06-14 RO RO94360A patent/RO78764B/en unknown
- 1978-06-14 ES ES470766A patent/ES470766A1/en not_active Expired
- 1978-06-14 LU LU79816A patent/LU79816A1/en unknown
- 1978-06-14 DE DE19782826111 patent/DE2826111A1/en not_active Ceased
- 1978-06-14 CA CA000305458A patent/CA1117047A/en not_active Expired
- 1978-06-14 PT PT68167A patent/PT68167A/en unknown
- 1978-06-14 SE SE7806844A patent/SE439928B/en not_active IP Right Cessation
- 1978-06-15 JP JP53071561A patent/JPS6013677B2/en not_active Expired
- 1978-06-15 PH PH21263A patent/PH14418A/en unknown
- 1978-06-15 YU YU1424/78A patent/YU40830B/en unknown
- 1978-06-15 AT AT0435878A patent/AT364657B/en not_active IP Right Cessation
- 1978-06-15 DK DK269778A patent/DK269778A/en not_active Application Discontinuation
- 1978-06-15 PL PL1978207653A patent/PL121700B1/en unknown
- 1978-06-15 SU SU782626705A patent/SU1230469A3/en active
- 1978-06-15 CH CH6544/78A patent/CH648059A5/en not_active IP Right Cessation
- 1978-06-15 GB GB7827046A patent/GB2000144B/en not_active Expired
- 1978-06-15 NO NO782083A patent/NO145641C/en unknown
- 1978-06-15 CS CS783948A patent/CS241460B2/en unknown
- 1978-06-15 BE BE2057061A patent/BE868122A/en unknown
- 1978-06-15 FI FI781911A patent/FI64642C/en not_active IP Right Cessation
- 1978-06-15 HU HU78CE1168A patent/HU181413B/en unknown
- 1978-06-15 DD DD78206028A patent/DD140415A5/en unknown
- 1978-06-15 NL NL7806475A patent/NL7806475A/en not_active Application Discontinuation
- 1978-06-15 AR AR272619A patent/AR223648A1/en active
- 1978-06-15 IT IT24618/78A patent/IT1098335B/en active
- 1978-06-15 BR BR7803835A patent/BR7803835A/en unknown
- 1978-06-16 FR FR7818074A patent/FR2394253A1/en active Granted
- 1978-06-16 OA OA56530A patent/OA05986A/en unknown
- 1978-06-16 CU CU7834936A patent/CU34936A/en unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4618579A (en) | Raw starch saccharification | |
| US4276379A (en) | Preparation of high fructose syrups from sucrose | |
| JP2589941B2 (en) | Glucoamylase enzyme fractionation | |
| US4335207A (en) | Process for the production of high fructose syrups and ethanol | |
| US3565765A (en) | Preparation of high maltose conversion products | |
| US4356262A (en) | Process for the production of high fructose syrups and ethanol | |
| US4849356A (en) | Fructosyl transferase and the preparation of fructose oligomers therewith | |
| CS241460B2 (en) | Method of fructose containing product preparation from saccharase | |
| US4317880A (en) | Process for the production of fructose polymers and high fructose syrups | |
| US4077842A (en) | Stabilized glucose isomerase enzyme concentrate | |
| US3654082A (en) | Production of high maltotetraose syrup | |
| Avigad et al. | An enzymic synthesis of a sucrose analog: α-D-xylopyranosyl-β-D-fructofuranoside | |
| US4423150A (en) | Preparation of high fructose syrups from sucrose | |
| NO132356B (en) | ||
| Ho Park et al. | A new method for the preparation of crystalline L-arabinose from arabinoxylan by enzymatic hydrolysis and selective fermentation with yeast | |
| US2967804A (en) | Method of making dextrose using purified amyloglucosidase | |
| JP3559609B2 (en) | Recombinant enzyme, its production method and use | |
| EP0188047A1 (en) | Process for preparing fructo-oligosaccharose | |
| Bailey et al. | Intracellular glycosidases of dextran-producing bacteria | |
| US20020052029A1 (en) | Method for preparing water-insoluble alpha-1, 4-glucans | |
| US3047471A (en) | Method of refining amyloglucosidase | |
| US3935070A (en) | Production of sweet syrup from dextrose mother liquor | |
| KR810001443B1 (en) | Manufacturing method | |
| US3549496A (en) | Process for making high maltose syrup | |
| Suzuki | Recent advances of starch science and starch technology in Japan |