CS241460B2

CS241460B2 - Method of fructose containing product preparation from saccharase

Info

Publication number: CS241460B2
Application number: CS783948A
Authority: CS
Inventors: Robert E Heady
Original assignee: Cpc International Inc
Priority date: 1977-06-16
Filing date: 1978-06-15
Publication date: 1986-03-13
Also published as: FR2394253A1; SE439928B; PT68167A; DE2826111A1; CA1117047A; RO78764B; PL121700B1; NO782083L; RO78764A; JPS548737A; ATA435878A; YU142478A; IL54857A0; FI64642B; OA05986A; NO145641B; FI781911A; SU1230469A3; ES470766A1; IT7824618A0

Description

Postup · podle vynálezu se provádí zpracováním vodného· roztoku sacharózy · a hmotnostní koncentraci 10 až 80 % pomocí fruktosyltransferázového enzymu odvozeného od Pullularia pullulans při teplotě 25 až 65 °C. a při hodnotě pH 4,5 až 6,5. Takto· vzniklý produkt obsahuje dextrózu, fruktózu a po· lysacharidy s obsahem přinejmenším 66 ·%' hmotnostních fruktosylových zbytků, které jsou · · .-spojeny (2-l)-beta vazbami. Tento· produkt· · se případně zpracovává ve druhém stupni · pomocí izomerázového enzymu za účelem izomerizace části· dextrózy na fruktózu. · Ve třetím stupni se provádí hydrolýza pomocí invertázového enzymu nebo kyseliny v nepřítomnosti izomerázového enzymu.......

Tímto postupem se získá sirup s vysokým obsahem fruktózy, aniž by bylo . nutné provádět · fyzikální oddělování výsledného ' fruktózového produktu.

Vynález se týká způsobu přípravy produktu obsahujícího fruktózu ze sacharózy, přičemž se vychází ze substrátu, který obsahuje fruktózový polymer. Obecně náleží postup podle vynálezu к postupům enzymatické transfruktosylace sacharózy.

Vzhledem к tomu, že se v daném oboru používá mnoho termínů, a rovněž i v popisu uvedeného vynálezu bude použito větší množství různých termínů, jsou v následujícím textu uvedeny definice některých základních termínů, které budou i nadále použity v celém dalším textu.

Glukóza a dextróza

Termínem ,,glukóza“ a ,,dextróza“ se míní v tomto vynálezu stejný produkt, který je používán zaměnitelně a zahrnuje tento uvedený monosacharid v jakékoliv formě v roztoku nebo v suché formě.

Sacharóza.

Termínem „sacharóza“ se míní v uvedeném textu tento uvedený disacharid v rafinované nebo surové formě, v roztoku nebo v suché formě, který se získá z jakéhokoliv zdroje sacharózového surového materiálu, jakým je například cukrová třtina nebo cukrová řepa. Při praktickém provádění postupu podle uvedeného vynálezu se tento výchozí sacharózový materiál obyčejně používá ve formě vodného roztoku.

Fruktóza a levulóza.

Termínem „fruktóza“ a „levulóza“ se v tomto textu míní stejný uvedený produkt, navzájem zaměnitelný, který znamená izomer dextrózy, který je sladší než dextróza. Fruktóza se nalézá v medu a v invertním cukru, společně s dextrózou, přičemž tento produkt je cenným materiálem z hlediska jeho sladkosti. Termínem fruktóza a levulóza, jak již bylo uvedeno, se míní stejný vzájemně zaměnitelný produkt vztahující se к uvedenému monosacharidu, který se může vyskytovat v jakékoliv formě, jako například v roztoku nebo v suché formě.

Enzymatický přípravek.

Výše uvedeným termínem „enzymatický přípravek“ se míní v tomto textu jakákoliv směs hmoty, která projevuje požadovanou enzymatickou aktivitu. Tímto termínem se například míní nativní celé buňky, buněčné extrakty a koncentrované přípravky, které se připraví z buněk a z kultivačního prostředí. Uvedené enzymatické přípravky mohou být použity buďto ve formě roztoku nebo v immobilizované formě při praktickém provádění postupu podle vynálezu.

Izomerázový enzym.

Enzymatický přípravek, který je schopen izomerizovat dextrózu na levulózu, se v uvedeném textu označuje jako „izomerázový enzym“. Tyto uvedené enzymy jsou dostatečně známy z dosavadního stavu techniky, přičemž se označují jako dextrózoizomeráza, xylózoizomeráza a glukózoizomeráza. Tyto enzymy mohou být získány od mnoha různých vhodných mikroorganismů. Jako- příklad těchto vhodných mikroorganismů je možno uvést mikroorganismy rodu Streptomyces, Bacillus, Arthrobacter, Actinoplánes, Curtobacterium a jiné další mikroorganismy.

Ve výhodném provedení postupu podle uvedeného vynálezu se jako izomerázového enzymu používá při praktickém provádění produktu odvozeného od mikroorganismu Streptomyces olivochromogenes ATCC No. 21713, ATCC No. 21714 nebo ATCC No. 21715 [poslední z uvedených je izolátem z kolonie vypěstované z jedné buňky ATCC 21713), jak je to uvedeno v patentu Spojených států amerických č. 3 813 318 a v patentu Spojených . států amerických číslo 3 957 587 ž 23. června 1975, a zvláště jestliže se postupuje podle postupu, který je popsán v patentu Spojených států amerických č. 3 770 589 nebo v patentu Spojených států amerických č. 3 813 318.

V nedávné době byly vyvinuty postupy, při kterých se izomerázový enzym immobi. lizuje na inertním nosičovém materiálu, který je nerozpustný ve vodě. Výše uvedený immobilizovaný enzym je potom vhodný к použití při kontinuální konverzi glukózy na sirup s vysokým obsahem fruktózy. Příklady těchto postupů je možno nalézt v patentech Spojených států amerických číslo 3 708 397, 3 788 945, 3 850 751, 3 868 304; v belgickém patentu č. 819 859 a v patentu Spojených států amerických č. 3 960 663 (belgický patent č. 810 480).

Izomerázová jednotka.

„Izomerázová jednotka“ je definována jako množství enzymatické aktivity, které je potřebné к přípravě jednoho mikromolu levulózy za minutu za izomerizačních podmínek, které budou dále uvedeny pod odstavcem „zjišťování izomerázové aktivity“.

Zjišťování izomerázové aktivity.

Pod tímto termínem se míní v tomto textu testovací postup, který zahrnuje provádění spektrofotometrického stanovení ketózy produkované z roztoku glukózy za standardních podmínek.

Zásobní roztok se připraví následujícím způsobem:

Zásobní roztok pro výše uvedený test:

Složka Množství

0,1 M MgSOd. 7 HžO 1 ml

0,001 M C0CI2.6 H2O 1 ml

M fosforečnan sodný jako tlumič, pH 7,5 0,5 ml bezvodá D-glukóza 1,44 g

К těmto složkám se přidá destilovaná voda v množství, odpovídajícímu celkovému objemu 7,5 mililitru.

Enzymatický přípravek, který je určen к testování, se nejprve zředí tak, aby obsahoval 1 až 6 izomerázových jednotek na mililitr.

Enzymatická izomerace se podle uvedeného vynálezu provede tak, že se přidá 1 mililitr enzymatického přípravku ke 3 mililitrům zásobního roztoku a inkubace probíhá po dobu 30 minut při teplotě 60 °C. Ke konci tohoto inkubačního období se odebere 1 mililitr alikvotního podílu a prudce se zchladí v objemu 9 mililitrů 0,5 N kyseliny chloristé. Takto získaný rychle zchlazený alikvotní podíl se potom zředí na celkový objem 250 mililitrů. Jako kontrolní vzorek pro srovnávací účely se připraví glukózový srovnávací roztok, přičemž v tomto roztoku se nahradí 1 mililitr enzymatického přípravku 1 mililitrem vody na počátku inkubačního období. '

Obsah ketózy se potom stanoví metodou s cysteinem a kyselinou sírovou. Pro účely tohoto testu se jedna izomerázová jednotka definuje jako množství enzymatické aktivity, které je potřebné к vyprodukování jednoho mikromolu levulózy za minutu za uvedených stanovených izomerizačních podmínek.

Transfruktosylace.

Tímto termínem se míní v uvedeném textu převedení fruktosylové části z donoru, to znamená ze sacharózy, na akceptor, to znamená na polysacharid.

Fruktosyltransferáza.

Tímto výše uvedeným termínem se v textu uvedeného vynálezu míní jakýkoliv enzym, který katalyzuje transfruktosylaci a zahrnuje enzymatický přípravek odvozený od Pullularia pullulans ATCC 9 348 (synonym s Aureobasidium pullulans).

Fruktosyltransferázová jednotka.

V textu uvedeného vynálezu je jedna fruktosyltransferázová jednotka definována jako množství enzymatické aktivity, které je potřebné к vyprodukování jednoho mikromolu redukujícího cukru, vyjádřeno jako glukóza, za minutu za dále uvedených podmínek:

— pH 5,5 — teplota 55 °C — koncentrace substrátu činí 60 gramů sacharózy potravinářské jakosti na 100 mililitrů vodné reakční směsi.

Stanovení obsahu redukujícího cukru (vyjádřeno jako glukóza) se provede na běžně používaném zařízení. Analýza se provádí běžnou alkalickou ferrokyanidovou metodou, viz např.: Analytical Biochemistry 45, No. 2, str. 517—524 (1972), která se přizpůsobí na výše uvedené zařízení. Pokud nebude jinak uvedeno, provádí se všechna stanovení enzymatické aktivity kontinuálním sledováním reakční směsi, která je tvořena následujícími složkami:

— 7,5 mililitru 80% vodného roztoku sacharózy potravinářské jakosti (hmot./ /obj.) — 2,3 mililitru citronanového tlumiče o koncentraci 0,1 M a pH 5,5 — 0,2 mililitru enzymatického vzorku, obsahující takové množství fruktosyltransferázy, které je schopné vyprodukovat 5—25 mikrogramů redukujícího cukru (vyjádřeno jako glukóza) za minutu na jeden mililitr reakční směsi.

Primární substrát.

Termínem „primární substrát“, který je použit v textu tohoto vynálezu, se míní takové sacharidy ve vhodné formě, které obsahují fruktosylovou část, která je к dispozici účastnit se transfruktosylace, jako je například vodný roztok sacharózy.

Sekundární substrát.

Termínem „sekundární substrát“, který je použit v tomto textu, se míní reakční produkt, který se získá tak, že se podrobí primární substrát působení fruktosyltransferázového přípravku, jak bylo uvedeno výše.

Díly a procenta.

V tomto textu jsou všechny díly uváděny jako díly hmotnostní a všechna procenta jako procenta hmotnostní na objem (hmot./ /obj.), pokud nebude výslovně uvedeno jinak.

Analýza vysokotlakou kapalinovou chromatografií.

Tímto výše uvedeným termínem se míní postup, při kterém se sirupy získané postupem podle uvedeného vynálezu analyzují za použití vysokotlaké kapalinové chromatografické metody, která se provede následu241460 jícím · způsobem. Složky se chromatografují elucí vodou z kationtové výměnné pryskyřice ve vápenné formě. Eluované složky se stanoví za pomoci diferenciálního refraktometru. Množství nedextrózních sacharidů se stanoví elektronickým integrátorem, a obsah dextrózy se stanoví z rozdílu. Obecný postup této metody · je· uveden v článku: Analisis of Carbohydrate Mixtures by liquid Chromatography, Am. Soc. Brew. . Chem. Proč., 1973, str. · 43—46.

Podstata ·způsobu přípravy produktu obsahujícího fruktózu ze sacharózy spočívá podle · uvedeného vynálezu v tom, že se zpracovává· vodný roztok sacharózy o hmotnostní · koncentraci v rozmezí od 10 % do 80 % pomocí fruktosyltransferázového enzymu odvozeného · · od · · Pullularia pullulans, při teplotě · · pohybující · se v rozmezí · · od 25 do 65 °C a při hodnotě pH v rozmezí od 4,5 do 6,5, za vzniku produktu obsahujícího dextrózu, fruktózu - a polysacharidy, s obsahem přinejmenším 66 % hmotnostních · fruktosylových zbytků, přičemž tyto· fruktosylové zbytky · jsou · spojeny · · [2-l-)beta vazbami, přičemž se případně zpracovává získaný produkt v prvním stupni · k ízomerizaci · části dextrózy na · fruktózu · pomocí izpmerázového enzymu, a · · ve třetím stupni · se provádí hydrolýza pomocí · · invertázového enzymu nebo· kyseliny v nepřítomnosti · izomerázového enzymu.

Ve výhodném provedení postupu podle uvedeného vynálezu se uvedená sacharóza použije v koncentraci alespoň 20 % hmotnostních.

Podle uvedeného· vynálezu je dále výhodné, · jestliže se produkt získaný v prvním stupni zpracuje · ve druhém stupni mobilizovaným glukózoizomerázovým enzymem.

Rovněž je výhodné podle vynálezu, jestliže se před provedením hydrolýzy polysacharidy fyzikálně oddělí od dextrózy a fruktózy. Výhodné je jestliže se uvedené polysacharidy oddělí ultrafiltrací.

Výhody postupu podle uvedeného vynálezu spočívají v tom, že se enzymatickým způsobem připraví sirupy s vysokým obsahem fruktózy, přičemž tento· obsah fruktózy je podstatně vyšší než u produktů · získaných glukózovou izomerizací škrobových hydrolyzátů podle dosavadního stavu techniky, aniž by bylo· nutné provádět fyzikální oddělování výsledného fruktózového koncového produktu. Postup podle uvedeného vynálezu se dá částečně · aplikovat na postup přípravy fruktózových sirupů, které obsahují více · než 55 % fruktózy.

Postupem podle uvedeného· vynálezu je možno získat četné · produkty. Tyto produkty zahrnují jednak konečnou fruktózu nebo sirup s vysokým obsahem fruktózy, · a rovněž · i různé přechodné produkty, jako· je například fruktózový polymer, substrát obsahující počáteční fruktózový polymer [nebo polysacharid), substrát · ze · kterého byl odstraněn · polymer a substrát obsahující nebo neobsahující polymer po izomerizaci.

Každý · z těchto uvedených produktů je možno přímo použít podle jejich · vlastností.

Každý · z těcbto produktů má · vlastnosti běžných cukrů a sirupů a · tyto· produkty mohou být použity · podle jejich obvyklých účelů použití. Tyto možnosti použití zahrnují například · použití jako sladících přísad a jako surového materiálu pro potravinářský průmysl a pro přípravu farmaceutických přípravků. Kromě toho· mohou být uvedené produkty použity pro běžné průmyslové účely, které jsou známé pro cukry a sirupy. · Například je možno· uvést, že tyto produkty je možno použít při výrobě lepidel, stabilizátorů vlhkosti potravin, při přípravě pergamenového· papíru, při výrobě třísliv, elektrických izolačníčh materiálů, při · přípravě pojiv· na jádra ve slévárenství, při · přípravě insekticidních přípravků, barviv a podobných jiných produktů a obecně je možno je použít · jako· plastifikátorů, zahušťovacích činidel · atd. Krátce řečeno, tyto produkty je možno použít ve · všech případech, kde se používají analogické produkty.

Sekundární substrát, získaný při provádění postupu podle uvedeného vynálezu, může být použit jako· vysoce stabilní, nekrystalující sirup při různých · aplikacích v potravinářském průmyslu. Produkt získaný postupem podle · uvedeného vynálezu · je zároveň jedinečnou směsí s vysokým obsahem sušiny, přičemž je tento produkt odolný k mikrobiologickému znečištění · a k tvorbě barevných částic, a současně je možno· tento · produkt použít pro skladování nebo· na lodích nebo při obou těchto možnostech, jako cukerný koncentrát o koncentraci, která byla dříve · nedosažitelná se zachováním výše uvedených vlastností. Kromě toho je třeba uvést, že tento nový sekundární substrát s vysokým obsahem suché složky může být podroben hydrolýze, za účelem získání invertní cukrové směsi, která má požadovanou sladící schopnost. Tento nový sekundární substrát, získaný postupem podle uvedeného· vynálezu má obsah suché · složky pohybující se · v rozmezí od 70 % do asi 82 · % hmot./hmot., a obsahuje monosacharidickou frakci, která · sestává v podstatě z dextrózy a polysacharidových polymerů, s přebytkem DPž, sestávající převážně z DPs produktu. Rovněž je přítomno malé · množství DP4+· polymerů (4,1 % a méně).

Při provádění postupu ·podle uvedeného vynálezu se · podrobí primární substrát, · ' to· znamená sacharóza, působení fruktosyltransferázového přípravku, který je schopen převést sacharózu na produkt obsahující frakci monosacharidů, která obsahuje jako hlavní podíl flúktózu a dále obsahuje· menší podíl fruktózy, · na polysacharidy, které obsahují přinejmenším 66 % hmotnostních fruktosylových částí.. Tento produkt tvoří sekundární substrát podle uvedeného vynálezu. Tyto výše uvedené polysacharidy sekundárního substrátu zahrnují všechny δ

polymery obsahující fruktózu (na rozdíl od sacharózy), které obsahují dvě nebo více monosacharidických částí. Tyto výše uvedené polymery mohou být dále charakterizovány tím, že zahrnují polysacharidy obsahující fruktosylové části spojené (2->l)-beta vazbami. Jak bude uvedeno v dalším textu, polysacharidy získané za daných podmínek transfruktosylace je možno podle uvedeného vynálezu ovlivnit tak, že budou mít převážně předem stanovený charakter, v určitých mezích. Tak je možno například uvést, že je možno připravit sekundární substrát, ve kterém bude větší množství (to znamená přinejmenším 60 % molárních) polysacharidů oligomery, které obsahují 2 až 10 (to znamená DP 2—10), a běžně 3 až 6 (to znamená DP 3—6) monosacharidických částí. Potom se uvedená glukóza izomeruje (pomocí působení izomerázového enzymu) na fruktózu v přítomnosti uvedených polysacharidů, přičemž potom následuje hydrolýza Uvedených polysacharidů v nepřítomnosti aktivního izomerázového enzymu. Výše uvedenou hydrolýzu je možno provést enzymaticky, přičemž se použije invertázy, nebo se provede kyselá hydrolýza za mírných podmínek.

Při provádění tohoto postupu mohou být výše uvedené polysacharidy odděleny od uvedené glukózy a uvedené fruktózy, a potom se provede hydrolýza stejným způsobem, jak již bylo předem uvedeno za vzniku sirupu s ultravysokým obsahem fruktózy, to znamená, že se získá sirup s obsahem fruktózy větším, než je 66 % hmotnostních a ve výhodném provedení je obsah větší než 90 % hmotnostních, přičemž tento produkt se získá přímo ze sekundárního substrátu podle uvedeného vynálezu, aniž by bylo zapotřebí provést izomerizaci dextrózy v uvedeném substrátu. Toto uvedené oddělení polysacharidů je možno provést běžným způsobem za pomoci běžných prostředků fyzikálního oddělování na bázi molekulárního oddělování, jako je například běžně prováděné membránové oddělování (to je například ultrafiltrace. dialýza), dále vysrážení z roztoku, absorpce na uhlíku a podobné další metody. Jako příklad těchto postupů membránového oddělování je možno uvést postupy v patentech Spojených států amerických č. 3 173 867, Re 26 097, 3 541 006 a 3 691 068.

Výhodným způsobem přípravy podle uvedeného vynálezu je postup, při kterém se získává sirup s vysokým obsahem fruktózy. Při tomto postupu se podrobí sacharóza působení fruktosyltransferázového přípravku, jako je například přípravek odvozený od Pullularia pullulans, jako jsou ATCC 9 348, ATCC 12 535, NRRL 1 673, NRRL Y2 311, NRRL Y83 892, NRRL YB 3 861, NRRL 3 937 a ATCC 15 223. Získaný výsledný produkt, nebo sekundární substrát se podrobí působení izomerázového enzymu. Potom se izomerázový produkt hydrolyzuje v nepřítomnosti aktivního izomerázového enzymu.

Předpokládá se, že sekundární substrát, získaný při provádění postupu podle uvedeného vynálezu, získaný shora uvedeným způsobem, je novým produktem. Tento substrát je jedinečným způsobem vhodný pro izomerizaci a následnou hydrolýzu к přípravě sirupu, který obsahuje více než 55 % fruktózy, přičemž tento sirup se připraví tak, že se sacharóza podrobí působení fruktosyltransferázového přípravku.

Postup podle uvedeného vynálezu probíhá přes substráty, které jsou vhodné pro enzymatickou izomerizaci a následnou hydrolýzu na sirupy, které obsahují více než 55 % fruktóžového sirupu, obsahující:

— od asi 20 % do asi 60 % hmotnostních monosacharidů, které obsahují velké množství glukózy a malé množství fruktózy, a — od asi 70 °/o do asi 40 % polysacharidů, které obsahují více než 66 % hmotnostních fruktosylových částí.

Zvláště výhodnými jsou sekundární substráty odvozené od sacharózy, připravené transfruktosylací v přítomnosti účinného množství fruktosyltransferázového přípravku, který je odvozen od rodu Pullularia pullulans ATCC '9 348, při těplotě pohybující se v rozmezí od 25 do 65 ^CC, a ve výhodném provedení postupu podle uvedeného vynálezu od 50 do 60 °C, a při hodnotě pH pohybující se v rozmezí od 4,5 do 6,5, a vé výhodném provedení postupu podle uvedeného vynálezu od 5,4 do 5,6. Výchozí použitá koncentrace sacharózy se může pohybovat dokonce na tak nízké hranici, jako je například 10 gramů na 100 mililitrů vody. Je ovšem výhodné používat při provádění postupu podle uvedeného vynálezu tak vysokou koncentraci suché složky, jak je to jenom možné, ve výhodném provedení postupu podle uvedeného vynálezu se tato koncentrace pohybuje v rozmezí od 30 gramů do 60 gramů na 100 mililitrů (za účelem dosažení maximální reakční rychlosti), až do bodu nasycení roztoku sacharózou (a až do vyšších koncentrací, jak ještě bude v dalším blíže objasněno).

К získání substrátu podle uvedeného vynálezu může být použito minimálně 0,5 jednotky fruktosyltransferázy na gram sacharózy. Obyčejně množství použitého enzymu nepřevyšuje 50 jednotek na gram sacharózy, neboť se berou v úvahu ekonomické důvody. Zvláště výhodné je při přípravě požadovaného sekundárního substrátu používat běžných provozních časů, a do výše uvedených provozních parametrů je možno zahrnout rozmezí 2 až 30 jednotek na gram sacharózy.

Výše uvedené znaky postupu podle uvedeného vynálezu a další detailní provedení tohoto postupu budou zřejmá z následujících příkladů provedení.

Postup přípravy fruktosyltransferázy, která je novým produktem, může probíhat tak, že se využije běžných fermentačních způsobů, které jsou například uvedeny v patentech Spojených států amerických číslo 3 565 756, 3 806 419, 3 535 123, a dále v článku S. Uedy a kol. Applied Microbiology, 11, 211—215 (1963). Ve výhodných provedeních postupu podle uvedeného vynálezu se používá nových separačních a čistících metod, které budou detailněji uvedeny v následujících příkladech.

Dále uvedený příklad je typickým fermentačním postupem přípravy enzymu z Pullularia pullulans ATCC 9 348.

Přikladl

Příprava fruktosyltransferázového přípravku — celitový nosič

A. Fermentační postup použitý к přípravě enzymu

Médium použité pro přípravu inokula a к provedení fermentace za účelem přípravy enzymu má následující složení:

0,5 % dvojsytný fosforečnan draselný

0,1 % chlorid sodný

0,02 % heptahydrát síranu horečnatého 0,06 % síran amonný

0,3 °/o kvasinkový extrakt

7,5 % sacharóza (potravinářská jakost) hodnota pH média se upraví na 6,8.

Zákvasné nádoby, což jsou Erlenmeyerovy láhve obsahující 100 mililitrů sterilního média, se inokulují kulturou černých kvasinek, Pullularia pullulans, ze šikmého agaru. Vybraný druh kvasinek, který se použije к provedení tohoto postupu podle uvedeného vynálezu je označen v katalogu Američan Type Culture Collection (Rockville, Maryland) pod číslem ATCC 9 348. Žákvasné nádoby se po zpracování na vratné třepačce, které probíhá po dobu 48 hodin při teplotě 32 °C, použijí к inokulaci jednolitrových Erlenmeyerových nádob, přičemž každá obsahuje 200 mililitrů předem definovaného média (viz výše). Koncentrace inokula je 0,5 % hmot./obj. Fermentace se provádí na vratné třepačce při teplotě 32 °C po dobu 7 dní.

B. Získání enzymu z fermentační živné půdy

Vzorky fermentační živné půdy ze čtyřiceti jednolitrových třepaných nádob se nalijí do společného prostoru a nádoby se opláchnou vodou, která se rovněž přidá к spojené živné půdě. Celkový konečný objem živné půdy po zředění je 12 litrů. Původní objem živné půdy je přibližně 8 litrů. Výše uvedený objem 12 litrů fermentační živné půdy se nechá projít Sharplovou kontinuální odstředivkou za účelem odstranění buněk kvasnic a buněčného odpadu. Kapalina nad usazeninou, která má podobu černého viskózního roztoku, se potom nadávkuje chloridem vápenatým do koncentrace 0,5 % hmot./obj. a hodnota pH roztoku takto získaného se upraví na 7,0 za pomoci hydroxidu sodného. Po tomto opatření se provede další zpracování pomocí výše uvedené Sharplesovy kontinuální odstředivky, přičemž se získá viskózní kapalina, která má světlejší barvu. Hodnota pH takto získané odbarvené kapaliny se potom upraví na hodnotu

5,5 za pomoci kyseliny chlorovodíkové, a potom se do této kapalina nadávkuje 1 000 jednotek (jak je definováno v patentu Spojených států amerických č. 3 806 419) pullulanasy. Takto získaná výsledná živná půda se konzervuje toluenem (který je přidán až do nasycení) a přidaná pullulanaza se ponechá reagovat při teplotě okolí po dobu přes noc. Po digesci s pullulaliázou přes noc se do tohoto roztoku přidá 1% Grefco 503 Celíte a do této živné půdy se potom přidá aceton v množství dvou objemů (to znamená 24 litry). Po tomto opatření se vytvoří sraženina, která se oddělí filtrací a takto získaný filtrační koláč se promyje acetonem a usuší se při teplotě okolí. Takto oddělený filtrační koláč obsahuje nerozpustný fruktosyltransferázový enzym.

Pokud se týče tohoto provedení podle příkladu 1, je třeba poznamenat, že přídavek chloridu vápenatého к výše uvedenému fermentačnímu prostředí, společně s úpravou hodnoty pH, se projeví v odstranění černého pigmentu a přítomných acidických polysacharidů. (Blíže o těchto acidických polysacharidech viz: Acta: Chem. Scand., 16, 615—622, 1962). Konečný enzymatický produkt je tímto к dispozici ve formě relativně čistého, bezbarvého přípravku. Tato výše uvedená čistící metoda tvoří charakteristický rys postupu podle uvedeného vynálezu,, přičemž umožňuje provádět poměrně jednoduchý čistící postup, za pomoci například odstřeďování, filtrace nebo vysrážení, za vzniku konečného produktu. Je tedy možno sumárně uvést, že podle tohoto výše uvedeného provedení postupu podle uvedeného vynálezu je možno oddělit acidické polysacharidy a černý pigment, které tvoří vedlejší produkty, z konečného fermentačního média černých kvasinek, Pullularia pullulans. Touto výše uvedenou metodou podle uvedeného vynálezu je možno připravit konečný enzymatický přípravek, který neobsahuje nežádoucí pigment a acidické polysacharidické vedlejší produkty, které vznikají během provádění fermentačního postupu. Pokud by se tyto vedlejší produkty neodstranily, potom dochází к současnému vysrážení těchto látek spolu s enzymem během přídavku rozpouštědla к fermentačnímu prostředí.

241480

Dále ’ se jeví jako nutné provést při výrobě enzymatického přípravku podle · uvedeného· vynálezu čištění tohoto přípravku · od pululanových polysacharidů, které jsou · inherentně přítomné ve fermentační živné půdě, neboť rovněž dochází k současnému vysrážení těchto· složek společně s fruktosyltransferázou během přídavku rozpouštědla do fermentačního prostředí. Z tohoto· důvodu je nutno kapalinu nad usazeninou získanou během přidávání a zpracovávání s chloridem · vápenatým, a úpravy hodnoty pH roztoku, zpracovat s běžně známými hydrolyzačními enzymy, jako je pullulanáza. Výše uvedená pullulanáza hydrolyzuje pullulan za vzniku nízkomolekulárních polymerů, čímž je možno se vyhnout současnému vysrážení a následnému znečištění fruktosyltransferázového přípravku během zpracovávání s rozpouštědlem (jako je například aceton, alkohol a podobné · jiné sloučeniny). Výše uvedené čištění fruktosyltransferázového přípravku tvoří další nové provedení postupu podle uvedeného vynálezu a další charakteristický znak tohoto postupu.

Fruktosyltransferázový přípravek podle uvedeného· vynálezu může být použit v daném · stavu, aniž by bylo nutno odstraňovat pullulan. Z výše uvedeného · je patrné, že postup podle uvedeného vynálezu je možno· prakticky provést bez hydrolýzy pullulanu pullulanázou, přičemž v tomto'· případě pullulan slouží jako nosič pro fruktosyltransferázu.

Další příklad · praktického· · provedení postupu podle vynálezu demonstruje použití pullulanu jako nosiče.

Příklad 2

Příprava sekundárního substrátu za použití fruktosyltransferázy na pullulanovém · nosiči

Podle tohoto příkladu provedení · se postupuje tak, že se do 20% roztoku sacharózy, který je tlumen pomocí 0,05 M roztoku citrónanového tlumiče na hodnotu pH · 5,5, přidá suchý · pullulan o koncentraci 1 %, který byl · připraven postupem podle příkladu 1, s tou výjimkou, že zde použitý pullulan není hydrolyzován pullulanázou a z· tohoto výše uvedeného důvodu slouží jako nosičovy materiál, přičemž v tomto případě není použit Celit. · Fruktosyltransferázová aktivita činí 677 jednotek/gram pullulanu. Reakce podle tohoto příkladu se provede při teplotě okolí, dokud se směs · nezakalí. Potom se vzorek takto· získaného materiálu analyzuje pomocí· vysokotlaké kapalinové chromatografie · s následujícími výsledky:

Rozdělení sacharidů zjištěné analýzou vysokotlakou · kapalinovou chromatografií

Fruktóza Dextróza DPz DP3 DP₄₊

6,9 40,6

Následující příklad provedení podle vynálezu dále charakterizuje enzym produkovaný postupem podle příkladu 1.

P ř í k 1 a d 3

Produkty enzymatického· působení · a tepelná stabilita enzymu

Podle tohoto provedení se postupuje tak, že se do reakčních nádob, které jsou opatřeny šroubovacími víčky, · přidá · 60 gramů sacharózy potravinářské jakosti a dále fruktosyltransferázový přípravek. Tento enzymatický přípravek byl získán z enzymatického produktu, připraveného postupem podle · příkladu 1, dispergováním vhodných alikvotních podílů tohoto enzymatického přípravku, který obsahuje pevný celit, do předem změřených množství vody, za účelem 'přípravy vhodně koncentrovaných roztoků enzymu, Obsažený celit se potom odstraní z roztoků filtrací. Takto získaný filtrát se po6,2 11,1 35,2 tom použije k dávkování do reakční směsi, přičemž se vytvoří koncentrace 10, 20 a 30 jednotek enzymu na gram sacharózového substrátu. Tyto· výše uvedené směsi se potom všechny zředí na konečný objem 100 mililitrů · pomocí vody. V dalším postupu podle tohoto příkladu se provedou požadované konverze, přičemž doba · konverze činí ’ 66 hodin, a podmínky, konverze zahrnují hodnotu pH 5,5 a teplotu · pohybující se v rozmezí od · 55 do 60°C (resp. obě tyto hodnoty, jak plyne z dále uvedené tabulky). Vzorky jsou odebírány v intervalu 24 hodin, 43 hodin a 66 hodin, přičemž se provádí stanovení obsahu redukčního cukru za účelem potvrzení enzymatické aktivity. Po· provedených analýzách na redukční cukr se · zbývající reakční · směsi zmrazí za účelem zastavení enzymatické aktivity · a vzorky se podrobí analýze na složení sacharidů za · pomoci vysokotlaké kapalinové chromatografie. Byly získány následující výsledky:

41'4 6 0

PH hodin

Test na redukční cukr¹

Teplota (°C)

Enzymatické jednotky^

Redukční cukr (mg/ml) 24 hodin

Redukční cukr (mg/ml)

PH hodin

Redukční cukr (mg/ml)

55	0	_____.	5,80	—	5,80	—
	10	191	5,40	231	5,25	268
	20	192	5,40	270	5,25	301
	30	246	5,35	334	5,15	390
60	0	0,7	5,75	1,5	5,80	2,1
	10	200	5,10	243	4,70	' 270
	20	219	5,15	288	4,90	346
	30	282	5,20	360	4,95	420

. Použitá metoda je uvedena pod definicí fruktosyltransferázové jednotky

Enzymatické jednotky na gram sacharózy

Složení -sacharidů zjištěné vysokotlakou kapalinovou chromatografií
Enzymatická Reakční Dextróza Levulóza DP2 dávka doba (%) (%) ’ (%) (jednotky/g (hod.) sacharózy)	DP3 (%)	DP4⁺ (%)

Reakční teplota 55 °C

10	24	31,7	2,3	10,0	25,0	31,0
	43	34,5	3,2	9,4	17,9	35,0
	66	36,7	3,9	8,6	15,0	35,8
20	24	33,9	2,8	8,8	19,7	34,8
	43	37,4	4,2	7,9	12,1	38,4
	66	40,5	4,9	7,4	10,8	36,4
30	24	37,4	4,0	7,1	12,5	39,0
	43	41,8	5,9	6,8	11,4	34,1
	66	46,1	7,5	7,0	11,5	27,9
......		Reakční	teplota 60 °C
10 .......	24	32,2	2,8	6,1	24,3	30,6
	43	35,0	4,0	9,8	18,2	33,0
	66	36,7	5,4	9,4	16,0	32,5
20	24	35,5	3,8	8,4	17,1	35,2
	43	38,4	5,0	8,0	12,3	36,3
	66	41,3	6,6	7,9	11,1	33,1
30	24	39,0	5,5	7,1	12,1	36,3
	43	43,7	7,1	7,3	11,0	30,9
	66	47,8	9,2	7,4	11,1	24,5

Výše uvedený příklad č. 3 demonstruje tepelnou stabilitu substrátu enzymu při teplotě 55 °C a 60 °C během - 66hodinového testu při hodnotě pH 5,5, což -dokumentuje značný obchodní význam uvedeného- enzymu. Kromě toho je třeba uvést, že sekundární substrát, který se připraví enzymatickou konverzí sacharózy společně s novým fruktosyltransferázovým přípravkem podle uvedeného vynálezu, představují na základě provedené analýzy na sacharidy potenciálně cenný produkt . -vhodný pro přípravu sirupů s vysokým- obsahem fruktózy ze sacharózy, neboť bylo zjištěno, že převážnou část tvoří dextróza - a polymery, které po následně provedené hydrolýze poskytují fruktózu, jako převažující monosacharid ve výsledném produktu. Postup podle tohoto- příkladu provedení - rovněž demonstruje, že nový - enzym podle uvedeného vynálezu je účinný při koncentraci sacharózy 60 % ' [hmot./obj.J. Rovněž je v tomto příkladu demonstrována funkčnost enzymu v přítomnosti vysokých koncentrací glukózy.

Příklad 4

Vliv teploty na aktivitu enzymu

Vliv teploty - na reakční rychlost fruktosyltransferázy - se zjistí následujícím způsobem, při kterém se využije autoanalyzér:

Reakční směs je tvořena 7,5 ml 80% roztoku sacharózy [hmot./obj.], 2,3 ml 0,1 M citronanového- tlumiče o hodnotě pH 5,5 a

0,2 ml 2% enzymatického- roztoku pyllulanu [hmot./ob].], což je enzymatický přípravek podle příkladu 2. Konečná koncentrace sacharózy činí 60 % hmot./obj. Jednotlivé vzorky jsou udržovány při následujících teplotách a analyzovány po 10 minutách na autoanalyzéru. Z uvedených výsledků plyne, že při teplotě 40 °C je enzymatická reakční rychlost l,89krát větší než při teplotě 30 °C, při teplotě 50 °C je l,29krát větší než při teplotě 40 °C a při teplotě 60 °C je l,8krát větší než při teplotě 50 °C. Z těchto výsledků je zřejmé, že reakční rychlost vzrůstá se zvyšující se teplotou.

Příklad 5

Demonstrování M.ichaelis-Mentenovy konstanty (K_1T1 ] fruktosyltransferázy

Hodnota K_m enzymu znamená koncentraci substrátu, při které je rychlost tvorby produktu poloviční vzhledem к V_max. Ke zjištění hodnoty K_m fruktosyltransferázy byla použita následující metoda.

Podle tohoto provedení se použije 90 % hmot. obj. zásobního roztoku sacharózy, jehož hodnota pH se upraví na 5.5 za pomoci 0,1 M citronanového tlumiče, přičemž se dále připraví vhodné koncentrace sacharózy v 9,8mililitrových alikvotních podílech, čímž se získají jednotlivé koncentrace: 5, 10, 30, 40, 50, 60 a 70 % sacharózy v konečném objemu 10 mililitrů. К takto naředěným vzorkům se potom přidá 0,2 ml roztoku, který obsahuje 1,1 jednotky fruktosyltransferázy. Potom se tyto výše uvedené vzorky okamžitě analyzují při teplotě 55 °C na autoanalyzéru, jak již bylo dříve uvedeno (viz fruktosyltransferázová jednotka). Pro daný případ se použije glukózový standard (kalibrováno v ^g/ml) jako kontrolní vzorek.

V následující tabulce je rychlost tvorby glukózy vyjádřena jako ^g/ml/min při různých koncentracích substrátu, přičemž se použije konstantní dávky (1,1 jednotky) fruktosyltransferázového přípravku podle příkladu 1.

Substrát %	^g/ml/min	^g/ml/mi.n^a
5	8,0	8,0
10	11,8	11,6
20	15,7	15,2
30	18,0	17,6
40	18,6	18,2
50	19,2	17,2
60	17,8	18,2
70	15,6	—

Příklad 6

Příprava a isomerizace sekundárního substrátu ze sacharózy

A. Příprava sekundárního substrátu

Podle tohoto provedení se sacharóza potravinářské jakosti, v množství 600 gramů, rozpustí ve vodě na celkový objem 800 ml. Hodnota pH tohoto roztoku se potom, upraví na 5,5 za pomoci zředěného roztoku kyseliny chlorovodíkové. Potom se suchý přípravek obsahující celit a enzym v množství 11 gramů, jehož aktivita je 550 jednotek/gram, připravený postupem podle příkladu 1, rozředí ve 100 ml vody. Takto připravená směs se potom zfiltruje ve vakuu za použití Whatmanova filtračního papíru č. 1 v Buchnerově nálevce. Takto získaný filtrační koláč se potom promyje dalším lOOmililitrovým množstvím vody. Takto získaných 200 ml filtrátu se potom přidá к roztoku sacharózy, který je v l,691itrové nádobě vybavené šroubovacím víčkem. Tato nádoba se potom umístí ve vodní lázni o teplotě 58 ^CC a reakce potom pokračuje po dobu 20 hodin, přičemž po proběhnutí této periody se vzorek reakčního produktu analyzuje vysokotlakou kapalinovou chromatografii za účelem stanovení složení sacharidů. Získaný výsledek je následující:

Složení sacharidů

Fruktóza 2,4 %

Dextrcza 32,8 %

DP2 10,6 %

DP3 22,9 %

DP4._k 31,3 %

Ke zbývajícímu reakčnímu produktu⁴ se se potom přidá chlorid hořečnatý (to znamená к sekundárnímu substrátu) na koncentraci 5 milimolů, a hodnota pH se upraví na 8,4 za pomoci zředěného roztoku hydroxidu sodného,

B. Kontinuální isomerizace sekundárního substrátu

Podle tohoto provedení se glukózová isomeráza odvozená od druhu Streptomyces ohvochromogenes ATCC 21715 (viz patent Spojených států amerických č. Re: 29 152) imobilizuje na porézní alumině (porézní nosičový materiál s kontrolovanou velikostí pórů, viz například patent Spojených států amerických č. 3 992 329) následujícím způsobem:

1. Nosičový materiál se promyje dvakrát vodou.

2. Nosič se inkubuje 0,1 M roztokem citronanu sodného po dobu 1 hodiny za míchání.

3. Citronan sodný se smyje od nosičové- ^a) výsledky získané znovu následující den ze 60% zásobního roztoku sacharózy.

Hodnota K_m je 0,27 molární koncentrace sacharózy. Maximální reakční rychlost se vyskytne při koncentraci substrátu 1,374 molů sacharózy, při hodnotě pH 5,5 a při teplotě 55 °C.

ho materiálu, dokud vodivost promývacího· roztoku nedosáhne 1000 mikroohmů.

4. Nosič se inkubuje 0,05 M chloridem horečnatým po dobu jedné hodiny a roztok -chloridu hořečnatého se dekantuje.

5. Objem 0,05 M chloridu hořečnatého se potom použije к přípravě konečné koncentrace enzymu 400 jednotek/mililitr.

6. Isomerázový koncentrát se potom přidá к nosičovému materiálu, přičemž výsledná koncentrace je 14 miliónů jednotek na

28,3 litru.

7. Nosič a enzym se kontaktují po dobu 22 až 24 hodin a potom se nevázaný enzym smyje z nosičového materiálu za pomoci destilované vody.

Do skleněné kolony, opatřené pláštěm (3 cm x 18 cm) a vybavené čerpadlem připojeným к zásobní nádrži nástřikové suroviny, se potom vloží imobilizovaný enzym, připravený shora uvedeným postupem. Objem lože kolony po zatížení činí 45 mililitrů. Tato uvedená kolona pracuje při teplotě 60 °C při všech isomerizačních postupech. Zatížená kolona se spustí na dextrózový sirup (o koncentraci 50 % hmot./obj.) s 5 milimoly chloridu hořečnatého a hodnota pH se upraví na 8,4, za účelem zjištění, zda je kolona aktivní. Množství protékající kolonou se upraví na 292 milílitrů/hod. Potom se obsah kolony vypustí až na objem lože. Přivedení sekundárního substrátu se potom provede ručním způsobem, přičemž množství tohoto substrátu je takové, že odteče z lože 20 ml vytékajícího proudu a toto množství se shromáždí stranou, a potom se protékající množství sekundárního substrátu kolonou upraví na 292 mllilitrů/hod. Prvních 100 mí sebraného sirupu se odvede stranou a ponechá se v klidu к převedení substrátu. Zbývající sekundární substrát (v množství asi 850 ml) se potom vede kolonou. Asi po jedné hodině se průtokové množství zvýší na 570 mllilitrů/hod. Ke konci provádění tohoto postupu se průtokové množství upraví a udržuje na 300 ml/hod. Po dokončení tohoto pochodu se sekundárním substrátem se kolona přepojí zpět na dextrózu za účelem ukázání toho, že isomerázová aktivita se stále ještě projevuje. V následující tabulce jsou porovnány výsledky získané vysokotlakou kapalinovou chromatografií s výchozím sekundárním substrátem a výsledky s konečným produktem z uvedené isomerizační kolony:

Sekundární substrát (A) Konečný produkt (B)

Fruktóza	2,4	15,7
Dextróza	32,8	18,9
dp₂	10,6	11,0
DPs	22,9	22,9
DPá ₊	31,3	31,5

Tyto výše uvedené výsledky ukazují, že 42,38 % volné dextrózy v sekundárním substrátu se isomerizuje ve výše uvedené koloně na fruktózu. Rovněž je nutno uvést, že fruktózové polymery přítomné v sekundárním substrátu nejsou zjevně ovlivňovány nebo neovlivňují isomerizaci dextrózy na fruktózu. Z výše uvedených výsledků je zvláště pozoruhodné to, že celkové rozdělení monosacharidů tvoří asi 45 % fruktó· zy a 55 % dextrózy.

V následujícím příkladu provedení jsou uvedeny dva postupy týkající se rozštěpení polysacharidů přítomných v sekundárním substrátu a rovněž isomerizačního produktu. V prvém postupu se využívá enzymatického zpracování a ve druhém kyselé hydrolýzy za mírných podmínek.

Příklad 7

Příprava sirupu s vysokým obsahem fruktózy hydrolýzou

A. Enzymatická hydrolýza

Podle tohoto provedení se ke 100 ml produktu B, připraveného podle příkladu 6, přidá 10 mg čištěné invertázy odvozené od Candida utllis. Takto připravená směs (která je konzervovaná toluenem) se ponechá reagovat přes noc při teplotě okolí a potom se takto získaný vzorek analyzuje za pomoci vysokotlaké kapalinové chromatografické metody. Zbývající produkt В se ponechá kontinuálně reagovat po dobu dalších 6 dní a potom se odejme takto· získaný vzorek, který se analyzuje stejným uvedeným způsobem, přičemž se získají následující výsledky:

Výcho-zí materiál Po působení invertázy Po dalších šesti (produkt B) dnech

Fruktóza	15,7 %	41,9	%	62,4 %
Dextróza	18,9 %	29,4	%	36.2 %
DP2	11,0 %	1,9	%	0
DP3	22,9 %	12,9	%	0,5 %
DPd +	31,5 θ/ο	13,9	%	0,9 %

Použitá invertáza je enzymatický přípravek, přičemž tento přípravek má aktivitu 123 jednotek/miligram. Jedna jednotka této invertázy katalyzuje rozštěpení sacharózy za vzniku 1 mikromolu glukózy a 1 mikromolu ’ fruktózy za minutu za stanovených podmínek.

B. Kyselá hydrolýza produktu B

Podle tohoto provedení se kyselá . hydro lýza vzorku produktu B, který se získá podle postupu v příkladu 6, provede přidavkem kyseliny sírové až na koncentraci 0,05 N a potom - se ’ provede zahřívání na teplotu pohybující se v rozmezí od 75 do 80 °C. Potom se z této směsi . odeberou vzorky po jedné hodině a po dvou hodinách hydrolýzy, a tyto vzorky se analyzují vysokotlakou kapalinovou chromatografickou metodou. Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

	Výchozí materiál (produkt B)	1 hodina	2 hodiny
Fruktóza	15,7	60,3	59,1
Dextróza	18,9	38,7	37,9
DP2	11,0	1,9	2,6
DP3	22,9	0,4	0,3
DP4 +	31,5	0	0,2

Výše uvedené výsledky v postupu A ukazují - na - vzrůst převážně obsahu fruktózy, - a vzrůst glukózy je menší, - přičemž současně poklesne -obsah DPz, DP3 a DP4+ frakcí, což naznačuje přítomnost fruktózového polymeru..

Výsledky získané při - provádění kyselé hydrolýzy v postupu B jsou v souhlase s výsledky, získanými při provádění hydrolýzy postupem A, a rovněž - ukazují na štěpení fruktózového polymeru.

Výše uvedené - diskuse se týkají provádění transfruktosylace, při které se používá primárního substrátu, ve kterém obsah suché složky výchozí sacharózy - nepřevyšuje bod nasycení za daných - reakčních podmínek - - .Následující příklad provedení demonstruje použití primárního' substrátu, jehož počáteční koncentrace sacharózy je vyšší než je -bod - nasycení, přičemž tento materiál se podrobí působení fruktosyltransferázy a výsledkem je produkt, obsahující vyšší obsah - DPs frakce (to znamená fruktosyl-sacharózy) a zmenšený obsah DPí+ produktů. Rovněž je - v- tomto příkladu poukázáno* na zvýšenou koncentraci suché složky (hmot./ /hmot.) sekundárního substrátu oproti koncentraci suché - složky, dosažené v nepřítomnosti působení fruktosyltransferázy. Kromě toho je v tomto příkladu ukázáno, že v případě, kdy koncentrace suché složky v primárním substrátu vzrůstá, potom stupeň polymerace fruktózového polymeru v sekundárním substrátu klesá a frakce DPd_Ťmateriálu je přítomna - pouze v malých množstvích.

Toto je markantní rozdíl ve srovnání s výsledky získanými v předchozích příkladech, při kterých bylo použito sacharózových substrátů - o* koncentraci - nižší než je bod nasycení. - V těchto příkladech je DP- + materiál primárním produktem.

Příklad 8

Příprava sekundárního substrátu ze sacharózových. směsí o- koncentraci vyšší než - je bod nasycení

Podle tohoto provedení se postupuje tak, že se umístí sacharóza potravinářské jakosti ve formě 200gramových alikvotních’ podílů v 0,4711irových skleněných nádobách se šroubovacími uzávěry. Pro kontrolní účely - se do jedné skleněné nádoby vloží 50 ml vody, přičemž do ostatních se vloží 50 ml vody -obsahující vzrůstající množství fruktosyltransferázového přípravku s celitem (tenoo' přípravek byl připraven postupem podle příkladu - 1), jak je to- uvedeno v - následující tabulce. Každá z uvedených nádob se uzavře a potom se všechny umístí do třepačky, ve které jsou dále umístěny na vodní lázni, přičemž teplota této vodní lázně se upraví -na hodnotu pohybující se z rozmezí od 54 do< 55 °C. Výše uvedené nádoby se potom protřepávají po- dobu 24 hodin, přičemž příležitostně se rovněž promíchají manuálním způsobem. Z každé nádoby se potom po provedení výše uvedeného zpracovávání při dané teplotě odeberou vzorky kapaliny nad usazeninou a tyto vzorky se

24

umístí do testovací trubice se šroubovacím uzávěrem, přičemž tyto trubice se umístí do lázně s vroucí vodou za účelem inaktivování enzymu. Potom se tyto vzorky nalyzují za pomoci vysokotlaké kapalinové chromaVýsledky příkladu č. 8

Nádoba	Sacharó- Enzyma-	Sušina	Sacharidické složení v roztoku zjištěné
č.	za (g) tické	v kapali-	vysokotlakou kapalinovou chromatografií
	jednotky¹	ně nad	(%)
		usazeni-	Fruk. Dex. DP2 DP3 DP4₊
		nou
		(hmot./ /hmot.)

1	200	100	74,5	0,6	9,6	80,9	8,9	ND²
2	200	200	75,6	0,7	12,7	72,2	13,7	0,7
3	200	300	76,3	. 1,0	14,5	66,8	16,6	1,1
4	200	400	77,1	0,9	15,7	62,6	19,0	1,8
5	200	500	77,7	1,1	17,3	58,5	21,0	2,1
6	200	600	78,1	1,3	18,0 '	56,0	21,9	2,8
7	200	700	78,1	1,1	18,8	53,9	23,1	3,0
8	200	800	80,0	1,0	19,3	52,2	24,1	3,4
9	200	900	79,0	1,3	19,9	50,0	25,0	3,7
10	200	1000	79,6	1,3	20,6	48,6	25,4	4,1
kontrolní	200	žádné	72,7	0,3	ND2	99,7	ND²	ND²

¹ celkový počet . jednotek fruktosyltransferázy v 50 ml vody ² ND = nestanoveno

V tomto bodě je nutno poznamenat, že je pozoruhodné, že při provádění postupu podle shora uvedeného· ' příkladu krystaluje kontrolní . vzorek v případě ochlazení na teplotu okolí (asi 25 °C), přičemž enzymatickým postupem vznikající sekundární substrát zůstává v roztoku a projevuje vynikající stabilitu při skladování, aniž by nastala krystalizace.

I přesto, že v postupu podle výše uvedeného příkladu 8 bylo použito 200 gramů sacharózy na 50 ml vody, to znamená 80 '°/o hmot./hmot., může být koncentrace suché složky sacharózového · výchozího materiálu zvýšena.

Takto získaný . sekundární substrát · podle výše uvedeného· provedení postupu podle uvedeného · vynálezu, který je novým produktem, může být použit jako vysoce stabilní, nekrystalující sirup při různých aplikacích v potravinářském průmyslu. Produkt získaný postupem podle uvedeného vynálezu je zároveň jedinečnou směsí s vysokým obsahem sušiny, přičemž je tento· produkt odolný k mikrobiologickému znečištění a k tvorbě barevných částic, a současně ' je možno tento produkt použít při skladování nebo· na lodích nebo při obou těchto mož tografické metody a stanoví se obsah suché složky v kapalině nad usazeninou (K. Fischerovou metodou), přičemž výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

nostech jako cukerný koncentrát o koncentraci, která byla dříve nedosažitelná, se zachováním výše uvedených vlastností. Kromě toho je třeba uvést, že tento nový sekundární substrát s vysokým obsahem suché složky může být podroben hydrolýze, ' · jak je to uvedeno· v příkladu 7, za účelem získání invertní cukrové směsi, která · má požadovanou sladící schopnost. ' Tento' nový· sekundární substrát, získaný postupem podle uvedeného· vynálezu, má obsah suché složky pohybující se v rozmezí od · 70 % do asi 82 % hmot./hmot., a obsahuje monosacharidickou frakci, která sestává v podstatě · z dextrózy a polysacharidové polymery, s přebytkem DP2, sestávající převážně z DP3 produktu. Rovněž je přítomno malé množství DPd.(. polymerů (4,1 % a méně).

Ačkoliv fáze transfruktosylace byla · · demonstrována jako vsázkový pochod, je zřejmé, že je rovněž možno použít podobným způsobem kontinuálního postupu. Při provádění kontinuální transfruktosylace se transfruktosyláza vhodným způsobem· imobilizuje, přičemž se použije způsobu, který byl již uveden pod definicí zmobilizovaného enzymu, · a rovněž se použije kontinuálního postupu, který je zde popsán.

Claims

PŘEDMÉT

1. Způsob přípravy .produktu obsahujícího fruktózu ze sacharózy, vyznačující se tím, že se zpracovává vodný roztok sacharózy o hmotnostní koncentraci v rozmezí od 10 procent do 80 procent pomocí fruktosyltransferázového enzymu odvozeného od Pullularia pullulans, při teplotě v rozmezí od 25 do· 65 °C a při hodnotě pH v rozmezí od

4,5 do 6,5, za vzniku produktu obsahujícího dextrózu, fruktózu a polysacharidy, s obsahem přinejmenším 66 -°/o hmotnostních fruktosylových · zbytků, přičemž tyto fruktosylové zbytky jsou spojeny (2-l).-beta vazbami, přičemž se případně zpracovává získa'ný produkt v prvním · stupni k isomerizaci části dextrózy na fruktózu pomocí isomerázového· enzymu, a ve třetím stupni se · pro-

VYNALEZU vádí hydrolýza pomocí invertázového enzymu · nebo kyseliny v nepřítomnosti isomerázového enzymu.
2. Způsob podle bodu 1, · vyznačující se tím, že uvedená sacharóza se použije v koncentraci alespoň 20 % hmotnostních.
3. Způsob podle bodu 1 nebo: podle bodu

2, vyznačující se tím, že produkt získaný v prvním stupni se zpracuje ve druhém stupni · imobilizovaným glukózoisorperázovým enzymem.
4. Způsob podle některého z bodů 1 až 3, vyznačující se tím, že se před · provedením hydrolýzy polysacharidy fyzikálně · oddělí cd dextrózy a fruktózy.
5. Způsob podle bodu 4, · vyznačující se tím, že se · oddělí polysacharidy ultrafiltrací.