HU181413B - Process for preparing a saccharide composition containing fructose from saccharose - Google Patents

Description

A találmány szacharóz enzimes transzfruktozilezésére vonatkozik. Közelebbről, a találmány tárgya új eljárás fruktóz előállítására szacharózból fruktozil poliszacharidokon keresztül. A találmány szerinti új enzimes módszerrel a keményítő hidrolizátumok glükóztartalmának izomerizálásával jelenleg kapható szirupoknál lényegesen nagyobb fruktóztartalmú szacharid készítmények állíthatók.elő a keletkező fruktóz-végtermék fizikai elkülönítésének szükségessége nélkül. Az eljárás különösen jól alkalmazható 55%-nál több fruktózt tartalmazó fruktóz-szirupok előállítására.

Számos olyan eljárás ismert, amelynek során szénhidrátokat enzimekkel kezelnek.

A C. A. 85, 124 254 k irodalmi helyen ismertetett eljárásban szacharózt Aspergillus törzsből nyert olyan enzimkészítménnyel kezelnek, amely fruktozil-transzferáz és glükozidhidroláz enzimet tartalmaz. Az így előállított szacharid (2—lekötésekkel kapcsolódó fruktozilgyököket tartalmaz.

A 3 689 362. számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás szerint glükózt borát-vegyület jelenlétében glükóz-izomerázzal fruktózzá izomerizálnak.

A 2 017 590. számú Német Szövetségi Köztársaság-beli nyilvánosságrahozatali iratban a keményítő enzimes hidrolízisét úják le, az így kapott dextrózt ezután enzimes úton fruktózzá izomerizálják.

A találmány szerinti eljárással számos terméket állíthatunk elő. Ilyen például maga a fruktóz vagy a nagy fruktóztartalmú szirup, valamint különböző köztitermékek, így a fruktozil poliszacharidok.

A találmány szerinti eljárás termékei a szokásos cukrok és szirupok tulajdonságaival rendelkeznek és ezek hagyományos felhasználási területein alkalmazhatók. így felhasználhatók például édesítőszerekként és nyersanyagként gyógyszerek készítéséhez, továbbá a cukrok és szirupok általános ipari alkalmazási területein. így használhatók ragasztók, nedvesítőszerek, pergamenpapír, cserzőszerek, elektromos szigetelők, öntödei magkötőanyagok, rovarirtószerek, színezékek és hasonlók gyártásánál, vagy még inkább lágyítókként, sűrítőszerekként stb. Röviden összegezve széleskörűen felhasználhatók minden olyan alkalmazási területen, amelyen hasonló termékeket már használnak.

Tekintettel a szakterületen általános használatban lévő számos elnevezésre, az alábbiakban megadjuk a leírás során használt elnevezések meghatározását.

A „glükóz” és „dextróz” elnevezéseket felváltva használjuk a találmány leírása során ezen monoszacharid oldatban vagy száraz formában való megnevezésére.

A „szacharóz” elnevezés ezen diszacharid bármely szacharóz nyersanyagból, például cukornádból vagy cukorrépából nyert finomított vagy nyers formájának elnevezésére szolgál oldatban vagy száraz anyag formájában. A találmányban a szacharóz kiindulási anyagot gyakorlatilag főként vizes közegben használjuk.

A „fruktóz” és „levulóz” elnevezéseket a szakterületen felváltva használják a dextróz izomerének elnevezésére, amely édesebb, mint a dextróz. A fruktóz mézben és invertcukorban található dextrózzal együtt, és édes íze miatt értékes. A levulóz és fruktóz elnevezéseket felváltva használjuk

-1181413 a találmány leírása során ezen monoszacharid bármely — oldatban lévő vagy száraz — formájának megnevezésére.

Az „enzimkészítmény” kifejezés az itt használt értelemben bármely olyan készítményre vonatkozik, amely a kívánt enzimatikus hatással rendelkezik. Ezt az elnevezést használ- 5 juk például élő teljes sejtek, száraz sejtek, sejtkivonatok, a sejtekből és tenyészfolyadékokból származó tisztított és koncentrált készítmények megnevezésére. Az enzimkészítményeket a találmány során a gyakorlatban oldatban vagy kötött formában használjuk. 10

A leírás során „izomeráz enzim” néven említünk minden olyan enzimkészítményt, amely dextrózt levulózzá izomerizál. Ezek az enzimek a szakterületen jól ismertek, és dextróz izomeráz, xilóz izomeráz és glükóz izomeráz néven említik őket. Ilyen enzimek számos alkalmas mikroorganizmusból 15 származhatnak. Ilyen mikroorganizmusok például a Streptomyces, Bacillus, Arthrobacter, Actinoplanes, Curtobacterium és egyéb törzsekhez tartoznak.

A jelen találmány során használt előnyös izomeráz enzim Streptomyces olivochromogenes ATCC No. 21 713, ATCC 20 No. 21714 vagy ATCC No. 21 715 törzsekből származik (az utóbbi az ATCC No. 21 713 különálló telepe), ahogy a 3 813 318. sz. és 3 957 587. sz. Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi leírásokban közzétettük, főként ha a 3 770 589. sz. vagy 3 813 318. sz. Amerikai Egyesült Álla- 25 mok-beli szabadalmi leírásban leírt eljárás szerint készült.

A szakirodalomban jelenleg közölnek olyan eljárásokat, ahol az izomeráz enzimet vízben oldhatatlan iners hordozóra kötik. A kötött enzim utána alkalmas glükóznak nagy fruktóztartalmú sziruppá történő folyamatos átalakítására. Ilyen 30 eljárásokra a 3 708 397.; 3 788 945.; 3 850 751.; 3 868 304. sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásokban, a 819 859. sz. belga szabadalmi leírásban és a 3 960 663. sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban (810 480. sz. belga szabadalmi leírás) közölnek példákat. 35 „Izomeráz egység” az enzimaktivitás mértékegysége, az az enzimmennyiség, amely percenként egy mikromól levulóz termeléséhez szükséges az izomeráz enzim aktivitás meghatározásánál alább leírt körülmények között

Izomeráz aktivitás meghatározás fogalma az itt használt 40 értelemben arra a meghatározási eljárásra vonatkozik, amelynek lényege a glükózoldatból állandósított körülmények között termelődő ketóz spektrofotometriás meghatározása.

A meghatározáshoz a következő törzsoldatot készítjük: 45

0,1 mólos MgS0₄ · 7H₂O oldat 1 ml,

0,001 mólos CoCl₂ · 6H₂O oldat 1 ml, mólos 7,5 pH-jú nátrium-foszfát puífer 0,5 ml, vízmentes D-glükóz 1,44 g.

Desztillált vízzel 7,5 ml össztérfogatra feltöltjük. 50

A meghatározandó enzimkészítményt először körülbelül

1—6 izomeráz egység/ml koncentrációra hígítjuk.

Az enzimes izomerizációt úgy végezzük, hogy 1 ml enzimkészítményt adunk 3 ml törzsoldathoz, és 60 °C-on 30 percig inkubáljuk. Az inkubációs periódus végén 1 ml aliquotot 55 kiveszünk, és 9 ml 0,5 n perklórsavba öntjük. Ezt az oldatot azután 250 ml végtérfogatra hígítjuk. Kontrollként, összehasonlító célokra, glükóz vakpróbát készítünk, 1 ml enzim helyett 1 ml vizet adva az oldathoz az inkubálási periódus kezdetén. 60

A ketózt azután cisztein-kénsav módszerrel határozzuk meg. A jelen meghatározás esetében az izomeráz egységet úgy definiáljuk, mint azt az enzimaktivitást, amely percenként egy mikromól levulóz termeléséhez szükséges a leírt izomerizációs körülmények között. 65

A „transzfruktozilezés” az itt használt értelemben egy fruktozil-gyöknek a donorról, például szacharózról, egy akceptorra, például poliszacharidra történő átvitelét jelenti.

A fruktozil transzferáz enzimen olyan enzimet értünk, amely katalizálja a transzfruktozilezést. Ilyen például a Pullularia pullulans ATCC 9348-ból (azonos az Aureobasidium pullulans-sal) származó enzimkészítmény.

Az itt használt értelemben a fruktozil transzferáz egységet úgy definiáljuk, mint azt az enzimaktivitás-mennyiséget, amely percenként egy mikromól glükózban számított redukáló cukor előállításához szükséges a következő feltételek mellett: a) pH=5,5; b) hőmérséklet: 55 °C; c) szubsztrátkoncentráció: 100 ml vizes reakcióelegyben 60 g étkezési minőségű szacharóz.

A redukáló cukor meghatározást (glükózra számolva) „Technicon Autoanalyzer II” (Technicon Inc., Tarrytown, New York) alkalmazásával végeztük. Az analízist a szokásos lúgos ferricianid módszerrel végeztük [Analitical Biochemistry, 45, (2), 517—524 (1972)], amelyet az „Autoanalyzer ΙΓ’-höz igazítottunk. Ha másképp nem jelezzük, akkor az enzimaktivitás-meghatározásokat az alábbi összetételű reakcióelegy folytonos megfigyelésével végezzük:

7,5 ml 80%-os élelmiszer minőségű vizes szacharóz oldat,

2,3 ml 0,1 mólos 5,5 pH-jú citrátpuffer,

0,2 ml enzim minta, amely olyan mennyiségű fruktoziltranszferáz enzimet tartalmaz, amely a reakcióelegy 1 ml-nyi mennyiségéből percenként 5—25 mikrogramm redukáló cukrot termel (glükózra számolva).

A „primer szubsztrát” kifejezés az itt használt értelemben olyan szacharidokra vonatkozik, amelyek transzfruktozilezésben való részvételre alkalmasak és hozzáférhető fruktozil gyököt tartalmaznak, mint például szacharóz vizes oldatai.

A „szekunder szubsztrát” kifejezés az itt használt értelemben a fruktozil-transzferáz enzimkészítmény hatásának kitett primer szubsztrátból keletkező reakciótennéket jelenti.

A találmány leírása során a rész kifejezés mindig súlyrészt jelent és a százalék kifejezés mindig vegyes százalékot (súly/ térfogat) jelent, ha másképp nem jelöljük.

A „nagynyomású folyadékkromatográfiás meghatározás” kifejezés itt azt az eljárást jelenti, amelynek során a találmány szerinti eljárással előállított szirupokat nagynyomású folyadékkromatográfiával analizáljuk a következő technikával. A komponenseket kalcium-formában lévő kationcserélő gyantáról vízzel eluálva kromatografáljuk. Az eluált komponenseket differenciál-refraktométer segítségével detektáljuk. A nem-dextróz jellegű szénhidrátok mennyiségét elektronikus integrátorral határozzuk meg, és a dextrózt különbségként kapjuk meg. Az általános eljárást a „Szénhidrát-elegyek analízise folyadékkromatográfiával” c. közlemény [Am. Soc. Brew. Chem. Proc., 43—46 (1973)] adja meg. Az alkalmazott gyanta kalcium-formájú „Aminex Q” 15-5 gyanta, a Bio Rád Laboratories, Richmond, Califomia készítménye.

A találmány értelmében tehát fruktóztartalmú szacharid készítményt állítunk elő szacharóz (primer szubsztrát) dextrózból, fruktózból és poliszacharidokból álló szacharid készítménnyé (szekunder szubsztrát) való átalakítása a dextróz fruktózzá történő izomerizálása és a poliszacharidok hidrolízise útján oly módon, hogy

1. szacharózt 25—60 °C hőmérsékleten és 4,5—6,5 pHértéken fruktozil-transzferáz enzimmel kezelve dextrózból, fruktózból és legalább 60 súly% fruktozil gyököt tartalmazó poliszacharidokból álló szacharid készítményt állítunk elő, ahol a fruktozil gyökök (2-lekötésekkel kapcsolódnak,

2. a szacharid készítményben levő dextróz egy részét izomeráz enzimmel fruktózzá izomerizáljuk és

-2181413

3. az 1. lépésben kapott poliszacharidot izomeráz enzim távollétében fruktóztartalmú termékké hidrolizáljuk.

A szekunder szubsztrát nagy mennyiségű glükózt és kismennyiségű fruktózt tartalmazó monoszacharid-frakcióból és legalább 60 súly% fruktozil-gyököt tartalmazó poliszacharidokból áll. A szekunder szubsztrát poliszacharidjai mind fruktóztartalmú polimerek (szacharóztól eltérőek), amelyek két vagy több monoszacharid-gyököt tartalmaznak. Ezekre a polimerekre továbbá még az jellemző, hogy (2->1)-β kötésekkel kapcsolódó fruktozil-gyököket tartalmazó poliszacharidokból állnak. Amint a későbbiekben leírjuk, az adott körülmények közt végbemenő transzfruktozilezésből származó poljszacharidok túlnyomórészt előre meghatározott tartományon belül lehetnek. így például olyan szekunder szubsztrát termelődhet, amelyben a poliszacharid legnagyobb része (azaz legalább 60 mól%-a) 2—10 monoszacharid-gyököt (DP 2—10), vagy inkább 3—6 mönoszacharid-gyököt (DP 3—6) tartalmazó oligomer. Ezután az említett glükóz (izomeráz enzim hatására) fruktózzá izomerizálódik az említett poliszacharidók jelenlétében, majd ezt követi az említett poliszacharidok hidrolízise aktív izomeráz enzim távollétében. A hidrolízist végezhetjük enzimatikusan invertáz alkalmazásával vagy savval enyhe körülmények között.

A találmány szerinti eljárás egy másik foganatosítási módja szerint a poliszacharidokat elválasztjuk a glükóztól és fruktóztól, majd ezt követően az előbb leírtak szerint hidrolizáljuk, így a szekunder szubsztrátból a szubsztrátban lévő dextróz izomerizálásának szükségessége nélkül közvetlenül nagyon nagy fruktóztartalmú szirupot kapunk, azaz 60 súly%-nál és előnyösen 90 súly%-nál magasabb fruktóztartalmút. Ilyen elválasztás a molekulanagyságon alapuló szokásos fizikai elválasztási technikákkal hajtható végre, például a szokásos membrános technológiával (ultraszűréssel, dialízissel), oldószeres kicsapással, szenes abszorpcióval és hasonlókkal. Membrános technológiákra a 3 173 867. számú, Re 26097. számú, 3 541 006. számú és 3 691 068. számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásokban találunk példákat.

A nagy fruktóztartalmú szirupok előállítására szolgáló eljárás egyik előnyös foganatosítási módja szerint úgy járunk el, hogy a szacharózt olyan fruktozil-transzferáz enzimkészítmény hatásának teszünk ki, amely például Pullularia pullulans törzsekből, így ATCC 9348, ATCC 12 535, NRRL 1673, NRRL Y2311, NRRL YB 3892, NRRL YB3861, NRRL 3937 és ATCC 15 223 törzsekből származik. A keletkezett terméket vagy szekunder szubsztrátot izomeráz enzim hatásának vetjük alá. Ezután az izomerizált terméket aktív izomeráz enzim távollétében hidrolizáljuk.

A találmány szerinti eljárással előállított szekunder szubsztrát véleményünk szerint új anyag. Ez a szubsztrát egyedülálló módon alkalmas izomerizálásra és ezt követő hidrolízisre, így 55%-nál nagyobb fruktóztartalmú szirupot eredményezve, és úgy állítható elő, hogy szacharózt fruktozil-transzferáz enzimkészítmény hatásának vetünk alá. A találmány szerinti eljárással enzimatikus izomerizálásra és ezt követő, 55%-nál több fruktózt tartalmazó sziruppá történő hidrolízisre alkalmas szubsztrátot nyerünk, amely (1) körülbelül 20—60 súly% monoszacharidot tartalmaz, amelynek nagy része glükóz, kisebb része fruktóz, és (2) körülbelül 70 —40% poliszacharidot, amely több mint 60 súly%-nyi fruktozil-gyökből áll.

Különösen előnyösek a szacharózból hatásos mennyiségű Pullaria pullulans ATCC 9348 törzsből származó fruktoziltranszferáz enzimkészítmény jelenlétében, körülbelül 25 °C tól körülbelül 65°C-ig, előnyösen körülbelül 50’C-tól 60 ’C-ig terjedő hőfoktartományban, és körülbelül 4,5—6,5, előnyösen körülbelül 5,4—5,6 pH-η végzett transzfruktozilezéssel kapott szekunder szubsztrátok. A kiindulásnál alkalmazott szacharózkoncentráció legalább 10 g/100 ml víz. Előnyös azonban, ha a lehető legmagasabb szárazanyagtartalomnak megfelelő koncentrációt alkalmazunk, előnyösen körülbelül 30—60 g szacharóz/100 ml víz koncentrációtól (maximális reakciósebesség) a szacharóz telítési pontjáig (és magasabbat, amint később bővebben leírjuk).

Egy gramm szacharóz legalább 0,5 egység fruktoziltranszferáz enzim használandó a találmány szerinti új szubsztrát előállításához. Gazdaságossági megfontolásokból általában az enzim mennyisége nem haladja meg az 50 egységet egy gramm szacharózra számítva. Gazdaságosság szempontjából előnyös, ha egy gramm szacharózra számítva körülbelül 2—30 egységnyi enzimet használunk,

A találmány szerinti eljárást az alábbiakban bővebben ismertetjük.

A fruktozil-transzferáz termelésére szolgáló eljárás sorún a szokásos fermentációs technikát alkalmazhatjuk [lásd például a 3 565 756. sz.; 3 806 419. sz.; 3 535 123. sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásokat és S. Ueda és mtsai. közleményét: Applied Microbiology, 11, 211—215. (1963)]. Előnyösen olyan új elválasztási és tisztítási eljárásokat alkalmaztunk, amelyeket részletesebben az alábbiakban írunk le. A következő példa tipikus fermentációs eljárás a Pullularia pullulans ATCC 9348-ból származó enzim előállítására.

1. példa

Celit hordozóra kötött fruktozil-transzferáz enzimkészítmény előállítása.

A) Az enzim termelésére használt fermentációs eljárás.

Az inokulumtenyésztéshez és az enzimtermelő fermentáláshoz a következő táptalajt használjuk:

0,5% dikálium-hidrogén-foszfát,

0,1% nátrium-klorid,

0,02% magnézium-szulfát-heptahidrát,

0,06% ammónium-szulfát,

0,3% élesztő extraktum (Difco),

7,5% szacharóz (élelmiszer minőségű), a táptalaj pH-ját 6,8-ra állítjuk be.

A 100 ml steril táptalajt tartalmazó 500 ml-es Erlenmeyer lombik oltópalackokat a Pullularia pullulans fekete élesztő ferde tenyészetéről oltjuk be. A használt élesztőtörzset az American Type Culture Collection (Rockville, Maryland) katalógusában ATCC 9348 jelzéssel illetik. A rázóasztalon 48 órán át 32 °C-on inkubált oltópalackokat használjuk az egyliteres Erlenmeyer lombik fermentálópalackok inokulálására, amelyek mindegyike 200 ml előbb megadott táptalajt tartalmaz. Az alkalmazott inokulum-koncentráció 0,5% (súly/térf.). A fermentációt rázóasztalon 32 °C-on 7 napig folytatjuk.

B) Az enzim kinyerése a fermentléből.

ötven darab egyliteres fermentáló palackból összeöntjük a fermentlevet, a palackokat vízzel átöblítjük, amit szintén hozzáadunk az egyesített fermentléhez. A fermentlé végtérfogata hígítás után 12 liter. A fermentlé eredeti térfogata körülbelül 8 liter. A 12 liter fermentléből Sharples folytonos centrifugán átengedve eltávolítjuk az élesztősejteket és a sejttörmeléket. A fekete viszkózus felülúszóhoz 0,5% koncentráció eléréséig adunk kalcium-Kloridot, és a kapott oldat

-3181413 pH-ját nátrium-hidroxiddal 7,0-re állítjuk. Még egyszer átengedjük a Sharples centrifugán, így már csak gyengén színes, viszkózus felülúszót kapunk. A derített felülúszó pH-ját sósavoldattal 5,5-re állítjuk, majd 1000 egység (3 806 419. sz. amerikai szabadalomban megadott definíció szerint) pullulanázt adunk hozzá. A kapott levet telítésig adagolt toluollal tartósítjuk, és a pullulanázt éjszakán át hagyjuk szobahőmérsékleten reagálni. A pullulanázzal való éjszakán át tartó feltárás után 1% Grefco No. 503 Celitet (Johns—Mainville Products Corporation, Lompoc, Califomia) szuszpendálunk a lében, majd 2 térfogat (24 liter) acetont adunk hozzá. Csapadék keletkezik, amelyet kiszűrünk, majd a szűrőlepényt acetonnal lemossuk, és szobahőmérsékleten megszáritjuk. A szürőlepény tartalmazza a kötött fruktozil-transzferáz enzimet.

Az 1. példával kapcsolatban megjegyzendő, hogy a kalcium-kloridnak a fermentléhez történő hozzáadása és a pHállítás a fekete pigment és a savas poliszacharidok eltávolítását szolgálja. [A savas poliszacharidokra vonatkozólag lásd: Acta Chem. Scand. 16, 615—622 (1962)]. A végső enzimkészítményt ennélfogva viszonylag tiszta, színtelen készítményként kapjuk. Ez a tisztítási eljárás a találmány előnyös megvalósítását képezi, és a végtermék nyerése céljából egyszerű tisztítási műveleteket, azaz centrifugálást, szűrést vagy kicsapást alkalmaz. így ez a megvalósítás eljárást bocsát rendelkezésünkre savas poliszacharidok és fekete pigment melléktermékek eltávolítására a Pullularia pullulans fekete élesztő végső fermentleveiből. A módszer a fermentációs eljárás során keletkező nem kívánt pigment és savas poliszacharid melléktermékektől mentes végső enzimkészítményt szolgáltat. Eltávolítás nélkül ezek a melléktermékek együtt válnak ki az enzimmel, mikor a fermentléhez oldószert adunk.

A találmány szerinti tisztított enzimkészítmények tovább tisztítása céljából kívánatos a fermentlében mindig jelenlévő pullulan poliszacharid eltávolítása, mivel ez szintén együti válik ki a fruktozil-transzferáz enzimmel, mikor oldószeri adunk a fermentléhez. Ezért a kalcium-kloridos kezelés és pH-állítás után kapott felülúszót tovább kell kezelni a jólis mert hidrolizáló enzimmel, a pullulanázzal. A pullulaná; enzim véletlenszerűen hidrolizálja a pullalant, és kisebb molekulasúlyú polimert termel. így elkerülhetjük, hogy az oldó szer (például aceton, alkohol vagy hasonló) hozzáadásakor a fruktozil-transzferáz enzimkészítménnyel együtt kiváljon és szennyezze a terméket a pullulan. A fruktozil-transzferáz enzim ily módon történő tisztítása a találmány egy újabt megvalósítását jelenti.

A találmány szerinti fruktozil-transzferáz enzimkészítmények a pullulan eltávolítása nélkül is használhatók. A talál mány a gyakorlatban a pullulan pullulanázzal történő hidrolízise nélkül is alkalmazható, ebben az esetben a pullulan szolgál a fruktozil-transzferáz enzim hordozójaként.

A következő példa szemlélteti a pullulan hordozóként történő felhasználását.

2. példa

Szekunder szubsztrát előállítása pullulan hordozóra kötött fruktozil-transzferáz enzim alkalmazásával.

0,05 mólos 5,5 pH-jú citrát-pufferral pufferolt 20%-os szacharóz oldathoz 1% száraz pullulant adunk, és az 1. példa eljárása szerint kezeljük, azzal az eltéréssel, hogy a pullulant nem hidrolizáljuk el pullulanázzal, így ez szolgál hordozóként, és nem használunk Celitet. A fruktozil-transzferáz aktivitás 677 egység/gramm pullulan. A reakciót szobahőmérsékleten végezzük, amíg az elegy zavarosodni kezd.

Az anyag egy mintáját nagy nyomású folyadékkromatográfiával analizáltuk, és a következő eredményeket kaptuk:

Szacharid megoszlás nagy nyomású folyadékkromatográfiás analízis szerint:

Fruktóz Dextróz DP₂ DP₃ DP₄

6,9 40,6 6,2 11,1 35,2

Az 1. példában előállított enzimet az alábbi módon alkal25 mázzuk.

3. példa

Az enzimes kezelés termékei és az enzim hőstabilitása.

Csavaros kupakkal ellátott reakcióedényekbe 60 g étkezési minőségű szacharózt és fruktozil-transzferáz enzimkészítményt töltünk be. Az enzimkészítményt az 1. példában előállított enzimtermékből készítjük úgy, hogy megfelelő mennyi35 ségű szilárd Celiten kötött enzimet szuszpendálunk mért mennyiségű vízben alkalmas koncentrációjú enzimoldathoz. A Celitet utána szűréssel eltávolítjuk. A szürletet használjuk fel; a reakcióelegyhez egy gramm szacharóz-szubsztrátra számítva 10,20 és 30 egység enzimet adunk. Az egyes elegye40 két utána vízzel 100 ml végtérfogatra hígítjuk. Az inkubálást 66 órán át végezzük pH 5,5-ön és 55 °C vagy 60 °C hőmérsékleten. Mintákat veszünk 24, 43 és 66 óra után redukáló cukor meghatározásához, hogy megállapítsuk az enzimaktivitást. Miután a redukáló cukor meghatározásokat elvégez45 tűk a mintákon, a reakcióelegyeket megfagyasztjuk, hogy leállítsuk az enzimműködést, és a mintákat nagy nyomású folyadékkromatográfiával szénhidrátösszetétel-meghatározásnak vetjük alá. A következő eredményeket kaptuk:

táblázat

Redukáló cukor meghatározás¹

Hőfok c	Enzimmennyiség2 Redukáló cukor mg/ml	pH	Redukáló cukor	pH	Redukáló cukor mg/ml
		24 óra		43 óra		66 óra
55	0		5 80		5,80
	10	191	540	231	5,25	268
	20	192	540	270	5,25	301
	30	246	535	334	5,15	390
60	0	0,7	575	1,5	5,80	2,1
	10	200	5 10	243	4,70	270

-4181413

1. táblázat

Redukáló cukor meghatározás¹

Hőfok •c	Enzimmennyiség’ Redukáló cukor mg/ml	pH	Redukáló cukor mg/ml	PH	Redukáló cukor mg/ml
		24 óra		43 óra		66 óra
	20	219	5,15	288	4,90	346
	30	282	5,2C>	360	4,95	420

¹ A fruktozil-transzferáz egység meghatározásánál leírt módszer.

¹ Egység enzim/gramm szacharóz.

2. táblázat

Szénhidrát-összetétel meghatározása nagy nyomású folyadékkromatográfiával Reakcióhömérséklet 55 °C

Enzimadag egység/gramm szacharóz	Reakcióidő óra	Dextróz %	Levulóz %		dp3 %	dp4 %
	24	31,7	2,3	10,0	25,0	31,0
10	43	34,5	3,2	9,4	17,0	35,0
	66	36,7	3,9	8,6	15,0	35,8
	24	33,9	2,8	8,8	19,7	34,8
20	43	37,4	4,2	7,9	12,1	38,4
	66	40,5	4,9	7,4	10,8	36,4
	24	37,4	4,0	7,1	12,5	39,0
30	43	41,8	5,9	6,8	11,4	34,1
	66	46,1	7,5	7,0	11,5	27,9
		Reakcióhőmérséklet 60 ’C
	24	32,2	2,8	6,1	24,3	30,6
10	43	35,0	4,0	9,8	18,2	33,0
	66	36,7	5,4	9,4	16,0	32,5
	24	35,5	3,8	8,4	17,1	35,2
20	43	38,4	5,0	8,0	12,3	36,3
	66	41,3	6,6	7,9	11,1	33,1
	24	39,0	5,5	7,1	12,1	36,3
30	43	43,7	7,1	7,3	11,0	30,9
	66	47,8	9,2	7,4	H,1	24,9

A rövidítések jelentése az alábbi:

DP₂: 2 szacharid egységből álló poliszacharid

DP₃: 3 szacharid egységből álló poliszacharid

DP₄₊: 4-nél több szacharid egységből álló poliszacharid

A 3. példa bemutatja az enzim hőstabilitását a szubsztrát jelenlétében 55 °C-on és 60 °C-on, 66 órán keresztül, pH

5,5-ön, így szemléltetve az enzim gyakorlati használhatóságát. A találmány szerinti új fruktozil-transzferáz készítménnyel szacharóz enzimatikus átalakítása útján termelt szekunder szubsztrát a szénhidrát-analízis tanúsága szerint magas fruktóztartalmú szirupok szacharózból történő előál- 60 lítására alkalmas, potenciálisan értékes termék, mivel a túlsúlyban lévő alkotórészek dextróznak és olyan polimereknek bizonyultak, amelyek ezt követő hidrolízis után fruktózt szolgáltatnak túlsúlyban lévő monoszacharidként. A példa még azt is bizonyítja, hogy a találmány szerinti új enzim még 65

60% szacharózkoncentrációnál is hatásos. Ezenkívül bizo55 nyitja az enzim működőképességét nagy glükózkoncentráció jelenlétében is.

4. példa

A hőmérséklet hatása az enzimaktivitásra.

A hőmérséklet hatását a fruktozil-transzferáz enzim reakciósebességére a „Technicon Autoanalyzer II” segítségével a következőképpen állapítottuk meg:

A reakcióelegy 7,5 ml 80%-os szacharóz oldatból, 2,3 ml

-5181413

0,1 mólos 5,5 pH-jú cítrátpufferból és 0,2 ml 2%-os pullulanenzim oldatból (2. példa szerinti enzimkészítmény) áll. A végső szacharózkoncentráció 60%. A mintákat az alább megadott hőmérsékleteken tartjuk és mérjük 10 percig a „Technicon Autoanalyzer ΙΓ’-n. Az eredmények azt mutatják, hogy az enzimes reakciósebesség 40 °C-on 1,89-szerese a 30 °C-on mértnek, 50 °C-on 1,29-szerese a 40 °C-on mértnek, és 60°C-on 1,48-szorosa az 50’C-on mértnek. Ez a hőmérséklet emelkedésével növekvő reakciósebességet bizonyít.

5. példa

A fruktozil-transzferáz enzim Michaelis—Menten állandójának (K_m) meghatározása.

Egy enzim K_m értéke az a szubsztrátkoncentráció, amelynél a termékképződés sebessége a fele. A következő eljárást használjuk a fruktozil-transzferáz enzim K_m értékének megállapítására.

0,1 mólos citrátpufferral 5,5 pH-ra beállított 90%-os szacharóz törzsoldatból 9,8 ml térfogatú olyan oldatokat készítünk, amelyek 10 ml végtérfogatra feltöltve 5,10, 30,40, 50, 60 és 70% szacharózt tartalmaznak. A temperált mintákhoz 0,2 ml enzimoldatot adunk, amely 1,1 egység fruktoziltranszferáz enzimet tartalmaz. Utána a mintákat azonnal mérjük 55 °C-on a „Technicon Autoanalyzer II” segítségével az előbbiekben leírtak szerint. (Lásd fruktozil-transzferáz egység). Kontrollként (pg/ml-ben kalibrált) glükóz standard szolgál.

Ezt követően pg/ml/perc-ben kifejezzük a glükózképződés sebességét különböző szubsztrátkoncentrációknál állandó mennyiségű (1,1 egységnyi) 1. példa szerinti fruktozil-transzferáz enzimkészítményt használva.

szubsztrát	pg/ml/perc	pg/ml/perc
5	8,0	8,0
10	11,8	11,6
20	15,7	15,2
30	18,0	17,6
40	18,6	18,2
50	.19,2	17,2
60	17,8	18,2
70	15,6	—

a) Másnap 60%-os szacharóz törzsoldattal megismételt mérések eredményei.

A K 0,27 mólos szacharózkoncentráció. Maximális réakm ciósebesség pH 5,5-nél és 55°C-on 1,374 mól szacharóz szubsztrátkoncentrációnál van.

6. példa

A szacharózból képződő szekunder szubsztrát előállítása és izomerizálása.

A) Szekunder szubsztrát előállítása.

600 g élelmiszer minőségű szacharózt oldunk vízben, és 800 ml-re feltöltjük. Az oldat pH-ját híg sósavval 5,5-re állítjuk. Az 1. példa szerint előállított Celit hordozóra kötött száraz enzimkészítményből, amelynek aktivitása 550 egység/g, 11 g-ot szuszpendálunk 100 ml vízben. A szuszpenziót Büchner tölcséren Whatman No. 1 szűrőpapíron átszívatjuk. A szűrőpogácsát további 100 ml vízzel mossuk.

A 200 ml szűrletet utána hozzáadjuk a szacharóz oldathoz, amely egy csavaros kupakkal ellátott 0,5 gallonos (kb. 2,27 lit.) palackban van. A palackot utána 58 °C-os vízfürdőbe helyezzük, és 20 órán keresztül inkubáljuk, utána a reakciótermék mintáját nagy nyomású folyadékkromatográfiával szénhidrátösszetétel-meghatározásnak vetjük alá, és a következő eredményeket kapjuk:

Szénhidrát-összetétel

Fruktóz	2,4%
Dextróz	32,8%
dp2	10,6%
dp3	22,9%
DP4+	31,3%
A reakciótermék többi részéhez (azaz a szekunder szubszt-

ráthoz) magnézium-kloridot adunk 5 millimólos koncentrációig, és a pH-t 8,4-re állítjuk híg nátrium-hidroxid oldattal.

B) A szekunder szubsztrát folyamatos izomerizációja.

Streptomyces olivochromogenes ATCC 21 715-ből (lásd Re 29 152. sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás) származó glükóz izomerázt porózus alumínium-oxidra (például Coming Glass Co., Coming, New York által gyártott szabályozott pórusú hordozó, lásd 3 992 329. sz. amerikai szabadalmi leírás) kötünk a következők szerint:

1. A hordozót kétszer mossuk vízzel.

2. A hordozót 0,1 mólos nátrium-citrát oldattal 1 órán át kezeljük.

3. A nátrium-citrátot kimossuk a hordozóból, amíg a mosófolyadék vezetőképessége 1000 mikroohm.

4. A hordozót egy órán át 0,05 mólos magnézium-klorid oldattal kezeljük, majd a magnézium-klorid oldatot dekán táljuk.

5. Olyan térfogatú 0,05 mólos magnézium-klorid oldatot adunk hozzá, amennyi 400 egység/ml végső enzimkoncentráció beállításához szükséges.

6. Az izomeráz enzimkoncentrátumot 14 millió egység/ köbláb (körülbelül 500 egység/ml) mennyiségben hozzáadjuk a hordozóhoz.

7. A hordozót és az enzimet 22—24 órán át érintkezni hagyjuk, és utána a meg nem kötött enzimet desztillált vízzel kimossuk a hordozóból.

Egy 3 cm x 18 cm méretű, csatlakozókkal ellátott üvegoszlopot, amely egy táptartályhoz csatlakozó szivattyúval van összekötve, megtöltünk az így készített kötött enzimmel. Az oszlop ágytérfogata töltés után 45 ml. Az oszlop az izomerizáció során 60 ’C-on üzemel. A töltött oszlopon először 5 millimól magnézium-kloridot tartalmazó és pH 8,4-re állított 50 súly%-os dextrózoldatot nyomatunk át, hogy megbizonyosodjunk róla, hogy működik-e az oszlop. Az oszlop átfolyási sebességét 292 ml/óra értékre állítjuk be. Az oszlopot utána a töltet szintjéig leengedjük. A szekunder szubsztrát bevezetését manuálisan végezzük, amíg 20 ml elfolyó összegyűlik, utána a szekunder szubsztrát átfolyási sebességét 292 ml/óra értékre állítjuk be. Az összegyűlt első 100 ml szirupot eldobjuk, hogy hagyjuk kicserélődni a szubsztrátot. A maradék (850 ml) szubsztrátot utána átnyomatjuk az oszlopon. Egy óra múlva az átfolyási sebesség 570 ml/óra értékre nő. Az átfolyási sebességet visszaállítjuk, és az körülbelül 300 ml/óra értékre nő az átnyomatás végére. A szekunder szubsztrát átnyomatásának befejezése után az oszlopot visszakapcsoljuk- dextrózra, hogy ellenőrizzük, megmaradt-e az izomeráz-aktivitás. Az alábbi táblázat tartalmazza a kiindulási szekunder szubsztrát és az izomerizációs oszlopról kapott végtermék nagynyomású folyadékkromatográfiás analízise eredményeinek összehasonlítását:

-6181413

Szekunder	Végtermék (B)
	szubsztrát (A)	(%)
	(%)
Fruktóz	2,4	15,7
Dextróz	32,8	18,9
dp2	10,6	11,0
dp3	22,9	22,9
DP<+	31,3	31,5

Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a szekunder szubszt- 10 rátban lévő szabad dextróz 42,38%-a izomerizálódott az oszlopon fruktózzá. A szekunder szubsztrátban jelenlévő fruktóz-polimerekre úgy tűnik nem hat a dextróz fruktózzá történő izomerizációja. Megjegyzendő, hogy az összes monoszacharid körülbelül 45%-a fruktóz és 55%-a dextróz. 15

A következő példában két módszert alkalmazunk a szekunder szubsztrátban és ennek izomerizációs termékében levő poliszaharidok hasítására. Az egyik kísérlet enzimes, a másik enyhe savas hidrolízist alkalmaz.

7. példa

Nagy fruktóztartalmú szirup előállítása hidrolízissel.

A) Enzimes hidrolízis. 25

A 6. példa B termékének lOOml-éhez 10 mg tisztított invertázt adunk, amely Candida utilisből származik. Ezt az elegyet (toluollal tartósítva) éjszakán át szobahőmérsékleten hagyjuk reagálni, utána mintát veszünk, és nagynyomású folyadékkromatográfiával analizáljuk. A maradékot továb- 30 bi 6 napig hagyjuk reagálni, és utána újabb mintát veszünk, amelyet hasonló módszenei vizsgálunk meg. A következő eredményeket kapjuk:

Kiindulási	Invertáz	További hat	35
	anyag	hatása után	nap múlva
	(B termék)
Fruktóz	15,7%	41,9%	62,4%
Dextróz	18,9%	29,4%	36,2%
dp2	n,o%	1,9%	0	40
dp3	22,9%	12,9%	0,5%
	31,5%	13,9%	0,9%

A felhasznált invertáz a Siekagaku Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan cég által gyártott enzimkészítmény, amelynek 45 aktivitása 123 egység/mg, ahol a szacharóz hasítását katalizáló 1 egység invertáz 1 mikrontól glükózt és 1 mikromól fruktózt termel percenként meghatározott körülmények között.

B) A B termék savas hidrolízise. 50

A 6. példa B termékének savas hidrolízisét úgy végezzük, hogy 0,05 n koncentráció eléréséig kénsavat adunk hozzá, és 75—80°C-on melegítjük. Egy és két óra hidrolízis után mintákat veszünk, és nagynyomású folyadékkromatográfiával analizáljuk. Az eredmények a következők: 55

Kiindulási	1 óra	2 óra
Fruktóz	anyag (B termék) 15,7	60,3	59,1
Dextróz	18,9	38,7	37,9
dp2	11,0	1,9	2,6
dp3	22,9	0,4	0,3
dp4+	31,5	0	0,2

Az A pontban előbb kapott eredmények jelentős növekedést mutatnak a fruktóz hozamban, és kisebb növekedést a glükóz hozamban a DP₂, DP₃ és DP₄₊ frakciókban beállott megfelelő csökkenéssel együtt, így bizonyítva fruktóz-polimer jelenlétét.

A B pontban a savas hidrolízis során kapott eredmények összhangban vannak az A pontban kapottakkal, így szintén fruktóz-polimerek hasítását bizonyítják.

Az előbbiekben tárgyaltak olyan transzfruktozilezésre vonatkoznak, amelynek során olyan primer szubsztrátot használtunk, ahol a kiindulási szacharózoldat szárazanyagtartalma nem haladta meg a telítési pontot az adott reakciókörülmények között. A következő példa olyan primer szubsztrátkoncentráció alkalmazását mutatja be, ahol a kezdeti szacharózkoncentráció a telítésinél több, és amely a fruktoziltranszferáz enzim hatására magasabb koncentrációban eredményez DP₃ anyagot (azaz fruktozil-szacharózt), és kisebb koncentrációban DP₄₊ termékeket. Növekedés észlelhető a szekunder szubsztrát szárazanyagkoncentrációjában is a fruktozil-transzferáz enzim hatása nélkül kapott szárazanyagkoncentrációhoz képest. Kimutatjuk továbbá, hogy ha a primer szubsztrát szárazanyagkoncentrációja nő, akkor csökken a szekunder szubsztrátban a fruktóz polimer polimerizációs foka, és a DP₄₊ anyag kismennyiségben van jelen.

Ez élesen eltér az előző példákban a telítésinél kevesebb szacharóz szubsztrát alkalmazásával kapott eredményektől. Ezekben a példákban a DP₄₊ anyag az elsődleges tennék.

8. példa

Szekunder szubsztrát előállítása a telítésinél több szacharózt tartalmazó szuszpenziókból.

200 g élelmiszer minőségű szacharózt teszünk csavaros fedéllel ellátott egy pint űrtartalmú csészékbe. Kontrollként 50 ml vizet teszünk az egyik csészébe, a többibe pedig növekvő mennyiségű Celitre kötött fruktozil-transzferáz enzimet (amelyet az 1. példa szerint állítottunk elő) 50 ml vízben, amint a következő táblázatban látható. Az egyes csészéket lezárjuk, és rázható vízfürdőbe helyezzük 54—55 °C-on. Az edényeket 24 órát rázatjuk, időnkénti kézi keveréssel. Az egyes csészék felülúszóiból mintát veszünk, és csavaros fedelű kémcsőbe téve forró vízfürdőben inaktiváljuk az enzimet. A mintákat utána nagynyomású folyadékkromatográfiával analizáljuk, és szárazanyag tartalom meghatározást végzünk (K. Fischer módszer), amelyek eredményeit a következő táblázatban láthatjuk:

Csésze száma	Szacharóz	Enzim1 egység	Szárazanyag a felülúszóban (s%)	S.énhidrátősszetétel az oldatban nagynyomású folyadékkromatográfiával (%)
				frukt.	dextr.	dp2	DP,	dp4+
1	200	100	74,5	0,6	9,6	80,9	8,9	NDZ
2	200	200	75,6	0,7	12,7	72,2	13,7	0,7
3	200	300	76,3	1,0	14,5	66,8	16,6	1,1

-7181413

Csésze száma	Szacharóz	Enzim1 egység	Szárazanyag a felülúszóban (s%)	Síénhidrátösszetétcl az oldatban nagynyomású folyadékkromatográfiával
				frukt.	dextr.	DP,	dp3	dp4+
4	200	400	77,1	0,9	15,7	62,6	19,0	1,8
5	200	500	77,7	1,1	17,3	58,5	21,0	2,1
6	200	600	78,1	1,3	18,0	56,0	21,9	2,8
7	200	700	78,1	1,1	18,8	53,9	23,1	3,0
8	200	800	80,0	1,0	19,3	52,2	24,1	3,4
9	200	900	79,0	1,3	19,9	50,0	25,0	. 3,7
10	200	1000	79,6	1,3	20,6	48,6	25,4	4,1
Kontroll	200	0	72,7	0,3	ND2	99,7	ND2	ND2

¹A fruktozil-transzferáz enzim összes mennyisége 50 ml vízben.

² ND=nem mértük.

Megjegyzendő, hogy a fenti példában a kontroll szobahőmérsékletre (körülbelül 25 °C) lehűtve kikristályosodott, 20 míg az enzimesen termelt szekunder szubsztrát oldatban marad, és kiváló tárolási Stabilitása van kristályosodás nélkül.

Bár a 8. példában 50 ml vízhez 200 g szacharózt alkalmazunk, azaz 80 súly%-ot, a kiindulási anyag szacharóz szárazanyag-koncentrációja emelhető.

A találmány ilyen megvalósítása szerinti új szekunder szubsztrát nagyon stabil, nem kristályosodó szirupként élelmiszeripari alkalmazást nyerhet. Egyedülállóan magas szárazanyagtartalmat biztosít, mikrobiális fertőzéssel és elszíne- 30 ződéssel szemben ellenálló, és a cukor olyan töménységben való szállítására és/vagy tárolására alkalmazható, ami eddig ilyen tulajdonságokkal rendelkező anyaggal nem volt elérhető. Az új, magas szárazanyagtartalmú szekunder szubsztrát a 7. példában látható módon hidrolizálható kívánt édességű 35 invertcukor eleggyé. A találmány szerinti új szekunder szubsztrát szárazanyagtartalma körülbelül 70 súly%-tól körülbelül 80 súly%-ig terjed, és lényegében dextrózból álló monoszacharid frakciót és olyan poliszacharid polimereket tartalmaz, amelyek között túlsúlyban van a DP₂ és sok a 40 DP₃ tennék. Kismennyiségű (4,1% és kevesebb) DP_4t polimer van még jelen benne.

Mivel a találmány szerinti transzfruktozilálási lépést nagy méretben is bemutattuk, a szakterületen járatosak részére kézenfekvő, hogy folyamatos működésű egységekben hasonlóképp alkalmazható. Ilyen folyamatos transzfruktozilálás kivitelezésénél a transzfruktoziláz enzimet az előbbiekben a kötött enzim leírásánál tárgyalt szokásos technikával kötjük meg, és az ott leírt folytonos feldolgozási módszert alkalmaz25 zuk.

Claims (3)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás fruktózt tartalmazó szacharid készítmény előállítására: szacharóz dextrózból, fruktózból és poliszacharidokból álló szacharid készítménnyé való átalakítása, majd a nyert elegyben lévő dextróz legalább egy részének fruktózzá történő izomerizálása, valamint jelenlevő poliszacharidok izomeráz enzim távollétében végzett hidrolízise útján, azzal jellemezve, hogy a szacharózt 25—60 ’C hőmérsékleten és 4,5—6,5 pH-értéken fruktozil-transzferáz enzimmel kezeljük.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy legalább 20 százalékos szacharóz oldatot alkalmazunk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy Pullularia pullulans-ból származó fruktozil-transzferáz enzimet alkalmazunk.