SE439928B - Sett att framstella fruktos fran sackaros - Google Patents

Description

78068 449-2 Definitioner 7 På grund av de många uttryck, som allmänt användes inom detta omrâde ges följande definitioner för att klar- göra innebörden av dessa uttryck i föreliggande text: Glukos och dextros Uttrycken "glukos" och "dextros" användes utan åt- skillnad i föreliggande ansökan för att beteckna denna monosackarid i godtycklig form i lösning eller i torrt tillstånd.

Sackaros Uttrycket "sackaros" avser denna disackarid i renad eller orenad form, i lösning eller i torr form från en god- tycklig råmaterialkälla för sackarosen, t ex sockerrör eller sockerbetor. Vid genomförandet av uppfinningen an- vändes sackarosutgångsmaterialet vanligen i vattenhaltigt medium.

Fruktos och levulos Uttrycken "fruktos" och "levulos" användes vanligen utan åtskillnad inom detta område för att beteckna den dextrosisomer, som är sötare än dextros. Fruktos finns i honung och invertsocker tillsammans med dextros och är värdefull på grund av sin sötma. Uttrycken levulos och fruktos användes utan åtskillnad i föreliggande ansökan för att beteckna denna monosackarid i någon form, i lösning eller torr.

Enzymberedning Uttrycket “enzymberedning" användes för att beteckna ett alster, som uppvisar önskad enzymatisk aktivitet. Ut- trycket betecknar exempelvis levande hela celler, torra celler, cellextrakt, rena och koncentrerade beredningar, som härrör från celler och från odlingsvätskor. Enzymbe~ redningen kan användas antingen såsom en lösning eller i immobiliserad form vid genomförandet av uppfinningen.

Isomerasenzym En enzymberedning, som isomeriserar dextros till levu- los betecknas i detta sammanhang som ett "isomerasenzym".

Dessa enzymer är väl kända inom detta område och har be- tecknats som dextrosisomeras, xylosisomeras och glukos- 7so5e44~2 3 isomeras. Sådana enzymer kan härröra från ett flertal lämpliga mikroorganismer. Exempel på sådana mikroorganis- mer inbegriper sådana, som tillhör släktena Streptomyces, Bacillus, Arthrobacter, Actinoplanes, Curtobacterium och andra.

Ett föredraget isomerasenzym, som är lämpligt att använda vid genomförandet av uppfinningen, härrör från Streptomyces olivochromogenes ATCC nr 21 713, ATCCnr 21714 eller ATCC nr Zl 715 (av vilka den senare utgör ett enko- loniisolat av ATCC nr 21 713) såsom beskrivits i US PS 3 813 318 och US PS 3 957 587, särskilt då dessa fram- ställts enligt den metod, som beskrivis i US PS 3 770 589 eller US PS 3 813 318.

Man har nyligen metoder, där isomerasenzym immobiliseras på en vatteno- inom detta område kommit fram till löslig inert bärare. Det immobiliserade enzymet är då lämp- ligt att använda för kontinuerlig omvandling av glukos till sirap med hög fruktoshalt. Exempel på sådana metoder beskrives i US PS 3 708 397; 3 788 945; 3 850 751; 3 868 304; BE PS 819 859; och US PS 3 960 663 (BE PS 810 480).

Isomerasenhet “Isomerasenhet“ definieras såsom den mängd enzymakti- vitet, som erfordras för att ge en mikromol levulos per minut under de isomeriseringsbetingelser, som beskrives i det följande under rubriken "Analys av isomerasaktivitet).

Analys av isomerasaktivitet I detta sammanhang avser detta uttryck den analys- metod, som inbegriper en spektrofotometrisk bestämning av den ketos, som bildas ur en glukoslösning under stan- dardbetingelser.

En förrådslösning får upprättas på följande sätt: 7806844--2 4 FÖRRÅDSLÖSNING FÖR ANALYS Komgonent mängd 0,l M MgSO4.7H2O l ml 0,001 M C0Cl2.6H2O l ml l M natriumfosfatbuffert, pH 7,5 0,5 ml Vattenfri D-glukos 1,44 g Tillsätt destillerat vatten till en totalvolym av 7,5 ml.

Den enzymberedning, som först analyseras, spädes så att den innehåller från 1 till 6 isomerasenheter per ml.

Enzymisomeriseringen genomfördes gemm1attnnntillsätter l ml av enzymberedningen till 3 ml av förrådslösningen och inkuberar i,3O min vid 60°C. Efter avslutad inkubering tas en alikvot mängd pâ 1 ml och inkuberingen avbrytes genom att denna mängd nedföres i 9 ml 0,5 N perklorsyra.

Den kylda alikvota mängden spädes sedan till en total volym på 250 ml. I jämförande syfte göres också som kon- trollprov ett glukosprov där l ml av enzymberedningen i lösning ersättes med l ml vatten i början av inkubations- perioden.

Ketos bestämmes sedan med en cystein-svavelsyrametod.

Vid denna analys definieras en isomerasenhet som den mängd enzymaktivitet, som krävs för att ge en mikromol av levulos per minut under de angivna isomeriseringsbetingelserna.

Transfruktosylering Detta uttryck avser i detta sammanhang överförandet av en fruktosylkomponent från en givare, t ex sackaros, till en acceptor, t ex polysackarid.

Fruktosyltransferasenzym .

Detta uttryck avser i detta sammanhangettenzym, som katalyserar transfruktosylering och inbegriper enzymbered~ ningar, som härrör från Pullularia pullulans ATCC 9348 (synonymt med Aureobasidium pullulans).

Fruktosyltransferasenhet I detta sammanhang definieras en fruktosyltransferas~ enhet såsom den mängd enzymaktivitet, som krävs för att ge en mikromol reducerande socker, beräknat som glukos, per (a) PH 5.5, minut under följande betingelser: (b) tempe- lO 780684-4--2 ratur 55°C och (c) substratkoncentration vid 60 g sacka- ros av livsmedelskvalitet per 100 ml vattenhaltig reak- tionsblandning.

Bestämningen av reducerande socker (beräknat såsom glukos) genomföres med en “Technicon Autoanalyzer II" (Technicon, Inc., Tarrytown, New York). Analysen genom- föres med en konventionell alkalisk järncyanidmetod, “Analytical Biochemistry"45, nr 2, sid 5l7-524 (1972) som är anpassad för användning i "Autoanalyzer II". Såvida ej annat angivits genomföres bestämningarna av enzymaktivi- teten genom att man kontinuerligt mäter en reaktionsbland- ning, som består av följande komponenter: 7,5 ml 80 % (vikt/volym) vattenhaltig sackaroslösning av livsmedelskvalitet 2,3 ml 0,1 M citratbuffert pH 5,5 0,2 ml enzymprov, som innehåller den mängd fruktosyl- transferasenzym, som ger från 5 till 25 mikrogram reducerande socker (beräknat som glukos) per minut per ml reaktionsblandning.

Primärt substrat Uttrycket "primärt substrat" avser i detta samman- hang sådana sackarider, som förekommer i en form, som är lämplig för och som har en fruktosylkomponent, som är till- gänglig för,ett deltagande i transfruktosyleringen, såom exempelvis vattenhaltiga sackaroslösningar.

Sekundärt substrat Uttrycket "sekundärt substrat" avser i detta samman- hang den reaktionsprodukt, som bildas då det primära sub- stratet utsättes för inverkan av en fruktosyltransferas- enzymberedning av angivet slag.

Delar och procenttal I denna ansökan avser alla delar viktdelar och procent- tal vikt till volym (vikt/volym) såvida ej annat uttryck- ligen angivits.

Högtrycksvätskekromatografianalys Dettauttryckavserdennætod,därsirapernaenligtuppfin- ningenanalyserasmedhögtrycksvätskekromatografienligtföl- jande.Komponenternakromatograferas genom eluering i vatten 78068 44-2 '35 6 ur ett katjonbytarharts i kalciumform. De eluerade kompo- nenterna detekteras med en differentialrefraktormeter.

Icke-dextroshaltiga kolhydrater kvantifieras med en elek- tronisk integrator och dextrosmängden erhållesav'skillnaden.

Den allmänna metoden är den som ges i "Analysis of Carbo- hydrate Mixtures by Liquid Chromatography", Am. Soc. Brew.' Chem. Proc., 1973, sid 43-46. Det använda hartset är "Aminex Q" 15-5 i kalciumform (BioRad Laboratories, Rich- mond, California.

Sammanfattning av uppfinningen.

Föreliggande uppfinning avser ett sätt att framställa 'siraper, vilket sätt innebär att man utsätter ett primärt substrat, t ex sackaros, för inverkan av en fruktosyl- transferasenzymberedning, som har förmåga att omvandla sackarosen till en produkt, som inbegriper en monosackarid- fraktion, som innehåller en större mängd glykos och en mindre mängd fruktos, och polysackarider som innehåller minst 66 vikt% fruktosylkomponent. En sådan produkt inbe- griper ett sekundärt substrat enligt uppfinningen. Dessa polysackarider i det sekundära substratet inbegriper alla fruktoshaltiga polymerer (av annat slag än sackaros) med två eller flera monosackaridkomponenter. Dessa polymerer kan vidare karaktäriseras såsom innefattande polysackarid- er, som innehåller fruktosylkomponenter bundna genom (2+-l)-betabindningar. Såsom kommer att beskrivas i det följande kan de polysackarider, som erhålles vid givna betingelser för trans-fruktosylering,till övervägande del ligga inom i förväg bestämt område. Sålunda kan exempelvis ett sekundärt substrat framställas, i vilket den övervä- -gande delen (t ex minst 60 mol%) av polysackariden är oligomerer med 2 till 10 (dvs DP 2-lO) eller normala 3 till 6 (dvs DP 3-6) monosackaridkomponenter. Därefter isomeri- seras glukosen (via inverkan av isomerasenzym) till fruktos i närvaro av polysackariderna, varefter följer hydrolys av polysackariderna i frånvaro av aktivt isomerasenzym. Hydro- lysen kan ske enzymatiskt med invertas eller genom syra- hydrolys under milda betingelser.

Enligt en annan utföringsform av uppfinningen kan U1 78068 13-11-42 7 polysackariderna separeras från glukosen och fruktosen och därefter hydrolyseras såsom tidigare beskrivits för bildning av sirap med mycket hög fruktoshalt, t ex med en fruktoshalt överstigande 66 vikt% och företrädesvis över- stigande 90 vikt%, direkt utgående från det sekundära substratet enligt uppfinningen utan att man behöver iso- merisera dextrosen i substratet. Denna separation kan lämpligen ske med konventionella fysikaliska separatione- metoder baserade på molekylstorlek, såsom exempelvis kon- ventionell membranteknologi (t ex ultrafiltrering, dialys) lösningsmedelsutfällning, kolabsorption och liknande.

Sådan membranteknologi beskrives exempelvis i US PS 3 173 867; Re 26097; 3 541 006; och 3 691 068.

En föredragen utföringsform är en sådan metod att framställa sirapen med hög fruktoshalt, vilken metod inne- bär att sackarosen utsättes för inverkan av en fruktosyl- transferasenzymberedning såsom exempelvis den beredning, som härrör från Pullularia pullulans, såsom ATCC 9348; ATCC 12538; NRRL 1673; NRRL Y23ll; NRRL YB3892; NRRLYB 3861; NRRL 3937 och ATCC 15 223. Den bildade produkten, eller detsekundära substratet, utsättes för inverkan av isomeras- enzym, därefter hydrolyseras den isomeriserade produkten i frånvaro av aktivt isomerasenzym.

Det sekundära substrat, som bildats enligt förelig- gande uppfinning anses vara nytt. Detta substrat är på ett unikt sätt lämpligt för isomerisering och efterföljande hydrolys, varvid erhålles en sirap, som innehåller mer än 55 % för inverkan av en fruktosyltransferasenzymberedning. fruktos, och som bildas genom att sackaros utsättes En annan del av föreliggande uppfinning avser därför sub- strat, som är lämpliga för enzymatisk isomerisering och efterföljande hydrolys till siraper, som innehåller mer än 55 % till cirka 60 vikt% monosackarider, som innehåller en fruktsirap, som innefattar (1) från cirka 20 större mängd glukos och en mindre mängd fruktos, och (2) från cirka 70 till cirka 40 % polysackarid, som innehåller mer än 66 vikt% fruktosylkomponenter.

Särskilt lämpliga är sådana sekundära substrat, som 71306844--2 l0 8 bildas av sackaros genom transfruktosylering i närvaro av en verksam mängd fruktosyltransferasenzymberedning, som kan härledas från en stam av Pullularia pullulans ATCC 9348 vid en temperatur från cirka 25°C till cirka 65°C, företrädesvis från cirka 50°C till cirka 60°C och ett pH från cirka 4,5 till cirka 6,5, företrädesvis från cirka 5,4 till cirka 5,6.

Utgångskoncentrationerna av sackarosen kan vara så låg som 10 g per lOO ml vatten. Man föredrar emellertid att använda så hög halt torrsubstans som möjligt, varvid denna halt lämpligen varierar från cirka 30 g till cirka 60 g per l00 ml (för maximal reaktionshastighet) upp till sac- karosens mättnadspunkt (och högre såsom kommer att beskri- vas mera detaljerat i det följande).

Minst 0,5 enheter fruktosyltransferas per gram sacka- ros kan användas för bildning av det nya substratet enligt uppfinningen. Vanligen överstiger den använda mängden en- zym ej 50 enheter per gram sackaros av ekonomiska skäl.

För att man skall få ett önskat sekundärt substrat på en kommersiell godtagbar tid och inom de angivna processpara- metrarna föredrar man särskilt ett intervall från cirka 2 till cirka 30 enheter per gram sackaros.

De angivna utföringsformer och andra utföringsformer av uppfinningen kommer att beskrivas mera i detalj i det följande.

Detaljerad beskrivning av uppfinningen Vid sättet att framställa det nya fruktosyltrans- feraset enligt uppfinningen kan man utnyttja konventionell jästeknik, se t ex US PS 3'565 756; 3 806 419; 3 535 l23; Applied Microbiology, ll, 211-215 (1963). Det är lämpligt att använda vissa nya separations- eller reningsmetoder, som kommer att beskrivas mera fullständigt i det följande.

Följande exempel avser en typisk jäsningsmetod för fram- ställning av enzymet Pullularia pullulans ATCC 9348. 7so6s44~2 §§§MPEL 1 Framställning av fruktosyltransferasenzymberedning - Celitbärare A. Jäsningsmetod för framställning av enzymet Det medium, som användes för utveckling av ympämnet och jäsningen för framställning av enzymet var följande: 0,5 % tvåbasiskt kaliumfosfat O,l % natriumklorid 0,02 % magnesiumsulfat-heptahydrat 0,06 % diammoniumsulfat ' 0,3 % jästextrakt (Difco Laboratories) 7,5 % sackaros (livsmedelskvalitet medietspH inställs på 6,8.

Ympflaskorna, 500 ml erlenmeyer-kolvar, som innehöll 100 ml sterilt medium, ympades från en snedkultur av jäs- ten Pullularia pullulans. Den speciella jäststam, som an- vändes, betecknas i katalogen frân American Type Culture Collection (Rockville, Maryland) som ATCC 9348. Efter ut- veckling på en skakanordning i 48 h vid 32°C användes ymp- flaskorna för ympning av l liters erlenmeyer-jäsflaskor, som vardera innehöll 200 ml av det tidigare angivna mediu- met. Ympämneskoncentrationen uppgick till 0,5 % (vikt/volymL Jäsningen ägde rum på en skakanordning vid 32°C i 7 dagar.

B. Utveckling av enzymet ur jäsbuljongen Jäsbuljong från 40 l liters skakflaskor sammanfördes och flaskorna sköljdes med vatten, som också tillsattes till de sammanslagna buljongerna. Den slutliga volymen buljong efter spädning var 12 liter. Buljongens ursprung- liga volym var ungefär 8 liter. De l2 litrarna jäsbuljong kördes i en kontinuerlig centrifug (Sharple) för avlägs- anande av jästceller och cellfragment. övervätskan, som utgjordes av en svart viskös lösning,försattes med kalcium- klorid till en koncentration av 0,5 % (vikt/volym) och den bildade lösningens pH inställdes på 7,0 med natriumhydroxid.

Därefter körde man en andra gång i centrifugen, varvid man erhöll en viskös övervätska, som hade ringa färg. Den av- färgade övervätskans pH inställdes på 5,5 med saltsyra varefter man tillsatte 1000 enheter (såsom definieras i 7806844-2 US PS 3 806 4l9) pullulanas. Den bildade buljongen konser- verades med toluen (tillsatt till mättnad) och pullulanaset fick reagera vid rumstemperatur över natten. Efter inverkan av pullulanas över natten uppslammandes Grefco nr 503 celite (l % koncentration, Johns-Manville Products Corpo- ration, Lompoc, California) i buljongen, varefter man till- satte 2 volymer (24 liter) aceton. En fällning bildades och denna uppsamlades genom filtrering och filterkakan tvättades med aceton och torkades vid rumstemperatur. Den uppsamlade filterkakan innehöll detinsolubiliserade fruk- tosyltransferasenzymet.

Vad beträffar exempel l bör man notera att tillsat- sen av kalciumklorid till jäsbuljongen med inställning av buljongens pH leder till att det svarta pigmentet avlägs- nas och de sura polysackariderna finns närvarande [för diskussion av dessa sura polysackarider se Acta. Chem.

Scand. l6, 615-622 (l962)]. Den slutliga enzymprodukten övergår därvid till en form av en relativt ren, färglös beredning. Denna reningsmetod utgör en föredragen utfö- ringsform av uppfinningen och medger enkla reningsmetoder, t ex centrifugering, filtrering eller utfällning, för er- hållande av slutprodukten. Denna utföringsform avser så- lunda ett sätt att skilja de sura polysackariderna och de svartpigmenterade biprodukterna från den slutliga jäsbul- jongen av den svarta jästen Pullularia pullulans. Denna metod ger en slutlig enzymberedning, som är fri från icke önskade pigment och sura polysackaridbiprodukter, som bildas under jäsningprocessen. Dessa produkter samutfälles med enzymet vid lösningsmedelstillsatsen till jäsbuljongen, om de ej avlägsnas.

Som en ytterligare rening för utvinning av renade en- zymberedningar enligt uppfinningen är det önskvärt att man avlägsnar den pullulanpolysackarid, som föreligger i jäs- buljongen, eftersom också denna kommer att samutfällas med fruktosyltransferasenzymet vid tillsats av lösningsmedlet till jäsbuljongen. Den övervätska, som erhålles vid kal- ciumkloridbehandlingen och pH-inställning kan därför be- handlas ytterligare med det välkända hydrolysenzymet lO ll pullulanas. Pullulanasenzymet hydrolyserar slumpvis pul- lulanet för bildning av en lågmolekylär polymer, vari- genom man undviker samutfällning och efterföljande för- orening av fruktosyltransferasenzymberedningen under lös- ningsmedelsbehandlingen (t ex aceton, alkohol och liknande.

Reningen av det önskade fruktosyltransferasenzymet pâ detta sätt är en annan ny utföringsform enligt uppfin- ningen.

Fruktosyltransferasenzymberedningarna enligt uppfin- ningen kan användas utan att man avlägsnar pullulan. Så- lunda kan uppfinningen utövas utan hydrolys av pullulan med pullulanas, i vilket fall pullulan fungerar såsom bärare för fruktosyltransferasenzymet.

Följande exempel visar användning av pullulan såsom bärare.

EXEMPEL 2 Framställning av sekundärt substrat med fruktosyltrans- ferasenzym på pullulanbärare En 20 % sackaroslösning, som buffrats med 0,05 M citratbuffert, pH 5,5, försattes med torrt pullulan (l % koncentration), som bildats enligt_exempel l med det undan- taget att pullulanet ej hydrolyserats med pullulanas och därför fungerar som bärare och ingen Celite användes.

Fruktosyltransferasaktiviteten uppgick till 677 enheter/g pullulan. Reaktionen genomfördes vid rumstemperatur tills blandningen blev grumlig. Ett prov av detta material ana- lyserades med högtrycksvätskekromatografi med följande resultat: SACKARIDFÖRDELNING VID HPLC-ANALYS Fruktos Dextros 222 223 Q24+ 6,9 40,6 61,2 11,1 35,2 Följande exempel karaktäriserar ytterligare enzym, som framställts enligt exempel 1. 7806844-2 12 EXEMPEL 3 Produkter, som erhållits genom enzymverkan och enzymvärme- stabiliteten " 5 Reaktionsflaskor, som var försedda med skruvlock, försattes med 60 g sackaros av livsmedelskvalitet och en fruktosyltransferasenzymberedning. Enzymberedningen er- hölls från enzymprodukten i exempel l genom att man dis- pergerade lämpliga alikvota mängder av den fasta celit- enzymprodukten i uppmätta vattenmängder för att man skulle få en lämplig koncentration av enzymlösningen. Celiten avlägsnades sedan genom filtrering. Fitratet användes för dosering till reaktionsblandningen med 10, 20 och 30 en- zymenheter per gram sackarossubstrat. Dessa blandningar späddes sedan var och en till en slutvolym på 100 ml med vatten. Konversionerna genomfördes under 66 h vid pH 5,5 och 55 resp 60°C. Prover togs vid 24, 43 och 66 h för be- stämning av reducerande socker för att kontrollera närvaron av enzymaktivitet. Efter bestämningen av reducerande socker på proverna frös de kvarvarande reaktionsblandningarna för att avbryta enzymverkan och proverna analyserades med av- Seende kolhydratsammansättning med högtrycksvätskekromato- grafi. Följande resultat erhölls. 4*2 780684 13 .moumxomm adam Hmm Emnøw umuwficm ^N HOUÜÄCÜMMHUWWGMHQHMWOUMÜHM >M É@GOHUfiCHMOÜ HÜUQU fl0>HMMm®Q HW CUUOQÜÉ MÜCW>Gfl QÜQAH oww mm.« omm o~_m ~æ~ om wvm om.« www mH_m QHN o~ oß~ o>_« www oH.m oo~ ofi H.~ om.m m.H m~.m ~.o o om omm m~.m «mm mm.m www om How m~.m o>~ o«.m maa om mmm m~.m Hmm o«.m Hmfi ofi _ 111 ow_m ||| oæ_m 11» o mm Hmåšfifl vw Hßššflü MW Hßššfifl aE\wE HE\mE HE\mE Enaco UO HÜMUOW UUGMHNODUON må HUMOOW ÜÜGMHÜODÜNM Hm fl0äU0m ÜUQMHÜOÜÜUM HOMÜQGN .QEÜB H umxuom møcmumoøømn >m mæfimcm 780684-4-2 14 m_«~ AJHH «.h ~.m w.>« ww m.øm o.HH m.» H<> >_m« _m« om m_@m H.~H H_> m.m o.mm «~ H_~m H.fiH m_> @_@ m_H« ww m_@m m_~H o.m o_m «.wm mw om ~_mm H_>H «.w w_m m_mm «~ m_- o.@H «_m «_m >.mm mm o_mm ~.w~ w_m o_« o_mm m« ofl @_om m.«~ H.@ w.~ ~.Nm wm ooøw Hnnmnmmñwvmnofluxmmm m.>~ m.HH o~> m.> H.@« ww H.«m «.Hfi w.w m_m w.H« mq om o.mm m.~H H.ß o.« «_>m «~ «_mm w.oH «.> m.« m_o« ww «_wm fl.~A m_> ~.« «.>m MQ o~ w_«m >_@H w_w w.~ @.mm «~ w.mm o.mH w_w m.m >.@m mm o_mm m.>H «.m ~_m m_«m m« ofi o.Hm o_m~ o.ofl m_~ >.Hm wm Awv |4ww .wv Awv Awv ^nv moumxuøm \»wn:w wmn mmm mmm w0Hø>mA mouuxwn Uflumcofiuxmmm moøëmucm + oomm Høumnmmamnmcofluxmwm mwflmcmluflmm øfi> møflcnummcmëšmwumnøænflom Exempel 3 visar värmestabiliteten i närvaro av sub- strat av enzymet vid 55°C och 60°C under en 66 h period vid 5,5 och visar på detta sättet enzymets kommersiella potential. Det sekundära substratet, som bildas vid den enzymatiska omvandlingen av sackaros med den nya frukto~ syltransferasföreningen enligt uppfinningen visas dessutom genom kolhydratanalysen vara en potentiellt värdefull pro- dukt, som är lämplig för framställning av siraper med hög fruktoshalt utgående från sackaros på grund av att de över- vägande beståndsdelarna visar sig utgöras av dextros och polymerer, som vid efterföljande hydrolys ger fruktos så- som dominerade monosackarid. Detta exempel visar också att det nya enzymet enligt uppfinningen är verksamt vid en sackaroskoncentration på 60 % (vikt/volym). Enzymets fuktionalitet i närvaro av höga glukoskoncentrationer visas också.

EXEMPEL 4 Inverkan av temperaturer på enzymaktiviteten Inverkan av temperaturen på fruktosyltransferasenzy- mets reaktionshastighet bestämdes med "Technicon Autoana- lyzer II" enligt följande: Reaktionsblandningen bestod av 7,5 ml 80 % (vikt/volym) sackaroslösning, 2,3 ml O,l M citratbuffert vid pH 5,5 och 0,2 ml 2 % (vikt/volym) pullulanenzymlösning (enzymbered- ning enligt exempel 2). Den slutliga sackaroskoncentraionen uppgick till 60 % (vikt/volym). Proverna hölls vid följan- de temperaturer och analyserades i 10 min på "Technicon Autoanalyzer II". Resultaten visade att vid 40°C var den enzymatiska reaktionshastigheten 1,89 ggr hastigheten vid °C, vid SOOC var den 1,29 ggr större än 40oC och vid 60°C var 1,48 ggr större än vid 50°C. Detta visar en ökan- de reaktionstid med ökande temperatur.

EXEMPEL 5 Michaelis-Mentenkonstanten (Km) för fruktosyltransferas- ensymet m Km-värdet för ett enzym betecknar den substratkoncen- tration, vid vilken hastigheten för produktbildningen är hälften av Vàa . Följande metod användes för bestämning av X 7806844-2 16 Km för fruktosyltransferasenzymet.

Man använde en 90 % (vikt/volym) sackarosförråds- lösning, som inställts på pH 5,5 med 0,l M citratbuffert och de rätta sackaroskoncentrationerna i alikvota mängder om 9,8 ml inställdes så att man fick: 5, l0, 30, 40, 50, 60 och 70 % koncentrationer av sackaros vid slutvolymen ml. En enzymlösning på 0,2 ml innehållande l,l frukto- syltransferasenzymenhet tillsattes till de utblandade proven. Därefter analyserades proverna omedelbart vid 5500 i “Technicon Autoanalyzer II" såsom tidigare beskrivits (se fruktosyltransferasenehten). En glukosstandard (kali- brerad i ng/ml) ingick som kontroll.

I det följande anges hastigheten för glukosbild- ningen uttrycks såsom ng/ml/min vid de olika substratkon- centrationer varvid man använde en konstant dos (l,l en- het) av fruktosyltransferasenzymberedningen enligt exem- pel l.

% Substrat Eg/ml/min Eg/ml/mina) 8,0 8,0 10 11,8 11,6 15,7 15,2 18,0 17,6 40 18,6 18,2 50 l9,2 17,2 60 17,8 18,2 70 15 , s ---- a) Omkörning nästa dag från en 60 % förrådssackaroslös- ning. ° Km uppgick till 0,27 molär sackaroskoncentration. Den maximala reaktionshastigheten inträffade vid en substrat- koncentration på l,374 M sackaros vid pH 5,5 och 5500.

EXEMPEL 6 Framställning ochisomerisering av sekundärt substrat ut- gående från sackaros A. Framställning av sekundärt substrat 600 g sackaros av livsmedelskvalitet löses i vatten till en volym på 800 ml. Denna lösnings pH inställdes på 7s06ß44~2 17 ,5 med utspädd saltsyra. En torr beredning av Celite- enzym, ll g, med aktiviteten 550 enheter/g som framställts såsom i exempel 1, uppslammades i 100 ml vatten. Uppslam- ningen filtrerades i vakkum på ett filterpapper (Whatman nr 1) i en buchnertratt. Filterkakan tvättades med ytter- ligare l00 ml vatten. 200 ml av filtratet tillsattes sedan till sackaroslösnigen, som fanns i en 1,9 liters flaska, som var försedd med skruvlock. Flaskan placerades sedan i ett vattenbad (58°C)och reaktionen fick fortgå under 20 h, varefter ett prov av reaktionsprodukten analyserades med högtrycksvätskekromatografi för bestämning av kolhydrat- sammansättningen med följande resultat: Kolhydratsammansättning Fruktos 2,4 % Dextros 32,8 % DP2 lO,6 % D23 22,9 % DP4+ 31,3 % Magnesiumklorid tillsattes till den kvarvarande reaktionsprodukten (dvs det sekundära substratet) till en koncentration av 5 mM och pH inställdes på 8,4 med ut- spädd natriumhydroxid.

B. Kontinuerlig isomerisering av sekundärt substrat Glukosisomeras från Streptomyces Olivochromogenes ATCC 21 715 (se US PS nr 29 152) immobiliserades på porös aluminiumoxid (en reglerad porbärare, framställd av Corning Glass Co., Corningf New York, set<æ enligt följande: l. Bäraren tvättades 2 ggr med vatten; 2. Bäraren inkuberades med 0,1 M natriumcitrat l h under omskakning; 3. Natriumcitratet tvättades från bäraren tills tvätt- lösningens konduktivitet uppgick till 1000 mikromho; 4. Bäraren inkuberades med 0,05 M magnesiumklorid i l h och magnesiumkloridlösningen dekanterades; j 7806844-2 18 . En volym av 0,05 M magnesiumklorid tillsattes sedan till en slutlig enzymkoncentration av 400 enheter/ml; 6. Isomerasenzymkoncentratet tillsattes till bäraren i en halt 0,5 106 enheter per dm3; 7. Bärare och enzym bringades i kontakt i 22-24 h och därefter avtvättades obundet enzym från bäraren med destillerat vatten.

En mantlad glaskolonn (3 cm x 18 cm), som var utrustadi med en pump, som var ansluten till en förrådsbehållaren, tiilföraee det på detta sätt fremetällae immobiiieereae en- zymet. Kolonnens bäddvolym efter tillförseln uppgick till 45 ml. Kolonnen arbetade vid 60°C för alla isomerisering- vikt/vikt koncentration) med S mM magnesiumklorid och inställdes på arna. Kolonnen startades med dextrossirap (50 % pH 8,4 för att visa att kolonnen var aktiv. Strömnings- hastigheten genom kolonnen inställdes på 292 ml/h. Kolon- nen torkades sedan till bäddnivå. Införandet av ett sekun- därt substrat skedde manuellt tills 20 ml effluent upp- samlats och därefter inställdes strömningshastigheten för det sekundära substratet till 292 ml/h. De första 100 ml sirap, som uppsamlades, kastades för att man skulle kunna byta substrat. Sekundärt substrat (cirka 850 ml) fick se- dan passera genom kolonnen. Efter l h steg strömningshas- tigheten till 570 ml/h. Strömningshastigheten reglerades och hölls vid 300 ml/h till körningens slut. Efter avslu- tad körning med sekundärt substrat kopplades kolonnen till- baka till dextros för att visa att isomerasaktiviteten alltjämt fanns kvar. Följande tabell jämför högtrycksvät- skekromatografianalyser av de sekundära substrat, som man utgår från, och slutprodukten från isomeriseringskolonnen: Sekundärt substrat (A) Slutprodukt (B) Fruktos 2,4 15,7 Dextros 32,8 18,9 DP2 10,6 11,0 DP3 22,9 22,9 DP 31,3 31,5 4+ 7so6à44-2 19 Dessa resultat visar att 42,38 % av den fria dex- trosen i det sekundära substratet isomeras i kolonnen till fruktos. Fruktospolymerer, som förelåg i det sekundära sub- stratet syntes ej påverkas av eller påverka isomerisering- en av dextros till fruktos. Man bör lägga till märka till att den totala monosackaridfördelningen innebär cirka 45 % fruktos och 55 % dextros.

I följande exempel använder man två metoder för att spjälka de polysackarider, som föreligger i det sekundära substratet och även i isomeriseringsprodukten därur. Ett sätt är enzymatiskt och vid det andra sättet utnyttjas mild sur hydrolys.

EXEMPEL 7 Framställning av sirap med hög fruktoshalt genom hydrolys A. Enzymatisk hydrolys 100 ml av produkt B från exempel 6 tillsättes till mg renat invertas från Candida utilis. Denna blandning (konserverad med toluen) får reagera över natten vid rums- temperatur, varefter ett prov avlägsnas och analyseras med högtrycksvätskekromatografi. Den kvarvarande produkten B får fortsätta att reagera under ytterligare 6 dagar och därefter analyseras ett andra prov på samma sätt med föl- jande resultat: Utgångsmaterial Efter inverkan Efter ytterli- (Produkt B) invertas gare 6 dagar Fruktos 15,7 % 41,9 % 62,4 % Dextros 18,9 % 29,4 % 36,2 % DP2 11,0 % 1,9 % 0 DP3 22,9 % 12,9 % 0,5 % DP4+ 31,5 % 13,9 % 0,9 % Det invertas, som användes, är en enzymberedning, som tillverkas av Siekagaku Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan, med en aktivitet på 123 enheter/mg, där 1 invertasenhet katalyserar spjälkningen av sackaros för bildning av l mikromol glukos och l mikromol fruktos per minut under vissa betingelser. 17806844-2 B. Syrahydrolys av produkt B Syrahydros av ett prov från produkt B i exempel 6 genomfördes genom att man tillsatte svavelsyra till en koncentration av 0,05 N och uppvärmda till 75-80°C.

Prover togs efter 1 och 2 h hydrolys och analyserades med högtrycksvätskekromatografi. Resultaten var följande: Utgângsmaterial 1 h 2 h (Produkt B) Fruktos 15,7 60,3 59,1 Dextros 18,9 38,7 37,9 DP2 11,0 1,9 2,6 DP3 22,9 0,4 0,3 n1>4+ 31,5 o 0,2 De angivna resultaten i steg A visar en övervägande och en mindre ökning av glukosutbytet och DP4+-frak- ökning av fruktos med en motsvarande minskning av DP2~, DP3- tionerna, varav närvaron av fruktospolymer visas.

Resultaten av syrahydrolysen i steg B överensstämmer med de resultat, som erhålles i steg A, vilket också visar spjälkningen av fruktospolymerer.

Den redovisade diskussionen avser transfruktosylering med ett primärt substrat, där innehållet torrsubstans i utgångssackarosen ej överstiger mättnadspunkten under giv~ na reaktionsbetingelser. Följande exempel visar användning av ett primärt substrat med en begynnelsesackaroskoncentra- tion över mättnadspunkten och vilket substrat, då det utsätts för inverkan av fruktosyltransferasenzym leder till en produkt, som innehåller ökade halter DP3-material (dvs fruktosyl-sackaros) och minskade konoentrationer DP4+- produkter. Man får också en ökning i torrsubstanskoncen- trationen (vikt/vikt) hos det sekundära substratet jämfört med den torrsubstanskoncentration, som erhålles i frånvaro av inverkan av fruktosyltransferasenzym. Vidare framgår att då det primära substratets torrsubstanskoncentration stiger, sjunker polymerisationsgraden hos fruktospolymeren i det sekundära substratet och DP4+-materialet föreligger 7so6ß44~p 21 i små mängder.

Det är en klar skillnad jämfört med de resultat, som erhållits i det tidigare exemplen, där sackarossubstrat, som ej var mättade användes. I dessa exempel är DP4+-mate- rialet primärprodukterz.

EXEMPEL 8 Framställning av sekundärt substrat av sackarosuppslam- ningar i övermättnad.

Alikvota mängder av 200 g sackaros av livsmedelskva- litet placerades i flaskor som rymde 0,57 liter och som var försedda med skruvlock. Som kontroll tillsattes 50 ml vatten till en flaska och de andra flaskorna försattes med 50 ml vatten, som innehöll ökande mängder fruktosyltrans- ferasenzym-celitberedning (framställd enligt exempel l) såsom visas i följande tabell. Var och en av flaskorna tillslutes med lock och placerasj.ett skakande vattenbad vid temperaturen 54-55°C. Flaskorna skakas i 24 h med manu- ell blandning då och då. Ett prov av övervätska avdrages från varje flaska och placeras i ett provrör med skruvlock i ett kokande vattenbad för inaktivering av enzymet. Dessa prov analyseras med högtrycksvätskekromatografi och torr~ substansbestämningar av övervätskan (K Fischer-metoden) göres med följande resultat. 7806844~2 22 K Enzyml Torrsubstans i Kolhydratsammansättning Flaska Sackaros enheter övervätskan i lösning enligt HELG nr (g) (vikt/vikt) (Z) 74,5 Eruk. Dex. DPZ DPS DP4+ 1 zoo 1oo 74,5 0,6 9,6 80,9 8,9 Nnz 2 200 200 75,6 0,7 12,7 72,2 13,7 0,7 3 200 300 76,3 1,0 14,5 66,8 16,6 1,1 4 200 400 77,1 0,9 15,7 62,6 19,0 1,8 200 500 77,7 1,1 17,3 58,5 21,0 2,1 6 zoo eoo 78,1 1,3 18,0 56,0 21,9 2,8 7 200 700 78,1 1,1 18,8 53,9 23,1 3,0 s zoo soo 80,0 1,0 19,3 52,2 24,1 3,4 9 zoo 900 79,0 1,3 19,9 50,0 25,0 3,7 200 1000 79,6 1,3 20,6 48,6 25,4 4,1 kontroll zoo inga 72,7 0,3 m2 99,7 Noz m2 1 Totalantalet av fruktosyltransferasenheter i 50 ml vatten ZND = ej detekterad I det angivna exemplet är det värt att notera att kontrollprovet kristalliserade då det kyldes till rums- temperatur (cirka 25°C), medan däremot de enzymatiskt fram- ställda sekundära substraten förblir i lösning och uppvisar utmärkt lagringsstabilitet utan kristallisation.

Fastän i exempel 8 200 g sackaros användes per 50 ml vatten (dvs 80 % vikt/vikt) kan torrsubstanskoncentrationen i sackarosutgångsmaterialet ökas.

Detnya sekundära substratet enligt denna utförings- form kan användas såsom en synnerligen stabil, icke kris- talliserande sirap inom livsmedelsområdet. Detta substrat har en unikt hög torrsubstanshalt, är beständigt mot mikrobiell förorening och bildning av färgkroppar, de kan användas för skeppning och/eller lagring av socker i kon- centrationer, som hittills ej kunnat erhållas i en form, som har de angivna egenskaperna. Vidare kan detta nya se- kundära substrat med hög torrsubstanshalt hydrolyseras så- som visas i exempel 7 för bildning av en invertsocker- 7806844--2 23 blandning med önskad sötningsgrad. Det nya sekundära sub- stratet har en hög torrsubstanshalt (vikt/vikt) från cirka 70 till cirka 82 % och innehåller en monosackarid- '_fraktion, som väsentligen består av dextros och polysacka- ridpolymerer, som förutom ett överskott av DP2 övervägande består av DP3-produkt. En mindre mängd (4,1 % Del; och därunder) +-polymerer finns också närvarande. 7 Fastän transfruktosyleringssteget enligt uppfinningen visats för ett satsvis förfarande är det uppenbart att kon- tinuerliga förfaranden också kan användas. Då man genomför en sådan kontinuerlig transfruktosylering immobiliseras transfruktosylasenzymet lämpligen med de metoder, som tidi- gare diskuterats under definitionen av immobiliserad enzym och den kontinuerliga bearbetningsmetodik, som därvid be- skrivits.

Claims (5)

1. ~.| '. 7806844-2 10 15 20 25 30 24 PATENTKRAV l. Sätt att framställa en sackaridkomposition innehållande minst 55 vikt% fruktos, varvid (l) sackaros behandlas för erhållande av en komposi- tion, som innehåller dextros, früktos och polysacka- rider, (2) den vid steg (1) erhållna kompositionen even- tuellt utsätts för inverkan av ett isomerasenzym för att isomerisera dextros till fruktos, och (3) de i steg (1) erhållna polysackariderna hydro- lyseras i frånvaro av aktivt isomerasenzym, k ä n n e t e c k nqa t därav, att i steg (l) sackaros med en begynnelsekoncentration av minst 10 %g(vikt/volym) utsätts för inverkan av fruktosyl- transferasenzym vid en temperatur av 25-65°C och vid ett pH av 4,5-6,5 för att ge en produkt som inbegriper dextros, fruktos och polysackarider innehållande minst 66 vikt% fruktosylkomponenter, varvid fruktosylkompo- nenterna är förenade med (241) beta-bindningar.

2. Sätt enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t därav, att den sackaros, som enzymet inverkar pà, före- ligger i en koncentration av minst ca 20 %.

3. sätt enligt krav l eller 'z, därav, att isomeriseringen genomföras med ett k ä n n e t e c k - n a t immobiliserat glukosisomerasenzym.

4. Sätt enligt något av kraven 1-3, t e c k n a t därav, att polysackariderna separeras fysikaliskt från dextrosen och fruktosen före hydrolys.

5. Sätt enligt krav 4, k ä n n e t e c k n a t därav, att polysackariderna separeras genom ultrafil- k ä n n e- trering. f wfrdßfflfàwllhwflhiudoow