JPH08154696A - Ｌ−ケトヘキソースの製造方法 - Google Patents
Ｌ−ケトヘキソースの製造方法Info
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- JPH08154696A JPH08154696A JP7252038A JP25203895A JPH08154696A JP H08154696 A JPH08154696 A JP H08154696A JP 7252038 A JP7252038 A JP 7252038A JP 25203895 A JP25203895 A JP 25203895A JP H08154696 A JPH08154696 A JP H08154696A
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- C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 Ｌ−ケトヘキソースの工業的製造方法の確立
を課題とする。 【解決手段】 Ｄ−ケトヘキソース・３−エピメラーゼ
を用いてＬ−プシコース又はＬ−ソルボースからそれぞ
れＬ−フラクトース又はＬ−タガトースを製造する方法
により解決する。
を課題とする。 【解決手段】 Ｄ−ケトヘキソース・３−エピメラーゼ
を用いてＬ−プシコース又はＬ−ソルボースからそれぞ
れＬ−フラクトース又はＬ−タガトースを製造する方法
により解決する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｌ−ケトヘキソー
スの製造方法に関するものであり、更に詳細には、Ｌ−
プシコース又はＬ−ソルボースに作用しそれぞれＬ−フ
ラクトース又はＬ−タガトースを生成する酵素を用いて
Ｌ−プシコース又はＬ−ソルボースからそれぞれＬ−フ
ラクトース又はＬ−タガトースを製造する方法に関する
ものである。
スの製造方法に関するものであり、更に詳細には、Ｌ−
プシコース又はＬ−ソルボースに作用しそれぞれＬ−フ
ラクトース又はＬ−タガトースを生成する酵素を用いて
Ｌ−プシコース又はＬ−ソルボースからそれぞれＬ−フ
ラクトース又はＬ−タガトースを製造する方法に関する
ものである。
【０００２】
【従来の技術】Ｌ−フラクトース及びＬ−タガトース
は、Ｌ−ケトヘキソースに分類される単糖類で、自然界
には殆ど存在しない希少糖質である。その製造方法とし
ては、原理的には、有機化学的手法により製造すること
が可能である。即ち、Ｌ−グルコース又はＬ−マンノー
スをカセイソーダ、ピリジンなどのアルカリ性薬剤の共
存下で異性化させてＬ−フラクトースを製造する。ま
た、Ｌ−ガラクトースを同様にアルカリ性薬剤の共存下
で異性化させてＬ−タガトースを製造する。しかし、実
際には、原料となるＬ−グルコース、Ｌ−マンノースや
Ｌ−ガラクトースを入手することが困難であり、Ｌ−フ
ラクトースおよびＬ−タガトースを十分量製造する好適
な方法は現在まで報告されていない。尚、Ｌ−タガトー
スについては、本発明者等が先に特開平５−３０８９８
４号公報でクレブジエラ属に属する細菌を用いて、ガラ
クチトールからの製造方法を開示した。しかし、この製
造方法は、大量の菌体および長時間の培養を必要とし、
精製も煩雑で未だ実現していない。
は、Ｌ−ケトヘキソースに分類される単糖類で、自然界
には殆ど存在しない希少糖質である。その製造方法とし
ては、原理的には、有機化学的手法により製造すること
が可能である。即ち、Ｌ−グルコース又はＬ−マンノー
スをカセイソーダ、ピリジンなどのアルカリ性薬剤の共
存下で異性化させてＬ−フラクトースを製造する。ま
た、Ｌ−ガラクトースを同様にアルカリ性薬剤の共存下
で異性化させてＬ−タガトースを製造する。しかし、実
際には、原料となるＬ−グルコース、Ｌ−マンノースや
Ｌ−ガラクトースを入手することが困難であり、Ｌ−フ
ラクトースおよびＬ−タガトースを十分量製造する好適
な方法は現在まで報告されていない。尚、Ｌ−タガトー
スについては、本発明者等が先に特開平５−３０８９８
４号公報でクレブジエラ属に属する細菌を用いて、ガラ
クチトールからの製造方法を開示した。しかし、この製
造方法は、大量の菌体および長時間の培養を必要とし、
精製も煩雑で未だ実現していない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】近年、生化学工業が急
速に発達し、糖質化学の分野においても、新たな糖質の
開発が望まれている。Ｌ−フラクトース又はＬ−タガト
ースは、大量製造方法が確立されていない。従って、未
だ、食品工業、医薬品工業、化学工業などの工業原料と
して使用されるに至っていない。
速に発達し、糖質化学の分野においても、新たな糖質の
開発が望まれている。Ｌ−フラクトース又はＬ−タガト
ースは、大量製造方法が確立されていない。従って、未
だ、食品工業、医薬品工業、化学工業などの工業原料と
して使用されるに至っていない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、Ｌ−フラ
クトース及びＬ−タガトースなどのＬ−ケトヘキソース
を生化学的手段により大量、安価に製造することを目的
に鋭意研究した。その結果、本発明者等が先に発見し、
特開平６−１２５７７６号公報で開示しているＤ−ケト
ヘキソース・３−エピメラーゼが、意外にもＬ−ケトヘ
キソースに作用し、とりわけ、Ｌ−プシコース又はＬ−
ソルボースによく作用してそれぞれＬ−フラクトース又
はＬ−タガトースを多量生成することを見いだし、Ｌ−
フラクトース又はＬ−タガトースの工業的製造方法とし
ての全く新しい製造方法を確立して本発明を完成した。
クトース及びＬ−タガトースなどのＬ−ケトヘキソース
を生化学的手段により大量、安価に製造することを目的
に鋭意研究した。その結果、本発明者等が先に発見し、
特開平６−１２５７７６号公報で開示しているＤ−ケト
ヘキソース・３−エピメラーゼが、意外にもＬ−ケトヘ
キソースに作用し、とりわけ、Ｌ−プシコース又はＬ−
ソルボースによく作用してそれぞれＬ−フラクトース又
はＬ−タガトースを多量生成することを見いだし、Ｌ−
フラクトース又はＬ−タガトースの工業的製造方法とし
ての全く新しい製造方法を確立して本発明を完成した。
【０００５】本発明に用いるＤ−ケトヘキソース・３−
エピメラーゼは、通常、Ｄ−ケトヘキソース・３−エピ
メラーゼ産生能を有する微生物を培養して、Ｄ−ケトヘ
キソース・３−エピメラーゼを生成させればよい。
エピメラーゼは、通常、Ｄ−ケトヘキソース・３−エピ
メラーゼ産生能を有する微生物を培養して、Ｄ−ケトヘ
キソース・３−エピメラーゼを生成させればよい。
【０００６】微生物としては、例えば、シュードモナス
属に属する細菌が適しており、具体的には、特開平３−
２６６９９６号公報に開示されているシュードモナス
チコリ ＳＴ−２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７３６）及び
その変異株などが有利に利用できる。
属に属する細菌が適しており、具体的には、特開平３−
２６６９９６号公報に開示されているシュードモナス
チコリ ＳＴ−２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７３６）及び
その変異株などが有利に利用できる。
【０００７】培養方法は、常法にしたがって、炭素源、
窒素源、無機塩、ビタミンなどを含む栄養培地に約１乃
至５日間培養し、望ましくは、液体培地に通気撹拌など
により好気的条件下で培養し、得られる菌体又は培養上
清などの培養物からＤ−ケトヘキソース・３−エピメラ
ーゼを採取すればよい。通常、培養物を粗Ｄ−ケトヘキ
ソース・３−エピメラーゼとして利用することができ
る。必要ならば、培養物を濾過、遠心分離、塩析、透
析、濃縮、凍結乾燥など公知の方法で部分精製して採取
し、利用することができる。更に高度の精製を必要とす
る場合には、例えば、イオン交換体への吸着・溶出、ゲ
ル濾過、等電点分画、電気泳動、高速液体クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー、更には、
モノクローナル抗体への吸着・溶出などを組合わせて最
高純度に高めて利用することも随意である。
窒素源、無機塩、ビタミンなどを含む栄養培地に約１乃
至５日間培養し、望ましくは、液体培地に通気撹拌など
により好気的条件下で培養し、得られる菌体又は培養上
清などの培養物からＤ−ケトヘキソース・３−エピメラ
ーゼを採取すればよい。通常、培養物を粗Ｄ−ケトヘキ
ソース・３−エピメラーゼとして利用することができ
る。必要ならば、培養物を濾過、遠心分離、塩析、透
析、濃縮、凍結乾燥など公知の方法で部分精製して採取
し、利用することができる。更に高度の精製を必要とす
る場合には、例えば、イオン交換体への吸着・溶出、ゲ
ル濾過、等電点分画、電気泳動、高速液体クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー、更には、
モノクローナル抗体への吸着・溶出などを組合わせて最
高純度に高めて利用することも随意である。
【０００８】また、Ｄ−ケトヘキソース・３−エピメラ
ーゼ、又はその酵素活性を有する微生物を公知の方法で
固定化し、本発明のＬ−プシコース又はＬ−ソルボース
を原料とし、これらからそれぞれＬ−フラクトース又は
Ｌ−タガトースへの変換反応に繰返し利用することも、
また、連続反応に利用することも有利に実施できる。こ
の変換反応は、通常、次の条件で行われる。基質濃度
は、１乃至６０ｗ／ｖ％、望ましくは、約５乃至５０ｗ
／ｖ％、反応温度は１０乃至７０℃、望ましくは、約３
０乃至６０℃、反応ｐＨは５乃至１０、望ましくは、約
７乃至１０、酵素活性は基質グラム当たり１単位以上、
望ましくは、１０乃至５，０００単位の範囲から選ばれ
る。反応時間は、適宜選択できるが、経済的にバッチ反
応の場合には、通常、５乃至５０時間の範囲から選ばれ
る。
ーゼ、又はその酵素活性を有する微生物を公知の方法で
固定化し、本発明のＬ−プシコース又はＬ−ソルボース
を原料とし、これらからそれぞれＬ−フラクトース又は
Ｌ−タガトースへの変換反応に繰返し利用することも、
また、連続反応に利用することも有利に実施できる。こ
の変換反応は、通常、次の条件で行われる。基質濃度
は、１乃至６０ｗ／ｖ％、望ましくは、約５乃至５０ｗ
／ｖ％、反応温度は１０乃至７０℃、望ましくは、約３
０乃至６０℃、反応ｐＨは５乃至１０、望ましくは、約
７乃至１０、酵素活性は基質グラム当たり１単位以上、
望ましくは、１０乃至５，０００単位の範囲から選ばれ
る。反応時間は、適宜選択できるが、経済的にバッチ反
応の場合には、通常、５乃至５０時間の範囲から選ばれ
る。
【０００９】変換反応後の反応溶液は、原料のＬ−プシ
コース又はＬ−ソルボースと共に、新たに生成したＬ−
フラクトース又はＬ−タガトースを含有しており、これ
をそのまま甘味料、保湿剤、結晶析出防止剤、照り付与
剤などとして利用することも有利に実施できる。通常、
反応溶液は、常法に従い、活性炭を用いて脱色し、Ｈ型
及びＯＨ型イオン交換樹脂を用いて脱塩して精製し、濃
縮して、シラップ状製品を得る。必要ならば、更にこの
濃縮液を、例えば、アルカリ金属型又はアルカリ土類金
属型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグ
ラフィーにより、新たに生成したＬ−フラクトース又は
Ｌ−タガトース高含有画分と、原料のＬ−プシコース又
はＬ−ソルボース高含有画分とを分離採取し、このＬ−
フラクトース又はＬ−タガトース高含有画分を精製、濃
縮し、シラップ状製品を得ることも、更に、晶出させ
て、結晶状製品を得ることも有利に実施できる。また、
この分離採取されたＬ−プシコース又はＬ−ソルボース
高含有画分を再度、変換反応の原料に用いることも有利
に実施できる。
コース又はＬ−ソルボースと共に、新たに生成したＬ−
フラクトース又はＬ−タガトースを含有しており、これ
をそのまま甘味料、保湿剤、結晶析出防止剤、照り付与
剤などとして利用することも有利に実施できる。通常、
反応溶液は、常法に従い、活性炭を用いて脱色し、Ｈ型
及びＯＨ型イオン交換樹脂を用いて脱塩して精製し、濃
縮して、シラップ状製品を得る。必要ならば、更にこの
濃縮液を、例えば、アルカリ金属型又はアルカリ土類金
属型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグ
ラフィーにより、新たに生成したＬ−フラクトース又は
Ｌ−タガトース高含有画分と、原料のＬ−プシコース又
はＬ−ソルボース高含有画分とを分離採取し、このＬ−
フラクトース又はＬ−タガトース高含有画分を精製、濃
縮し、シラップ状製品を得ることも、更に、晶出させ
て、結晶状製品を得ることも有利に実施できる。また、
この分離採取されたＬ−プシコース又はＬ−ソルボース
高含有画分を再度、変換反応の原料に用いることも有利
に実施できる。
【００１０】このようにして得られたＬ−フラクトース
又はＬ−タガトースは、甘味料として好適であり、飲食
物、飼料、餌料、歯みがき、口中香錠、舌下錠、内服薬
などの経口摂取物の甘味付けや、嗜好性向上などに有利
に利用できる。また、発酵用炭素源、試薬、化学品・医
薬品の原料、中間体などとしても有利に利用できる。
又はＬ−タガトースは、甘味料として好適であり、飲食
物、飼料、餌料、歯みがき、口中香錠、舌下錠、内服薬
などの経口摂取物の甘味付けや、嗜好性向上などに有利
に利用できる。また、発酵用炭素源、試薬、化学品・医
薬品の原料、中間体などとしても有利に利用できる。
【００１１】以下、実験に基づき、Ｄ−ケトヘキソース
・３−エピメラーゼのＬ−ケトヘキソースに対する活性
について説明する。
・３−エピメラーゼのＬ−ケトヘキソースに対する活性
について説明する。
【００１２】
【実験】Ｄ−ケトヘキソース・３−エピメラーゼの各種
Ｌ−ケトヘキソースに対する相対酵素活性を求めた。Ｌ
−プシコース、Ｌ−フラクトース、Ｌ−ソルボース及び
Ｌ−タガトースからなる４種類のＬ−ケトヘキソースを
それぞれ基質とし、これに実施例１の方法で製造した精
製Ｄ−ケトヘキソース・３−エピメラーゼを作用させ
て、基質に対する酵素活性を求めた。反応条件は、基質
０．１Ｍ溶液（ｐＨ７．５）とし、酵素量を基質グラム
当たり、１１単位加え、３０℃で２４時間反応させた。
対照の基質として、Ｄ−タガトースを使用し、この相対
酵素活性を１００とした。結果は、表１に示した。
Ｌ−ケトヘキソースに対する相対酵素活性を求めた。Ｌ
−プシコース、Ｌ−フラクトース、Ｌ−ソルボース及び
Ｌ−タガトースからなる４種類のＬ−ケトヘキソースを
それぞれ基質とし、これに実施例１の方法で製造した精
製Ｄ−ケトヘキソース・３−エピメラーゼを作用させ
て、基質に対する酵素活性を求めた。反応条件は、基質
０．１Ｍ溶液（ｐＨ７．５）とし、酵素量を基質グラム
当たり、１１単位加え、３０℃で２４時間反応させた。
対照の基質として、Ｄ−タガトースを使用し、この相対
酵素活性を１００とした。結果は、表１に示した。
【００１３】
【表１】
【００１４】表１の結果から明らかなように、Ｄ−ケト
ヘキソース・３−エピメラーゼは、Ｌ−ケトヘキソース
の変換反応にも作用することが判明し、とりわけ、Ｌ−
プシコースによく作用して、Ｌ−プシコースをＬ−フラ
クトースに変換することが判明した。また、Ｌ−プシコ
ースとＬ−フラクトースとの変換反応は、平衡反応であ
って、その平衡点は、Ｌ−プシコースとＬ−フラクトー
スが、ほぼ３：７で圧倒的にＬ−フラクトース側に片寄
っており、Ｌ−フラクトースを製造する上で好都合であ
ることも判明した。また、Ｌ−ソルボースとＬ−タガト
ースとの変換反応も、平衡反応により行われることが判
明した。
ヘキソース・３−エピメラーゼは、Ｌ−ケトヘキソース
の変換反応にも作用することが判明し、とりわけ、Ｌ−
プシコースによく作用して、Ｌ−プシコースをＬ−フラ
クトースに変換することが判明した。また、Ｌ−プシコ
ースとＬ−フラクトースとの変換反応は、平衡反応であ
って、その平衡点は、Ｌ−プシコースとＬ−フラクトー
スが、ほぼ３：７で圧倒的にＬ−フラクトース側に片寄
っており、Ｌ−フラクトースを製造する上で好都合であ
ることも判明した。また、Ｌ−ソルボースとＬ−タガト
ースとの変換反応も、平衡反応により行われることが判
明した。
【００１５】以下、本発明の実施例を述べる。
【００１６】
【実施例１】硫酸アンモニウム０．２ｗ／ｖ％、リン酸
一カリウム０．２４ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．５
６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０１ｗ／ｖ
％、酵母エキス０．５ｗ／ｖ％、Ｄ−グルコース１ｗ／
ｖ％及び脱イオン水からなる培養液をジャーファーメン
ターに取り、１２０℃で２０分間滅菌した後、シュード
モナス チコリ ＳＴ−２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７３
６）の種培養液１ｖ／ｖ％を無菌的に添加し、通気撹拌
しながら３０℃で４０時間培養した。得られた培養液８
０Ｌを遠心分離して集菌し、これを活性アルミナを用い
て磨砕し、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に
て酵素を抽出した。
一カリウム０．２４ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．５
６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０１ｗ／ｖ
％、酵母エキス０．５ｗ／ｖ％、Ｄ−グルコース１ｗ／
ｖ％及び脱イオン水からなる培養液をジャーファーメン
ターに取り、１２０℃で２０分間滅菌した後、シュード
モナス チコリ ＳＴ−２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７３
６）の種培養液１ｖ／ｖ％を無菌的に添加し、通気撹拌
しながら３０℃で４０時間培養した。得られた培養液８
０Ｌを遠心分離して集菌し、これを活性アルミナを用い
て磨砕し、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に
て酵素を抽出した。
【００１７】この粗酵素抽出液を塩化マンガン存在下で
ポリエチレングリコール６０００（以下、「ＰＥＧ」と
略記する。）を用いた分画沈澱法を繰返して精製した。
即ち、０．１Ｍ塩化マンガン存在下でＰＥＧの濃度が５
ｗ／ｖ％から１８ｗ／ｖ％の間に生ずる沈澱を同一緩衝
液に溶解した。このＰＥＧ分画を２回繰返して精製し
た。次いで５０℃で２０分間の熱処理を行い、変性蛋白
質を遠心分離により除去した後、『ＤＥＡＥ−トヨパー
ル６５０Ｍ』に吸着させ、塩化カリウムを用いて溶出す
ることにより精製した。限外濾過（濾過膜は、東洋濾紙
『ＵＫ−１０』を使用）により脱塩し、濃縮した後、
『セファデックスＧ１５０』（ファルマシア社製）を用
いたゲル濾過法により更に精製した。活性画分を濃縮
し、更にアンフォライン（ＬＫＢ社製）を用いる焦点電
気泳動法により精製した。
ポリエチレングリコール６０００（以下、「ＰＥＧ」と
略記する。）を用いた分画沈澱法を繰返して精製した。
即ち、０．１Ｍ塩化マンガン存在下でＰＥＧの濃度が５
ｗ／ｖ％から１８ｗ／ｖ％の間に生ずる沈澱を同一緩衝
液に溶解した。このＰＥＧ分画を２回繰返して精製し
た。次いで５０℃で２０分間の熱処理を行い、変性蛋白
質を遠心分離により除去した後、『ＤＥＡＥ−トヨパー
ル６５０Ｍ』に吸着させ、塩化カリウムを用いて溶出す
ることにより精製した。限外濾過（濾過膜は、東洋濾紙
『ＵＫ−１０』を使用）により脱塩し、濃縮した後、
『セファデックスＧ１５０』（ファルマシア社製）を用
いたゲル濾過法により更に精製した。活性画分を濃縮
し、更にアンフォライン（ＬＫＢ社製）を用いる焦点電
気泳動法により精製した。
【００１８】本酵素の活性測定は次のように行った。即
ち、反応液組成は、５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）１００μｌ、４０ｍＭ Ｄ−タガトースを５０
μｌ及び酵素液を５０μｌとした。反応は３０℃で６０
分間行い、生成物であるＤ−ソルボースを高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した。酵素活性
１単位は、１分間に１μｍｏｌのＤ−タガトースをエピ
マー化してＤ−ソルボースを生成する酵素量とした。
ち、反応液組成は、５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）１００μｌ、４０ｍＭ Ｄ−タガトースを５０
μｌ及び酵素液を５０μｌとした。反応は３０℃で６０
分間行い、生成物であるＤ−ソルボースを高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した。酵素活性
１単位は、１分間に１μｍｏｌのＤ−タガトースをエピ
マー化してＤ−ソルボースを生成する酵素量とした。
【００１９】この酵素の精製工程を表２にまとめた。
【００２０】
【表２】
【００２１】表２の結果から明らかなように、この精製
工程によって、比活性は約２９０倍向上し、この時の活
性回収率は約２％であった。この精製Ｄ−ケトヘキソー
ス・３−エピメラーゼをＬ−プシコースの５ｗ／ｖ％水
溶液（ｐＨ７．５）に、Ｌ−プシコースグラム当たり
５，０００単位の割合で加え、４０℃で３０時間反応し
た。反応後、反応液を常法に従って、活性炭を用いて脱
色し、次いで、『ダイヤイオンＳＫ１Ｂ』（Ｈ型、三菱
化成工業株式会社製の商品）及び『ダイヤイオンＷＡ３
０』（ＯＨ型、三菱化成工業株式会社製の商品）を用い
て脱塩して精製し、減圧濃縮してＬ−プシコースとＬ−
フラクトースとを含む濃度約６０％の透明なシラップを
得た。次いで、『ダウエックス５０Ｗ−Ｘ４』（塩型強
酸性カチオン交換樹脂、ダウケミカル社製の商品）を用
いるカラムクロマトグラフィーによりＬ−フラクトース
高含有画分とＬ−プシコース高含有画分とに分離し、更
に、このＬ−フラクトース高含有画分を、常法に従って
精製し濃縮し、晶出し、分離して結晶Ｌ−フラクトース
を原料に対して固形物当たり約６０％の収率で得た。
工程によって、比活性は約２９０倍向上し、この時の活
性回収率は約２％であった。この精製Ｄ−ケトヘキソー
ス・３−エピメラーゼをＬ−プシコースの５ｗ／ｖ％水
溶液（ｐＨ７．５）に、Ｌ−プシコースグラム当たり
５，０００単位の割合で加え、４０℃で３０時間反応し
た。反応後、反応液を常法に従って、活性炭を用いて脱
色し、次いで、『ダイヤイオンＳＫ１Ｂ』（Ｈ型、三菱
化成工業株式会社製の商品）及び『ダイヤイオンＷＡ３
０』（ＯＨ型、三菱化成工業株式会社製の商品）を用い
て脱塩して精製し、減圧濃縮してＬ−プシコースとＬ−
フラクトースとを含む濃度約６０％の透明なシラップを
得た。次いで、『ダウエックス５０Ｗ−Ｘ４』（塩型強
酸性カチオン交換樹脂、ダウケミカル社製の商品）を用
いるカラムクロマトグラフィーによりＬ−フラクトース
高含有画分とＬ−プシコース高含有画分とに分離し、更
に、このＬ−フラクトース高含有画分を、常法に従って
精製し濃縮し、晶出し、分離して結晶Ｌ−フラクトース
を原料に対して固形物当たり約６０％の収率で得た。
【００２２】本品の理化学的性質は、東京化成工業株式
会社から市販されている標準物質Ｌ−フラクトースのそ
れとよく一致した。本品は、甘味料、発酵用炭素源、試
薬、化学品、医薬品の原料、中間体などとして有利に利
用できる。また、本酵素反応が可逆的な反応であること
から、原料としてＬ−フラクトースを用いることによ
り、Ｌ−プシコースを製品として採取することも容易で
ある。
会社から市販されている標準物質Ｌ−フラクトースのそ
れとよく一致した。本品は、甘味料、発酵用炭素源、試
薬、化学品、医薬品の原料、中間体などとして有利に利
用できる。また、本酵素反応が可逆的な反応であること
から、原料としてＬ−フラクトースを用いることによ
り、Ｌ−プシコースを製品として採取することも容易で
ある。
【００２３】
【実施例２】Ｌ−プシコースの１０ｗ／ｖ％水溶液（ｐ
Ｈ７．０）に、実施例１の方法でＰＥＧ画分２回目まで
部分精製した酵素液を、Ｌ−プシコースグラム当たり
３，０００単位の割合で加え、５０℃で３０時間反応さ
せた。反応後、反応液を実施例１と同様に、脱色し、脱
塩し、減圧濃縮してＬ−プシコースとＬ−フラクトース
とを約３：７の割合で含有する濃度約７０％の透明なシ
ラップを、固形物当たり約９０％の収率で得た。本品
は、上品な高甘味度甘味料として好適であり、各種飲食
物の甘味付け剤としてのみならず、保湿剤、結晶析出防
止剤、照り付与剤などとして有利に利用できる。
Ｈ７．０）に、実施例１の方法でＰＥＧ画分２回目まで
部分精製した酵素液を、Ｌ−プシコースグラム当たり
３，０００単位の割合で加え、５０℃で３０時間反応さ
せた。反応後、反応液を実施例１と同様に、脱色し、脱
塩し、減圧濃縮してＬ−プシコースとＬ−フラクトース
とを約３：７の割合で含有する濃度約７０％の透明なシ
ラップを、固形物当たり約９０％の収率で得た。本品
は、上品な高甘味度甘味料として好適であり、各種飲食
物の甘味付け剤としてのみならず、保湿剤、結晶析出防
止剤、照り付与剤などとして有利に利用できる。
【００２４】
【実施例３】実施例１の方法でＰＥＧ分画２回目まで部
分精製した酵素液を、『キトパールＢＣＷ２５０３』
（富士紡績株式会社製の商品）に固定化した。固定化は
樹脂に部分精製酵素を添加し３０℃で２時間振盪して行
うことにより、酵素活性で約８０％の酵素が固定化され
た。５ｗ／ｖ％のＬ−プシコース水溶液（ｐＨ７．５）
に、このようにして得た固定化酵素をＬ−プシコースグ
ラム当たり５００単位の割合で加え、４５℃で４０時間
反応させた。反応後、反応液を実施例１と同様に、脱色
し、脱塩し、減圧濃縮してＬ−プシコースとＬ−フラク
トースとを約３：７の割合で含有する濃度約７０％の透
明なシラップを、固形物当たり約９０％の収率で得た。
本品は、上品な高甘味度甘味料として好適であり、各種
飲食物の甘味付け剤としてのみならず、保湿剤、結晶析
出防止剤、照り付与剤などとして有利に利用できる。
分精製した酵素液を、『キトパールＢＣＷ２５０３』
（富士紡績株式会社製の商品）に固定化した。固定化は
樹脂に部分精製酵素を添加し３０℃で２時間振盪して行
うことにより、酵素活性で約８０％の酵素が固定化され
た。５ｗ／ｖ％のＬ−プシコース水溶液（ｐＨ７．５）
に、このようにして得た固定化酵素をＬ−プシコースグ
ラム当たり５００単位の割合で加え、４５℃で４０時間
反応させた。反応後、反応液を実施例１と同様に、脱色
し、脱塩し、減圧濃縮してＬ−プシコースとＬ−フラク
トースとを約３：７の割合で含有する濃度約７０％の透
明なシラップを、固形物当たり約９０％の収率で得た。
本品は、上品な高甘味度甘味料として好適であり、各種
飲食物の甘味付け剤としてのみならず、保湿剤、結晶析
出防止剤、照り付与剤などとして有利に利用できる。
【００２５】
【実施例４】実施例３の方法で得た固定化Ｄ−ケトヘキ
ソース・３−エピメラーゼを４ｗ／ｖ％のＬ−ソルボー
スを含有する０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１
００ｍｌに加え、４５℃で９０時間振盪して反応させ
た。次いで、固定化酵素を濾過分離した。
ソース・３−エピメラーゼを４ｗ／ｖ％のＬ−ソルボー
スを含有する０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１
００ｍｌに加え、４５℃で９０時間振盪して反応させ
た。次いで、固定化酵素を濾過分離した。
【００２６】この反応液の上清を常法に従って活性炭で
脱色し、次いで、『ダイヤイオンＳＫ１Ｂ』（Ｈ型、三
菱化成工業株式会社製の商品）、および『ダイヤイオン
ＷＡ３０』（ＯＨ型、三菱化成工業株式会社製の商品）
を用いて脱塩し、減圧濃縮して、基質として用いたＬ−
ソルボースを不純物として含む約６０％の透明なシラッ
プを得た。このシラップを『ダウエックス５０ＷＸ４』
（Ｃａ型カチオン交換樹脂、ダウケミカル社製の商品）
を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製し、濃縮
した後、Ｌ−タガトースを結晶化させて分蜜してＬ−タ
ガトース結晶を得た。Ｌ−タガトースのＬ−ソルボース
に対する収率は、固形物当たり約２０％であった。
脱色し、次いで、『ダイヤイオンＳＫ１Ｂ』（Ｈ型、三
菱化成工業株式会社製の商品）、および『ダイヤイオン
ＷＡ３０』（ＯＨ型、三菱化成工業株式会社製の商品）
を用いて脱塩し、減圧濃縮して、基質として用いたＬ−
ソルボースを不純物として含む約６０％の透明なシラッ
プを得た。このシラップを『ダウエックス５０ＷＸ４』
（Ｃａ型カチオン交換樹脂、ダウケミカル社製の商品）
を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製し、濃縮
した後、Ｌ−タガトースを結晶化させて分蜜してＬ−タ
ガトース結晶を得た。Ｌ−タガトースのＬ−ソルボース
に対する収率は、固形物当たり約２０％であった。
【００２７】このようにして得られた製品を同定するた
めに、実験によりその理化学的性質を調べ、その性質を
文献に示されたＤ−タガトースの文献値と比較すると共
に、シグマ社から標準物質として市販されている試薬Ｄ
−タガトースの測定値と比較した。
めに、実験によりその理化学的性質を調べ、その性質を
文献に示されたＤ−タガトースの文献値と比較すると共
に、シグマ社から標準物質として市販されている試薬Ｄ
−タガトースの測定値と比較した。
【００２８】（１）融点 本製品の測定値：１３１〜１３３℃ Ｄ−タガトースの文献値：１３４〜１３５℃ Ｌ−タガトースの文献値：１３３〜１３５℃ 文献：『ディクショナリー・オブ・オーガニック・コン
パウンズ』、第５版、第３巻、第５，０９７頁（１９８
２年）、チャップマン・アンド・ホール社
パウンズ』、第５版、第３巻、第５，０９７頁（１９８
２年）、チャップマン・アンド・ホール社
【００２９】（２）比旋光度 本製品の測定値： ［α］20 D ＝ ＋６．１（ｃ＝５％、Ｈ2Ｏ） 試薬Ｄ−タガトースの測定値： ［α］20 D ＝ −５．８（ｃ＝５％、Ｈ2Ｏ）
【００３０】（３）赤外線吸収スペクトル ＫＢｒ錠剤法で測定した本製品の赤外線吸収スペクトル
を図１に示した。このスペクトルは、これとは別に測定
した標準物質としての試薬Ｄ−タガトースの赤外線吸収
スペクトルとよく一致した。
を図１に示した。このスペクトルは、これとは別に測定
した標準物質としての試薬Ｄ−タガトースの赤外線吸収
スペクトルとよく一致した。
【００３１】（４）高速液体クロマトグラフィーによる
分析 本製品をＨＰＬＣ（装置及び条件：日本分光工業株式会
社製『８８０−ＰＵ』、日立製作所製『ＧＬ−Ｃ６１１
カラム』、溶離液は１０-4Ｍ水酸化ナトリウム、温度は
６０℃、流速は１ｍｌ／分、検出器は島津製作所製『Ｒ
ＩＤ−６Ａ』）で分析したところ、その溶出位置は、標
準物質としての試薬Ｄ−プシコース、Ｄ−フラクトー
ス、Ｄ−ソルボースなどのＤ−ケトヘキソースとは異な
り、試薬Ｄ−タガトースと同一の２２．２分であった。
分析 本製品をＨＰＬＣ（装置及び条件：日本分光工業株式会
社製『８８０−ＰＵ』、日立製作所製『ＧＬ−Ｃ６１１
カラム』、溶離液は１０-4Ｍ水酸化ナトリウム、温度は
６０℃、流速は１ｍｌ／分、検出器は島津製作所製『Ｒ
ＩＤ−６Ａ』）で分析したところ、その溶出位置は、標
準物質としての試薬Ｄ−プシコース、Ｄ−フラクトー
ス、Ｄ−ソルボースなどのＤ−ケトヘキソースとは異な
り、試薬Ｄ−タガトースと同一の２２．２分であった。
【００３２】以上の結果から明らかなように、本製品の
融点、赤外線吸収スペクトル、およびＨＰＬＣによる分
析値は、文献に示されたＤ−タガトースの文献値、また
はその標準物質としての試薬Ｄ−タガトースの測定値と
よく一致した。比旋光度については、標準物質としての
試薬Ｄ−タガトースの実測値と絶対値においてほぼ一致
し、旋光性（＋、−）が逆であったことから、本発明の
方法で得られた製品は、Ｌ−タガトースであると判断さ
れる。
融点、赤外線吸収スペクトル、およびＨＰＬＣによる分
析値は、文献に示されたＤ−タガトースの文献値、また
はその標準物質としての試薬Ｄ−タガトースの測定値と
よく一致した。比旋光度については、標準物質としての
試薬Ｄ−タガトースの実測値と絶対値においてほぼ一致
し、旋光性（＋、−）が逆であったことから、本発明の
方法で得られた製品は、Ｌ−タガトースであると判断さ
れる。
【００３３】本製品は、稀少糖質としての試薬用途のみ
ならず、食品工業、医薬品工業、化学品工業における原
料、中間体などとしても有利に利用できる。
ならず、食品工業、医薬品工業、化学品工業における原
料、中間体などとしても有利に利用できる。
【００３４】
【発明の効果】上記したことから明らかなように、本発
明は、従来得ることの極めて困難であったＬ−フラクト
ース及びＬ−タガトースを、生化学的方法により容易に
製造する方法を確立するものである。特に、Ｄ−ケトヘ
キソース・３−エピメラーゼを用いてＬ−プシコースを
原料としてＬ−フラクトースを生産できることを見出だ
したことは、Ｌ−フラクトースの製造方法にとって、極
めて有利である。すなわち、原料となるＬ−プシコース
は酸化還元反応によってＤ−タガトースあるいはＤ−プ
シコースから生産できるため、Ｌ−フラクトースの大量
生産が可能となった。
明は、従来得ることの極めて困難であったＬ−フラクト
ース及びＬ−タガトースを、生化学的方法により容易に
製造する方法を確立するものである。特に、Ｄ−ケトヘ
キソース・３−エピメラーゼを用いてＬ−プシコースを
原料としてＬ−フラクトースを生産できることを見出だ
したことは、Ｌ−フラクトースの製造方法にとって、極
めて有利である。すなわち、原料となるＬ−プシコース
は酸化還元反応によってＤ−タガトースあるいはＤ−プ
シコースから生産できるため、Ｌ−フラクトースの大量
生産が可能となった。
【００３５】また、Ｌ−ソルボースを原料として、Ｌ−
タガトースを生産できることを見い出したことは、Ｌ−
タガトースの製造にとって極めて有利であり、原料のＬ
−ソルボースがソルビトールから大量、安価に生産され
ることから見ても好都合である。
タガトースを生産できることを見い出したことは、Ｌ−
タガトースの製造にとって極めて有利であり、原料のＬ
−ソルボースがソルビトールから大量、安価に生産され
ることから見ても好都合である。
【００３６】従って、本発明の方法は、Ｌ−フラクトー
ス及びＬ−タガトースの工業的製造方法として好適であ
り、大量、安価な供給を容易にし、希少糖質としての試
薬用途のみならず、従来予想すらできなかった食品工
業、医薬品工業、化学品工業など広範な工業用途への途
を拓くものである。
ス及びＬ−タガトースの工業的製造方法として好適であ
り、大量、安価な供給を容易にし、希少糖質としての試
薬用途のみならず、従来予想すらできなかった食品工
業、医薬品工業、化学品工業など広範な工業用途への途
を拓くものである。
【図１】本発明の方法で得たＬ−タガトースの赤外線吸
収スペクトルを示す図である。
収スペクトルを示す図である。
Claims (4)
- 【請求項１】 Ｌ−プシコース又はＬ−ソルボースを含
有する溶液に、Ｄ−ケトヘキソース・３−エピメラーゼ
を作用させてそれぞれＬ−フラクトース又はＬ−タガト
ースを生成せしめ、これを採取することを特徴とするＬ
−ケトヘキソースの製造方法。 - 【請求項２】 Ｄ−ケトヘキソース・３−エピメラーゼ
が、シュードモナス属に属する微生物由来の酵素である
請求項１記載のＬ−ケトヘキソースの製造方法。 - 【請求項３】 Ｌ−ケトヘキソースを採取する方法が、
塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグ
ラフィーにより分離精製されたＬ−フラクトース又はＬ
−タガトースを採取する方法である請求項１又は２記載
のＬ−ケトヘキソースの製造方法。 - 【請求項４】 Ｌ−プシコース又はＬ−ソルボースを含
有する溶液に、Ｄ−ケトヘキソース・３−エピメラーゼ
を作用させてそれぞれＬ−フラクトース又はＬ−タガト
ースを生成せしめ、これを採取することを特徴とするＬ
−ケトヘキソース含有甘味料の製造方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7252038A JPH08154696A (ja) | 1994-10-05 | 1995-09-06 | Ｌ−ケトヘキソースの製造方法 |
| DE69520322T DE69520322T2 (de) | 1994-10-05 | 1995-10-04 | Verfahren zur Herstellung von L-Ketohexose |
| US08/539,068 US5811271A (en) | 1994-10-05 | 1995-10-04 | Process for producing L-ketohexose |
| EP95307039A EP0709463B1 (en) | 1994-10-05 | 1995-10-04 | Process for producing l-ketohexose |
| TW084110431A TW399099B (en) | 1994-10-05 | 1995-10-04 | Process for producing L-ketohexose |
| KR1019950034086A KR100374450B1 (ko) | 1994-10-05 | 1995-10-05 | L-케토헥소오스의제조방법 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26440694 | 1994-10-05 | ||
| JP6-264406 | 1994-10-05 | ||
| JP7252038A JPH08154696A (ja) | 1994-10-05 | 1995-09-06 | Ｌ−ケトヘキソースの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08154696A true JPH08154696A (ja) | 1996-06-18 |
Family
ID=26540510
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7252038A Pending JPH08154696A (ja) | 1994-10-05 | 1995-09-06 | Ｌ−ケトヘキソースの製造方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5811271A (ja) |
| EP (1) | EP0709463B1 (ja) |
| JP (1) | JPH08154696A (ja) |
| KR (1) | KR100374450B1 (ja) |
| DE (1) | DE69520322T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002053588A (ja) * | 2000-08-08 | 2002-02-19 | Nippon Shokuhin Kako Co Ltd | 結晶タガトースの製造方法 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7815956B2 (en) | 2001-04-27 | 2010-10-19 | Pepsico | Use of erythritol and D-tagatose in diet or reduced-calorie beverages and food products |
| CN1510993A (zh) * | 2001-05-01 | 2004-07-07 | ���¿��ֹ�˾ | 赤藓糖醇和d-塔格糖在零热量或低热量饮料和食品中的用途 |
| AU2003270232A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-04-19 | Dsm Ip Assets B.V. | Process for producing l-ascorbic acid |
| DE10307445A1 (de) * | 2003-02-20 | 2004-10-21 | Institut für Technologie der Kohlenhydrate -Zuckerinstitut- eV | Verwendung von D-Tagatose zur Geschmacksverstärkung von Aromen |
| KR100744479B1 (ko) | 2005-06-01 | 2007-08-01 | 씨제이 주식회사 | 사이코스 에피머화 효소에 의한 사이코스의 생산 방법 |
| JP5283173B2 (ja) | 2006-11-10 | 2013-09-04 | 松谷化学工業株式会社 | 希少糖を含む非う蝕性素材および抗う蝕剤 |
| AU2013250804A1 (en) | 2012-04-17 | 2016-08-11 | Agtive Bio-Sciences Private Limited | Method of production of monosaccharides |
| KR102288901B1 (ko) * | 2019-03-29 | 2021-08-12 | 씨제이제일제당 주식회사 | 혼합당 조성물 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2876417B2 (ja) * | 1990-03-17 | 1999-03-31 | 株式会社林原生物化学研究所 | Ｄ―ソルボースの製造方法 |
| JP3194160B2 (ja) * | 1992-05-08 | 2001-07-30 | 株式会社林原生物化学研究所 | Ｌ−タガトースの製造方法 |
| JP3333969B2 (ja) * | 1992-10-08 | 2002-10-15 | 株式会社林原生物化学研究所 | Ｄ−ケトヘキソース・３−エピメラーゼとその製造方法並びに用途 |
-
1995
- 1995-09-06 JP JP7252038A patent/JPH08154696A/ja active Pending
- 1995-10-04 US US08/539,068 patent/US5811271A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-10-04 DE DE69520322T patent/DE69520322T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-10-04 EP EP95307039A patent/EP0709463B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-05 KR KR1019950034086A patent/KR100374450B1/ko not_active IP Right Cessation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002053588A (ja) * | 2000-08-08 | 2002-02-19 | Nippon Shokuhin Kako Co Ltd | 結晶タガトースの製造方法 |
| JP4712166B2 (ja) * | 2000-08-08 | 2011-06-29 | 日本食品化工株式会社 | 結晶タガトースの製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5811271A (en) | 1998-09-22 |
| KR960014353A (ko) | 1996-05-22 |
| DE69520322D1 (de) | 2001-04-19 |
| DE69520322T2 (de) | 2001-08-23 |
| EP0709463A1 (en) | 1996-05-01 |
| KR100374450B1 (ko) | 2003-05-09 |
| EP0709463B1 (en) | 2001-03-14 |
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