DE60013232T2 - Verfahren zur Herstellung und Rückgewinnung von Erythritol aus Kulturmedium - Google Patents

Verfahren zur Herstellung und Rückgewinnung von Erythritol aus Kulturmedium Download PDF

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung und Gewinnung von Erythritkristallen, genauer betrifft sie ein fermentatives Verfahren zur Erzeugung von Erythrit ohne gleichzeitig höher viskose Polysaccharide zu erzeugen, was vorteilhaft ist für die Gewinnung von Erythritkristallen durch Direktkristallisation aus unraffinierter mikroorganismen-freier Fermentationsbrühe.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Erythrit erzeugende Hefen, die Erythrit durch Fermentation erzeugen, schließen solche ein, die zu der Gattung Moniliella, Trichonosporoides oder Trichonosporon gehören, wobei die typischerweise verwendeten Arten Moniliella tomentosa var. pollinis und Trichonosporoides megachiliensis sind.
  • Ein übliches Verfahren, um Erythrit aus einem Kulturmedium zu isolieren und zu gewinnen, das durch Züchtung von Erythrit produzierenden Hefen in einem wässrigen Medium erhalten wurde, beinhaltet, dass das Kulturmedium einer Vorbehandlung unterzogen wird, wie der Entfernung von Biomasse durch Filtration, Entfärbung unter Verwendung von Aktivkohle, Entsalzung und Entfärbung des Kulturmediums mit Ionenaustauschharzen, und dann dieses eingeengt und gekühlt wird, wodurch das gewünschte Erythrit kristallisiert.
  • Verunreinigungen, die die Isolierung, Kristallisierung und/oder Gewinnung von Erythrit beeinflussen, umfassen die folgenden Bestandteile:
    • – Polyole, wie Glycerin und Ribitol
    • – Oligosaccharide, u.a. Disaccharide und höhere Saccharide, die in dem Ausgangsstärkehydrolysat enthalten sind ebenso wie Reaktionsprodukte, die daraus gebildet werden
    • – Viskose mikrobielle Polysaccharide, die von der Hefe erzeugt werden.
  • Aufgrund der Bildung von Polysacchariden erhöht sich die Viskosität des Mediums. Dies führt zu einer verringerten Sauerstoffübertragungsrate und durch anaerobe Fermentation wird ein Teil der Kohlenhydratquelle in Ethanol umgewandelt, wodurch sich die Produktion an Erythrit vermindert. Weiterhin schaffen hochviskose Fermentationsbrühen Probleme beim Abfiltern der Zellen und die Polyolgewinnung ist sehr schwierig.
  • EP 0 327 016 beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung von hochreinem Erythrit aus einem erythrithaltigen Kulturmedium, indem die mikroorganismenfreie Fermentationsbrühe durch chromatographische Trennsäulen geschickt wird, die mit stark sauren Kationenaustauscherharzen vom Alkalimetall- oder Ammoniumtyp gepackt sind. Die Entfernung verschiedener Salze, von färbendem Material, von verschiedenen Oligosacchariden und Polysacchariden wird erreicht. Das Verfahren beinhaltet, dass ein Erythrit erzeugender Mikroorganismus in einem wässrigen Medium unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird; die Zellen aus dem entstehenden Kulturmedium entfernt werden; der erhaltene Überstand durch Trennsäulen geleitet wird, die mit stark sauren Kationenaustauschharzen vom Alkalimetall- oder Ammoniumtyp gepackt sind; diese mit Wasser eluiert werden; Fraktionen, die Erythrit als Hauptkomponente enthalten, gesammelt werden und dann Erythrit aus diesen Fraktionen gewonnen wird. Dieses Verfahren erfordert einen sehr hohen Wasserverbrauch und die abgetrennten Komponenten sind sehr verdünnt, was zu hohen Verdampfungskosten führt. Weiterhin sind die Investitionskosten für eine solche Trennanlage hoch.
  • EP 0 908 523 betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von hochreinen Erythritkristallen. Das Verfahren beinhaltet eine Kristallisationsstufe und eine Kristallabtrennungsstufe, wobei eine Erythritkonzentration der erythrithaltigen wässrigen Lösung von 30 bis 60 Gew.-% zu Beginn der Kristallisationsstufe eingestellt wird. Vor der Kristallisationsstufe beinhaltet das Verfahren eine Mikrobenabtrennstufe und eine chromatographische Trennung.
  • Derwent Abstract des Japanischen Patents JP 10287603 beschreibt die saure Behandlung der mikroorganismenfreien erythrithaltigen Fermentationsbrühe zur Hydrolyse der gebildeten Polysaccharide und Verunreinigungen. Die Hydrolyse verwandelt gewisse Verunreinigungen in andere weniger viskose Nebenprodukte um, aber im Prinzip ist die Gesamtreinheit nicht erhöht. Diese Nebenprodukte werden anschließend durch übliche Trennmethoden, wie Aktivkohle und Ionenaustauschbehandlung, entfernt.
  • Derwent Abstract des Japanischen Patents JP 01215293 beschreibt die Gewinnung von Erythrit aus einer polysaccharidhaltigen Fermentationsbrühe mit Ultrafiltrationsmembranen. Polysaccharide, die die mikroorganismenfreie Fermentationsbrühe trüb machen, werden vollständig durch Ultrafiltration mit Membranen mit einer Trenngrenze von 1.000 bis 100.000 Dalton entfernt und Erythrit wird aus dem gereinigten Medium gewonnen.
  • US 4,906,569 betrifft ein Verfahren zur Isolierung und Gewinnung von hochreinem Erythrit mit einer hohen Kristallisationsausbeute aus einem Kulturmedium eines Erythrit erzeugenden Mikroorganismus, das umfasst, dass verschiedene Verunreinigungen und Nebenprodukte, wie verschiedene Salze, färbende Materialien und Polysaccharide abgetrennt und entfernt werden. Die Verunreinigungen und Nebenprodukte werden durch chromatographische Auftrennung unter Verwendung von stark saurem Kationenaustauschharz entfernt.
  • Alle oben zitierten Literaturstellen erfordern auf die eine oder andere Weise eine Reinigungsstufe zur Entfernung von gebildeten Polysacchariden, wie die Behandlung mit Ionenaustauschharzen, Säulenchromatographie, saurer Hydrolyse oder Ultrafiltration.
  • EP 0136805 beschreibt ein Fermentationsverfahren in Gegenwart von stark Sporen bildenden Kolonien des hefeartigen Pilzes Moniliella tomentosa var. pollinis, was zu 2,3–3,5% Polysacchariden bezogen auf den Erythritgehalt führt. In Gegenwart von wenig Sporen bildenden Kolonien werden bis zu 16–25% Polysaccharide bezogen auf den Erythritgehalt gebildet. Obwohl bei stark Sporen bildenden Kolonien die Menge an Polysacchariden schon auf 2,3–3,5% bezogen auf den Erythritgehalt reduziert wurde, wird beschrieben, dass die Kulturbrühe vor dem Einengen auf 60% bis 80% Trockensubstanz raffiniert wird. Erythrit wird daraus kristallisiert. Weiterhin sind lange Fermentationszeiten von bis zu 13 Tagen erforderlich, um eine Erythritausbeute von 34% zu erzielen.
  • Somit besteht ein Bedarf für ein Verfahren zur Erzeugung von Erythrit durch Fermentation und Gewinnung von Erythritkristallen ohne Reinigung des mikroorganismenfreien Fermentationskulturmediums. Das Gewinnungsverfahren sollte frei von 1) intensiver Raffinierung, 2) Erzeugung großer Abwasserströme, 3) hohem Energieverbrauch sein, sollte aber eine gute Wiedergewinnung von hochreinen Erythritkristallen liefern.
  • Die vorliegende Erfindung liefert ein solches Verfahren.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Erzeugung von Erythrit durch Fermentation unter Verwendung von Mikroorganismen und Gewinnung von Erythritkristallen, wobei das Verfahren die folgenden Stufen beinhaltet:
    • a) Bereitstellung von Mikroorganismen eines Polysaccharid-negativen Erythrit produzierenden Stamms von Moniliella tomentosa var pollinis TCV 364 [Hinterlegungsnummer MUCL 40385], wobei der Stamm weniger als 1% Polysaccharide erzeugt, bezogen auf den Erythritgehalt,
    • b) Herstellung eines Fermentationskulturmediums,
    • c) Zugabe der Mikroorganismen zu dem Fermentationskulturmedium,
    • d) Wachsen lassen der Mikroorganismen, bis mindestens 50 g/l Erythrit in dem Fermentationskulturmedium erhalten werden,
    • e) Entfernung der Mikroorganismen aus dem Fermentationskulturmedium,
    • f) Einengen des unraffinierten mikroorganismenfreien Fermentationskulturmediums auf eine Trockensubstanz von mehr als 80% G/G
    • g) Kristallisieren von Erythrit und
    • h) Sammeln der Erythritkristalle.
  • Bevorzugt erzeugt in Stufe a) der Polysaccharid-negative Erythrit erzeugende Stamm Moniliella tomentosa var. pollinis TCV 364 weniger als 0,1% Polysaccharide bezogen auf den Erythritgehalt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem unraffiniertes Mikroorganismenfermentationskulturmedium auf eine Trockensubstanz von mindestens 85% G/G, bevorzugter mehr als 90% G/G eingeengt wird.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart weiterhin ein Verfahren, bei dem Erythritkristalle mit einer Ausbeute von mindestens 85% gewonnen werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem Erythritkristalle mit einer Reinheit von mindestens 98% G/G, bevorzugt 99% G/G gewonnen werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem Mikroorganismen in weniger als 10 Tagen wachsen gelassen werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem das Fermentationskulturmedium in einem Blasensäulenreaktor oder Airlift hergestellt wird.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart weiterhin ein Verfahren, bei dem in Stufe a) Moniliella tomentosa var pollinis TCV 364 verwendet wird.
  • Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung einen Polysaccharid-negativen Erythrit erzeugenden Moniliella Stamm, der weniger als 1% Polysaccharide, bevorzugt weniger als 0,1% Polysaccharide bezogen auf den Erythritgehalt erzeugt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Polysaccharid-negativen Erythrit erzeugenden Moniliella Stamm, der ein Moniliella tomentosa Stamm ist, bevorzugt Moniliella tomentosa var. pollinis TCV 364, der gemäß Budapester Vertrag bei BCCM/MUCL (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms/Mycotheque de l'Universite Catholique de Louvain von Eridania Beghin Say, Vilvoorde R&D Centre, Havenstraat 84, B-1800 Vilvoorde) am 28.03.1997 unter der Nummer MUCL 40385 hinterlegt wurde.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zur Erzeugung von Erythrit durch Fermentation unter Verwendung von Mikroorganismen und Gewinnung von Erythritkristallen, wobei das Verfahren die folgenden Stufen beinhaltet:
    • i) Bereitstellung von Mikroorganismen eines Polysaccharid-negativen Erythrit produzierenden
    • Stamms von Moniliella tomentosa var pollinis TCV 364 [Hinterlegungsnummer MUCL 40385], wobei der Stamm weniger als 1% Polysaccharide erzeugt, bezogen auf den Erythritgehalt,
    • j) Herstellung eines Fermentationskulturmediums,
    • k) Zugabe der Mikroorganismen zu dem Fermentationskulturmedium,
    • l) Wachsen lassen der Mikroorganismen, bis mindestens 50 g/l Erythrit in dem Fermentationskulturmedium erhalten werden,
    • m) Entfernung der Mikroorganismen aus dem Fermentationskulturmedium,
    • n) Einengen des unraffinierten mikroorganismenfreien Fermentationskulturmediums auf eine Trockensubstanz von mehr als 80% G/G
    • o) Kristallisieren von Erythrit und
    • p) Sammeln der Erythritkristalle.
  • Normalerweise führt aufgrund der Gegenwart erheblicher Mengen an Polysacchariden das Einengen des unraffinierten mikroorganismenfreien Fermentationskulturmediums vor der Kristallisation zu einer schnell ansteigenden Viskosität des Mediums. Als Ergebnis wird die Kristallisationsrate erheblich gesenkt und es ist sehr schwierig, hochreine Kristalle zu erhalten, da die Abtrennung der kristallinen Masse von der Mutterlauge sehr aufwändig ist.
  • Die Gegenwart von mehr als 2% Polysacchariden bezogen auf den Erythritgehalt ist noch zu hoch, um ein direktes Einengen auf eine Trockensubstanz von mehr als 80% zuzulassen.
  • Weiterhin werden diese Polysaccharide während der Kristallisation von Erythrit ausgefällt und die so erhaltenen Erythritkristalle sind mit den Polysacchariden kontaminiert. Die Wiederauflösung dieser unreinen Kristalle liefert trübe Lösungen. Es ist daher unvermeidbar, das Kulturmedium nur in einem begrenzten Ausmaß einzuengen, wodurch das Ausfällen der Polysaccharide verhindert wird, wodurch aber die Kristallisationsausbeute an Erythrit erheblich gesenkt wird. Die Kristallisationsausbeute an Erythrit ist eine Funktion der Trockensubstanz. Eine zu niedrige Trockensubstanz führt zu einer niedrigen Kristallausbeute und ein Recycling der hochviskosen Mutterlauge ist aufgrund der Gegenwart von Polysacchariden ausgeschlossen.
  • Der Polysaccharid-negative Erythrit erzeugende Stamm wird aus der Gattung Moniliella, Trichonosporoides und Trichonosporon ausgewählt.
  • Der Polysaccharid-negative Erythrit erzeugende Stamm erzeugt weniger als 1% Polysaccharide, bevorzugt weniger als 0,1% Polysaccharide bezogen auf den Erythritgehalt. In Gegenwart des Wildtypstamms (CBS 461.67) werden 10,5 g/l Polysaccharide oder 33% Polysaccharide auf Basis des Erythritgehalts gesammelt.
  • Der Gehalt an Polysacchariden wird mit Hochleistungsflüssigchromatographie (Ionenaustauschharz Shodex KC-811 H+-Form, eluiert mit 0,01% Schwefelsäurelösung und Messen der Flächenprozent der eluierten Peaks) bestimmt. Da die Polysaccharidfraktion mit Salzen und Xanthangummi co-eluiert wird, die dem Kulturmedium zugegeben werden, wird der tatsächliche Gehalt an gebildeten Polysacchariden bestimmt, indem der Null-Gehalt (= Hintergrund an Salzen und Xanthangummi, gemessen zu Beginn der Fermentation) von dem Endgehalt, gemessen am Ende der Fermentation, d. h. nach Entfernung der Biomasse, abgezogen.
  • Rohmaterialien, die zur Herstellung des Fermentationskulturmediums verwendet werden, sind Stärkehydrolysat, das mehr als 90% Glucose enthält, als Kohlenstoffquelle, und Maiseinweichwasser, Hefeextrakt und/oder Ammoniumsulfat als Stickstoffquelle. Xanthangummi und/oder Silikonöl können zugegeben werden, um ein Schäumen zu unterdrücken.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem das unraffinierte Mikroorganismenfermentationskulturmedium auf eine Trockensubstanz von mindestens 85% G/G, bevorzugter mehr als 90% G/G eingeengt wird und die gesammelten Erythritkristalle eine Reinheit von mindestens 98% G/G, bevorzugt 99% G/G haben.
  • Das unraffinierte mikroorganismenfreie Kulturmedium wird direkt eingeengt auf mehr als 80% G/G Trockensubstanz, bevorzugt auf eine Trockensubstanz von mindestens 85% G/G, bevorzugter über 90% G/G und indem langsam auf 20°C gekühlt wird, wobei Erythritkristalle mit einer Reinheit von 98–99% G/G erhalten werden. Die direkte Kristallisation bei hoher Trockensubstanz führt zu einer hohen Kristallausbeute, während die Mutterlauge an den Anfang der Kristallisiervorrichtung zurückgeführt werden kann wegen des Fehlens der Polysaccharide. Die unraffinierte mikroorganismenfreie Fermentationsbrühe, die im Wesentlichen frei von Polysacchariden ist, leidet nicht unter ansteigender Viskosität während des Einengens aufgrund der hohen Trockensubstanz und der Gegenwart von Glycerin, das ein Nebenprodukt der Fermentation sein kann, was das Einengen auf eine so hohe Trockensubstanz wie mehr als 90% begünstigt.
  • Vor dem Einengen und der Kristallisation wird die Biomasse (Mikroorganismen) mit üblichen bekannten Filtrationstechniken, wie Zentrifugation, vorbeschichtete Vakuumfiltration oder Mikrofiltration entfernt. Die entstehende mikroorganismenfreie Fermentationsbrühe wird als solche zum Einengen und zur Kristallisation von Erythritkristallen verwendet. Eine Raffinierungsstufe zur Entfernung restlicher Verunreinigungen, wie die Behandlung mit Aktivkohle oder mit Ionenaustauschharzen ist in dem Prozess nicht enthalten.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem die Mikroorganismen in weniger als 10 Tagen wachsen gelassen werden und trotzdem hohe Erythritkonzentrationen erhalten werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem das Fermentationskulturmedium in einem Blasensäulenreaktor oder Airlift hergestellt wird. Das Kulturmedium ist nicht viskos und die Fermentation zur Erzeugung von Erythrit kann in einem einfachen Fermentationsreaktor mit geringer Energiezufuhr durchgeführt werden.
  • Typischerweise wird das Verfahren der vorliegenden Erfindung unter aeroben Bedingungen durchgeführt mit einem Stamm, der ausgewählt ist aus der Gattung Moniliella, Trichonosporoides und Trichonosporon. Bevorzugt werden Mutantenstämme von Moniliella tomentosa var. pollinis und Trichonosporoides megachiliensis angewendet, bevorzugter der Mutantenstamm Moniliella tomentosa var pollinis TCV 364. Die Mutantenstämme können mit klassischer Mutagenese, wie UV-Strahlung, salpetriger Säure, Ethylmethansulfonat (EMS), Diethylsulfat, N-Methyl-N'-nitrosoguanidin-(NTG)-Behandlung, Acridinbehandlung und dgl. erhalten werden. Polysaccharid-negative Erythrit erzeugende Stämme, die weniger als 1% Polysaccharide bezogen auf den Erythritgehalt erzeugen, werden bevorzugt erhalten durch Mutagenese in Gegenwart von N-Methyl-N'nitrosoguanidin (NTG). Die isolierten Kolonien werden 5 Tage lang gezüchtet und der zellfreie Überstand mit Isopropanol gemischt und der gebildete Niederschlag getrocknet und gewogen. Die Kolonien, die die geringste Menge an Niederschlag ergeben, werden ausgewählt.
  • Die Fermentation mit Moniliella tomentosa var. pollinis TCV 364 führt zu einem Polysaccharidgehalt von weniger als 1 g/l oder weniger als 1% Polysaccharide, bevorzugt weniger als 0,1% Polysaccharide bezogen auf den Erythritgehalt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Polysaccharid-negativen Erythrit erzeugenden Moniliella-Stamm, der weniger als 1% Polysaccharide, bevorzugt weniger als 0,1% Polysaccharide bezogen auf den Erythritgehalt erzeugt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Polysaccharid negativen Erythrit erzeugenden Moniliella-Stamm, der ein Moniliella tomentosa Stamm ist, bevorzugt Moniliella tomentosa var. pollinis TCV 364, der gemäß Budapester Vertrag bei BCCM/MUCL (Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms/ Mycotheque de l'Universite Catholique de Louvain von Eridania Beghin Say, Vilvoorde R&D Centre, Havenstraat 84, B-1800 Vilvoorde) am 28.03.1997 unter der Nummer MUCL 40385 hinterlegt wurde.
  • Die Abwesenheit von Polysacchariden liefert erhebliche Vorteile für die Fermentation, die Entfernung der Mikroorganismen und die Kristallisation:
    • 1. Das Kulturmedium ist nicht viskos und die Fermentation zur Erzeugung von Erythrit kann in einem einfachen Fermentationsreaktor durchgeführt werden mit geringer Energiezufuhr, wie einem Airlift oder einem Blasensäulenreaktor, bevorzugt einem Blasensäulenreaktor.
    • 2. Der angewendete Mutantenstamm ist sehr stabil gegenüber einer Reversion.
    • 3. Aufgrund der geringeren Viskosität wird ein besserer Sauerstofftransfer erhalten, was zu einer geringeren Ethanolerzeugung und erhöhten Erythritausbeute führt. Erythritkonzentrationen von mehr als 250 g/l oder 300 g/l können erreicht werden. Diese hohen Erythritkonzentrationen werden in weniger als 10 Tagen Fermentationszeit erreicht.
    • 4. Die Abwesenheit von gebildeten Polysacchariden lässt eine bessere Diffusion in die Zellen zu, wodurch die Fermentation in Gegenwart höheren Konzentrationen an Stickstoffquelle durchgeführt werden kann, was auch die Fermentationszeit erheblich reduziert.
    • 5. Die geringere Viskosität führt zu einer verbesserten und schnelleren Biomassenfiltration und die unraffinierte mikroorganismenfreie Fermentationsbrühe wird direkt einer Einengung zu hoher Trockensubstanz, Kristallisation und Gewinnung der Erythritkristalle unterzogen ohne Vorbehandlung mit Aktivkohle und Ionenaustauschharz.
    • 6. Die unraffinierte mikroorganismenfreie Fermentationsbrühe wird direkt auf mehr als 80% G/G Trockensubstanz eingeengt und liefert eine hohe Kristallausbeute an Erythrit.
    • 7. Eine Erythritwiedergewinnung von mindestens 85% wird erreicht und weniger verdünnter Abwasserstrom wird erzeugt.
    • 8. Erythritkristalle mit einer Reinheit von 98–99% G/G werden erhalten.
  • Die erhaltenen Erythritkristalle können mit üblichen Methoden, z. B. einem Wirbelbetttrockner, getrocknet werden.
  • Um die Reinheit auf mehr als 99,5% G/G zu erhöhen, können die Erythritkristalle, die 98–99% G/G rein sind (was mit Hochleistungsflüssigchromatographie bestimmt wird (Kationenaustauschharz Shodex KC-811 H+-Form, eluiert mit 0,01% Schwefelsäurelösung und Messung der Flächenprozent der eluierten Peaks) wieder aufgelöst werden und mit Hilfe von Aktivkohle und/oder Ionenaustauschharz entfärbt und entsalzt werden vor einer zweiten Einengung und Kristallisation. Die Mutterlauge kann in die erste Kristallisationsstufe zurückgeführt werden.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch folgenden Beispiele erläutert.
  • Beispiel 1 beschreibt eine Mutagenesemethode, um dem Mutantenstamm Moniliella tomentosa var. pollinis TCV 364 zu erhalten.
  • Beispiel 2 beschreibt die Impfung und Fermentation mit dem nativen Stamm CBS 461.67 und die Ausbeute an Erythrit und den Gehalt an Polysacchariden im Vergleich zur Fermentation mit dem Mutantenstamm Moniliela tomentosa var. pollinis TCV 364 (Beispiel 4).
  • Beispiel 3 beschreibt die Beimpfung und Fermentation mit dem stark Sporen bildenden Unterstamm, der in EP 0136805 beschrieben wird, und die Viskosität der mikroorganismenfreien Fermentationsbrühe wird mit der Viskosität der Mikroorganismenfermentationsbrühe verglichen, die mit dem Mutantenstamm Moniliella tomentosa var pollinis TCV 364 (Beispiel 4) erhalten wird. Die Viskosität der Fermentationsbrühe steigt mit dem Gehalt an Polysacchariden, die in der Fermentationsbrühe vorhanden sind, an.
  • Beispiel 5 beschreibt die Fermentation mit Moniliella tomentosa var. pollinis TCV 364 im Pilotmaßstab gefolgt von der Gewinnung der Erythritkristalle (= nachgeschaltete Prozessierung).
  • Beispiel 1
  • Mutagenese, um Moniliella tomentosa var. pollinis TCV 364 zu erhalten
  • Moniliella pollinis wurde bei 30°C in Schüttelkolben auf einem Medium, das 30% Glucose und 1% Hefeextrakt enthielt, gezüchtet. Nach 2 Tagen wurde 1 ml gesättigte N-Methyl-N'-nitrosoguanidin-(NTG)-Lösung zu der Kultur zugegeben und 1 Stunde lang unter Rühren inkubiert. Die Zellen wurden zentrifugiert und zweimal mit frischem Kulturmedium gewaschen. Die Zellen wurden in sterilem Wasser verdünnt und auf festem Medium, das 20% Glucose, 1% Hefeextrakt und 2% Agar enthielt, plattiert und 1 Woche lang bei 30°C inkubiert. Isolierte Kolonien wurden in Flüssigmedium 5 Tage lang gezüchtet.
  • Die Zellen wurden durch Zentrifugation getrennt und der zellfreie Überstand mit zwei Teilen Isopropanol gemischt. Der Niederschlag wurde getrocknet und gewogen. Die Kolonien, die die geringste Menge an Niederschlag ergaben, wurden ausgewählt.
  • Vergleichsbeispiel 2 – Polysaccharidbildung – Nativer Stamm 461.67
  • 1. Impfung – Erlenmeyer
  • Kristalline Dextrose (C*Dex02001) wurde in 50 ml Wasser gelöst, bis eine Konzentration von 30% G/V erreicht war. Hefeextrakt (Ohly) 1% G/V wurde zugegeben. Das Medium wurde mit wenigen Kolonien aus der Petrischale beimpft. Die Temperatur war 30°C und das gesamte Medium wurde 3 Tage mit 100 Schlägen pro Minute geschüttelt.
  • 2. Fermentation
  • Das gesamte Arbeitsvolumen war 1,2 1 und kristalline Dextrose (C*Dex 02001) wurde zu Wasser zugegeben, bis eine Konzentration von 30% G/V erreicht war. 5% G/V Maiseinweichwasser (C*P1us15855, 5%), das getrennt in 200 ml Wasser sterilisiert wurde, wurde zugegeben und anschließend das Inokulum, das in dem Erlenmeyer-Kolben hergestellt worden war, und 500 ppm Silikonöl (SAG) und 500 ppm Xanthan. Die Temperatur war 35°C und die Brühe wurde mit 600 bis 11.000 U/min gerührt. Die Gesamtfermentationszeit war 120 Stunden. Der Gehalt an Polysacchariden und Erythrit wurde mit HPLC bestimmt und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
  • Vergleichsbeispiel 3 – Viskosität der Fermentationsbrühe mit dem stark Sporen bildenden Unterstamm, der in EP 0136805 beschrieben wird
  • Das Inokulum wurde hergestellt, indem die gleichen Reaktionsbedingungen angewendet wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben. Anstelle der Verwendung des nativen Stamms wurde mit Kolonien des stark Sporen bildenden Unterstamms, der in EP 0136805 beschrieben wird, beimpft. Die Fermentationsbedingungen waren wie in Beispiel 2 beschrieben.
  • Die Viskosität der mikroorganismenfreien Fermentationsbrühe wurde mit der Viskosität der mikroorganismenfreien Fermentationsbrühe verglichen, die mit dem Mutantenstamm Moniliella tomentosa var. pollinis TCV 364 erhalten wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
  • Beispiel 4
  • Polysaccharidbildung – Mutantenstamm TCV 364
  • Das Inokulum wurde hergestellt, indem die gleichen Reaktionsbedingungen, wie in Beispiel 2 beschrieben, angewendet wurden. Statt der Verwendung des nativen Stamms wurden Kolonien des Mutantenstamms Moniliella tomentosa var. pollinis TCV 364 geimpft. Die Fermentationsbedingungen waren wie in Beispiel 2 beschrieben.
  • Der Gehalt an Polysacchariden und Erythrit wurde mit HPLC bestimmt und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1
    Figure 00090001
    Tabelle 2
    Figure 00090002
  • Beispiel 5
  • Fermentation + nachbeschaltete Prozessierung
  • Fermentation
  • Ein 6000 Liter Blasensäulenreaktor wurde 30 Minuten lang bei 121°C sterilisiert. Steriles Wasser wurde zugegeben und Stärkehydrolysat (C*Plus02668, 95% Dextrose, 70% d.s.) wurde zugegeben, bis die Endkonzentration von Dextrose nach Beimpfung (berechnet auf 3600 l) zwischen 220 und 250 gA lag.
  • Die Temperatur der Brühe wurde konstant auf 35°C gehalten. Sterile Luft wurde in den Reaktor injiziert, um eine Leerrohrgeschwindigkeit des Gases von 5 bis 15 cm/s zu erhalten. Das Volumen wurde mit einer 3 Tage alten Vorkultur beimpft (deren Volumen zwischen 500 l und 1000 l lag).
  • 4,5% bis 5% G/V Maiseinweichwasser (C*P1us15855, 50% d.s.), 400–500 ppm Silikonöl (SAG 471) und 400–500 ppm Xanthan wurden 30 Minuten lang bei 121°C sterilisiert (die Konzentrationen wurden auf das Endvolumen von 36001 berechnet) und zu der Fermentationsbrühe zugegeben.
  • Nach 30 bis 40 Stunden wurde die Zugabe von pasteurisiertem Stärkehydrolysat (C*P1us02668, 95% Dextrose, 70% d.s.) gestartet, um den Dextrosegehalt zwischen 20 und 100 g/l1 zu halten. Diese Zugabe wurde fortgesetzt, bis das Endvolumen der Brühe 4800 l war. Die Fermentation wurde fortgesetzt, bis der Dextrosegehalt in der Brühe unter 2 g/l war, d. h. in weniger als 10 Tagen.
  • Die Endkonzentration von Erythrit lag zwischen 250 und 300 g/l. 0,42% Polysaccharide (bezogen auf den Erythritgehalt) wurden gebildet.
  • Kristallisation
  • Die Biomasse wurde aus der Fermentationsbrühe durch Filtration auf einem vorbeschichteten Drehvakuumfilter entfernt. Die geklärte Fermentationsbrühe wurde in einem diskontinuierlichen Vakuumverdampfer eingeengt bis auf einen Gesamttrockenfeststoffgehalt von 90% G/G bei 90°C.
  • Diese geklärte Lauge wurde in einen bewegten diskontinuierlichen Kühlkristallisator überführt. Das Kühlen erfolgte linear von 90°C auf 20°C über einen Zeitraum von 6 Stunden. Erythritkristalle wurden durch Chargenzentrifugation gewonnen. Die Kristalle wurden in der Zentrifuge mit kaltem Wasser gewaschen, wobei das Verhältnis von Wasser zu Kristallen 15 : 100 war. Die Erythritgewinnung war 85% und die Reinheit der Kristalle war 99,1% G/G.

Claims (11)

  1. Verfahren zur Herstellung von Erythrit durch Fermentation unter Verwendung von Mikroorganismen und Gewinnung von Erythritkristallen, wobei das Verfahren die folgenden Stufen aufweist: a) Bereitstellung von Mikroorganismen eines Polysaccharid-negativen Erythrit produzierenden Stamms von Moniliella tomentosa var pollinis TCV 364 [Hinterlegungsnummer MUCL 40385], wobei der Stamm weniger als 1% Polysaccharide erzeugt, bezogen auf den Erythritgehalt, b) Herstellung eines Fermentationskulturmediums, c) Zugabe der Mikroorganismen zu dem Fermentationskulturmedium, d) Wachsen lassen der Mikroorganismen, bis mindestens 50 g/l Erythrit in dem Fermentationskulturmedium erhalten werden, e) Entfernung der Mikroorganismen aus dem Fermentationskulturmedium, f) Einengen des unraffinierten mikroorganismenfreien Fermentationskulturmediums auf eine Trockensubstanz von mehr als 80% G/G g) Kristallisieren von Erythrit und h) Sammeln der Erythritkristalle.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Stufe a) der Polysaccharid-negative Erythrit produzierende Stamm Moniliella tomentosa var pollinis TCV 364 weniger als 0,1% Polysaccharide bezogen auf den Erythritgehalt erzeugt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das unraffinierte mikroorganismenfreie Fermentationskulturmedium auf eine Trockensubstanz von mindestens 85% G/G eingeengt wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das unraffinierte mikroorganismenfreie Fermentationskulturmedium auf eine Trockensubstanz von mehr als 90% G/G eingeengt wird.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass in Stufe h) Erythritkristalle mit einer Wiedergewinnung von mindestens 85% und einer Reinheit von mindestens 98% G/G gesammelt werden.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass in Stufe h) Erythritkristalle mit einer Wiedergewinnung von mindestens 85% und einer Reinheit von mindestens 99% G/G gesammelt werden.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen in weniger als 10 Tagen wachsen gelassen werden.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Fermentationskulturmedium in einem Blasensäulenreaktor oder Airlift hergestellt wird.
  9. Polysaccharid-negativer Erythrit erzeugender Stamm Moniliella tomentosa var pollinis TCV 364, hinterlegt am 28.03.1997 unter der Nummer MUCL 40385.
  10. Stamm nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass er weniger als 1% Polysaccharide bezogen auf den Erythritgehalt erzeugt.
  11. Stamm nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass er weniger als 0,1 % Polysaccharide bezogen auf den Erythritgehalt erzeugt.
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