DE1904265C3 - Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von D-Sibose - Google Patents
Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von D-SiboseInfo
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Description
D-Ribose ist beispielsweise wichtig als Ausgangsmaterial
für die Synthese von Riboflavinverbindungen und als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Nucleotidwürzen,
die kürzlich entwickelt wurden.
Die folgenden Verfahren zur Herstellung von D-Ribose unter Verwendung von Mikroorganismen }o
sind bereits bekannt, aber diese Verfahren sind im großtechnischen Maßstab kaum durchfuhrbar, weil bei
ihnen nur geringe Mengen D-Ribose erhalten werden.
1. Verfahren zur Herstellung von D-Ribose durch Züchtung von Bacillus subtilis, der L-Tyrosin, L-Tryptophan
und L-Phenylalanin nicht zum Wachstum benötig!, in einem Kulturmedium, das kein L-Tyrosin, L-Tryptophan
und L-Phenylalanin enthält (japanische Patentanmeldung 13 393/1962, offengelegt am 3. Juni 1964 unter
der Offenlegungsnummer 9439/1964, Kurzreferat in »Chemical Abstracts«, 61,1380g [1964]).
2. Verfahren zur Herstellung von D-Ribose durch Züchtung von Brevibacterium ammoniagenes in einem
an Kalium, Magnesium und Phosphat reichen Medium (niederländische Patentanmeldung 64 08 806, Kurzreferat
in »Chemical Abstracts« 63,19000 g [1965]), und
3. Verfahren zur Herstellung von D-Ribose durch
I. ein Züchtungsverfahren zur Herstellung von nucleinsäureähnlichen Materialien unter Verwendung
von Bacillus subtilis und II. ein Verfahren zur Zersetzung der so angehäuften nucleinsäureähnlichen Materialien in D-Ribose
durch Verwendung von Xanthomonas lactucae (japanische Patentanmeldung 58597/1964, offengelegt
am 24. Januar 1967 unter der Offenlegungsnummer 1479/1967, Kurzreferat in »Chem. Abstr.«
66,74956a (1967).
Die Ausbeute des Verfahrens zu 1) beträgt nur 0,1 g D-Ribose pro Liter Kulturmedium, die Ausbeute von
Verfahren 2) beträgt nur 8,6 g D-Ribose pro Liter filtrierter Fermentationsbrühe und die Ausbeute nach
Verfahren 3) beträgt nur 3,2 g D-Ribose pro Liter der durch Züchtung von Bacillus subtilis erhaltenen Lösung.
Wie aus den Beispielen hervorgeht, sind die Ausbeuten erfindungsgemäß wesentlich höher. f>s
Gemäß der Erfindung, die in den Ansprüchen definiert ist, wird D-Ribose in einer bemerkenswert
großen Menge im Kulturmedium angereichert, und die hierbei angereicherte D-Ribose läßt sich aus dem
Kulturmedium leicht abtrennen. Das Verfahren gemäß der Erfindung ist aufgrund der guten Ausbeute
vorteilhaft für die Großherstellung von D-Ribose.
Die gemäß Anspruch 1 einzusetzenden Bacillen werde von Wildstämmen nach an sich bekannten
üblichen Mutationsmethoden erhalten oder von Wildstämmen isoliert Die Mutation kann vorgenommen
werden, indem Wilstämme der Gattung Bacillus einer Behandlung mit beispielsweise Ultraviolettlicht, Röntgenstrahlen,
Gammastrahlen und einem Mutagen wie Nitrosoguanidin, unterworfen werden.
Als Mikroorganismen eignen sich für die Zwecke der Erfindung beispielsweise Bacillus pumilus IFO 12600,
Bacillus pumilus IFO 12601, Bacillus pumilus IFO 12602, Bacillus subtilis IFO 12603 und Bacillus subtilis IFO
12604, die Mutanten sind.
Diese fünf Mikroorganismen können aufgrund ihrer mikrobiologischen Eigenschaften D-Gluconsäure,
L-Arabinose oder D-Ribose nicht als Kohlenstoffquelle zum Wachstum ausnutzen und benötigen zum Wachstum
L-Tyrosin, L-Tryptophan und L-Phenylalanin. Die übrigen mikrobiologischen Eigenschaften sind identisch
mit denen, die in Bergys Manual of Determinative Bacteriology, 620 - 622 (1957) beschrieben sind.
Für die Großherstellung von D-Ribose wird der Mikroorganismus im allgemeinen in einem flüssigen
Kulturmedium gezüchtet. Die Züchtung wird gewöhnlich als Submerskultur unter Belüftung und Bewegung
unter Verwendung eines Kulturmediums durchgeführt, das L-Tyrosin, L-Tryptophan und L-Phenylalanin
enthalten muß.
L-Tyrosin, L-Tryptophan und L-Phenylalanin können dem Kulturmedium jeweils in der isolierten Form
zugesetzt werden, jedoch können auch natürlich Substanzen, die sie enthalten, z. B. Trockenhefe, Pepton,
Fleischextrakt, Casaminosäure, Maisquellwasser usw. und deren Gemische verwendet werden.
L-Tyrosin, L-Tryptophan und L-Phenylalanin müssen dem Kulturmedium in einer für das Wachstum des
Mikroorganismus genügenden Menge zugesetzt werden. Deshalb werden diese Verbindungen dem Kulturmedium
so zugesetzt, daß ihre Konzentration mehr als je 100 jVm1 und vorzugsweise weniger als je 5000}>/ml
beträgt.
Als assimilierbare Kohlenstoffquellen können Verbindungen wie Monosaccharide, z. B. D-Glucose, D-Fructose,
D-Mannose, Sorbit, D-Mannit, Disaccharide, z. B. Saccharose und Maltose, verschiedene Polysaccharide,
z. B. Dextrin und lösliche Stärke, Rest Melasse, u. dgl. allein oder zu mehreren verwendet werden.
Als assimilierbare Stickstoffquellen eignen sich beispielsweise anorganische Stickstoffverbindungen,
z. B. Ammoniumsulfat und Ammoniumnitrat, und organische Stickstoffverbindungen wie Harnstoff. Ferner
kann eine geringe Menge anorganischer Salze wie Magnesiumsulfat, Calciumphosphat und Calciumcarbonat
zugesetzt werden.
Die Kultivierungstemperatur muß so eingestellt werden, daß die gewünschte Substanz in maximaler
Menge angereichert wird. Im allgemeinen liegt die Temperatur im Bereich von 25 bis 45° C.
Die Kultivierung wird so lange durchgeführt, bis die maximale Menge D-Ribose im Kulturmediuni angereichert
ist. Die zur maximalen Anreicherung von D-Ribose erforderliche Zeit hängt von verschiedenen
Faktoren ab, beträgt jedoch gewöhnlich 24 bis 120 Stunden, gerechnet vom Beginn der Kultivierung.
Die Kulturbrühe enthält nach Beendigung der Kultivierung eine große Menge D-Ribose. Da der
größere Teil der so gebildeten D-Ribose in der FlOssigphase der Brühe angereichert wird, ist es
zweckmäßig, zunächst die Zellen abzutrennen und dann die D-Ribose aus dem Filtrat zu gewinnen. Beispielsweise
kann die D-Ribose durch Entsalzen des Filtrats mit einem Ionenaustauschharz und Entfärbung mit einer
Säule aus Kohlepulver gewonnen werden.
Wenn die Kulturbrühe nach der Kultivierung Kohlehydrate aus dem Ausgangsmaterial neben der
gewünschten D-Ribose enthält, können diese Kohlehydrate nach an sich bekannten Metboden entfernt
werden, z. B. durch Behandlung der Brühe mit Glucoseoxydase im Falle der Verwendung von Glucose
als Ausgangskohlehydrate oder mit Backhefe, die nicht die D-Ribose, sondern nur die Kohlehydrate ausnutzt.
Ausführungsforrnen der Erfindung werden durch die folgenden Beispiele veranschaulicht. In diesen Beispielen
bedeutet die zur Kennzeichnung der Mikroorganismen gebrauchte Abkürzung IFO »Institute for Fermentation
Osaka«. Die Prozentsätze beziehen sich auf Gewicht/Volumen, falls nicht anders angegeben.
Die Mutante Bacillus pumilus IFO 12600, die von Bacillus pumilus ATCC 7061 durch Bezahlung mit
Ultraviolettlicht und anschließende Anwendung der Penicillintechnik (Experientia 6, 41 [I960]) und der
Replica-Plating-Methode (Journal of Bacteriology 63, 399 [1952]) erhalten worden ist, wird zum Impfen von
500 ml eines Mediums verwendet, das 2% lösliche Stärke, 2% Maisquellwasser, 0,3% Dikaliumhydrogenphosphat
und 0,1% Kaliumdihydrogenphosphat enthält. Das Medium wird zur Herstellung einer Impfkultur 24
Stunden bei 28°C gehalten. Mit dieser Impfkultur werden 301 eines Mediums geimpft (nachstehend als
Medium A bezeichnet), das 12,5% D-Glucose, 2,5% Trockenhefe, 1,5% Ammoniunisulfat, v),5% sekundäres
Calciumphosphat, 0,5% tertiäres Calciumphosphat und 1,0% Calciumcarbonat enthält. Das Medium wird 66
Stunden unter konstanter Belüftung und Bewegung bei 32°C gehalten. Auf diese Weise werden 28,5 mg
D-Ribose pro ml Kulturbrühe gebildet.
Die die D-Ribose enthaltende Kulturbrühe wird durch eine Aktivkohlesäule (15 cm χ 100 cm) geleitet.
Der Ablauf wird unter vermindertem Druck auf etwa 5 I eingeengt und nach Zusatz von 10% Backhefe 1 Stunde
bei 37°C gehalten. Nach Entfernung der Hefezellen durch Filtration wird das Konzentrat zur Entsalzung
durch Schichten von Kationenaustauschharzen und Anionenaustauschharzen geleitet. Die ablaufende Flüssigkeit
wird auf 1 1 eingeengt. Durch Zusatz von 1 1 Äthylalkohol zu diesem Konzentrat werden 620 g rohe
Kristalle von D-Ribose erhalten.
Mit der nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise erhaltenen Mutante Bacillus pi'milus IFO 12601 werden
500 ml eines Mediums geimpft, das 2% Sorbit, 2% Maisquellwasser, 0,3% Dikaliumhydrogenphosphat und
0,1% Kaliumdihydrogenphosphat enthält. Das Medium wird 24 Stunden bei 32°C bebrütet, wobei eine
Impfkultur erhalten wird. Mit der Impfkultur werden dann 301 eines Mediums geimpft, das aus dem Medium
A und 150 y/ml L-Phenylalanin besteht. Dieses Medium
wird dann unter Belüftung und Bewegung 55 Stunden bei 370C gehalten. Auf die oben beschriebene Weise
werden 30,5 mg D-Ribose pro ml in der Kulturbrühe gebildet Die die D-Ribose enthaltende Brühe wird auf
die in Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt, wobei 693 g rohe Kristalle von D-Ribose erhalten werden.
Mit der nach der in Beispiel 1 beschriebenen Welse erhaltenen Mutante Bacillus pumilus IFO 12602 werden
500 ml eines Mediums geimpft, das die gleiche
ίο Zusammensetzung hat wie das zur Herstellung der
Impfkultur gemäß Beispiel 2 verwendete Medium. Das Medium wird zur Herstellung der Impfkultur 24
Stunden unter Schütteln bei 37° C bebrütet.
Mit dieser Impfkultur werden 301 des Mediums A
geimpft, dem 50y/ml L-Tyrosin zugesetzt worden sind.
Das Medium wird 80 Stunden unter Belüftung und Bewegung bei 37° C gehalten. Auf die oben beschriebene
Weise werden 29,3 mg D-Ribose pro ml in der Kulturbrühe gebildet Diese Kulturbrühe wird auf die in
Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt, wobei 620 g rohe Kristalle von D-Ribose erhalten werden.
Mit der Mutante Bacillus subtilis IFO 12603, die durch
Bestrahlung von Bacillus subtilis ATCC 6051 mit Ultraviolettlicht und anschließende Anwendung der
Penicillintechnik (Experientia 6, 41 [I960]) und der Replica-Plating Methode (Journal of Bacteriology 63,
399 [1952]) erhalten worden ist, werden 500 ml eines Mediums geimpft, das 2% lösliche Stärke, 2%
Maisquellwasser, 0,3% Dikaliumhydrogenphosphat und 0,1% Kaliumdihydrogenphosphat enthält. Das Medium
wird 24 Stunden bei 32°C bebrütet. Mit dieser Impfkultur werden dann 30 I eines Mediums geimpft,
das 10% lösliche Stärke, 1,5% Trockenhefe, 1,5% Ammoniumsulfat, 0,5% tertiäres Calciumphosphat,
0,5% sekundäres Calciumphosphat und 1,0% Calciumcarbonat enthält. Dieses Medium wird 72 Stunden unter
Belüftung und Bewegung bei 32°C gehalten. Auf die oben beschriebene Weise werden 26,5 mg D-Ribose pro
ml in der Kulturbrühe gebildet.
Die Kulturbrühe wird zur Entfernung der Zellen mit einem Filterhilfsstoff filtriert. Das Filtrat wird durch
eine Säule (20 cm χ 100 cm) von mit Säure vorbehandeltem Kohlepulver geleitet. Die ablaufende Flüssigkeit
wird unter vermindertem Druck auf etwa 4,51 eingeengt. Das Konzentrat wird nach Zusatz von 10%
Backhefe 1 Stunde bei 37"C gehalten. Nach Entfernung der Hefezellen durch Filtration wird das Konzentrat zur
Entsalzung durch aufeinanderfolgende Schichte von Kationenaustauschharzen und Anionenaustauschharzen
geleitet. Die ablaufende Flüssigkeit wird unter vermindertem Druck auf 1 I eingeengt. Zum Konzentrat
werden 1,51 Äthylalkohol gegeben, wobei 558 g rohe Kristalle von D-Ribose erhalten werden.
Ein Bacillus subtilis wurde mit Ultraviolettlicht bestrahlt, wobei die Mutante Bacillus subtilis IFO 12604
erhalten wurde. Mit dieser Mutante werden 500 ml des Mediums A geimpft. Das Medium wird dann 20 Stunden
bei 30°C bebrütet. Mit der erhaltenen Impfkultur werden 301 eines Mediums geimpft, das 10% D-Glucose,
2,0% Trockenhefe, 1,8% Ammoniumsulfat, 0,5% sekundäres Calciumphosphat, 0,5% tertiäres Calciumphosphat,
1,0% Calciumcarbonat und lOOy/ml L-Phenylalanin
enthält. Das Medium wird 68 Stunden bei 32°C bebrütet.
Auf diese Weise werden 29,5 mg D-Ribose pro ml in der Kulturbrühe gebildet Die Brühe wird auf die in
Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt, wobei 615 g rohe Kristalle von D-Ribose gebildet werden.
Beispiel 6
(nachgereicht)
(nachgereicht)
Isolierung von L-Tyrosin, L-Tryphtophan und L-Phenylalanin
zum Wachstum benötigenden Mutanten von Bacillus pumilus ATCC 4510, Bacillus pumüus ATTC
4522, Bacillus subtilis ATCC 9858 und Bacillus subtilis
ATCC 9943 unter Verwendung von Nitrosoguanidin als Mutagen.
Ein oder zwei (s. die Tabelle) L-Tyrosin, L-Tryptophan
und L-Phenylalanin zum Wachstum benötigende Mutanten wurden aus jedem dieser Ausgangsmikroorganismen
unter Verwendung von Nii.osoguanidin als Mutagen hergestellt und nach der im Beispiel I
angegebenen Technik isoliert Die Zusammensetzung des Mediums und die Bedingungen der Kultur waren
dieselben, wie sie in Beispiel 1 verwendet wurden, mit der Ausnahme, daß die Versuche in kleinem Maßstab
unter Verwendung von Flaschen durchgeführt worden sind, wobei das mittlere Volumen 200 ml pro Flasche
betrug. Wie aus der nachsiehenden Tabelle hervorgeht,
wurde D-Ribose von allen Mutanten produziert
| Stämme | Produzierte |
| D-Ribose | |
| mg/ml*) | |
| Bacillus pumilus ATCC 4510 | |
| (Ausgangsstamm) | 0 |
| TTP") benötigender Mutant-1 | 27,5 |
| TTP benötigender Mutant-2 | 33,4 |
| Bacillus pumilus ATCC 4522 | |
| (Ausgangsstamm) | 0 |
| TTP benötigender Mutant | 26,3 |
| Bacillus subtilis ATCC 9858 | |
| (Ausgangsstamm) | 0 |
| TTP benötigender Mutant | 30,2 |
| Bacillus subtilis ATCC 9943 | |
| (Ausgangsstamm) | 0 |
| TTP benötigender Mutant | 29,1 |
5-Tage-KuItur.
TTP benötigender Mutant bedeutet, daß der Mutant für sein Wachstum L-Tyrosin, L-Tryptophan und L-Phenylalanin benötigt
Claims (2)
1. Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von D-Ribose, dadurch gekennzeichnet, daß
man einen D-Ribose bildenden und L-Tyrosin, L-Tryptophan sowie L-Phenylalanin zum Wachstum
benötigenden Stamm von Bacillus pumilus oder von Bacillus subtilis in einem Kulturmedium, das
L-Tyrosin, L-Tryptophan und L-Phenylalanin in ι ο einer Menge von mehr als je etwa lOOy/ml neben
assimilierbarem Kohlenstoff und Stickstoff enthält, aerob züchtet, bis D-Ribose darin angereichert ist,
und daß man die angereicherte D-Ribose aus dem Kulturmedium gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Bacillus
pumilus IFO 12600, Bacillus pumilus IFO 12601, Bacillus pumilus IFO 12602, Bacillus subtilis IFO
12603 oder Bacillus subtilis IFO 12604 einsetzt.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP622468 | 1968-02-01 | ||
| JP622468 | 1968-02-01 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE1904265A1 DE1904265A1 (de) | 1969-10-02 |
| DE1904265B2 DE1904265B2 (de) | 1977-06-16 |
| DE1904265C3 true DE1904265C3 (de) | 1978-02-02 |
Family
ID=
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