DE1904265B2 - Biotechnisches verfahren zur herstellung von d-ribose - Google Patents

Description

D-Ribose ist beispielsweise wichtig als Ausgangsmaterial für die Synthese von Riboflavinve:rbindungen und als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Nucleotidwürzen, die kürzlich entwickelt wurden.

Die folgenden Verfahren zur Herstellung von D-Ribose unter Verwendung von Mikroorganismen sind bereits bekannt, aber diese Verfahren sind im großtechnischen Maßstab kaum durchführbar, weil bei ihnen nur geringe Mengen D Ribose erhalten werden.

1. Verfahren zur Herstellung von D-Ribose durch Züchtung von Bacillus subtilis, der L-Tyrosin. L-Tryptophan und L-Phenylalanin nicht zum Wachstum benötigt, in einem Kulturmedium, das kein L-Tyrosin, L-Tryptophan und L-Phenylalanin enthält (japanisch:· Patentanmeldung 13 393/1962, offengelegt am 3. Juni 1964 unter der Offenlegungsnummer 9439/1964, Kurzreferat in »Chemical Abstracts«, 61,1380g [1964]).

2. Verfahren zur Herstellung von D-Ribose durch Züchtung von Brevibacterium ammoniagenes in einem an Kalium, Magnesium und Phosphat reichen Medium (niederländische Patentanmeldung 64 08 806, Kurzreferat in »Chemical Abstracts« 63,19000 g [1965]), und

3. Verfahren zur Herstellung von D-Ribose durch

I. ein Züchtungsverfahren zur Herstellung von nucleinsäureähnlichen Materialien unter Verwendung von Bacillus subtilis und H. ein Verfahren zur Zersetzung der so angehäuften nucleinsäureähnlichen Materialien in D-Ribose durch Verwendung von Xanthomonas lactucae (japanische Patentanmeldung 58597/1964, offengelegt am 24. Januar 1967 unter der Offenlegungsnummer 1479/1967, Kurzreferat in »Chem. Abstr.« 66,74956a (1967).

Die Ausbeute des Verfahrens zu 1) beträgt nur 0,1 g D-Ribose pro Liter Kulturmedium, die Ausbeute von Verfahren 2) beträgt nur 8,6 g D-Ribose pro Liter filtrierter Fermentationsbrühe und die Ausbeute nach Verfahren 3) beträgt nur 3,2 g D-Ribose pro Liter der durch Züchtung von Bacillus subtilis erhaltenen Lösung. Wie aus den Beispielen hervorgeht, sind die Ausbeuten erfindungsgemäß wesentlich höher. <>5

Gemäß der Erfindung, die in den Ansprüchen definiert ist, wird D-Ribose in einer bemerkenswert großen Menge im Kulturmedium angereichert, und die hierbei angereicherte D-Ribose läßt sich aus dem Kulturmedium leicht abtrennen. Das Verfahren gemäß der Erfindung ist aufgrund der guten Ausbeute vorteilhaft für die Großherstellung von D-Ribose.

Die gemäß Anspruch 1 einzusetzenden Bacillen werde von Wildstämmen nach an sich bekannten üblichen Mutationsmethoden erhalten oder von Wildstämmen isoliert Die Mutation kann vorgenommen werden, indem Wilstämme der Gattung Bacillus einer Behandlung mit beispielsweise Ultraviolettlicht, Röntgenstrahlen, Gammastrahlen und einem Mutagen wie Nitrosoguanidin, unterworfen werden.

Als Mikroorganismen eignen sich für die Zwecke der Erfindung beispielsweise Bacillus pumilus IFO 12600, Bacillus pumilus IFO 12601, Bacillus pumilus IFO 12602, Bacillus subtilis IFO 12603 und Bacillus subtilis IFO 12604, die Mutanten sind.

Diese fünf Mikroorganismen können aufgrund ihrer mikrobiologischen Eigenschaften D-Gluconsäure, L-Arabinose oder D-Ribose nicht als Kohlenstoffquelle zum Wachstum ausnutzen und benötigen zum Wachstum L-Tyrosin, L-Trypiophan und L-Phenylalanin. Die übrigen mikrobiologischen Eigenschaften sind identisch mit denen, die in Bergys Manual of Determinative Bacteriology, 620 - 622 (1957) beschrieben sind.

Für die Großherstellung von D-Ribose wird der Mikroorganismus im allgemeinen in einem flüssigen Kulturmedium gezüchtet. Die Züchtung wird gewöhnlich als Submerskultur unter Belüftung und Bewegung unter Verwendung eines Kulturmediums durchgeführt, das L-Tyrosin, L-Tryptophan und L-Phenylalamn enthalten muß.

L-Tyrosin, L-Tryptophan und L-Phenylalanin können dem Kulturmedium jeweils in der isolierten Form zugesetzt werden, jedoch können auch natürlich Substanzen, die sie enthalten, z. B. Trockenhefe, Pepton, Fleischextrakt, Casaminosäure, Maisquellwasser usw. und deren Gemische verwendet werden.

L-Tyrosin, L-Tryptophan und L-Phenylalanin müssen dem Kulturmedium in einer für das Wachstum des Mikroorganismus genügenden Menge zugesetzt werden. Deshalb werden diese Verbindungen dem Kulturmedium so zugesetzt, daß ihre Konzentration mehr als je lOOy/ml und vorzugsweise weniger als je 5000 y/ml beträgt

Als assimilierbare Kohlenstoffquellen können Verbindungen wie Monosaccharide, z. B. D-Glucose, D-Fructose, D-Mannose, Sorbit D-Mannit, Disaccharide, z. B. Saccharose und Maltose, verschiedene Polysaccharide, z. B. Dextrin und lösliche Stärke, Rest Melasse, u. dgl. allein oder zu mehreren verwendet werden.

Als assimilierbare Stickstoffquellen eignen sich beispielsweise anorganische Stickstoffverbindungen, z. B. Ammoniumsulfat und Ammoniumnitrat, und organische Stickstoffverbindungen wie Harnstoff. Ferner kann eine geringe Menge anorganischer Salze wie Magnesiumsulfat, Calciumphosphat und Calciumcarbonat zugesetzt werden.

Die Kultivierungstemperatur muß so eingestellt werden, daß die gewünschte Substanz in maximaler Menge angereichert wird. Im allgemeinen liegt die Temperatur im Bereich von 25 bis 45°C.

Die Kultivierung wird so lange durchgeführt, bis die maximale Menge D-Ribose im Kulturmedium angereichert ist. Die zur maximalen Anreicherung von D-Ribose erforderliche Zeit hängt von verschiedenen Faktoren ab, beträgt jedoch gewöhnlich 24 bis 120 Stunden, gerechnet vom Beginn der Kultivierung.

Die Kulturbrühe enthält nach Beendigung der Kultivierung eine große Menge D-Ribose. Da der größere Teil der so gebildeten D-Ribose in der Flüssigphase der Brühe angereichert wird, ist es zweckmäßig, zunächst die Zellen abzutrennen und dann die D-Ribose aus dem Filtrat zu gewinnen. Beispielsweise kann die D-Ribose durch Entsalzen des Filtrats mit einem Ionenaustauschharz und Entfärbung mit eiüer Säule aus Kohlepulver gewonnen werden.

Wenn die Kulturbrühe nach der Kultivierung Kohlehydrate aus dem Ausgangsmaterial neben der gewünschten D-Ribose enthält, können diese Kohlehydrate nach an sich bekannten Methoden entfernt werden, z.B. durch Behandlung der Brühe mit Glucoseoxydase im Falle der Verwendung von Glucose als Ausgangskohlehydrate oder mit Backhefe, die nicht die D-Ribose, sondern nur die Kohlehydrate ausnutzt

Ausführungsformen der Erfindung werden durch die folgenden Beispiele veranschaulicht In diesen Beispielen bedeutet die zur Kennzeichnung der Mikroorganismen gebrauchte Abkürzung IFO »Institute for Fermentation Osaka«. Die Prozentsätze beziehen sich auf Gewicht/Volumen, falls nicht anders angegeben.

Beispiel 1

Die Mutante Bacillus pumilus IFO 12600, die von Bacillus pumilus ATCC 7061 durch Betrahlung mit Ultraviolettlicht und anschließende Anwendung der Penicillintechnik (Experientia 6, 41 [I960]) und der Replica-Plating-Methode (Journal of Bacteriology 63, 399 [1952]) erhalten worden ist, wird zum Impfer von 500 ml eines Mediums verwendet, das 2% lösliche Stärke, 2% Maisquellwasser 03% Dikaliumhydrogenphosphat und 0,1% Kaliumdihydrogenphosphat enthält. Das Medium wird zur Herstellung einer Impfkultur 24 Stunden bei 28°C gehalten. Mit dieser Impfkultur werden 301 eines Mediums geimpft (nachstehend als Medium A bezeichnet), das 12,5% D-Glucose, 2,5% Trockenhefe, 1,5% Ammoniumsulfat, 0,5% sekundäres Calciumphosphat 0,5% tertiäres Calciumphosphat und 1,0% Calciumcarbonat enthält Das Medium wird 66 Stünden unter konstanter Belüftung und Bewegung bei 32° C gehalten. Auf diese Weise werden 28,5 mg D-Ribose pro ml Kulturbrühe gebildet.

Die die D-Ribose enthaltende Kulturbrühe wird durch eine Aktivkohlesäule (15 cm χ 100 cm) geleitet. Der Ablauf wird unter vermindertem Druck auf etwa 5 I eingeengt und nach Zusatz von 10% Backhefe 1 Stunde bei 37°C gehalten. Nach Entfernung der Hefezellen durch Filtration wird das Konzentrat zur Entsalzung durch Schichten von Kationenaustauschharzen und Anionenaustauschharzen geleitet Die ablaufende Flüssigkeit wird auf 11 eingeengt Durch Zusatz von 1 1 Äthylalkohol zu diesem Konzentrat werden 620 g rohe Kristalle von D-Ribose erhalten.

Beispiel 2

Mit der nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise erhaltenen Mutante Bacillus pumilus IFO 12601 werden 500 ml eines Mediums geimpft, das 2% Sorbit, 2% Maisquellwasser, 03% Dikaliumhydrogenphosphat und 0,1% Kaliumdihydrogenphosphat enthält. Das Medium wird 24 Stunden bei 32° C bebrütet wobei eine Impfkultur erhalten wird. Mit der Impfkultur werden dann 301 eines Mediums geimpft das aus dem Medium A und 150y/ml L-Phenylalanin besteht Dieses Medium wird dann unter Belüftung und Bewegung 55 Stunden bei 37° C gehalten. Auf die oben beschriebene Weise werden 30,5 mg D-Ribose pro ml in der Kulturbrühe gebildet Die die D-Ribose enthaltende Brühe wird auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt, wobei 693 g rohe Kristalle von D-Ribose erhalten werden.

Beispiel 3

Mit der nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise erhaltenen Mutante Bacillus pumilus IFO 12602 werden 500 ml eines Mediums geimpft, das die gleiche

ίο Zusammensetzung hat wie das zur Herstellung der Impfkultur gemäß Beispiel 2 verwendete Medium. Das Medium wird zur Herstellung der Impfkultur 24 Stunden unter Schütteln bei 37° C bebrütet

Mit dieser Impfkulitur werden 301 des Mediums A geimpft dem 50y/ml L-Tyrosin zugesetzt worden sind. Das Medium wird 80 Stunden unter Belüftung und Bewegung bei 37° C gehalten. Auf die oben beschriebene Weise werden 29,3 mg D-Ribose pro ml in der Kulturbrühe gebildet Diese Kulturbrühe wird auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt wobei 620 g rohe Kristalle von D-R<bose erhalten werden.

Beispiel 4

Mit der Mutante Bacillus subtilis IFO 12603, die durch Bestrahlung von Bacillus subtilis ATCC 6051 mit Ultraviolettlicht und anschließende Anwendung der Penicillintechnik (Experientia 6, 41 [I960]) und der Replica-Plating-Methode (Journal of Bacteriology 63, 399 [1952]) erhalten worden ist, werden 500 ml eines Mediums geimpft das 2% lösliche Stärke, 2% Tviaisquellwasser, 0,3% Dikaliumhydrogenphosphat und 0,1% Kaliumdihydrogenphosphat enthält Das Medium wird 24 Stunden bei 32°C bebrütet. Mit dieser Impfkultur werden dann 301 eines Mediums geimpft, das 10% lösliche Stärke, 1,5% Trockenhefe, 1,5% Ammoniumsulfat, 0,5% tertiäres Calciumphosphat, 0,5% sekundäres Calciumphosphat und 1,0% Calciumcarbonat enthält. Dieses Medium wird 72 Stunden unter Belüftung und Bewegung bei 32°C gehalten. Auf die oben beschriebene Weise werden 26,5 mg D-Ribose pro ml in der Kulturbrühe gebildet.

Die Küitürbrühe wird zur Entfernung der Zellen mit einem Filterhilfsstoff filtriert. Das Filtrat wird durch eine Säule (20 cm χ 100 cm) von mit Säure vorbehandeltem Kohlepulver geleitet. Die ablaufende Flüssigkeit wird unter vermindertem Druck auf etwa 4,51 eingeengt. Das Konzentrat wird nach Zusatz von 10% Backhefe 1 Stunde bei 37° C gehalten. Nach Entfernung der Hefezellen durch Filtration wird das Konzentrat zur Entsalzung durch aufeinanderfolgende Schichte von Kationenaustauschharzen und Anionenaustauschharzen geleitet. Die ablaufende Flüssigkeit wird unter vermindertem Druck auf 1 I eingeengt. Zum Konzentrat werden 1,5 1 Äthylalkohol gegeben, wobei 558 g rohe Kristalle von D-Ribose erhalten werden.

Beispiel 5

Ein Bacillus subtilis wurde mit Ultraviolettlicht bestrahlt, wobei die Muiante Bacillus subtilis IFO 12604 erhalten wurde. Mit dieser Mutante werden 500 ml des Mediums A geimpft. Das Medium wird dann 20 Stunden bei 30°C bebrütet Mit der erhaltenen Impfkultur werden 301 eines Mediums geimpft, das 10% D-Glucose, 2,0% Trockenhefe, 1,8% Ammoniumsulfat, 0,5% sekundäres Calciumphosphat, 0,5% tertiäres Calciumphosphat, 1,0% Calciumcarbonat und lOOy/ml L-Phenylalanin enthält. Das Medium wird 68 Stunden bei 32°C bebrütet.

Auf diese Weise werden 29,5 mg D-Ribose pro ml in der Kulturbrühe gebildet Die Brühe wird auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt, wobei 615 g rohe Kristalle von D-Ribose gebildet werden. sind, wobei das mittlere Volumen 200 ml pro Flasche betrug. Wie aus der nachstehenden Tabelle hervorgeht, wurde D-Ribose von allen Mutanten produziert.

5 Stämme

Beispiel 6
(nachgereicht)

Isolierung von L-Tyrosin, L-Tryphtophan und L-Phenylalanin zum Wachstum benötigenden Mutanten von Bacillus pumilus ATCC 4510, Bacillus pumilus ATTC 4522, Bacillus subtilis ATCC 9858 und Bacillus subtilis ATCC 9943 unter Verwendung von Nitrosoguanidin als Mutagen.

Ein oder zwei (s. die Tabelle) L-Tyrosin, L-Tryptophan und L-Phenylalanin zum Wachstum benötigende Mutanten wurden aus jedem dieser Ausgangsmikroorganismen unter Verwendung von Nitrosoguanidin als Mutagen hergestellt und nach der im Beispiel 1 angegebenen Technik isoliert Die Zusammensetzung des Mediums und die Bedingungen der Kultur waren dieselben, wie sie in Beispiel 1 verwendet wurden, mit der Ausnahme, daß die Versuche in kleinem Maßstab unter Verwendung von Flaschen durchgeführt worden Bacillus pumilus ATCC 4510 (Ausgangsstamm)

TTP·*) benötigender Mutant-1

TTP benötigender Mutant-2 Bacillus pumilus ATCC 4522 (Ausgangsstamm)

TTP benötigender Mutant Bacillus subtilis ATCC 9858 (Ausgangsstamm)

TTP benötigender Mutant Bacillus subtilis ATCC 9943 (Ausgangsstamm) TTP benötigender Mutant

Produzierte

D-Ribose

mg/ml*)

274 33,4

0 26,3

0 30,2

29,1

\ 5-Tage-Kultur.

I TTP benötigender Mutant bedeutet, daß der Mutant für

sein Wachstum L-Tyrosin, L-Tryptophan und L-Phenylalanin benötigt.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von D-Ribose, dadurch gekennzeichnet, daß man einen D-Ribost bildenden und L-Tyrosin, L-Tryptophan sowie L-Phenylalanin zum Wachstum benötigenden Stamm von Bacillus pumilus oder von Bacillus subtilis in einem Kulturmedium, das L-Tyrosin, L-Tryptophan und L-Phenylalanin in einer Menge von mehr als je etwa 100 y/ml neben assimilierbarem Kohlenstoff und Stickstoff enthält, aerob züchtet, bis D-Ribose darin angereichert ist, und daß man die angereicherte D-Ribose aus dem Kulturmedium gewinnt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Bacillus pumilus IFO 12600, Bacillus pumilus IFO 12601, Bacillus pumilus IFO 12602, Bacillus subtilis IFO 12603 oder Bacillus subtilis IFO 12604 einsetzt.