DE1904265A1

DE1904265A1 - Verfahren zur Herstellung von D-Ribose

Info

Publication number: DE1904265A1
Application number: DE19691904265
Authority: DE
Inventors: Ken-Ichi Sasajima; Masahiko Yoneda
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1968-02-01
Filing date: 1969-01-29
Publication date: 1969-10-02
Also published as: DK119304B; IT947028B; FR2001108A1; NL146879B; MY7500011A; NL6901570A; GB1255254A; DE1904265B2; US3607648A

Description

PATENTANWÄLTE DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHDNWALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL.-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL.-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLOPSCH KDLN 1, DEICHMANNHAUS

Köln, den 23.1.1969 Kl/Ax

Takeda Chemical Industries, Ltd.,

27, Doshomaohi 2-chome, Higashi-ku, Osaka (Japan).

Verfahren zur Herstellung von D-Ribose

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Ribose, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Kulturmedium, das !-Tyrosin, !-Tryptophan und L-Phenylalanin in einer Menge von mehr als je etwa 100 γ/ml neben assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoff quellen, enthält, mit einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus impft, der D-Ribose bildet und !-Tyrosin, L-Tryptophan und !-Phenylalanin zum Wachstum erfordert, das Kulturmedium bebrütet, bis D-Ribose darin angereichert ist, und die so angereicherte D-Ribose aus deia Kulturmedium gewinnt.

D-Ribose ist beispielsweise wichtig als Ausgangsmaterial für die Syntkese von Riboflavinverbindungen und als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Nucleotidwürzen, die kürzlich entwickelt wurden.

Mehrere Verfahren zur Herstellung von D-Ribose unter Verwendung von Mikroorganismen sind bereits bekannt, aber diese Verfahren sind im großtechnischen Maßstab kaum durchführbar, weil bei ihnen nur geringe Mengen D-Ribose erhalten werden.

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Gemäß der Erfindung wird durch Züchtung gewisser Mikroorganismen der Gattung Bacillus D-Ribose in einer bemerkenswert großen Menge im Kulturmedium angereichert, und die hierbei angereicherte D-Ribose läßt sich aus dem Kulturmedium leicht abtrennen. Das Verfahren gemäß der Erfindung ist auf Grund der guten Ausbeute vorteilhaft für die Großherstellung von D-Ribose·

Die Mikroorganismen der Gattung Bacillus (nachstehend einfach als "Mikroorganismus; "bezeichnet) werden von Wildstämmen nach an sich bekannten üblichen Mutationsmethoden erhalten oder von Wildstämmen isoliert. Die Mutation kann vorgenommen werden, indem Wildstämme der Gattung Bacillus einer Behandlung mit beispielsweise Ultraviolettlicht, Röntgenstrahlen, Gammastrahlen und einem Mutagen, wie Nitrosoguanidin, unterworfen werden.

Als Mikroorganismen eignen sieh für die Zwecke der Erfindung beispielsweise die Mutanten von Bacillus pumilus, z.B. Bacillus pumilus Ντ·5Ο3 (Ii¹O 12600), Bazillus pumilus Nr. 537 (IPO 12601), Bacillus pumllas.irr.558 (IPO 12602), und die Mutanten von Bacillus subtilis, z.B. Bacillus subtilis Nr.429 (IPO 12603) und Bacillus subtilis Nr.483 (IPO 12604).

Diese Mikroorganismen können auf G^-und ihrer mikrobiologischen Eigenschaften D-Gluconsäure, L-Arabinose oder D-Ribose nicht als Kohlenstoffqaelle zum Wachstum ausnutzen und benötigen zum Wachstem L-Tyrosin, L-Tryptophan und L-Phenylalanin. Die übrigen mikrobiologischen Eigenschaften sind identisch mit denen,, die in Bergy's Manual of Determinative Bacteriology, 620-622 (1957) beschrieben sind.

Pur die Großherstellung von D-Hibose wird der Mikroorganismus im allgemeinen vorzugsweise in einem flüssigen Kulturmedium gezüchtet. Die Züchtung wird ge-

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wohnlich als Submerskultur unter Belüftung und Bewegung unter Verwendung eines Kulturmediums durchgeführt, das L-Iyrosin, L-Tryptophan und L-Phenylalanin enthalten muß.

L-Tyrosin, L-Iryptophan und L-Phenylalanin können dem Kulturmedium jeweils in der isolierten Form zugesetzt werden, jedoch können auoh natürlich Substanzen, die sie enthalten, z.B. Trockenhefe, Pepton, Fleischextrakt, Gasaminosäure, Maisquellwasser usw. und deren Gginisohe, verwendet werden.

L-Tyrosin, L-Tryptophan und L-Phenylalanin müssen dem Kulturmedium in einer für das Wachstum des Mikroorganismus genügenden Menge zugesetzt werden. Im allgemeinen werden diese Verbindungen dem Kulturmedium so zugesetzt, daß ihre Konzentration mehr als je 100 γ/ml und vorzugsweise weniger als je 5000 γ/ml "beträgt.

Als assimilierbare Kohlenstoffquellen können Verbindungen, wie Monosaccharide, z.B. D-Glucose, D-Fructose, D-Mannose, Sorbit, D-Mannit, Disaccharide, z.B. Saooharose und Maltose, verschiedene Polysaccharide, z.B. Dextrin und lösliche Stärke, Rest-Melasse u.dgl. allein oder zu mehreren verwendet werden.

Als assimilierbare Stickstoffquellen eignen sich beispielsweise anorganische Stickstoffverbindungen, z.B. Ammoniumsulfat und Ammoniumnitrat, und organische Stickstoffverbindungen, wie Harnstoff. Ferner kann eine geringe Menge anorganischer Salze, wie Magnesiumsulfat, Calciumphosphat und Oalciumoarbonat, zugesetzt werden.

Die KuItiwierungstemperatur muß so eingestellt werden, daß die gewünschte Substanz in maximaler Menge angereichert wird. Im allgemeinen liegt die Temperatur im Bereich von 25 bis 45⁰C

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Die Kultivierung wird so lange durchgeführt, bis die maximale Menge D-Ribose im Kulturmedium angereichert ist. Die zur maximalen Anreicherung von D-Ribose erforderliche Zeit hängt von verschiedenen Paktoren ab, beträgt jedoch gewöhnlich 24 bis 120 Stunden, gerechnet vom Beginn der Kultivierung·

Die Kulturbrühe enthält'nach Beendigung der Kultivierung eine große Menge D-Ribose. Da der größere Teil der so gebildeten D-Ribose in der Flüssigphase der Brühe angereichert wird, ist es zweckmäßig, zunächst die Zellen abzutrennen und dann die D-Ribose aus dem Piltrat zu gewinnen. Beispielsweise kann die D-Ribose durch Entsalzen des Filtrats mit einem Ionenaustauschharz und Entfärbung mit einer Säule aus Kohlepulver gewonnen werden·

Wenn die Kulturbrühe nach der Kultivierung Kohlehydrate aus dem Ausgangsmaterial neben der gewünschten D-Ribose enthält, können diese Kohlehydrate nach an sich bekannten Methoden entfernt werden, z.B. durch Behandlung der Brühe mit Gluoöseoxydase im Palle der Verwendung von Glucose als Ausgangskohlehydrate oder mit Backhefe, die nicht die D-Ribose, sondern nur die Kohlehydrate ausnutzt.

Zur Zeit bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden durch die folgenden Beispiele veranschaulicht. In diesen Beispielen bedeutet die zur Kennzeichnung der Mikroorganismen gebrauchte Abkürzung "IPO" "Instiute for Fermentation Osaka". Die Prozentsätze beziehen sich auf Gewicht/Volumen, falls nicht anders angegeben.

Beispiel 1

Der Mutant Nr.503 von Bacillus pumilus (IPO 12600), der von Bacillus pumilus (ATOO Nr.7061) durch Bestrahlung mit ültraviolettlioht und anschließende An-

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wendung der Penicillintechnik (Experientia 66, 41

und der * > —*

(I960))/Replica-Plating-Methode (Journal of Bacteriology 63., 399 (1952)) erhalten worden ist, wird zum Impfen von 500 ml eines Mediums verwendet, das 2$ lösliohe Stärke, 2$ Maisquellwasser, 0,3$ Dikaliumhydrogenphosphat und 0,1$ Kaliumdihydrogenphosphat enthält. Das Medium wird zur Herstellung einer Impfkultur 24 Stunden bei 28⁰C gehalten./dieser Impfkultur werden 30 1 eines Mediums geimpft (nachstehend als Medium A bezeichnet), das 12,5$ Glucose, 2,5$ Trockenhefe, 1,5$ Ammoniumsulfat, 0,5$ sekundäres Caloiumphosphat, 0,5$ tertiäres Calciumphoaphat und 1,0$ Calciumoarbonat enthält. Das Medium wird 66 Stunden unter konstanter Belüftung und Bewegung bei 32⁰C gehalten. Auf diese Weise werden 28,5 mg D-Ribose pro ml Kulturbrühe gebildet.

Die die D-Ribose enthaltende Kulturbrühe wird durch eine Aktivkohlesäule (15 om χ 100 cm) geleitet. Der Ablauf wird unter vermindertem Druck auf etwa 5 1 eingeengt und nach Zusatz von 10$ Backhefe 1 Stunde bei 37⁰C gehalten. Nach Entfernung der Hefezellen durch Filtration wird das Konzentrat zur Entsalzung durch Schiohten von Kationenaustausohharzen (im Handel erhältlich als "Amberlite IR-120")und Anionenaustauschharzen (im Handel erhältlich als "Amberlite IR-A-400") geleitet. Die ablaufende Flüssigkeit wird auf 1 1 eingeengt. Durch Zusatz von 1 1 Äthylalkohol zu diesem Konzentrat werden 620 g rohe Kristalle von D-Ribose erhalten.

Beispiel 2

Mit dem auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise erhaltenen Mutanten Nr.537 von Bacillus pumilus (IFO 12601) werden 500 ml eines Mediums geimpft, das 2$ Sorbit, 2$ Maisquellwasser, 0,3$ Dikaliumhydrogenphosphat und 0,1$ Kaliumdihydrogenphosphat enthält. Das

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Medium wird 24 Stunden "bei 32⁰C bebrütet, wobei eine Impfkultur erhalten wird. Mit der Impfkultur werden dann 30 1 eines Mediums geimpft, das aus dem Medium A und 150 γ/ml !-Phenylalanin "besteht. Dieses Medium wird dann unter Belüftung und Bewegung 55 Stunden hei 37⁰O gehalten. Auf die oben beschriebene Weise werden 30,5 mg D-Ribose pro ml in der Kulturbrühe gebildet. Die die D-Ribose enthaltende Brühe wird auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt, wobei 693 g rohe Kristalle von D-Ribose erhalten werden.

Beispiel 3

Mit dem auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise erhaltenen MutantenNr.558 von Bucillus pumilus (IFO 12602) werden 500 ml eines Mediums geimpft, das die gleiche Zusammensetzung hat wie das zur Herstellung der Impfkultur gemäß Beispiel 2 verwendete Medium. Das Medium wird zur Herstellung der Impfkultur 24 Stunden unter Schütteln bei 37°0 bebrütet.

Mit dieser Impfkultur werden 30 1 des Mediums A geimpft, dem 50 γ/ml L-Syrosin zugesetzt worden sind. Das Medium wird 80 Stunden unter Belüftung und Bewegung bei 37°0 gehalten. Auf die oben beschriebene Weise werden 29»3 mg D-Ribose pro ml in der Kulturbrühe gebildet. Diese Kulturbrühe wird auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt, wobei 620 g rohe Kristalle von D-Ribose erhalten werden.

Beispiel 4

Mit dem Mutanten ITr. 429 von Bacillus subtilis (Ii¹O 126G3), der durch Bestrahlung von Bacillus subtilis (AIOC Nr.6051) mit Ultraviolettlicht und anschließende Anwendung der Penioillintechnik (Experientia 6j5, 41 (1960)) und der Replica-Plating-Methode (Journal of Bacteriology 63,, 399 (1952) erhalten worden ist, werden 500 ml eines Mediums geimpft, das 2fi lösliche Stärke,

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2$ Maisquellwasser, 0,3$ Dikaliumhydrogenphosphat und 0,1$ Kaliumdihydrogenphosphat enthält. Das Medium wird 24 Stunden bei 32⁰C bebrütet. Mit dieser Impfkultur v/erden dann 30 1 eines Mediums geimpft, das 10$ lösliehe Stärke, 1,5$ Trockenhefe, 1,5$ Ammoniumsulfat, 0,5$ tertiäres Oalciumphosphat, 0,5$ sekundäres CaI-ciumphosphat und 1,0$ Calciumoarbonat enthält. Dieses Medium wird 72 Stunden unter Belüftung und Bewegung bei 32⁰C gehalten. Auf die oben beschriebene Weise werden 26,5 mg D-Ribose pro ml in der Kulturbrühe gebildet.

Die Kultur brühe wird zur Entfernung der Zellen mit einem Filterhilfsstoff filtriert. Das FiItrat wird durch eine Säule (20 cm χ 100 om) von mit Säure vorbehandeltem Kohlepulver geleitet. Die ablaufende Flüssigkeit wird unter vermindertem Druck auf etwa 4-,5 1 eingeengt. Das Konzentrat wird nach Zusatz von 10$ Backhefe 1 Stunde bei 37⁰C gehalten. Nach Entfernung der Hefezellen duroh Filtration wird das Konzentrat zur Entsalzung durch aufeinanderfolgende Schichten von Kationenaustausohharzen (im Handel unter der Bezeichnung "Amberlite IR-120" erhältlich) und Anionenaustauschharzen (im Handel unter der Bezeichnung "Amberlite IR-A-400" erhältlich) geleitet. Die ablaufende Flüssigkeit wird unter vermindertem Druok auf 1 1 eingeengt. Zum Konzentrat werden 1,5 1 Äthylalkohol gegeben, wobei 558 g rohe Kristalle von D-Ribose erhalten werden.

Beispiel 5

Bacillus subtilis wird mit Ultraviolettlicht bestrahlt, wobei der Mutant 483 von Bacillus subtilis (IFO 12604) erhalten wird. Mit diesem Mutanten werden 500 ml des Mediums A geimpft. Das Medium wird dann 20 Stunden bei 30⁰C bebrütet. Mit der erhaltenen Impfkultur werden 30 1 eines Mediums geimpft, das 10$ D-Gluoose, 2,0$

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Trookenhefe, 1,856 Ammoniumsulfat, 0,5$ Calciumphosphat, 1,0j6 Oalciumcarbonat und 100 γ/ml L-Phenylalanin enthält. Das Medium wird 68 Stunden bei 32°0 bebrütet. Auf diese Weise werden 29,5 mg D-Ribose pro ml in der Kttlturbrühe gebildet. Die Brühe wird auf die in Beispiel t beschriebene Weise behandelt, wobei 615 g rohe Kristalle von D-Ribose gebildet werden.

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Claims

F a t e η t a η a ρ r ü ehe

1) Verfahren zur Herstellung von D-Ribose, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kulturmedium, das L-Tyrosin» L-Tryptophan und L-Phenylalanin in einer Menge von mehr als ^e etwa 100 γ/ml neben assimilierbarem Kohlenstoff und Stiefestoff enthält, mit einem D-Ribose bildenden Mikroorganismus der Gattung Bacillus impft» der L-Tyrosin, L-Tryptophan und L-Phenylalanin zum Wachstum benötigt, das Kulturmedium bebrütet, bis B-Ribose darin angereichert ist, und die angereicherte D-Ribose aus dem Kulturmedium gewinnt.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dal L-Tyrosin, L-Tryptophan und L-Phenylalanin in Mengen von weniger als 5000 γ/ml im Kulturmedium enthalten sind.

Ji) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, ua& der Mikroorganismus im Kulturmedium bei Temperaturen von etwa 25 bis 45°C unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird.

%) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Bacillus pumillus verwendet.

5} Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Bacillus pumilus Nr. 503 (IPO 12600) verwendet *

6) Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Bacillus pumilus Nr. 537 (IFO 12601) verwendet.

.7) Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Bacillus pumilus Nr. 558 (IPO 12602> verwendet.

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8) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Bacillus subtilis einsetzt.

9) Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Bacillus subtilis Hr. 429 (IS¹O 12603) einsetzt.

10) Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Bacillus subtilis Kr. 485 (ISO 126o4) einsetzt.

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