DE3027380A1 - Herstellung eines cephalosporins durch fermentierung - Google Patents
Herstellung eines cephalosporins durch fermentierungInfo
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Description
PATENTANWÄLTE
J. REITSTÖTTER
W. BUNTE (1958-1976)
DR. ING.
DR. ING.
W. KINZEBACH
K. P. HÖLLER
TBLKFONl (089) 87 6083 TELBXl B21S2O8 ISAR D
BAUBRSTRASSB 22, 80OO MÜNCHEN 40
München, den M/21 174 1980
GLAXO GROUP LIMITED Clarges House,
6-12, Clarges Street London W1Y 8DH (Großbritannxen)
Herstellung eines Cephalosporins durch Fermentierung
POSTANSCHRIFT! POSTFACH 780, D-8000 MÖNCHEN
030065/0941
Die Erfindung betrifft die Herstellung eines Cephalosporins durch Fermentierung.
Cephalosporin C Fermentierungen sind eine Hauptquelle für Cephalosporin-Kernstücke, welche in großen Mengen zur Herstellung
einer Vielzahl von semi-synthetischen Cephalosporin-Antibiotika verwendet werden. Derartige Fermentierungen erfolgen
im allgemeinen während einiger Tage und es wurde beobachtet, daß aufgrund der Tatsache, daß Cephalosporin C
selbst in wäßriger Lösung durch ß-Lactam-Hydrolyse einem nichtenzymatischen
Abbau unterliegt, bei einem typischen industriellen Fermentierungsverfahren
etwa 25 % des festgestellten Cephalosporin C Gehaltes aufgrund von nicht-enzymatischem Abbau verlorengehen.
Es wurde auch allgemein beobachtet, daß etwa 15 % des während der Fermentierung hergestellten Cephalosporin-Kernstückes
als Desacteyl-Cephalosporin C vorliegen. Wenngleich diese Verbindung ebenfalls als Ausgangsmaterial für das
Cephalosporin-Kernstück brauchbar ist, ist es im allgemeinen umständlich und unwirtschaftlich, die Menge an Desacetyl-Cephalosporin
C, die sich gebildet hat zu isolieren, da die notwendigen Verfahrenstechniken verschieden und sehr
aufwendig sind. So stellen auch die 15 % des Cephalosporin-Kernstückes,
die als Desacetyl-Cephalosporin C vorliegen, einen Verlust dar, so daß im allgemeinen etwa 40 %
des hergestellten Cephalosporin-Kernstückes nicht zur Extraktion als Cephalosporin C zur Verfügung stehen.
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Es wurde nun überraschend gefunden, daß entgegen früheren Berichten (Konecny et al., J. Antib., Vol. XXVI, Nr. 3, S. 140)
Desacetyl-Cephalosporin C bezüglich des nicht-enzymatischen ß-Lactam-Abbaus ii Kulturbrühe sehr viel stabiler ist als
Cephalosporin C. Es wurde überraschenderweise kein Abbau von Desacetyl-Cephalosporin C in wäßrigen Lösungen und Kulturbrühen
unter Fermentierungsbedingungen festgestellt, auch nicht mit empfindlichen Meßverfahren.
Aufgrund dieser Tatsache wurde nun ein Verfahren entwickelt, bei dem Cephalosporin C unmittelbar nach der Bildung während der
Fermentierung in Desacetyl-Cephalosporin C umgewandelt wird. Ein solches Verfahren hat zweierlei Vorteile. Erstens tritt
praktisch kein Verlust an Cephalosporin Produkt aufgrund von Abbau auf, da das Desacetyl-Cephalosporin C überraschend
stabil ist, und zweitens kann das Desacetyl-Cephalosporin C, aas bei herkömmlichen Fermentierungen erhalten wird, ebenfalls
gewonnen werden. Es wurde somit gefunden, daß eine erhebliche Zunahme der Cephalosporin-Produktausbeuten erreicht wird.
Diese Zunahme beträgt typischerweise etwa 40 %, kann jedoch, abhängig vom Desacetyl-Cephalosporin C-Gehalt der normalen
Cephalosporin C-Fermentierung und der Kinektik der !
Cephalosporin C-Akkumulierung, variieren. !
Darüberhinaus wurde gefunden, daß Desacetyl Cephalosporin C weiter akkumuliert, wenn die Fermentierung langer als !
bei der Cephalosporin C-Hersfcellung üblich, fortgeführt ■
wird. Im allgemeinen läßt die Akkumulierung von Cephalosporin C nach etwa sechs Tagen Fermentierungs zeit nach, was die Standard-jfermentierungszeit
darstellt. Es wurde jedoch gefunden, daß I bis zu weiteren 50 % verwertbares Cephalosporin-Kernstück j
erhalten werden können, wenn die Fermentierungszeit in Gegen- j
wart von Acetylesterase um beispielsweise 2 Tage oder etwa ein Drittel der Zeit verlängert wird. So kann, wenn die
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ORIGINAL INSPECTED
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Ferm-ntierung verlängert wird, die Gesamtausbeute an verwertbarem
Cephalosporin-Kernstück durch absichtliche Herstellung von Desacetyl-Cephalosporin C bis zu 90 % größer
sein als bei einer normalen Cephalosporin C Fermentierung.
Dies ist somit eine beträchtliche Zunahme der Ausbeute an verwertbarem Cephalosporin-Kernstück, die einen bedeutenden
wirtschaftlichen Wert darstellt. Darüberhinaus können die Grenzen, welche durch die Instabilität des Cepaholsporins
C für die Herstellung und die Ausbeuten an Cephalosporin-Kernstück durch Fermentierung gesetzt sind, weitgehend
abgebaut νerden.
Desacetyl-Cephalosporin C kann leicht in pharmakologisch
wertvolle Derivate, wie Cephalothin und Cephaloridin überführt werden.
Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung von Desacety!cephalosporin C, bei dem ein Cephalosporin C
produzierender Mikroorganismus in Gegenwart von so viel Acetylesteraseenzym fermentiert wird, daß praktisch das
gesamte hergestellte Cephalosporin C in Desacetyl-Cephalosporin C überführt wird, bevor ein nicht-enzymatischer Abbau des
Cephalosporin C stattfindet.
Die Acetyl-Esterase kann entweder gleich bei Beginn der j Fermentierung oder wenn die Cephalosporin C-Wachstumsphase
beginnt, oder wahlweise in Intervallen während der Fermentierung zugesetzt werden.Alternativ kann die Acetyl-Esterase während
des gesamten Fermentierungsverfahrens in situ entwickelt werden.
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Das Esterase-Enzym kann aus einer großen Vielzahl von Quellen stammen. So kann die Esterase unter anderem von höheren
Pflanzen, Bakterien, Hefen und Fungi stammen. Zu geeigneten höheren Pflanzen gehören die Schalen von Citrusfruchten, wie
in der Britischen Patentschrift 966,222 beschrieben, und Weizenkeime, wie in der Britischen Patentschrift
1 121 308 beschrieben. Letztere Patentschrift beschreibt auch geeignete Acetylesterase-Aktivität bei dem Bakterium genus
Rhizobium. Geeignete Hefen sind die vom Genus Rhodotorula,
wie sie in der britischen Patentschrift 1 474 519 der Anmelderin beschrieben sind. Mikroorganismen der Klasse
Basidiomycetes, wie in der britischen Patentschrift 1 531 der Anmelderin beschrieben und Bakterien der Species B. subtilis,
wie in App. Microbiol. Vol. 30, Nr. 3, S. 413 beschrieben, sind ebenfalls geeignete Ausgangsstoffe. Ein Ausgangsmaterial
für das Enzym, welches sich als besonders geeignet erwiesen hat, sind die Mikroben Genus Rhodosporidium, insbesondere :
die Species Rhodosporidium toruloides, beispielsweise Stamm CBS 349, wie in der oben erwähnten Patentschrift 1 531 212
der Anmelderin beschrieben.
Geeignete Auswahlverfahren zur Bestimmung brauchbarer
Esterase-Grundstoffe, sind in der Britischen Patentschaft 1 531 121 der Anmelderin beschrieben. Wenngleich dort die
Beschreibung des Verfahrens sich im allgemeinen auf die Bestimmung der Esterasespiegel bezieht, die durch Mikro- ;
Organismen der Klasse Basidiomycetes erhalten werden, kann ' das Verfahren leicht zur Bestimmung von Esterasen abgewandelt j
werden, die aus anderen Grundstoffen durch geeignete Wahl der Verfährensbedingungen erhalten werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise durch
Kultivierung eines bekannten Cephalosporin C produzierenden Stammes in Gegenwart des Acetylesterase-Enzyms unter aeroben
Bedingungen, bevorzugt in Submerskultur unter Schütteln
oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff, durchgeführt. Das verwendete Fermentierungsmedium sollte eine assimilierbare
Kohlenstoffquelle, eine verwertbare Stickstoffquelle und,
falls gewünscht, wachstumsfördernde Substanzen sowie anorganische Salze enthalten.
Geeignete Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose,
Sucrose, Stärke, lösliche Stärke, η-Paraffine, pflanzliche und tierische öle, Essigsäure, Methanol, Glycerin, Sorbit
und Äthanol.
Geeignete Stickstoffquellen sind beispielsweise natürliche, '■
Stickstoff-enthaltende Substanzen oder Materialien, die j daraus hergestellt sind, wie Fleischextrakte, Pepton,
Casein, Maisquellwasser, Hefeextrakte, Sojabohnenmehl, Trypton, Baumwollsamenmehl und Weizenkleie. Es
können auch Stickstoff enthaltende organische oder anorganische Verbindungen verwendet werden, beispielsweise Harnstoff,
Nitrate und Ammoniumsalze, wie Ammoniumacetat, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat und Ammoniumphosphat.
Anorganische Salze, die in dem Fermentattionsmedium verwendet ; werden können, sind beispielsweise Kalium-, Magnesium- und |
CaIcium-Sulfate, -Nitrate, -Chloride, -Carbonate und -Phosphate.'
Wachstumsfördernde Substanzen, die verwendet werden können j
sind beispielsweise Cystein, Cystin, Thiosulfat, Methyloleat und insbesondere Methionin, sowie auch Spurenelemente wie '<
Eisen, Zink, Kupfer und Mangan.
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Die Kulturbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert und Fermentationszeit werden so gewählt, daß der verwendete Stamm eine
maximale Menge des gewünschten Cephalosporins bilden kann. Vorteilhafterweise erfolgt die Fermentierung in 'einem Temperaturbereich
von 15 bis 45 0C, vorzugsweise bei etwa 25 0C, bei
einem pH von 4 bis 9, beispielsweise von 5 bis 8, und vorzugsweise etwa 6, während einer Zeit von 1 bis 20 Tagen,
vorzugsweise während 4 bis 10 Tagen.
Der bevorzugteste Cephalosporin C bildende Stamm ist ein Stamm vom Acremonium chrysogenum (früher Cephalosporium
acremonium genannt). Es wurde auch gefunden, daß einige Mutanten von Acremonium chrysogenum große Mengen an Acetylesterase
in situ während der gesamten Fermentierung bilden können. Auch andere Stämme vom Genus Cephalosporium,
beispielsweise Stämme von Cephalosporium polyaleurum, und einige Mikroorganismen des Genus Emericellopsis und Streptomyces,
beispielsweise Stämme von Emericellopsis glabra, Emericellopsis microspora und Streptomyces lactamdurans können
Cephalosporin C bilden.
Die Menge an Esterase oder Esterase-enthaltendem Material, !
die notwendig ist,' um das bei der Fermentierung gebildete '
Cephalosporin C in Desacetyl-Cephalosporin C zu überführen, kann durch vorheriges Bestimmen der Enzymaktivität oder ;
durch Probeversuche in kleinem Maßstab leicht bestimmt werden und ist abhängig von der Esterase und den verwendeten ,
Reaktionsbedingungen. Den Verlauf der Reaktion überwacht man am besten mit Hilfe von HPLC oder durch Abtrennen mit' '
Dünnschicht- oder Papier-Chromatographie, unter Verwendung ι einer geeigneten Träger-Lösungsmittelsystem-Kombination
und durch densitometrische Bestimmung. Brauchbare Verfahren !
sind in der Britischen Patentschrift 1 531 212 der Anmelderin, j
auf die bereits oben Bezug genommerfwurde, beschrieben. Im ί
allgemeinen ist es angebracht, einen wesentlichen Überschuß [
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an Esterase zu verwenden.
Das zur Isolierung des Desacetyl-Cephalosporin C Produktes verwendete Verfahren verläuft im allgemeinen wie üblich,
beispielweise wie es in der Britischen Patentschrift 1 433 beschrieben ist. Nach Zentrifugieren oder Filtrieren der
Fermentationsbrühe, z.B. durch ein Kieselgur-Bett, kann die Isolierung erfolgen, beispielsweise indem man die Lösung
durch Adsorption an Aktivkohle entsalzt und anschließend mit Aceton und Wasser eluiert. Das Eluat kann dann noch weiter
gereinigt werden, indem man es an einem Anionenaustauscherharz,
(z.B. Amberlite IRA-68 in Acetatform) absorbiert, das Desacetyl-Cephalosporin mit Kaliumacetatlösung aus dem
Harz eluiert und das Produkt mit Aceton ausfällt.
Im allgemeinen liegt die Esterase in einer Form vor, die leicht in der Fermentierungsbrühe zur Hydrolyse des
Cephaolsporins C verteilt werden kann. Wenn die Esterase von
einem anderen Mikroorganismus stammt, kann eine Probe der gesamten Kultur oder der abgetrennten Zellen verwendet werden,
vorzugsweise nach einer Behandlung die die Zellen nicht-lebensfähig macht, und, falls gewünscht, nach Zerstören der Zellen,
z.B. durch herkömmliche Methoden, wie Ultraschallbehandlung, Behandlung mit Iytischen Enzymen oder mit Detergentien.
Andere Zellpräparationen, bei denen während der Lagerung die ι
Esteraseaktivität erhalten bleibt, können ebenfalls verwendet werden, beispielsweise acetongetrocknete Pulver oder
mit Aceton behandelte Zellen.
Die mikrobielle Esterase kann auch in zellfreier Form verwendet
werden. So kann man ein Filtrat oder die überstehende Flüssigkeit von der Kultur verwenden. Falls gewünscht, können j
die Zellen vor dem Filtrieren oder Zentrifugier.en,beispielsweise
wie oben beschrieben, zerstört werden. Alternativ kann die zellfreie Esterase auf herkömmliche Weise weiter gereinigt
werden. Zu den Verfahrenstechniken, die angewendet werden
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können, gehört die Ausfällung des Enzyms, z. B. mit Salz oder mit organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, die Chromatographie,
z.B. an Ionenaustauscher-Harzen oder an Trägermaterialien mit einer speziellen Affinität für das Enzym, und Entsalzen,
z.B. GeIfiltrierung oder Dialyse. Die zellfreie Esterase kann als Lösung, als Niederschlag oder als geeignetes
immobilisiertes Präparat verwendet werden.
Wenn die Esterase von einer höheren Pflanze stammt, ist es wünschensert, einen enzym-haltigen Extrakt der Pflanze zu
verwenden. Ein solcher Extrakt kann auf herkömmliche Weise hergestellt werden, wobei man im-allgemeinen das Enzym aus
der Pflanze durch physikalische Verfahrensweisen, wie Mahlen oder Pressen, freisetzt, wie es in der Britischen Patentschrift
966 222 beschrieben ist, oder mittels chemischer Verfahren, beispielsweise durch Behandeln der Pflanze mit
einem Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel, wie Petroläther, wie es wiederum in der Britischen Patentschrift 1 121 308
beschrieben ist. Das erhaltene Präparat kann dann mit oder ohne Entfernung von Zellrückständen direkt der Hydrolyse-Lösung
zugesetzt werden. Alternativ kann man, falls gewünscht, das Präparat weiter behandeln, beispielsweise unter Anwendung j
der oben für die mikrobiellen Enzyme beschriebenen Verfahrens- j weisen, wobei man dann eine zellfreie Esterase erhält, die j
dann, wie für die mikrobiellen Enzyme beschrieben, verwendet | werden kann. I
Selbstverständlich wird bei den oben beschriebenen Formen j
der Acetylesterase das Enzym der Fermentierungs- „ :
brühe zugesetzt. Nach einem Alternativverfahren ist es jedoch auch möglich, das Enzym in situ zu entwickeln,
indem man eine Mischkultur* der Cephalosporin produzierenden Organismen und einem der weiter oben beschriebenen
Esterase produzierenden Origanismus verwendet. Alternativ können auch Mikroorganismen, beispielsweise Mutanten von
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Acremonium chrysogenum, welche zusätzlich zu Cephalosporin C
während der gesamten Fermentierung hohe Esterasespiegel produzieren, verwendet werden. Solche Mikroorganismen
sind noch nicht bekannt und bilden somit einen weiteren Gegenstand der Erfindung.
Solche Mutanten von Acremonium chrysogenum können nach einer Vielzahl von Verfahren hergestellt werden, einschließlich
den Verfahrenstechniken, wie sie in "Techniques for the Development of Micro-Organisms" von H.I. Adler, in
"Radiation and Radioisotopes for Industrial Microorganisms", Proceedings of the Symposium, Wien, 1973, S. 241, International
Atomic Energy Authority, beschrieben sind. Bei derartigen Verfahren verwendet man:
i) Ionisierende Strahlung, z.B. Röntgen- und γ-Strahlung,
UV-Licht, UV-Licht in Anwesenheit eines photosensibilisierenden Mittels, beispielsweise 8-Methoxypsoralen; Stickstoffoxyd,
Hydroxylamin; Pyrimidinbasen-Analoga, z.B. 5-Bromuracil;
Acridine; Alkylierungsmittel, z.B. Äthylmethansulfonat
oder Senfgas; Wasserstoffperoxid; Phenolen; Formaldehyd; Hitze, und
ii) genetische Techniken, wie Rekombination, Transduktion, Transformation, Lysogenisation, Lysogene Konversion
und Selektiv- Techniken für spontane Mutanten.
Es wurde gefunden, daß die Verwendung von UV-Licht geeignet ist.
Die Anwesenheit eines Mutanten, gemäß dieser Ausführungsform
der Erfindung, kann unter Verwendung geeigneter Screeningverfahren
festgestellt werden. So werden in einem ersten Verfahren Mutanten, welche während des gesamten Fermentierungsverfahrens
wesentliche Mengen DAC und sehr wenig Cephalosporin C produzieren mittels Standard-Testverfahren bestimmt.
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In einem zweiten Verfahren werden Mutanten, welche die Deacetylierung von zugesetztem Cephalosporin C bewirken,
ebenfalls mittels Standard-Testmethoden identifiziert. Mutanten gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung sind
diejenigen, welche beiden Testverfahren genügen.
Die Erfindung wird nun noch detaillierter anhand der folgenden Beispiele beschrieben, die jedoch nicht einschränkend
sein sollen. Alle Temperaturen sind in C angegeben.
Der Stamm IMI 237183 wurde beim Commonwealth Mycological Institute, Kew, England, am 9. April 1979 hinterlegt.
Stämmme dieses Typs sind unter anderem in "Cephalosporiumartige Schimmelpilze (Hyphomycetes)" von Walter Gams (Verlag,
Westdeutschland) 1971, S. 109-111 beschrieben.
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(a) Herstellungvon Acetylesterase
Rhodosporidium toruloides CBS 349 kultiviert man in 2 1-Kolben auf einem flüssigen Medium, welches Glucose (2 %),
Hefe-Extrakt (1 %) , Pep'ton (1 %) , Kaliumdihydrogenphosphat
(0,5 %) und Polypropylenglycol (0,1 %) enthält, während 72 Stunden. Eine 100 ml Suspension der Hefe
gibt man dann in einen sterilen Kolben und kühlt auf 4 0C. Dazu gibt man 30 ml Aceton, das zuvor auf -10 0C
gekühlt worden war. Nachdem man kurz gerührt hat, gibt man weitere Volumenteile kaltes Aceton nacheinander zu,
um die Acetonkonzentration stufenweise auf 75 % (V/V) zu erhöhen. Man läßt die Hefezellen sich absetzen, dekantiert
und gibt frisches, sauberes Aceton zu. Nachdem man gründlich gemischt hat, dekantiert man das überschüssige
Aceton und wäscht die behandelten Zellen zweimal durch Zentrifugieren in sterilem Wasser. Die gewaschenen
Zellen nimmt man erneut in eine Suspesnion in sterilem Wasser auf, wobei man ein Suspension mit einer Esteraseaktivität
von 3,5 iu/ml erhält.
(b) Fermentierung von Desacetylcephalosporin C (DAC)
Die Fermentierung erfolgt in Schüttelkolben, welche 9,5 ml Medium der nachstehend angegebenen Zusammensetzung
enthalten, denen man dann 0,4 ml der unter (a) hergestellten
Esterasesuspension nach der Autoklaven-Behandlung zusetzt:
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Maisquellwasser
Lactose
Glucose
Methionin
Phenylacetyläthanolamin
Calciumcarbonat
Harnstoff
Ammoniumsulfat
Maisöl
pH (vor der Autoklavenbehandlung mit NaOH eingestellt)
0,5 % als Stickstoff g/l 2 g/l
2.3 g/l 1,5 g/l
16 g/l 0,8 g/l
3.4 g/l
6 Tropfen pro Kolben
6,6
Man inokuliert die Kolben mit A. chrysogenum Stamm IMI 237183 (0,5 ml) der zuvor 48 Stunden lang .in einem Medium
kultiviert worden war, das Maisquellwasser (0,1 % als Stickstoff), Ammoniumacetat (5,5 g/l), Sucrose(25 g/l)
und Calciumcarbonat (10 g/l) enthält.Man inkubiert die Kolben 5 Tage lang bei 25 auf einem Schüttler und bestimmt
den DAC-Gehalt durch HPLC. Tabelle I zeigt den Gehalt an DAC nach 3, 4 und 5 Tagen; Jede Zahl bedeutet
das Mittel aus drei individuell getesteten Kolben. Zur Kontrolle wurden Kolben, welche Medium und Mikron
Organismen, aber keine Esterase enthielten, gleichzeitig getestet.
Zeit (Tage)
DAC (μg/ml) Esterase· -.vorhanden
DAC keine Esterase
3 4 5
352 1732 2615
89 137 478
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Inokulum-Entwicklung
Eine gefriergetrocknete Ampulle A. chrysogenum IMI 237183 wird unter Verwendung von 2 ml flüssigem Sabouraud-Medium
rekonstituiert. Die erhaltene Zellsuspension verwendet man, um einen 250 ml Kolben mit abgeflachter Seite (Blake bottle),
der verfestigtes Sabouraud1sches Medium enthält, zu inokulieren.
Man inkubiert die Kultur 14 Tage lang bei 25 0C.
Sabouraud1sches Medium
Maltose 4,0 % Gew./Vol.
Malzextrakt 2,4 %
Pepton 1,0%
Agar 2,5 %
mit Wasser auf 100 % auffüllen,
Der pH wird vor der Sterilisation auf 7,5 eingestellt.
Nach beendeter Inkubation werden etwa 50 ml steriles Wasser und Glasperlen zugegeben, um die Oberflächenkultur abzuwaschen.
Die suspendierten Zellen verwendet man dann um einen 500 ml Kolben mit abgeflachter Seite (Roux Kolben) zu inokulieren,
der verfestigtes Sabouraud1sches Medium enthält. Für jeden
der Kolben verwendet man dann etwa 4 ml Suspension und inkubiert dann 12 Tage bei 25 0C.
Man stellt eine Zellsuspension her, indem man die Oberflächenkultur
mit 40 ml sterilem Wasser und Glasperlen abwäscht. Diese Suspension verwendet man zum Inokulieren der flüssigen
Saatansätze in 2 Liter Kolben mit flachem Boden und Wandvorsprüngen,
die 600 ml Pepton/Malzextrakt-Medium enthalten.
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M/21 174
Pepton/Malzextrakt-Medium
Pepton 1,0 % Gew./Vol.
Malzextrakt 2,4 %
Yeatex Granulat 2,68 %
Kalk 0,5 %
Sojabohnenöl 1,96 %
mit Wasser auf 100 % auffüllen.
Der pH wird vor dem Sterilisieren auf 7,5 eingestellt.
Die flüssigen Saatansätze werden jeweils mit 6 ml Zellsuspension aus dem Roux-Kolben inokuliert und dann bei 25 0C
auf einer Schüttelvorrichtung mit einem Ausschlag von 4,9 cm bei 110 U/min. 72 Stunden lang inkubiert. Man sammelt zwei
"flüssige Saatkulturen, um ein Inokulum für die Haupt-Fermentierungsstufe zu schaffen.
Es werden zwei Fermentierungsvorgänge, jeweils in einem
7-Liter-Kolben durchgeführt, wobei man bei 25 0C rührt und
das Fermentierungsmedium nach Beispiel 1 (b) verwendet, jedoch mit der Ausnahme, daß Maisöl in einem Anteil von
3,0 % Vol/Vol enthalten ist. Der pH wird auf 6,0 +_ 0,1 eingestellt,
wobei man 1 M Schwefelsäure und 8 M Ammoniumhydroxyd verwendet. Während der gesamten Fermentierung
wurde eine mehr als 30 %-ige Sättigung an gelöstem Sauerstoff aufrechterhalten. Ein Zusatz von 24 %-iger Ammoniumsulfatlösung
wurde bei einem Teil der Fermentierung verwendet, um den Gehalt an freiem Ammoniak höher als 500 ppm zu halten.
Wenn die eingesetzten Kohlenstoffvorräte nach etwa 72 Stunden verbraucht waren, wurde während der restlichen Fermentierungszeit
ein Glucosezusatz zugegeben, um die Atmungsrate aufrechtzuerhalten. Dies waren etwa 15 ml/h 55 %-ige Cerelose
(Glucosemonohydrat).
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Um den Vorteil einer Fermentierung unter Herstellung von
Desacetyl-Cephalosporin C (DAC) zu veranschaulichen, wurde Acetylesterase von Rhodosporidium toruloides CBS 3 49
(wie in Beispiel 1 a hergestellt) zu einer der Fermentierungen beim Beginn der Cephalosporin-Akkumulierungsphase (48 Std.)
zugegeben. Es wurde eine Menge äquivalent 400 ml Hefebrühe zugesetzt.
Die Fermentierung dauerte 8 Tage, wobei täglich Proben entnommen und auf Cepahlosporin C und DAC unter Verwendung von
HPLC-Assays untersucht wurden.
Ein Vergleich zwischen der Vergleichsfermentierung, bei
der Cepahlosporin C hergestellt wurde und der mit Esterase behandelten Fermentierung zur Erzeugung von DAC ist in
Tabelle III zusammengefaßt.
Zeit Kontrolle Esterase-behandelt
Std. Ceph C ug/g DAC μg/g Ceph c μg/g DAC μg/g
| 45 | 400 | 50 | 500 | 1 | 0 |
| 69 | 1 800 | 120 | 200 | 2 | 500 |
| 93 | 1 800 | 160 | 0 | 3 | 200 |
| 117 | 2 700 | 320 | 0 | 3 | 000 |
| 141 | 2 500 | 430 | 0 | 3 | 300 |
| 165 | 2 600 | 610 | 0 | 3 | 500 |
| 189 | 2 300 | 720 | 0 | 900 | |
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M/21 174 l
Tabelle IV zeigt die DAC Gehaltenach 141 und 189 Stunden,
ausgedrückt in Äquivalenten Cephaosporin C
Zeit Kontrolle Esterase-behandelt % Zunahme an Std. Ceph C (ug/g) DAC (in Ceph C Äquiv.) ^beUte fÜr
141 2 500 3 663 47 %
189 2 300 4 329 88 %
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Claims (16)
1. Verfahren zur Herstellung von Desacetyl-Cephalosporin C, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Cephalosporin C
produzierenden Mikroorganismus in Anwesenheit von soviel Acetylesterase-Enzym fermentiert, daß praktisch das
gesamte erzeugte Cephalosporin C in Desacetyl-Cephalosporin C überführt wird, bevor der nicht-enzymatische Abbau
des Cephalosporin C stattfindet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentierung bei 15 bis 45 C und
4 bis 9 während 1 bis 20 Tagen erfolgt.
die Fermentierung bei 15 bis 45 C und einem pH-Wert von
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentierung bsi etwa 25 °C und einem pH On 5 bis 8
während 4 bis 10 Tagen erfolgt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Cephalosporin C produzierender
Mikroorganismus ein Stamm der Species Acremonium chrysogenum verwendet wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß als Cephalosporin C produzierender Mikroorganismus ein Stamm, ausgewählt unter den Arten
Cephalosporium, Emericellopsis oder Streptomyces verwendet
wird.
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6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß
als Hikroorganismus ein Stamm, ausgewählt unter den Species Cephalosporium polyaleurum, Emericellopsis glabra,
Emericellopsis microspora und Streptomyces lactamdurans
verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Überschuß des Acctylesterase-Enzyms
zugibt bevor sich das Cephalosporin C bildet.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Acetylesterase-Enzym von einer
höheren Pflanze, Bakterien, Hefe oder Fungi stammt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch
gekennzeichnet, daß die Acetylesterase von der Bakterienart Rhizobium, der Hefenart Rhodotorula oder der Klasse
Basidomycetes oder der Species B. subtilis stammt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch
gekennzeichnet, daß die Acetylesterase von der Species Rhodosporidium toruloides stammt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Acetylesterase von Rhodosporidium ι
toruloides, Stamm CBS 349 stammt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch
gekennzeichnet, daß die Esterase in Form eines zellfreien Präparates verwendet wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Acetylesterase in situ durch :
Fermentierung des Esterase-produzierenden Mikroorganismus ·
gebildet wird. ■'
030065/0941
M/21 174 - 3 -
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Acetylesterase in situ
durch den Cephalosporin C produzierenden Mirkoorganismus während der Fermentierung gebildet wird.
15. Cephalosporin C produzierender Mikroorganismus der
bei der Fermentierung eine solche Menge Acetylesterase erzeugt, daß im wesentlichen das gesamte erzeugte
Cephalosporin C in Desacetyl-Cephalosporin C umgewandelt werden kann, bevor der nicht-enzymatische Abbau des
Cepahlosporin C auftritt.
16. Mikroorganismus nach Anspruch 15 in Form eines Mutanten
von Acremonium chrysogenum.
• 030065/0941
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