KR100446108B1 - 세팔로스포린c생산미생물및이를이용한세팔로스포린c의제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세팔로스포리움 아크레모니움(Cephalosporium acremonium; KFCC- 10782)의 변이주로서 친주에 비해 높은 리파아제 활성을 가지며 이에 따라 오일 이용효율이 높아서 세팔로스포린 C를 고농도로 생산할 수 있는 미생물 및 이 변이주를 이용하여 세팔로스포린 C를 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

세팔로스포린 Ｃ 생산 미생물 및 이를 이용한 세팔로스포린 Ｃ 의 제조방법
본 발명은 세팔로스포리움 아크레모니움(Cephalosporium acremonium; KFCC- 10782)의 변이주로서 친주에 비해 높은 리파아제 활성을 가지며 오일 이용효율이 높아서 세팔로스포린 C를 고농도로 생산할 수 있는 미생물 및 이 변이주를 이용하여 세팔로스포린 C를 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 세팔로스포린 C 생산균주를 사용하여 세팔로스포린 C를 생산하는 경우에 배지성분중에 오일을 첨가하면 첨가하지 않은 경우에 비해 세팔로스포린의 생산량이 증가하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 배지중의 오일을 일정량 이상으로 증가시키면 오히려 세팔로스포린 C 생산이 감소하는 경향을 보이는데, 이는 오일을 탄소원으로 이용하기 위해 지방산 단위로 분해하는 효소인 리파아제의 오일 분해 능력에 한계가 있기 때문인 것으로 생각되었다. 따라서 오일 이용에 필수적인 효소인 리파아제의 활성이 증가된 균주를 얻을 수 있다면 세팔로스포린 C에 대한 생산능력 역시 향상될 수 있을 것으로 기대되었다.
이에 본 발명자들은 세팔로스포리움 아크레모니움 KFCC-10782를 친주로하여 리파아제의 활성이 증가된 변이주를 얻고, 이들 리파아제 활성이 증가된 변이주중에서도 세팔로스포린 C 생산 능력이 크게 향상된 균주를 분리하기 위하여 집중적인 연구를 수행하였으며, 그 결과 본 발명에 따른 변이주를 얻는데 성공하여 본 발명을 완성하게 되었다. 이하, 본발명의 구성을 상세히 설명한다.
본 발명은 세팔로스포리움 아크레모니움 KFCC-10782의 변이주로서 높은 리파아제 활성을 가짐으로해서 배지내 오일의 이용효율이 높아, 세팔로스포린 C 를 고수율로 생산할 수 있는 미생물에 관한 것이다.
리파아제 활성이 높은 변이주를 얻기 위하여 본 발명자들은 먼저 친주인 세팔로스포리움 아크레모니움 KFCC-10782 균주를 자외선 조사, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소 구아니딘(NTG)등의 변이유발제로 통상의 방법에 따라 처리한 후, 유화된 오일과 로다민 B가 함유되어 있는 한천배지에 도말하였다. 이를 30℃에서 10 내지 15일동안 배양한 후 지방산과 로다민 B가 반응하여 만들어진 오렌지 빛의 둥근환이 큰 집락을 선별하였다. 이 과정을 통해 선별된 균주를 하기 표 1의 오트밀 한천 사면배지(Oatmeal agar slant medium)에서 2주일간 배양한 후 삼각 플라스크 배양을 실시하여 세팔로스포린 C 생산능을 확인하였다. 변이주를 선별하는 과정은 하기 실시예 1에 보다 구체적으로 나타내었다.
오트밀 한천 사면배지 조성
성분 함량(%)
오트밀 한천효모 추출물말토오스무수 아세트산나트륨한천 2.40.11.00.11.8
pH 6.4
이러한 방법을 통해서 친주에 비해 리파아제 활성이 23%정도 향상된 변이주들을 얻을 수 있었으며, 이 변이주들 중에서 세팔로스포린 C를 친주에 비해 18% 정도 고농도로 생산하는 균주를 선별하였다.
균주 선별을 위한 리파아제 활성측정 방법은 다음과 같다. 먼저 물 90㎖와 콩기름 10㎖에 레시틴 1.2g을 넣고 혼합기에서 5분 정도 유화시킨다. 이 때, 혼합기는 1분씩 나눠서 작동시킨다. 유화가 완전히 이루어진 유화액은 우유빛을 띠며 기름층이 분리되지 않고, pH는 6.4 부근이다. 이 유화액을 121℃, 1.2기압하에 15분간 살균한다. 이와 같이 조제된 유화액을 이용하여 다음과 같이 리파아제 활성 측정을 위한 고체 배지를 제조한다. 우선, 기본 한천 배지(아스파라긴 1g/ℓ, 포도당 10g/ℓ, 황산마그네슘 0.5g/ℓ, 인산 제1칼륨 0.46g/ℓ, 인산 제2칼륨 1g/ℓ, 한천 20g/ℓ, pH 7.0)를 살균한 후 50℃정도로 식힌다. 여기에 유화액 10%와 로다민 B를 1㎎/㎖ 농도로 가한 후 한천 평판 배지를 만든다. 만들어진 배지는 밝은 분홍색을 띄게 된다. 한천 평판배지에 자외선을 조사하거나 변이유발제로 처리한 균체 현탁액을 도말하여 30℃에서 10 내지 15일간 배양한다. 균체가 평판배지에 생육하게 되면 균체가 분비하는 리파아제의 작용에 의해 배지내 오일이 분해되면서 지방산이 생성된게 된다. 생성된 지방산은 배지내에 첨가된 로다민 B와 반응하여 350nm UV하에서 오렌지색 형광을 나타내게 되며, 또한 육안으로도 식별가능한 빨간 고리환이 균체 집락 주위에 형성된다. 따라서, 이때 형성된 적색 고리환의 크기로 리파아제 활성을 비교할 수 있다. 변이주의 리파아제 활성을 확인하기 위하여 고리환의 육안 식별이외에 배양 상등액의 리파아제 활성 측정도 병행하며, 균체 배양 상등액의 리파아제 활성 측정법은 다음과 같다. 먼저, 유화액 2㎖를 기질로서 시험관에 넣고 30℃ 반응조에서 5분간 방치한 후 효소액(배양액) 0.2㎖를 가하여 혼합시키면서 1시간 동안 반응시킨다. 아세톤과 에탄올의 혼합액(1:1, v/v) 4㎖를 가하여 반응을 정지시킨후 60% 에탄올성 0.1N KOH 2㎖를 떨어뜨리고 0.01N 염산으로 적정한다. 적정에 소요된 염산의 양으로부터 하기 수학식 1에 의거하여 리파아제에 의해 유리된 지방산량을 산출해낼 수 있다.
대조군적정에소요된염산부피-시험군적정에소요된염산부피=유리된지방산의몰수
수학식 1에 의해 산출해 낸 유리 지방산의 몰수로부터 효소활성을 계산하며, 이때 효소 1 unit은 1분동안 1마이크로몰의 지방산을 유리시키는 효소의 양으로 하였다.
위와 같은 방법으로 리파아제 고활성 균주를 선별한 결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같은 세팔로스포리움 아크레모니움 LIP-1 내지 LIP-20 의 20가지 변이주를 얻을 수 있었다. 이에, 본 발명자들은 30리터 발효배지 중에서의 배양을 통해 각 변이주의 세팔로스포린 C 생산성을 확인하였으며, 그 결과 LIP-8 변이주가 세팔로스포린 C의 생산성이 가장 높은 것으로 판별되었다.
따라서, 본 발명자들은 선별된 균주를 세팔로스포리움 아크레모니움 LIP-8 (Cephalosporium acremoniumLIP-8)이라 명명하고, 이를 1997년 10월 14일자로 사단법인 한국종균협회에 기탁하여 KFCC-10994의 기탁번호를 부여받았다. 본 발명에 따른 변이주 KFCC-10994의 균학적 성질은 세팔로스포린 C 생산성 및 리파아제 활성도를 제외하고는 친주와 동일하다.
하기 표 2에 본 발명에 따른 변이주 LIP-8를 선별하는 과정에서 확인된 각 변이주들의 리파아제 활성(오렌지색 고리환의 크기로 표시) 및 세팔로스포린 C 생산 농도를 나타내었다.
변이주들의 리파아제 활성 및 세팔로스포린 C 생산농도
균주명 오렌지빛 환의 크기(㎜) 플라스크 배양 후 세팔로스포린 C 농도(g/ℓ)
KFCC-10782(친주) 13 22.5
LIP-1 13.5 21.6
LIP-2 14 23.8
LIP-3 12.5 19.8
LIP-4 15 23.3
LIP-5 11.5 20.4
LIP-6 14 22.6
LIP-7 15 23.0
LIP-8(본 발명의 변이주) 16 26.5
LIP-9 13 20.4
LIP-10 13 21.2
LIP-11 12.5 18.3
LIP-12 16.5 23.3
LIP-13 14 21.4
LIP-14 13 19.7
LIP-15 15.5 23.5
LIP-16 11 12.7
LIP-17 13 21.9
LIP-18 12.5 21.3
LIP-19 15.5 24.6
LIP-20 14 19.3
이와 같이 본 발명에 따른 변이주가 친주에 비해 리파아제 활성이 향상되었을 뿐아니라 우수한 세팔로스포린 C 의 제조활성을 지니므로, 본 발명은 이러한 변이주를고농도의 오일을 함유하는 배지중에서 배양하여 세팔로스포린 C를 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.
이때, 배지로는 주성분으로서 이성화액당, 혼합오일(메틸올레이트와 미강유가 1:1(v/v)로 혼합된 것), 땅콩분, 콘스팁리커를 함유하는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 이 성분들을 함유하지 않는 배지중에서 배양하는 경우 세팔로스포린 C의 생산수율이 저하될 수 있기 때문이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
친주인 세팔로스포리움 아크레모니움 KFCC-10782를 오트밀 한천 사면배지(표 1 참조)에 접종한 후 2 주일간 배양하였다. 배양완료된 사면배지에 생리 식염수(0.9% NaCl 수용액) 10㎖를 가하고, 사면배지 표면을 긁어서 포자 현탁액을 제조하였다. 이 포자 현탁액을 유리솜이 충진된 주사기에 넣고 여과한 후 페트리 디쉬에 부었다. 30㎝ 거리에서 100초 동안 자외선을 조사하였다. 자외선이 조사된 포자현탁액을 유화액 10%와 로다민 B 1㎎/㎖가 함유되어 있는 기본 한천배지에 도말하고 15일간 30℃에서 배양하였다. 배양후 집락이 형성되면 지방산과 로다민 B가 반응하여 생긴 오렌지 빛의 둥근환이 큰 집락을 선별하였다. 이 과정을 통해 선별된 균주를 오트밀 한천 사면배지에서 2 주일간 배양한 후 삼각 플라스크 배양을 실시하였다. 삼각 플라스크 배양 방법은 다음과 같다.
1차 종배지(표 3 참조)를 50㎖씩 500㎖ 용량의 진탕용 삼각 플라스크에 넣고 살균한 후 균주를 접종하여 30℃에서 200rpm으로 96시간동안 1차 종배양하였다. 2차 종배지(표 4 참조)를 50㎖씩 500㎖ 용량의 진탕용 삼각 플라스크에 넣고 살균, 냉각시킨 후 1차 종배양액을 10분의 1로 희석하여(생리식염수 이용) 접종하였다. 2차 종배양을 96시간동안 실시한 후 표 5의 발효배지가 25㎖ 들어있는 250㎖ 삼각 플라스크에 2차 종배양액 3㎖를 접종하고 25℃, 300rpm에서 7일간 배양하였다. 그 결과는 본 명세서의 표 2에 나타낸 바와 같다.
실시예 2
하기 표 3의 1차 종배지를 50㎖씩 500㎖ 용량의 진탕용 삼각 플라스크에 넣고, 살균시킨후 균주를 식균하여 30℃에서 220rpm으로 96시간동안 1차 종배양하였다. 하기 표 4의 2차 종배지를 7리터 용량의 시험용 발효조에 각 5리터씩 분주하고 121℃에서 30분간 살균, 냉각시킨후 1차 종배양에서 얻은 배양 원료액을 15㎖씩 접종한 다음, 매분당 0.8리터의 속도로 공기를 공급하면서 30℃에서 700rpm으로 90 시간동안 종배양하였다.
하기 표 5의 발효배지를 30리터 용량의 시험용 발효조에 19.4리터씩 분주하고 121℃에서 30분간 살균, 냉각한 다음 2차 종배양액을 1.6리터씩 접종하였다. 공기를 매분당 0.8리터의 속도로 공급하면서 500rpm, 25℃의 조건하에 배양하였다. 배양초기에 배지중에 첨가된 혼합오일(메틸올레이트/미강유=1/1, v/v)의 양은 1.6리터였으며, 배양시작후 50시간 및 90시간에 각각 0.8리터씩의 혼합오일을 배지중에 첨가하였다. 따라서, 초기에 발효배지에 첨가된 혼합오일과 추가된 오일의 합계는3.2리터였다. 배양중 pH는 암모니아수를 사용하여 5.5로 조절하였다. 배양완료후 세팔로스포린 C의 농도를 측정한 결과, 친주인 KFCC-10782가 39.8g/ℓ, 본 발명에 따른 변이주 KFCC-10994가 46.5g/ℓ인 것으로 나타났다. 또한, 발효액중에 잔존하는 혼합오일의 양과 균주의 최고 리파아제 활성을 측정한 결과, 공지균주 KFCC-10782의 경우 각각 16.3g/ℓ, 1584unit/㎖ 이고, 본 발명에 따른 변이주 KFCC-10994의 경우 3.8g/ℓ, 1776unit/㎖인 것으로 확인되었다.
1차 종배지 조성
성분 함량(중량%)
대두분콘스팁리커설탕포도당탄산칼슘소포제(KM-70) 3.00.752.51.00.50.14
pH 7.0
2차 종배지 조성
성분 함량(중량%)
대두분땅콩분콘스팁리커설탕포도당탄산칼슘소포제(KM-70) 3.03.01.52.51.00.50.14
pH 7.0
발효배지의 조성
성분 함량(중량%)
이성화액당혼합오일땅콩분콘스팁리커콘밀글루텐밀D,L-메티오닌황산칼슘탄산칼슘소포제(KM-70) 4.515.22.53.51.53.00.751.02.50.1
pH 7.0
실시예 3
배양초기에 배지중에 첨가하는 혼합오일량을 1.6리터로 하고, 배양시작후 50시간 및 90시간에 각각 1리터씩의 혼합오일을 첨가하여 배지에 첨가된 혼합오일의 총량이 3.6리터가 되도록 하는 것을 제외하고는 사용균주, 1차 및 2차 종배지, 배양방법을 실시예 2에서와 동일하게 하여 배양을 실시하였다. 배양 완료후 배지중에 생성된 세팔로스포린 C의 농도 및 리파아제 활성은 하기 표 6에 나타낸 바와 같다.
세팔로스포린 C 생산농도 및 리파아제 활성의 비교
균주 세팔로스포린 C 농도(g/ℓ)
KFCC-10782 KFCC-10994
생산된 세팔로스포린 C 농도(g/ℓ)배지중 혼합오일 잔존량(g/ℓ)리파아제 활성(unit/㎖) 40.130.41502 47.94.31811
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 변이주 세팔로스포리움 아크레모니움 LIP-8(KFCC-10994)는 리파아제의 활성이 증가됨에 따라 오일이용능력이 향상되어 세팔로스포린 C 생산농도가 친주에 비해 20% 가량 월등히 증가된 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 변이주는 세팔로스포린 C를 미생물학적으로 제조하는 경우에 매우 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (3)

  1. 세팔로스포리움 아크레모니움(Cephalosporium acremonium)(기탁번호:KFCC-10782)의 변이주로서 리파아제 활성이 증가되고 세팔로스포린 C를 고농도로 생산할 수 있는 세팔로스포리움 아크레모니움(Cephalosporium acremonium) LIP-8(기탁번호:KFCC-10994).
  2. 제1항의 세팔로스포리움 아크레모니움(Cephalosporium acremonium) LIP-8 (기탁번호: KFCC-10994)을 배지중에서 배양함을 특징으로하여 세팔로스포린 C를 제조하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 배지가 이성화액당, 혼합오일, 땅콩분 및 콘스팁리커를 함유함을 특징으로 하는 방법.
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