KR100446110B1 - 세팔로스포린 c 생산 미생물 - Google Patents

세팔로스포린 c 생산 미생물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고농도의 글리세롤에 대해 내성을 지니며 세팔로스포린 C 를 고농도로 생산할 수 있는 세팔로스포리움 아크레모니움(Cephalosporium acremonium; KFCC-10782)의 변이주에 관한 것이다.

Description

세팔로스포린 Ｃ 생산 미생물
본 발명은 고농도의 글리세롤에 대해 내성을 지니며 세팔로스포린 C 를 고농도로 생산할 수 있는 세팔로스포리움 아크레모니움(Cephalosporium acremonium; KFCC-10782)의 변이주에 관한 것이다.
종래의 세팔로스포린 C 생산 균주, 예를들어 본 발명에 따른 변이주의 친주인 세팔로스포리움 아크레모니움 KFCC-10782의 경우, 배지중의 성분들이 고농도로 농축되어 있는 고농도 배지조건하에서는 균체의 생육이 저해되고, 세팔로스포린 C 생산도 저해되는 결과를 나타내는데, 이는 배지농도의 증가에 따른 배지내 삼투압 상승에 의해 세팔로스포린 C 생산이 저해되기 때문인 것으로 생각되었다.
이에 본 발명자들은 고농도 배지조건하에서도 세팔로스포린 C 생산이 저해되지 않는 신규한 변이주를 개발하여 세팔로스포린 C를 보다 효율적으로 제조할 수 있는 미생물학적 방법을 확립하고자 노력하였으며, 그 결과 배지내 삼투압을 상승시키는 물질중의 하나인 글리세롤에 내성을 가지는 변이주로서 세팔로스포린 C를 고농도로 생산할 수 있는 신규한 미생물을 분리하는데 성공하여 본 발명을 완성하게 되었다. 이하 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.
본 발명은 세팔로스포리움 아크레모니움 KFCC-10782 균주의 변이주로서 고농도의 글리세롤에 내성을 가지며, 그 결과 고농도의 발효배지중에서 생육가능하여 세팔로스포린 C를 고수율로 생산할 수 있는 미생물에 관한 것이다. 특히, 본 발명에 따른 변이주는 20%(v/v) 이상의 글리세롤 농도에서도 내성을 나타낸다.
본 명세서에서 고농도 배지라 함은 배지성분들중에서 탄산칼슘을 제외한 전 성분들이, 기존 발효배지를 100%로 했을 때 중량기준으로 120%, 140% 등으로 증량된 배지를 의미한다.
본 발명에 따른 글리세롤 내성주를 얻기 위하여 본 발명자들은 먼저 친주인 세팔로스포리움 아크레모니움 KFCC-10782 균주를 자외선 조사 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 등의 변이유발제로 통상의 방법에 따라 처리한후, 글리세롤이 10 내지 40% 농도(v/v)로 함유된 액체 배지(포도당 10g/ℓ, 아스파라긴 1g/ℓ, 황산 마그네슘 0.5g/ℓ, 인산 제1칼륨 0.5g/ℓ, 인산 제2칼륨 1g/ℓ, pH 7.0)에서 7 내지 10 일간 배양하였다. 변이주를 선별하는 과정은 하기 실시예 1에 보다 구체적으로 나타내었다.
이러한 방법을 통해 배양한 다양한 변이주들 중에서 친주인 KFCC-10782는 생육하지 못하는 조건인 20% 글리세롤 농도에서도 생육가능하고 고농도 배지에서의 세팔로스포린 C 생산 농도가 친주에 비해 약 10내지 20% 정도 향상된 균주를 선별하는데 성공하였다. 본 발명자들은 이에 따라 선별된 균주를 세팔로스포리움 아크레모니움 GR32(Cephalosporium acremoniumGR32)라 명명하고, 이를 1997년 10월 14일자로 사단법인 한국종균협회에 기탁하여 KFCC-10995의 기탁번호를 부여받았다. 본 발명에 따른 변이주 KFCC-10995의 균학적 성질은 세팔로스포린 C 생산성 및 글리세롤 내성을 제외하고는 친주와 동일하며, 하기 표 1 및 2에 본 발명에 따른 세팔로스포리움 아크레모니움 GR32 균주의 균학적 특성 및 글리세롤 내성을 친주인 KFCC-10782 와 비교하여 나타내었다. 단, 배지로는 액체배지를 사용하였으며, 표 2에서 +는 생육을 의미하고 - 는 생육하지 못함을 의미한다.
[표 1]
본 발명에 따른 변이주의 균학적 특성
특 성 친주(KFCC-10782) 본 발명에 따른 변이주(KFCC-10995)
분생포자병 무격벽으로 직립 무격벽으로 직립
분생포자 타원형의 공(ball)상 타원형의 공(ball)상
영양요구성 없음 없음
글리세롤 내성 최대 생육가능농도는 10% 20% 에서 생육가능
[표 2]
글리세롤에 대한 내성 비교
글리세롤 농도(%) 0 10 20 30 40
KFCC-10782 (친주)KFCC-10995 (본 발명에 따른 변이주) +++ + - - -+++ ++ + - -
이와 같이 본 발명에 따른 변이주가 친주에 비해 고농도의 글리세롤 존재하에서도 생육이 가능하며 우수한 세팔로스포린 C 의 제조활성을 지니므로, 본 발명은 이러한 변이주를 고농도 배지중에서 배양하여 세팔로스포린 C를 고수율로 제조하는 방법도 그 대상으로 한다.
이때, 배지로는 주성분으로서 이성화액당, 혼합오일(메틸올레이트와 미강유가 1:1(v/v)로 혼합된 것), 땅콩분, 콘스팁리커를 함유하는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 이 성분들을 함유하지 않는 배지중에서 배양하는 경우 세팔로스포린 C의 생산수율이 저하될 수 있기 때문이다. 또한, 배지성분들이 농축된 상태의 고농도 배지를 사용하여 배양하는 것이 세팔로스포린 C의 수율을 높이는 면에서 바람직하다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
친주인 세팔로스포리움 아크레모니움 KFCC-10782를 하기 표 3에 그 조성을 나타낸 오트밀 한천 사면배지에 접종한 후 2주일간 배양하였다. 배양이 완료된 사면배지에 생리 식염수(0.9% NaCl 수용액) 10㎖를 가하고 사면배지 표면을 긁어서 포자 현탁액을 제조하였다. 이 포자 현탁액을 유리솜이 충진된 주사기에 넣고 여과한 후 페트리 디쉬에 부었다. 30㎝거리에서 100초동안 자외선을 조사하였다. 자외선이 조사된 포자 현탁액을 글리세롤이 각각 10%, 20%, 30%, 40%(v/v) 농도로 함유된 30℃의 액체배지(포도당 10g/ℓ, 아스파라긴 1g/ℓ, 황산마그네슘 0.5g/ℓ, 인산 제1칼륨 0.5g/ℓ, 인산 제2칼륨 1g/ℓ, pH 7.0)중에서 10일간 배양하였다. 배양 후 20% 농도의 글리세롤이 함유된 액체배지에서 자란 배양액을 기본 한천배지(상기 액체배지에 한천 20g/ℓ 추가)에 도말하고 15일간 배양하여, 평판배지상의 집락을 취함으로써 본 발명에 따른 변이주를 수득하였다.
[표 3]
오트밀 한천 사면배지 조성
성분 함량(중량%)
오트밀 한천효모 추출물말토오스무수 아세트산나트륨한천 2.40.11.00.11.8
pH 6.4
실시예 2
하기 표 4의 1차 종배지를 50㎖씩 500㎖ 용량의 진탕용 삼각 플라스크에 넣고, 살균시킨후 균주를 접종하여 30℃에서 220rpm으로 96시간동안 1차 종배양하였다. 하기 표 5의 2차 종배지를 7리터 용량의 시험용 발효조에 각 5리터씩 분주하고 121℃에서 30분간 살균, 냉각시킨후 1차 종배양에서 얻은 배양 원료액을 15㎖씩 접종한 다음, 매분당 0.8리터의 공기를 공급하면서 30℃에서 700rpm으로 90시간동안 종배양하였다.
하기 표 6의 발효배지를 30리터 용량의 시험용 발효조에 19.4리터씩 분주하고 121℃에서 30분간 살균, 냉각하고 2차 종배양액을 1.6리터씩 접종한 다음, 공기를 매분당 0.8리터씩 공급하면서 500rpm, 25℃로 배양하였다. 배양액중 혼합오일(메틸올레이트와 미강유가 1:1(v/v)로 혼합된 것)의 농도가 4 내지 5%로 떨어지면 살균된 혼합오일을 수시로 공급함으로써 추가된 혼합오일과 초기에 발효배지에 첨가된 혼합오일의 합계가 발효액량 대비 15 내지 20%로 유지되도록 조절하면서 계속 배양하였다. 본 실시예에서는 혼합오일의 농도를 15.3%로 조절하였다. 배양중 pH는 암모니아수를 사용하여 5.5로 조절하였다. 배양완료후 세팔로스포린 C의 농도를 측정한 결과, 친주인 KFCC-10782가 39.3g/ℓ, 본 발명에 따른 변이주 KFCC-10995가 41.5g/ℓ인 것으로 나타났다.
[표 4]
1차 종배지 조성
성분 함량(중량%)
대두분콘스팁리커설탕포도당탄산칼슘소포제(KM-70) 3.00.752.51.00.50.14
pH 7.0
[표 5]
2차 종배지 조성
성분 함량(중량%)
대두분땅콩분콘스팁리커설탕포도당탄산칼슘소포제(KM-70) 3.03.01.52.51.00.50.14
pH 7.0
[표 6]
발효배지의 조성
성분 함량(중량%)
이성화액당혼합오일땅콩분콘스팁리커콘밀글루텐밀D,L-메티오닌황산칼슘탄산칼슘소포제(KM-70) 4.515.32.53.51.53.00.751.02.50.1
pH 6.9
실시예 3
배지농도를 100%, 120%, 140%로 변화시키는 점을 제외하고는 사용균주, 1차 및 2차 종배지, 배양방법을 실시예 2에서와 동일하게 하여 배양을 실시하였다. 이때 배지중 혼합오일은 배지의 농도에 관계없이 동일하게 첨가하였다. 배양 완료후 세팔로스포린 C의 농도는 하기 표 7에 나타낸 바와 같다.
[표 7]
배지농도별 세팔로스포린 C 생산농도 비교
배지농도(%) 세팔로스포린 C 농도(g/ℓ)
KFCC-10782 KFCC-10995
100120140 39.339.937.8 41.544.244.6
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 세팔로스포리움 아크레모니움 GR32 변이주는 고농도의 글리세롤에 대한 내성을 가지게 되어 고농도 배지에서의 세팔로스포린 C 생산농도가 월등히 증가된 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 변이주는 세팔로스포린 C를 미생물학적으로 제조하는 경우에 매우 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (1)

  1. 세팔로스포리움 아크레모니움(Cephalosporium acremonium)(기탁번호:KFCC-10782)의 변이주로서 농도 20부피% 이상의 글리세롤에 대해 내성을 가지며 세팔로스포린 C 를 고농도로 생산할 수 있는 세팔로스포리움 아크레모니움 (Cephalosporium acremonium) GR32 (기탁번호:KFCC-10995).
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