KR900007945B1

KR900007945B1 - 글루타민산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 글루타민산의 제조방법

Info

Publication number: KR900007945B1
Application number: KR1019880016540A
Authority: KR
Inventors: 현형환; 이윤기; 정성오; 심재익; 오윤석
Original assignee: 제일제당 주식회사; 손영희
Priority date: 1988-12-12
Filing date: 1988-12-12
Publication date: 1990-10-23
Also published as: KR900009963A

Abstract

내용 없음.

Description

글루타민산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 글루타민산의 제조방법

본 발명은 글루타민산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 글루타민산의 제조방법에 관한 것으로, 좀더 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 변번이주로서 페니실린계 항생제에 감수성이 높고 글루타민산을 탄소원 및 질소원으로 자화할 수 없으며 배지중에 비오틴이 과잉 존재하더라도 페니실린계 항생제, 또는 계면활성제(양이온, 음이온, 비이온계)를 발효초기 또는 발효중에 첨가하지 않아도 글루타민산을 고농도, 고수율로 생산하는 미생물에 관한 것이다.

종래 미생물을 이용하여 글루타민산을 생산하는 초기의 기술은 포도당, 전분 가수분해물 등 비오틴이 전혀 존재치 않거나 극미량 존재하는 원료인 경우는 배지중에 비오틴을 제한적으로 첨가하여 글루타민산을 생산하는 방법이었으며 그 후에는 포도당 및 전분가수 분해물이 고가라는 이유로 비오틴이 과잉으로 존재하는 저럼한 가격의 폐당밀을 사용하므로써 발효초기 또는 발효도중(대수증식기 초기부터 말기)에 페니실린계 항생제나 계면활성제를 첨가하여 글루타민산을 생산하는 방법이 개발되었다.

이 방법은 일반적으로 폐당밀속에는 주성분인 당질외에 중요한 생장인자가 되는 비오틴이 과잉으로 존재하며 비오틴은 글루타민산 생산균에서 세포벽의 합성을 촉진하여 세포내에 생성된 글루타민산이 세포외로분비되는 것을 억제하여 글루타민산의 생산을 저해하기 때문에 비오틴이 과잉존재하는 폐당밀을 사용할 경우, 발효초기 또는 발효도중에 페니실린계 항생제나 계면활성제를 첨가하여 균의 생육을 적절히 조절하고페니실린에 의한 세포벽합성의 저해를 통한 글루타민산의 세포벽 분비 촉진 및 계면활성제에 의한 글루타민산의 원형질막의 통과를 용이하게 하여 글루타민산을 생산하는 방법이었다.

이러한 종래의 방법은 폐당밀이 함유하는 비오틴 함량에 따라 페니실린계 항생제나 계면활성제의 첨가시기 및 첨가량이 달라져야 하며 또한 발효진행중 글루타민산이 균체밖으로 용이하게 분비되지 않으면 균체내에 글루타민산이 과도하게 축적되어 세포내의 글루타민산 합성에 관여하는 효소들이 저해를 받아 글루타민산 생산성이 저하될 뿐만 아니라, 여기에서 사용된 미생물들은 글루타민산을 탄소원, 에너지원 및 질소원으로 이용할 수 있기 때문에 발효도중 생성된 글루타민산이 대사에 이용되어 소모될 수 있어 생산성이 저하되는 단점이 있었다.

따라서 본 발명자 등은 상술한 단점을 제거하기 위해 우선 생체내에서 생성된 글루타민산을 용이하게 배출하도록 세포벽 합성기능에 이상이 생겨 페니실린계 항생제에 감수성이 높고 글루타민산을 탄소원 및 질소원으로 사용할 수 없는 변이주, 즉 글루타메이트 디하이드로게네이즈에 의해 글루타민산이 알파케토글루타레이트로 되는 역반응이 봉쇄된 1차 변이주를 얻은 다음, 이를 다시 돌연변이시켜 비오틴 농도가 과잉인 베지에서 페니실린계 항생제나 계면활성제를 첨가하지 않고도 글루타민산을 생산할 수 있는 미생물을 획득하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 미생물(KFCC 10658)은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032를 친주로하여 자외선조사, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소 구아니딘(NTG) 등의 변이유발제로 통상적인 방법으로 처리하여 복합배지(포도당 20g/l, 당밀 5g/l, KH₂PO₄1g/l, K₂HPO₄0.5g/l, 요소 0.3%1(NH₄)₂SO₄0.5g/l, MnSO₄20mg/l, FeSO₄20mg/l, MgSO₄0.5g/l, 티아민염산염 200㎍/l, 비오틴 20㎍/l, pH 7.0, 한천 20g/l)에서 생육시킨 다음, 페니실린계 항생제 첨가배지(육즙 1%, 펩톤 1%, 효모엑기스 0.5%, 포도당 1. 0%, NaCl 0.25%, pH 7.0, 페니실린 G0-0.3μ/ml첨가, 한천 20g/l) 및 비이온계 계면 활성제 첨가 배지(육즙 l%, 펩톤 1%, 효모엑기스 0.5%, 포도당 1.0%, NaCl 0.25%, 트윈 400-5000㎍/㎖, pH 7.0, 한천 20g/l)로 각각 옮겨 여기에서 생육하지 못하는 페니실린계 항생제와 비이온계 계면활성제(트윈 40, 시그마제조) 모두에 대하여 감수성을 동시에 갖는 1차 변이주를 얻은 다음, 다시 상술한 변이유발제로 처리한 후 글루타민산 배지(글루타민산 나트륨염 10g/l, KH₂PO₄1g/l, K₂/HPO₄0.5g/l, FeSO₄20mg/l, MnSO₄20mg/l, MgSO₄0.59/l, 티아민염산염 200㎍/l, 비오틴 20㎍/l, pH 7.0, 한천 20g/l)에서는 생육을 못하나 복합배지에서 생육하면서 비오틴과잉배지(포도당 30g/l, 당밀 5g/l, KH₂PO₄1g/l, K₂HPO₄0.5g/l, 요소 0.4%, (NH₄)₂SO₄0.5g/l, MnSO₄20mg/

l, FeSO₄20mg/l, MgSO₄0.5g/l, 티아민 염산염 200㎍/l, 비오틴 0-200㎍/l,pH 7)에서도 글루타민산을 생산하는 변이주를 획득하고 1988.12. 6.자로 한국종균협회에 기탁하였다 (기탁번호 KFCC 10658).

1차 변이주의 획득방법을 좀더 구체적으로 기술하면, 상술한 친주를 변이유발제로 처리한 후 잔존 변이유발제를 제거하고 적절히 희석하여 복합배지에 도말한 후 30℃에서 l-2일간 배양하여 코로니가 형성되면 페니실린계 항생제 첨가배지 및 비이온계 계면활성제 첨가 배지에 각각 레프리카로 이식하고 30℃에서 1-2일간 배양하여 복합배지에서는 생육을 하나 페니실린계 항생제첨가배지 및 비이온계 계면활성제 첨가배지에서는 생육을 못하는 l차 변이주를 선별, 획득하는 것이다.

상술한 바와같이 변이처리하여 획득된 본 발명의 글루타민산을 생산하는 미생물(KFCC 10658)은 포도당, 전분가수분해물, 당밀 등을 사용하여 발효실험을 행한 결과, 발효중 발생되는 종래의 문제점들이 해소됨과 동시에 글루타민산을 고수율, 고농도로 생산 할수 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명 미생물의 특성은 다음의 표에 기재된 바와 같다.

페니실린항생제에 대한 감수성 비교

[표 1]

＜주＞ +; 생육, -; 생육못함, 페닐실린계 항생제 첨가배지, 48시간배양

계면활성제(트윈 40)에 대한 감수성 비교

[표 2]

＜주＞ 비이온계 계면활성제 첨가배지, 30℃에서 48시간 배양

글루타민산배지에서의 생육도 비교

[표 3]

＜주＞ 페니실린계 항생제 첨가배지 조성중 한천을 제외한 배지사용, 30℃에서 180rpm으로 72시간 진탕 배양

비오틴농도에 대한 글루타민산 생성 비교

[표 4]

＜주＞ 종배양배지는 복합배지를 사용하였으며 글루타민산 생산확인은 비오틴과잉배지를 사용하였다. 종배양은 OD가 약 0.4(OD562×10)정도 생육하였을 때 원심분리하여 균체를 회수한 후 생리식염수로 2-3회 세정하여 종균으로 사용하였다.

글루타민산 생산확인은 비오틴과잉배지를 250ml 용량의 배양용 삼각 플라스크에 40ml 분주하고 살균 후 종균을 식균하여 32℃에서 220rpm으로 72시간 진탕배양하였다.

상술한 바와같이 본 발명은 종래의 균주를 사용하여 글루타민산을 생산할 경우, 발효가 진행됨에 따라 균체의 내외에는 글루타민산의 농도가 높아지게 되나, 비교적 균체 내외에 글루타민산의 농도가 낮은 발효전반부에서는 글루타민산의 생산수율이 당질 소모비로 환산할 때 높은 수준을 유지하다가 비교적 균체 내외에 글루타민산의 농도가 높은 발효후반부에서는 수율이 급격히 저하되므로 전반적인 수율이 떨어지는 것을 발견하고 이와같은 문제점 등은 페니실린계 항생제 및 비이온계 계면활성제에 감수성이 높음과 동시에 글루-타민산을 탄소원 및 질소원으로 사용할 수 없고 비오틴이 과잉으로 존재하는 배지에서 페니실린류 항생제 또는 계면활성제를 투여하지 않아도 글루타민산을 고수율, 고농도로 생산할 수 있는 변이주(KFCC 10658)를 획득하므로써 종래방법의 문제점을 완전히 해소한 것이다.

다음의 실시예에서 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다.

실시예 1

사용균주; 본 발명 미생물(KFCC 10658), ATCC 13032

1차종배지; 폐당밀 0.5%, 포도당 2.0%, MgSO₄0.5g/l, 요소 0.1%, FeSO₄20mg/l, MnSO₄20mg/l, K₂HPO₄0.5g/l, KH₂PO₄1g/l, (NH₄)₂SO₄0.5%, 티아민염산염 200㎍/l, 비오틴 20㎍/l, pH 7.0

2차종배지; 폐당밀(전화당으로) 2.0%, 글루코오즈 1%, 콘스팁리커 3%, MgSO₄0.5g/l, 요소 0.2% KH₂PO₄1g/l, K₂HPO₄0.5g/l, FeSO₄10mg/l, MnSO₄10mg/1, (NH₄)₂SO₄0.3%, 티아민염산염 200㎍/l, 비오틴 100㎍/l, pH 7.0

발효배지; 폐당밀(전화당으로) 8%, NH₄H₂PO₄0.15%, FeSO₄10㎎/l, MnSO₄10mg/l, 콘스팁리커 3%, (NH₄)₂SO₄0.3%, 티아민염산염 200㎍/l, pH 7.0

1차종배양; 1차 종배지를 40ml씩 진탕용 플라스크에 넣고 살균후 상기 균주를 각각 식균하여 180rpm으로 30℃에서 20-24시간 배양하였다.

2차종배양; 2차 종배지를 2.6리터 용량의 시험용 발효조에 각 1.2리터씩 분주하고 121℃에서 10분간 살균냉각후 l차 종배양에서 배양완료액을 5ml씩 식균하여 공기를 매분당 0.5-1.0리터씩 공급하면서 900rpm, 30℃에서 12-15시간 배양하였다.

발효방법; 상기 발효배지를 5리터 용량의 시험발효조에 1.8리터씩 분주하고 121℃에서 10분간 살균, 냉각하여 2차 종배양액을 약 150ml씩 접종한 후 공기를 매분당 1-2.5리터씩 공급하면서 900rpm, 30-37℃에서 배양하되 대수증식기 초기부터 말기[OD 0.15-0.4(OD562×100)] 사이에 페니실린을 0.3-1.2u/ml 첨가하였다. 배양중 잔존 당농도가 0.5-1.5%가 되면 살균된 폐당밀 또는 폐당밀과 원당을 일정비율 혼합한 혼합당을 수시로 공급하였다.

추가한 당밀 또는 혼합당과 초기의 발효배지에 첨가된 당의 합계가 발효액량대비 19%가 될 때까지 계속배양하였다. 배양중 pH는 암모니아수를 사용하여 7.8로 조절하였다. 배양완료 후 글루타민산의 농도는 ATCC 13032가 95.2g/l, KFCC 10658이 138.8g/l이었다.

실시예 2

사용균주, 1차 및 2차종배지, 발효배지, 1차 및 2차 종배양은 실시예1과 동일하나 발효방법은 실시예 1과 동일하되 대수증식기 초기에서 말기사이에 페니실린계 항생제 대신에 계면활성제인 트윈 40을 10㎍/ml-25㎍/ml, 페니실린항생제를 0.3-0.8u/ml되게 첨가하였다.

배양완료 후 글루타민산의 농도는 ATCC 13032가 96.7g/l, KFCC 10658이 136.8g/l이었다.

Claims

페니실린 항생제의 농도가 0.03μ/ml, 비이온계 계면활성제인 트윈 40의 농도가 50mg/ml 이상인 조건하에서 생육할 수 없으며, 글루타민산을 탄소원 및 질소원으로 자화할 수 없으며, 폐당 및 발효배지내 비오틴 농도 98㎍/l 이상에서도 글루타민산을 생산하는 코리네 박테리움 글루타미쿰 KFCC 10658.
코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 10658을 폐당밀, 포도당, 전분 가수분해물 및 원당 등이 포함된 배지중에서 배양하여 배양물로부터 글루타민산을 채취하는 것을 특징으로 하는 미생물을 이용한 글루타민산의 제조방법.