KR900007938B1

KR900007938B1 - 글루타민산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 글루타민산의 제조방법

Info

Publication number: KR900007938B1
Application number: KR1019880016533A
Authority: KR
Inventors: 현형환; 이윤기; 정성오; 심재익; 오윤석
Original assignee: 제일제당 주식회사; 손영희
Priority date: 1988-12-12
Filing date: 1988-12-12
Publication date: 1990-10-23
Also published as: KR900009956A

Abstract

내용 없음.

Description

글루타민산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 글루타민산의 제조방법

본 발명은 글루타민산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 글루타민산의 제조방법에 관한 것으로, 좀더 구체적으로는 브레비박테리움 락토퍼멘텀 ATCC 13869의 변이주로서 페니실린계 항생제에 감수성이 높고 글루타민산을 탄소원 및 질소원으로 자화할 수 없는 특징이 있어 주성분이 포도당, 전분가수 분해물, 폐당밀인 배지에서 배양시 글루타민산을 고수율, 고농도로 생산할 수 있는 미생물에 관한 것이다.

종래 미생물을 이용하여 글루타민산을 생산하는 방법으로는 포도당, 전분가수분해물 등과 같은 당질내에 비오틴이 존재하지 않거나 극미량 존재하는 원료인 경우은 배지중에 비오틴을 제한적으로 첨가하거나, 고가인 포도당 및 전분가수분해물 대신에 비오틴이 과잉으로 존재하는 폐당밀 등을 원료로 사용하는 경우에는 계면활성제(양이온, 음이온, 비이온계) 또는 페니실린계 항생제를 첨가하여 글루타민산을 생산하는 방법이었다.

그러나 생산원가면에서 유리한 폐당밀(사탕수수당밀, 사탕무우당밀)속에는 비오틴이 과잉으로 존재하고 있음은 물론, 당밀의 종류 및 생산지등에 따라 비오틴의 함량에 차이가 나기 때문에 이를 사용할 경우, 비오틴의 농도에 따라서 페니실린계 항생제 또는 계면활성제의 첨가시기 및 양이 달라지고 이에 따라 생산성에도 영향을 미치는 문제점이 있었다.

또한, 글루타민산 발효의 실제에 있어서 발효가 진행됨에 따라서 배지중에 글루타민산이 축적됨으로 인해 발효시작 전반부와 발효가 계속진행된 후반부의 구간별 당질소모에 대한 생산수율을 보면 후반부의 글루타민산 생산 수율이 현저하게 저하되는 것이 발견된다.

이러한 현상은 핵심효소인 글루타메이트 디하이드로게네이즈가 발효후반부가 되면 글루타민산에서 알파케토글루타레이트로의 반응을 진행시켜 기생성된 글루타민산이 소모됨에 의한 생산성의 저하로 판단된다.

따라서 본 발명자등은 상기 지적된 원인을 제거하고 어떠한 원료나 생산방법을 사용하더라도 항상 글루타민산을 고수율, 고농도로 생산할 수 있는 미생물을 변이처리 결과 획득하여 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명의 미생물은 세포벽합성능력이 부분적으로 결손되어 세포내에 생성된 글루타민산을 세포외로 용이하게 배출시켜서 세포내에 글루타민산이 고농도로 축적되거나 또는 세포내에 글루타민산이 과도하게 생성, 축적되므로해서 세포내에서 야기될 수 있는 생체내의 역기능을 제거키 위한 페니실린계 항생물질에 대한 높은 감수성 및/발효시에 있어서 세포외에서의 글루타민산의 농도가 높아짐에 따라 세포내에서도 글루타민산의 농도가 높아지게 되고 이런 환경이 조성되면 글루타메이트 디하이드로게네이즈가 역으로 작용하여 알파케토글루타레이트가 생성되거나 또는 상호 평행을 유지하므로써 글루타민산을 생성하지 못하는 역기능을 완화시키기 위해서 글루타민산을 탄소원 및 질소원으로 자화할 수 없는 특징을 가진 미생물이다.

본 발명의 미생물(KFCC 10651)은 브레비 박테리움 락토퍼멘텀 ATCC 13869를 친주로하여 자외선조사, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소-구아니딘(NTG)등의 변이 유발제로 통상적인 방법에 따라 처리한후 복합배지(폐당밀 0.5%, 포도당 2.0%, MgSO₄0.5g/l, 요소 0.1%, FeSO₄20mg/l, MnSO₄20mg/l, K₂HPO₄0.5g/l, KH₂PO₄1g/l, (NH₄)₂SO₄0.5%, 티아민염산염 200μg/l, 비오틴 20μg/l, 한천 20g/l, pH 7.0)에 도말하여 코로니를 형성시킨다음, 페니실린이 농도별로 첨가된 페니실린 첨가배지(육즙 1%, 펩톤 1%, 효모엑기스 0.5%, 포도당 1.0%, NaCl 0.25%, 한천 20g/l, 페니실린 0.01-0.4μ/ml까지 농도별로 첨가)로 이식하여 페니실린에 감수성이 높은 1차변이주를 얻은후 이를 다시 상술한 변이유발제로 처리하여 복합배지에 도말하고 코로니를 형성시킨다음, 탄소원 및 질소원으로 글루타민산만이 첨가된 글루타민산배지(글루타민산 나트륨염 10g/l, KH₂PO₄1g/l, K₂HPO₄0.5g/l, FeSO₄20mg/l, MnSO₄, 20mg/l, MgSO₄0.5g/l, 티아민염산염 200μg/l, 비오틴 20μg/l, pH 7.0, 한천 20g/l)로 이식하여 생육하지 않은 변이주를 획득하고 이를 1988. 12. 6. 자로 한국종균협회에 기탁하였다(기탁번호 ; KFCC 10651).

본 발명 미생물의 특성은 다음의 표에 기재된 바와 같다.

[표 1] 페니실린계 항생제에 대한 감수성 비교

＜주＞ + ; 생육, - ; 생육치못함, 30℃에서 48시간 배양.

[표 2] 글루타민산 배지에서의 생육도 비교

＜주＞ 글루타민산배지 조성중 한천을 제외한 배지사용, 용량 500ml의 배양용 삼각플라스크에 사용배지 40ml를 넣고 살균후 균주를 식균하여 30℃에서 180rpm으로 72시간 진탕배양.

다음의 실시예에서 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다.

실시예 1

사용균주 ; 본 발명 미생물(KFCC 10651), ATCC 13869.

1차종배지 ; 폐당밀 0.5%, 포도당 9.0%, MgSO₄0.5g/l, 요소 0.1%, FeSO₄20mg/l, MnSO₄20mg/l, K₂HPO₄0.5g/l, KH₂PO₄1g/l, (NH₄)₂SO₄0.5%, 티아민염산염 200μg/l, 비오틴 20μg/1, pH 7.0.

2차종배지 ; 폐당밀(전화당으로) 2.0%, 글루코오즈 1%, 콘스팁리커 3%, MgSO₄0.5g/l, 요소 0.2%, KH₂PO₄1g/l, K₂HPO₄0.5g/l, FeSO₄10mg/l, MnSO₄10mg/l, (NH₄)₂SO₄0.3%, 티아민염산염 200μg/l, 비오틴 100μg/l, pH 7.0.

발효배지 ; 폐당밀(전화당으로)8%, NH₄H₂PO₄0.15%, FeSO₄10mg/l, MnSO₄10mg/l, 콘스팁리커 3%, (NH₄)₂SO₄0.3%, 티아민염산염 200μg/l, pH 7.0.

1차종배양 ; 1차종배지를 40ml씩 250ml 용량의 진탕용 삼각플라스크에 넣고 살균후 사용균주를 식균하여 180rpm으로 30℃에서 20-24시간 진탕배양하였다.

2차종배양 ; 2차종배지를 2.6리터 용량의 시험용발효조에 각 1.2리터씩 분주하고 121℃에서 10분간 살균, 냉각후 1차종배양에서 얻은 배양완료액을 5ml씩 접종하고 공기를 매분당 0.5-1.0리터 공급하면서 900rpm으로 30℃에서 12-25시간 배양하였다.

발효방법 ; 상기 발효배지를 5리터 용량의 시험발효조에 1.8리터씩 분주하고 121℃에서 10분간 살균, 냉각하여 2차종배양액을 약 150ml씩 접종한후 공기를 매분당 1-2.5리터씩 공급하면서 900rpm, 30-37℃에서 배양하되 대수 증식기 초기부터 말기[OD₅₆₂0.15-0.4(OD₅₆₂×100)]사이에 페니실린을 0.3-1.2μ/ml 첨가하였다. 배양중 잔존 당농도가 0.5-1.5%가 되면 살균된 폐당밀 또는 폐당밀과 원당을 일정비율 혼합한 혼합당을 수시로 공급하였다. 추가한 당밀 또는 혼합당과 초기의 발효배지에 첨가된 당의 합계가 발효액량 대비 19%가 될때까지 계속 배양하였다. 배양중 pH는 암모니아수를 사용하여 7.8로 조절하였다. 배양완료후 글루타민산의 농도는 ATCC 13869가 98.2g/l, KFCC 10651이 143.8g/l이었다.

상술한 바와 같이 본 발명의 미생물은 통상 글루타민산의 발효시에 사용되는 원료 즉, 포도당, 전분가수분해물(옥수수, 고구마, 타피호카 등의 전분), 폐당밀(사탕수수당밀, 사탕무우당밀)등을 사용할 수 있고 어떠한 원료를 사용하여라도 고농도, 고수율의 글루타민산을 생산할 수 있음은 물론, 글루타메이트 디하이드로게네이즈와 역반응기작의 효소활성이 실활 또는 매우 약화되어 발효말기의 글루타민산 생산농도 및 생산수율을 향상시킬 수 있는 특징이 있는 것이다.

Claims

페니실린계 항생제의 농도가 0.03μ/ml 이상인 조건하에서는 생육할 수 없고, 글루타민산을 탄소원 및 질소원으로 사용할 수 없는 미생물로, 글루타민산을 생산하는 브레비박테리움 락토퍼멘텀 KFCC 10651.
브레비박테리움 락로퍼멘텀 KFCC 10651을 폐당밀, 포도당, 전분가수분해물 및 원당등이 포함된 배지중에서 배양하여 배양물로부터 글루타민산을 채취하는 것을 특징으로 하는 미생물을 이용한 글루타민산의 제조방법.