KR930008969B1 - 반코마이신을 생산하는 미생물 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

반코마이신을 생산하는 미생물

본 발명은 반코마이신을 생산하는 신규미생물 및 그 취득방법과 이 신규미생물을 사용한 발효에 의해서 반코마이신을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 특징은 자체 생성물인 반코마이신에 내성을 가지며, 당, 콩가루, 감자단백등을 주원료로 한 영양배지에서 호기적으로 배양하여 배양액중에 반코마이신을 고수율로 축적시키는 미생물 및 반코마이신의 제조방법에 관한 것으로 동미생물은 1991.11.20 사단법인 한국종균협회에 기탁하였다(기탁번호 KFCC 10745).

반코마이신은 글라이코펩타이드계의 항생제로서 항균기작은 세균의 세포벽 합성을 저해하는 것이다. 따라서 모든 그람양성 세균성 질환의 치료에 사용되며 특히 페니실린이나 세파로스포린계의 항생제에 저항성이 있는 세균성 질환의 치료나 알레르기가 있는 환자의 치료에 그 유용성이 높아지고 있다.

종래의 발효기술(미국특허 3,067,099)은 균주의 역가(0.2mg/ml)가 낮아 생산비용이 높은 단점이 있다. 상기의 문제점을 고려하여 본 발명의 목적은 반코마이신을 생산량이 크게 향상된 변이주를 분리하여 저가의 배지원으로 공업적으로 대량의 반코마이신들 제조하는데 있다. 본 발명에서는 국제 미생물 기탁기관인 에이티씨씨(The Amaerican Type Culture Collection, ATCC)로부터 분양받은 노카르디아 오리엔탈리스(Nocardia orientalis ATCC 19795) 균주를 친주로 사용하였다.

우수균주로 개량하기 위한 돌연변이원으로 자외선을 실시예 1의 방법으로 처리하여 반코마이신을 50-225mg 농도별로 첨가한 전분 1.0%, Bacto soytone 1.0%, 한천 2.0%로 구성되고 pH 7.0으로 조정된, "완전배지"(주1)에 도말하여 25℃-30℃ 항온기에서 3-6일간 배양하여 반코마이신 200mg/ℓ에서도 성장이 가능한 반코마이신 내성균주를 구한후 반코마이신에 성장이 억제되는 바실러스 써브틸리스(Bacillus subtilis ATCC 6677)의 배양액을 분주하여 30℃에서 하루더 배양하였다. 이때 나타나는 억제환의 크기가 친주보다 큰 변이주들을 선택하여 포도당 1.0%, 효모즙 0.3%, 맥아즙 0.3%, 펩톤 0.5%, 한천 2.0%로 구성되고 PH7.2로 조정된 "한천사면배지"(주2)에서 5-10일간 배양하였다. 이렇게 선별된 변이주들에 대한 반코마이신의 생산성 조사를 실시예 2와 같은 방법으로 실시하였다.

삼각플라스크에서의 반코마이신 생산성을 조사한 결과 친주인 노카르디아 오리엔탈리스 ATCC 19795(반코마이신 생성량 0.2mg/ml)보다 반코마이신의 생산성이 우수한 반코마이신 내성균주인 노카르디아 오리엔탈리스 CVA-2(KFCC 10745 : 반코마이신 생성량 2.3mg/ml)를 선별하였다. 선별된 변이주를 20계대 배양 동안의 생산역가를 비교실험한 결과 생산역가가 감소하지 않는 우수한 변이주로 판명되었다.

본 발명에서 얻어진 노카르디아 오리엔탈리스 CVA-2(KFCC 10745) 균주는 미생물학적으로 다음과 같은 특성을 가지고 있다.

1. 배지상의 생육상태.

1)현미경적 소견

영양세포의 형태(Y.M 배지) : 가지형태 균사.

영양세포의 증식(Y〉M 배지) : 균사.

2)한천 시면배지에서 성장특징.

* + : 성장, - : 성장치 못함.

2. 생리학적 특징.

산소요구성 : 호기성

최적생육온도 : 25℃-35℃

최적생육 pH : 6.5-8.0

그람염색 : +

AFB 염식 : -

질산염 테스트 : +

카탈라아제 테스트 : +

우레아제 테스트 : +

β-용혈 테스트 : +

3. 당의 이용성.

글로코오스 : +

프락토오스 : +

만노오스 : +

락토오스 : +

말토오스 : +

트리할로오스 : +

만니톨 : +

라피노스 : -

반코마이신 생산에 사용된 배지조성으로는 실시예 2에서 보는 바와 같이 탄소원, 유기영양원 및 소량의 무기물을 함유한 합성배지를 이용할 수 있다. 탄소원으로는 포도당, 과당, 전분, 가수분해전분등이 양호하며 유기영양원으로는 효모즙, 맥아즙, 참치즙, 대두박, 콩가루, 가자단백등이 양호하고 무기물로는 염화나트륨이 사용된다.

배양조건은 호기적 조건하에 배양온도 30℃-35℃, pH는 배양시작시 7.8-8.0에서 배양중 pH가 떨어지면 암모니아수를 이용하여 pH를 6.6-7.0으로 자동제어하였다. 아울러 균주의 성장에 따라 충분한 산소를 공급하기 위하여 RPM, 내압, 통기량을 조절하였다.

이와같은 본 발명을 실시예에 의하여 좀더 상세하게 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

돌연변이에 의한 반코마이신 내성균주 분리 방법.

변이주 분리는 친주인 노카르디아 오리엔탈리스 ATCC 19795를 사면 배양후 멸균된 생리식염수를 가하고 유리솜을 이용하여 균사체를 여과 분리시켜 포자현탁액을 조제한다. 이 포자현탁액에 자외선을 사멸율이 99.9%되게 40-60초 처리한 후 반코마이신을 10-225mg/ℓ(표 1)를 농도별로 첨가한 완전배지(주1)에 도말하여 30℃에서 3-6일간 배양하여 반코마이신 200mg/ℓ에서도 성장이 가능한 반코마이신 내성균주의 콜로니를 구한후 반코마이신에 성장이 억제되는 바실러스 써브틸리스 ATCC 6677의 배양액을 분주하여 30℃에서 하루더 배양하였다. 이때 나타나는 억제환의 크기가 친주보다 큰 변이주들을 선택하여 한천 사면 배지(주2)에서 5-10일간 배양하였다.

이와 같은 분리된 노카르디아 오리엔탈리스 ATCC 19795 변이주들을 삼각플라스크에 의하여 생산배양을 실시한 후 역가를 측정하여 반코마이신 역가 우수한 노카르디아 오리엔탈리스 CVA-2를 얻었다.

분리된 우수균주는 10% 스킴 밀크(skim milk)를 이용하여 액체질소 탱크에서 장기 보존하였고 재사용시는 녹인후 전배양배지에 식균하여 사용하였다.

[표 1] 반코마이신에 대한 내성 비교.

* + : 성장, - : 성장치 못함.

[실시예 2]

삼각플라스크에 의한 친주 및 본 발명 변이주의 반코마이신 생산력 비교.

전배양 배지

포도당 1.7%

맥아즙 0.3%

효모즙 0.3%

펩톤 1.1%

pH 7.2

종배양 배지

산화전분 5.0%

감자단백 0.5%

콩가루 0.5%

탄산칼슘 0.3%

소포제 0.2%

pH 7.2

생산 배지

가수분해전분 10.0%

감자단백 1.8%

콩가루 1.8%

염화나트륨 0.12%

소포제 0.2%

pH 7.8

[배양방법]

상기 조성의 전배양 배지 25ml을 250ml 삼각플라스크에 넣어 121℃에서 15분간 가압 살균한다. 이때 포도당은 별도로 살균후 첨가하였다. 각 균주를 식균하여 30℃에서 회전교반 배양기를 RPM 200 조건으로 24-30시간 배양한다.

상기 조성의 종배양 배지 25ml을 500ml 삼각플라스크에 넣어 121℃에서 30분간 가압 살균후 배양이 완료된 전배양 배양액을 0.1% 접종하여 30℃에서 30-40시간 배양한다. 생산배지 25ml을 500ml 삼각플라스크에 넣어 121℃에서 30분간 가압 살균후 멸균된 1N NaOH를 이용하여 pH를 7.8로 조절한 후 34℃에서 회전교반 배양기를 RPM 200조건으로 100시간 배양하였다. 그 결과는 표 2와 같으며 이때 USP반코마이신을 표준물질로 사용하여 HPLC 방법으로 정량하였다.

[표 2] 친주 및 변이주의 역가비교

[실시예 3]

발효조건에 의한 친주 및 본 발명 변이주의 반코마이신 생산력 비교.

본 실시예의 배지조성, 반코마이신의 정량방법등은 실시예 2와 동일하며 30L 발효조에 종배양배지 20L를 채운후 25분동안 살균하였다. 살균후 멸균된 1N NaOH를 이용하여 pH를 7.2로 조절한 후 실시예 2와 같은 방법으로 배양된 전배양 배양물 0.1%를 식균하여 종배양을 실시하였다. 30L 발효조에 생산배지 20L를 채운후 30분동안 가압 살균하였다. 이때 가수분해전분은 별도로 살균후 첨가하였다. 식균직전 배지의 pH를 멸균된 5N NaOH를 이용하여 pH를 7.8 조절한 후 배양이 완료된 종배양액을 준비된 생산 배양조에 5% 식균하였다. 34℃, 250-350 RPM, 통기량 0.5-1.0VVM. 내압 0.5-1.0atm의 조건에서 110시간 배양하였다. 이때 배양중 pH가 6.8이하시 암모니아수를 이용하여 pH를 6.8로 자동조절하였다. 그 결과는 표 3과 같다.

[표 3] 발효조에서 친주 및 변이주의 생산력 비교.

Claims (1)

1. 노카르디아 오리엔탈리스 변이주에 속하고 반코마이신에 대한 내성을 가짐을 특징으로 하는 변이주 KFCC 10745