KR100515186B1

KR100515186B1 - 테이코플라닌 고생산 변이주 에티노플레네스 테이코마이세티쿠스를 이용한 테이코플라닌의 발효 제조방법

Info

Publication number: KR100515186B1
Application number: KR10-2002-0022138A
Authority: KR
Inventors: 이연우; 현형환; 김혜진; 박상미; 정지현; 최창윤; 이정걸; 김상용
Original assignee: 주식회사 바이오앤진
Priority date: 2002-04-23
Filing date: 2002-04-23
Publication date: 2005-09-16
Also published as: KR20020057853A

Abstract

본 발명은 테이코플라닌을 생산하는 에티노플레네스 테이코마이세티쿠스(Actinoplanes teichomyceticus) 변이주 및 이 변이주를 이용한 테이코플라닌의 제조 방법에 관한 것으로, 야생주에 인공돌연변이를 통해 테이코플라닌 고생산성 에티노플레네스 테이코마이세티쿠스 균주를 분리하고 각종 배양조건을 최적화함으로써 고수율로 테이코플라닌을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

Description

테이코플라닌 고생산 변이주 에티노플레네스 테이코마이세티쿠스를 이용한 테이코플라닌의 발효 제조방법{Fermentation method for producing teicoplanin using hyper-productive mutant strain of Actinoplanes teichomyceticus }

본 발명은 그람양성균 치료제인 테이코플라닌(teicoplanin)을 생산하는 에티노플레네스 테이코마이세티쿠스(Actinoplanes teichomyceticus) 변이주 및 그 변이주를 이용한 테이코플라닌의 발효 생성 방법에 관한 것이다.

테이코플라닌은 에티노플레네스 테이코마이세티쿠스의 발효에 의해 생산되는 살균성 글라이코펩타이드(glycopeptide) 항생제로서 그람양성균의 세포벽 합성을 저해한다. 특히 테이코플라닌은 페니실린(penicillin) 내성 균주에 인한 감염을 치료할 뿐만 아니라 반코마이신(vancomycin) 내성 균주에 의한 감염에도 치료되어진다.

테이코플라닌은 N-아세틸무라믹 애시드(acetylmuramic acid)와 N-아세틸글로코사민(acetylglucosamin)으로 구성되어 있는 펩티도글리칸(peptidoglycan) 중 N-acetylmuramic acid에 결합하고 있는 5개의 아미노산들 중에서 맨 마지막에 결합하는 D-알라닐(alanyl)-D-알라닌(alanine)의 다이펩타이드(dipeptide)와 결합함으로 그람양성균의 세포벽 합성과정에서 트랜스글리코실레이션(transglycosylation)과 트랜스펩티데이션(transpeptidation)을 저해한다(Mackay, J. P. 등, J. Am. Chem. Soc, 116:4581-4590 (1994)). 따라서 테이코플라닌은 그람음성균의 감염보다 그람양성균감염 치료에 효과적이며 특히, 스타필로코커스(Staphylococcus)와 스트렙토코커스(Streptococcus)에 더 높은 치료효과를 보인다. 또한 테이코플라닌은 메티실린(methicillin)에 내성을 가지는 메티실린 내성 포도상구균(methicillin resistance Staphylococcus aureus, MRSA)에 의한 감염을 치료하는데 사용되어진다(Malabarba, A. 등, J. Antibiotics, 37:988-999 (1984)).

테이코플라닌 구성성분들의 생물학적 특성을 살펴보면 폐혈증에 감염된 쥐에게 각각의 테이코플라닌 구성성분들을 투여하여 폐혈증에 감염된 쥐 중 50%가 치료되었을 때를 살펴보면 T-A2-4와 T-A2-5가 가장 적은 양을 투여하여도 치료효과가 나타났다. 그러나 각 구성성분의 독성에 있어서 T-A2-1, T-A2-2, T-A2-3은 약 1,000mg/kg에서 2,000mg/kg을 각각 투여하였을 때 정상 쥐의 50%가 사망하였고 T-A2-4와 T-A2-5는 각각 500mg/kg에서 1,000mg/kg 정도만 투여하여도 50%의 치사율을 나타냈다(Borghi, A. 등 1984, J. Antibiotics, 37:615-620).

에티노플레네스 테이코마이세티쿠스(Actinoplanes teichomyceticus)에 대한 연구와 보고는 아직 미흡할 뿐만 아니라 테이코플라닌 생합성 경로 및 조절 기작에 대하여 보고 된 것이 극히 제한적이다. 따라서, 테이코플라닌 생산 균주의 역가 향상은 주로 인공 돌연변이를 통해 이루어지고 있으며 테이코플라닌의 전구 물질을 이용하여 생산 역가를 높이려는 연구들이 보고되고 있다(Borghi, A. 등 J. General Microbiology, 137:587-592 (1991)). 그 외에도, 테이코플라닌의 5종 구성성분 중 가장 많은 비율을 차지한 T-A2-2의 생산성을 높이거나, 유기합성에 의해 테이코플라닌 유도체를 생산하여 그 유도체의 생물·화학적 특성을 밝히는 연구를 하고 있다(Malabarba, A 등 J. Antibiotics, 37:989-999 (1984) , Malabarba, A 등 J. Antibiotics, 39:1430-1442 (1986)).

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 그람양성균 치료제인 테이코플라닌을 고수율로 생산하는 에티노플레네스 테이코마이세티쿠스(Actinoplanes teichomy- ceticus) 미생물 변이주를 분리 동정 개발하고, 배양 조건을 최적화함으로써 테이코플라닌의 생산성을 향상시키는 데 그 목적이 있다.

따라서 본 발명의 목적은 야생주 에티노플레네스 테이코마이세티쿠스 ATCC-31121을 자외선을 사용하여 인공 돌연변이시킨 후, 생장한 돌연변이 균주를 도말 배양하여 돌연변이 균주 주위에 포도상구균이 생장하지 못하여 생성된 생장억제환(clear zone)이 모균주와 비교하여 크거나 균락의 크기에 비해 생장억제환이 현저하게 큰 균주 중 테이코플라닌을 가장 많이 생성하는 균주를 선별하고, 다시 자외선을 이용하여 돌연변이시켜 테이코플라닌을 과량 생산하는 균주를 선별함을 특징으로 하는 테이코플라닌 생성 변이주 에티노플레네스 테이코마이세티쿠스 M76-35-7(기탁번호 KCCM-10363호)의 분리방법 및 분리된 테이코플라닌 생성 변이주 에티노플레네스 테이코마이세티쿠스 M76-35-7(기탁번호 KCCM-10363호)을 제공하는 것이다.

또한 에티노플레네스 테이코마이세티쿠스 M76-35-7(기탁번호 KCCM-10363호)을 종 배양시킨 후, 포도당 10∼30g/L, 효모추출물 2∼6g/L 및 무기염류를 함유하는 생장배지에서 생장시킨 후, 덱스트린 50∼150g/L, 효모추출물 3∼7g/L, 감자 단백질, 콩가루 및 무기염류를 함유하는 생산배지에서 성장시켜 고수율로 테이코플라닌을 발효 생성 제조하는 방법을 제공한다.

이때, 상기 종 배양은 초기 농도를 30∼50g/L으로 하고, 포도당의 농도를 10∼15g/L로 유지시킴을 특징으로 하고, 생산배지의 조성은 덱스트린 80∼150g/L, 효모추출물 3∼7g/L, 감자 단백질 12∼24g/L, 콩가루 12∼24g/L, corn steep liquor, cotton seed flour 등의 질소원 및 무기염류를 함유함을 특징으로 한다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 테이코플라닌 과량생산 변이주 에티노플레네스 테이코마이세티쿠스 M76-35-7(기탁번호 KCCM-10363호)을 제공하는 것이다. 한편, 상기 변이주는 야생주 에티노플레네스 테이코마이세티쿠스 ATCC-31121을 UV를 사용하여 인공돌연변이 시켜 돌연변이주를 분리하고 분리된 변이주를 다시 UV를 사용하여 인공돌연변이를 하여 돌연변이주를 선별하였다. 또한, 성장배지에서 종배양된 상기 균주 에티노플레네스 테이코마이세티쿠스 M76-35-7(기탁번호 KCCM-10363호)을 질소원의 종류, 탄소원의 종류 및 농도를 조절하여 배양 발효시켜 테이코플라닌을 제조함을 특징으로 하고 이때 생장배지는 포도당 20g/L, 효모추출물 4g/L, 펩톤 4g/L, 일인산칼륨 2g/L, 이인산칼륨 4g/L을 함유하는 배지이며 배지내에 포도당의 농도가 약 10g/L이 남아 있을 때까지 진탕 배양한다. 생산배지는 덱스트린 80g/L, 콩가루 18g/L, 감자 단백질 18g/L, 효모추출물 5g/L, 황산마그네슘 0.5g/L, 염화나트륨 1.2g/L, 염화칼슘 0.1g/L, 탄산칼슘 5g/L을 함유하는 배지이다.

친주 에티노플레네스 테이코마이세티쿠스 균주에 돌연변이원인 UV를 균주의 포자에 40∼60초 동안 처리하였다. 2시간 동안 암반응을 시킨 후 돌연변이 균주 중 야생주 보다 테이코플라닌을 고생산하는 균주를 선별하기 위한 선별 한천배지에 도말 하여 30℃에서 포자가 생장할 때까지 배양하였다.

선별 배지의 성분 구성표

성분	농도(%)
덱스트린	2.0
효모추출물	0.5
황산마그네슘(MgSO₄·7H₂O)	0.05
염화나트륨(NaCl)	0.01
염화칼슘(CaCl₂)	0.01
한천	2

선별배지에서 배양한 균주 중 테이코플라닌을 과량 생산하는 균주를 선별하기 위하여 포도상구균을 액체배지에 배양한 후 생장한 돌연변이 균주 위에 도말한 후 37℃에서 배양하여 돌연변이 균주 주위에 포도상구균이 생장하지 못하여 생성된 생장억제환(clear zone)이 모균주와 비교하여 크거나 균락의 크기에 비해 생장억제환이 현저하게 큰 균주를 선별하였다. 선별된 균주를 3차례 UV에 돌연변이 시킨 후 테이코플라닌을 과량 생산하는 균주를 최종적으로 선별하였다.

본 발명에서 분리된 변이주의 배양 방법과 분석 방법은 다음과 같다.

본 발명 변이주의 배양은 30℃, 200rpm에서 7∼8일간 진탕 배양하였다. 발효 액의 테이코플라닌 농도는 발효 액을 수산화나트륨(5M NaOH)용액으로 pH 11로 보정하여 균체를 제거한 후 0.45㎛ 여과 막으로 여과한 다음 역상칼럼(C₁₈, Zorbox, Japan)과 UV 디텍터(detector)(254nm)가 장착된 HPLC(Hewlett Packard 1100 series, USA)를 이용하여 측정하였다. 이때, 이동상은 0.2% 포름산(formic acid)과 아세토나이트릴(acetonitrile)을 9 : 1로 혼합한 용액(A 용액)과 0.2% 포름산과 아세토나이트릴을 3 : 7로 혼합한 용액(B 용액)을 섞어 사용하였고, 유속은 1mL/min이었다.

친주 에티노플레네스 테이코마이세티쿠스(Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121)와 높은 테이코플라닌 생산성을 나타내는 본 발명 변이주 에티노플레네스 테이코마이세티쿠스 M76-35-7의 형태적, 생리적, 생화학적 특성은 아래 표 2와 같다.

본 발명 변이주 에티노플레네스 테이코마이세티쿠스 M76-35-7의 형태적, 생리적, 생화학적 특성

특성	친주(에티노플레네스 테이코마이세티쿠스 ATCC31121)	본 발명 변이주(에티노플레네스 테이코마이세티쿠스 M76-35-7)
세포모양	균사체(filamentous)	균사체(filamentous)
균락색깔	오렌지색	오렌지색
용해성 색소	-	-
산소 요구성	호기성	호기성
온도별 균의 증식
20℃	+	+
30℃	+	+
33℃	+	+
40℃	-	-
황산형성	+	+
멜라닌 형성	+	+
타이로신분해	-	-
전분분해	+	+

본 발명 변이주 에티노플레네스 테이코마이세티쿠스 M76-35-7의 탄소원 이용

탄소원	증식여부
탄소원	친주 (에티노플레네스 테이코마이세티쿠스 ATCC31121)	변이주 (에티노플레네스 테이코마이세티쿠스 M76-35-7)
포도당	+	+
글리세롤	+	+
갈락토스	+	+
프록토스	±	±
슈크로스	+	+
락토스	±	+
말토스	+	+
소르비톨	+	+
이노시톨	-	-
자일로스	+	+
덱스트린	+	++
만노스	+	+
만니톨	+	+

본 발명을 실시예에 따라 상술하면 다음과 같다.

(실시예 1) 삼각플라스크에서 친주 및 본 발명 변이주의 테이코플라닌 생산성 비교 실험

선별된 균주의 테이코플라닌 생산성을 다음과 같은 조건에서 비교하였다. 선별된 각각의 균주들을 10ml의 생산배지(표4)가 담긴 100ml 삼각플라스크에 접종하여 200rpm, 30℃에서 7∼8일동안 배양하였다. 배양액을 수산화나트륨을 첨가하여 pH 11로 보정한 후 균체를 제거하고 HPLC로 분석하여 테이코플라닌 생산량을 조사하였고, 테이코플라닌 생산성이 가장 높은 본 발명 변이주(기탁번호 KCCM-10363호)를 선별하였으며 그 결과는 아래 표와 같다.

생산배지의 성분 구성표

성분	농도(g/L)
덱스트린	80
효모추출물	5
콩가루	18
감자 단백질	18
황산마그네슘(MgSO₄·7H₂O)	0.5
염화나트륨(NaCl)	1.2
염화칼슘(CaCl₂)	0.1
탄산칼슘(CaCO₃)	5

친주와 본 발명 변이주의 테이코플라닌 생산성

균주	테이코플라닌(mg/L)
친주(ATCC31121)	50
본 발명 변이주 M76-35-7	514

(실시예 2) 테이코플라닌 발효 생성 시험(탄소원 종류에 대한 테이코플라닌 생산성 실험)

배양 방법은 실시예 1과 같고, 100mL 삼각플라스크에서 탄소원 종류에 따른 본 발명 변이주 에티노플레네스 테이코마이세티쿠스 M76-35-7의 테이코플라닌 생산 실험을 수행하였다. 여러 종류의 탄소원을 첨가하여 30℃, 200rpm,에서 7∼8일 동안 배양하였다. 탄소원의 종류를 달리하여 실험한 결과 표 6과 같았고 탄소원으로 덱스트린을 사용하였을 때 최적의 생산성을 나타내었다.

본 발명 변이주 에티노플레네스 테이코마이세티쿠스 M76-35-7을 이용한 테이코플라닌 생산에 미치는 탄소원의 영향

탄소원	테이코플라닌(mg/L)
덱스트린	514
프록토스	337
갈락토스	<125
포도당	<125
락토스	167
말토스	447
만노스	145
소르비톨	<125
전분	167
슈크로스	192

(실시예 3) 테이코플라닌 발효 생성 시험(덱스트린 농도에 따른 테이코플라닌 생산성 실험)

배양방법은 실시예 1과 같으며, 덱스트린 초기 농도를 80g/L, 100g/L, 120g/L, 150g/L로 각각 달리하여 배양한 결과 표 7과 같았고 150g/L 덱스트린 농도에서 최적의 생산성이 나타났다.

에티노플레네스 테이코마이세티쿠스 변이주를 이용한 테이코플라닌 생산에 미치는 초기 덱스트린 농도의 영향

덱스트린 농도(g/L)	테이코플라닌(mg/L)
80	490
100	564
120	538
150	655

(실시예 4) 에티노플레네스 테이코마이세티쿠스 변이주를 이용하여 여러 가지 질소원 종류에 따른 테이코플라닌 발효 생성 시험

질소원의 종류에 따른 본 발명 변이주의 테이코플라닌 생산 실험을 수행하였다. 배양방법은 실시예 1과 같고, 생산배지(덱스트린 80g/L, 염화칼슘 0.1g/L, 염화나트륨 1.2g/L, 황산마그네슘 0.5g/L, 탄산 칼슘 5g/L, 콩가루 18g/L, 감자 단백질 18g/L, 효모추출물 5g/L)에 여러 가지 종류의 질소원을 0.5% 되도록 첨가하여 배양한 결과 표 8과 같았고 cotton seed flour와 corn steep liquor를 첨가하여 배양하였을 때 가장 높은 테이코플라닌 생산을 나타냈다.

에티노플레네스 테이코마이세티쿠스 변이주를 이용한 테이코플라닌 생산에 미치는 질소원의 영향

질소원	테이코플라닌(mg/L)	백분율(%)
질소원	테이코플라닌(mg/L)	T-A2-2	T-A2-3	T-A2-4	T-A2-5
not-added	555	64.6	10.6	13.0	11.9
corn steep liquor	968	61.3	10.9	13.8	14.1
Corn steep solid	384	54.5	17.5	18.4	9.6
Cotton seed flour	1051	66.3	10.3	11.2	12.1
Fishmeal	702	64.5	17.6	9.4	8.5
Gluten meal	629	53.7	19.6	14.1	12.6
HVP	929	59.2	17.3	12.0	11.4
NH₄Cl	-^a	-	-	-	-
(NH₄)₂SO₄	-^a	-	-	-	-
Wheat meal	898	62.3	11.6	11.6	14.4

-^a 검출되지 않음

(실시예 5) 온도 변화에 따른 테이코플라닌 생성 시험

7L 발효조에서 여러 배양 온도에 따른 본 발명 변이주 에티노플레네스 테이코마이세티쿠스 M76-35-7의 테이코플라닌 생산 실험을 수행하였다.

종 배양 : 에티노플레네스 테이코마이세티쿠스의 단일 균락을 전 배양 배지 25ml이 포함되어 있는 500ml 플라스크에 접종하여 진탕배양기에서 250rpm, 30℃로 48-60시간 동안 배양한 후 12.5ml의 배양액을 2.5L의 종 배양 배지가 들어 있는 5L 발효조에 접종하여 28℃, 900rpm으로 60∼72시간동안 배양하였다. 종 배양에서 포도당이 10g/L남아 있을 때 230ml의 종배양액을 4.6L의 생산배지가 들어 있는 7L 발효조에 접종하여 900rpm으로 7∼8일동안 배양하였다.

전 배양 배지의 성분 구성표

성분	농도(g/L)
포도당	20
효모추출물	4
펩톤	4
일인산화칼륨(KH₂PO₄)	2
이인산화칼륨(K₂HPO₄)	4
황화마그네슘(MgSO₄·7H₂O)	0.5

종 배양 배지의 성분 구성표

성분	농도(g/L)
포도당	30
효모추출물	5
콩가루	18
감자 단백질	18
염화나트륨(NaCl)	1.2
염화칼슘(CaCl₂)	0.1
황화마그네슘(MgSO₄·7H₂O)	0.5
탄산칼슘(CaCO₃)	5

본 배양 : 7L 발효조(Kobiotech Co., Korea)에서 본 배양을 수행하였다. 배양에서 당과 효모추출물이 함유된 생산배지의 부피가 4.6L였고 초기 교반 속도 및 통기량은 각각 900rpm, 1vvm으로 조절하였다. pH는 발효 전 과정 동안 조절하지 않았다. 배양 온도를 달리하여 실험한 결과 표 12와 같았고 33℃에서 배양하였을 때 최적의 생산을 나타내었다.

생산배지의 성분 구성표

성분	농도(g/L)
포도당	20
덱스트린	60
효모추출물	5
콩가루	18
감자 단백질	18
염화나트륨(NaCl)	1.2
염화칼슘(CaCl₂)	0.1
황화마그네슘(MgSO₄·7H₂O)	0.5
탄산칼슘(CaCO₃)	5

에티노플레네스 테이코마이세티쿠스 변이주를 이용한 테이코플라닌 생산에 미치는 배양온도의 영향

온도(℃)	균체(%)	테이코플라닌(mg/L)
25	39	584
28	40	1347
33	35	1549

(실시예 6) 최적화한 조건에서의 테이코플라닌 생성 시험

7L 발효조에서 최적화한 배지와 온도에서 본 발명 변이주 에티노플레네스 테이코마이세티쿠스 M76-35-7의 테이코플라닌 생산 실험을 수행하였다. 전 배양과 종배양은 실시예 5와 같고 7L 발효조(Kobiotech Co., Korea)에서 본 배양을 수행하였다. 생산배지의 조성은 표 11에 15ml/L의 corn steep liquor를 첨가하였다(표 13). 배양에서 당과 효모추출물이 함유된 생산배지의 부피가 4.6L였고 초기 교반 속도 및 통기량은 각각 900rpm, 1vvm으로 조절하였으며 33℃에서 배양하였다. pH는 발효 전 과정 동안 조절하지 않았다. 최적화된 배지와 온도에서 실험한 결과 도 1과 같았고 2.5g/L의 테이코플라닌을 생산하였다.

최적 생산배지의 성분 구성표

성분	농도(g/L)
포도당	20
덱스트린	60
효모추출물	5
콩가루	18
감자 단백질	18
염화나트륨(NaCl)	1.2
Corn steep liquor	15ml
염화칼슘(CaCl₂)	0.1
황화마그네슘(MgSO₄·7H₂O)	0.5
탄산칼슘(CaCO₃)	5

본 발명의 효과는 전량 수입에 의존하고 있는 그람양성균 치료제인 항생제 테이코플라닌의 생산을 현저하게 증가시킨 균주와 발효공정을 개발함으로서 저비용 고수율로 테이코플라닌을 발효 생산하기 위해 산업적으로 이용할 수 있으며 수입대체효과 및 국제 경쟁력에서 비교우위를 점할 수 있다.

도 1은 7L 발효조에서 시간 경과에 따른 테이코플라닌의 생산과 당의 농도 변화를 나타낸 그래프이다.

Claims

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에티노플레네스 테이코마이세티쿠스 M76-35-7(기탁번호 KCCM-10363호)을 종 배양시킨 후, 포도당 10∼30g/L, 효모추출물 2∼6g/L 및 무기염류를 함유하는 생장배지에서 생장시킨 후, 덱스트린 50∼150g/L, 효모추출물 3∼7g/L, 감자 단백질, 콩가루 및 무기염류를 함유하는 생산배지에서 성장시켜 고수율로 테이코플라닌을 발효 생성 제조하는 방법
제 3항에 있어서, 상기 종 배양은 초기 농도를 30∼50g/L으로 하고, 포도당의 농도를 10∼15g/L로 유지시킴을 특징으로 하는 고수율 테이코플라닌의 제조 방법
제 3항에 있어서, 생산배지의 조성은 덱스트린 80∼150g/L, 효모추출물 3∼7g/L, 감자 단백질 12∼24g/L, 콩가루 12∼24g/L, 옥수수 침출액 등의 질소원 및 무기염류를 함유함을 특징으로 하는 고수율 테이코플라닌 제조 방법