KR20200091580A - 반코마이신의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 글라이코펩타이드계 항생제인 반코마이신을 과량 생산하는 아미코라톱시스 오리엔탈리스(Amycolatopsisorientalis) 미생물 변이주를 개발하고, 이 변이주를 이용한 고생산성의 반코마이신 제조 방법을 제공하는 것으로, 야생주에 인공돌연변이를 통해 변형시켜 반코마이신 내성 및 반코마이신 생산능이 향상된 아미코라톱시스 오리엔탈리스균주를 개발하고, 무기염류, 비타민, 멜라닌 생합성 저해제 등의 미량원소를 함유하는 배지조성 및 배양조건을 최적화함으로써 고수율로 반코마이신을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

Description

반코마이신의 제조방법{Method for producing vancomycin}

본 발명은 글라이코펩타이드계 항생제인 반코마이신(vancomycin)을 발효, 생산하는 아미코라톱시스 오리엔탈리스 (Amycolatopsis orientalis) (한국미생물보존협회 기탁번호 KCCM-10293호로 기탁) 변이주 및 그 변이주를 이용하여 덱스트린 등의 탄소원, 콩가루 또는 감자단백 등의 질소원 및 무기질 미량원소 등의 배지 조성 및 배양 조건 최적화를 수행함으로써 고수율, 고생산성으로 반코마이신을 발효 생성하는 방법에 관한 것이다.

반코마이신은 글라이코펩타이드계의 항생제로서 병원균 세포벽의 합성을 저해하는 항균 기작을 갖는다. 모든 그람양성세균성 질환의 치료에 사용되며 페니실린이나 세파로스포린계의 항생제에 저항성이 있는 세균성 질환에 광범위하게 사

용된다. 또한 수술 환자 및 고령 환자, 면역력이 약한 사람에게 치명적인 메치실린 내성 황색 포도상 구균(MRSA)을 치료하는 유일한 항생제로 사용되고 있는 고부가가치 항생제이다.

반코마이신을 제조하기 위한 공지의 방법들의 발효농도는 매우 낮다. 미국 특허 제3,067,099호에서 개시한 반코마이신의 발효 생성 기술은 균주의 역가가 0.2 mg/mL로 매우 낮고 생산비용이 높은 단점이 있었다.

이를 해결하기 위해 반코마이신 생성 수율이 높은 각종 변이주를 개발하였는 바, 대한민국 특허 공개공보 제93-13090호에서는 노카르디아 속 변이주 KFCC-10745호를 개발하여 발효 배양시켜 반코마이신을 발효 생성하였으며, 또한 대한민국 특허 공개공보 제93-13091호에서도 노카르디아 속 변이주 KFCC-10744호를 개발하여 발효 배양시켜 반코마이신을 발효 생성하였다. 한편, 대한민국 특허 공개공보 제93-13090호에서는 상기 변이주 KFCC-10745호를 질소원으로 글루텐 및 대두박을 1.0∼2.0% 함유한 배양액에서 배양하여 반코마이신을 고수율로 축적시켜 제조하는 방법을 개시하고 있다.

노카르디아 속 변이주(최근 아미코라톱시스 속으로 속명 변경)들은 균주의 역가가 6.1 mg/mL 정도로 현저히 개선되기는 하였으나, 불순물의 함량이 높고 독성이 강하여 그 상용화가 현실적으로 어려울 뿐만 아니라 여전히 생산비용이 높은 단점이 있었던 것이다.

따라서 본 발명의 목적은 반코마이신의 생산성이 크게 향상된 새로운 변이주를 분리 개발하고, 그 변이주를 이용하여 질소원, 탄소원, 무기질 미량원소 등을 지닌 신규한 배지 조성의 배지에서 최적 배양조건으로 발효 배양을 수행하고, 발효 배양조에서 반코마이신만을 효율적으로 분리 정제함으로써 고수율 고순도로 반코마이신을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

따라서, 본 발명자들은 아미코라톱시스 오리엔탈리스 변이주를 이용하여 질소원의 농도를 적절히 조절하고, 멜라닌 생합성 억제제와 같은 특수한 미량원소를 적정 농도로 첨가하면 반코마이신의 생산성이 증가됨을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 글라이코펩타이드계 항생제인 반코마이신을 과량 생산하는 아미코라톱시스 오리엔탈리스 미생물 변이주를 분리하고, 그 분리된 변이주를 최적 배지 조성에서 최적 배양 조건으로 발효 배양시키고 반코마이신을 분리 정제함으로써 고수율 고순도로 반코마이신을 발효 제조하고자 하는 것이다.

따라서 본 발명의 목적은 고순도 고수율로 반코마이신을 생성하는 아미코라톱시스 오리엔탈리스 변이주 BNG 607(기탁번호 KCCM-10293호)을 제공하는 것이다.

또한, 상기 변이주의 분리방법은 야생주 아미코라톱시스 오리엔탈리스 ATCC-19795를 NTG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)을 사용하여 인공돌연변이시켜 반코마이신에 대한 자기내성 향상 균주를 분리하고, 다시 이 변이주를 NTG (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)을 사용하여 인공돌연변이시켜 반코마이신에 대한 자기내성 및 반코마이신 생성 능력 향상 균주를 분리시킨다.

한편, 성장배지에서 종배양된 아미코라톱시스 오리엔탈리스 BNG607(기탁번호 KCCM-10293호)을 12∼18% 덱스트린, 2.2∼3.8% 콩가루, 1.9∼2.9% 감자단백, 0.10∼0.14% 염화나트륨, 소량의 미네랄과 비타민, 멜라닌 생합성 제해제 농도를 조절시킨 배양 배지에서 배양 발효시키고 반코마이신을 분리 정제시킴을 특징으로 한다.

또한, 상기 배양 배지는 초기 질소원으로 콩가루 및 감자단백의 농도를 각각 2∼4(w/v)%로 조절하고, 1∼100 mg/L의 칼슘(CaCl2 ·2H2 O)이나 1∼100 mg/L의 피리독신(pyridoxine)을 더욱 첨가시킨 것을 특징으로 하고, 1∼100 mg/L의 칼슘과 1∼100 mg/L의 피리독신(pyridoxine), 1∼100 mg/L의 멜라닌 생합성 억제제를 더욱 첨가한 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 배양 배지는 1∼100 mg/L의 아부틴(arbutin),하이드로퀴논(hydroquinone), 트리사이클라졸(tricyclazole) 등의 멜라닌 생합성 저해제를 더욱 첨가한 것을 특징으로 한다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

상기 변이주는 야생주 아미코라톱시스 오리엔탈리스 ATCC-19795호를 모균주로 사용하여 NTG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)을 사용하여 인공돌연변이시켜 반코마이신에 의해 성장이 억제되는 바실러스 속 배양액을 분주하여 동 균주를 배양 후 억제환의 크기가 모균주보다 큰 변이주 가운데 콜로니의 크기, 색깔, 형태 변화에 따라 변이주를 분리시켜 반코마이신 내성 향상주를 분리하고, 다시 NTG (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)을 사용하여 인공돌연변이시켜 재차 반코마이신 내성 향상 및 반코마이신 생성능력 향상 균주를 분리함을 특징으로 한다.

또한 미생물에 의하여 반코마이신을 생산할 때 질소원 및 미량원소가 결핍 또는 과잉시에 배양시간이 경과함에 따라 반코마이신의 생산성이 낮아지는 단점이 있으나, 이러한 단점을 극복하기 위해 질소원, 미네랄 이온 또는 비타민의 농도

를 조절하여 반코마이신의 생산성을 증가시킨 것이다.

본 발명의 변이주 분리 방법은 다음과 같다. 반코마이신 생산균주인 아미코라톱시스 오리엔탈리스 ATCC-19795 모균주로부터 돌연변이원으로 NTG (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)을 사용하는 인공 돌연변이법과 단일

콜로니 분리방법을 이용하여 반코마이신 생성 능력이 향상된 변이주를 획득하였다.

본 발명은 아미코라톱시스 오리엔탈리스 야생주에 인공돌연변이를 통해 반코마이신 생합성 과정을 변형시켜 반코마이신에 내성을 나타내며, 반코마이신 생성능력이 향상된 특성을 지니는 반코마이신 고생산성 균주를 분리한 후 배양 조건을 최적화하는 것으로 구성된다.

야생주 아미코라톱시스 오리엔탈리스 균주의 포자 현탁액에 돌연변이원인 NTG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)을 처리하였다. 돌연변이 처리한 포자 현탁액을 생리식염수로 적절히 희석하여 반코마이신이 0.1∼50 g/L 첨가된 선별배지에 도말하여 28∼32℃에서 4일간 배양하였다. 모균주보다 높은 반코마이신 농도에서 성장한 콜로니를 반코마이신이 첨가되지 않은 평판배지에 옮겨 28∼32℃에서 3일간 배양 후 반코마이신에 의해 성장이 억제되는 바실러스 써브틸리스(Bacillus subtilis,ATCC-6633) 배양액을 분주하여 28∼32℃에서 20∼28시간 배양하였다. 모균주 보다 생장 억제환의 크기가 큰 변이주 가운데 콜로니 크기, 콜로니 색깔, 콜로니 형태 변화에 따라 변이주를 분리하여 삼각플라스크 및 발효조에서 확인 실험을 거쳐 모균주보다 반코마이신 생성 능력이 향상된 균주를 선별하였다.

반코마이신에 내성이 증가된 균주 가운데 반코마이신 생성능력이 향상된 변이주를 1차적으로 선별하기 위해 바실러스 써브틸리스(Bacillus subtilis,ATCC-6633)를 이용하였으며, 배지는 표 1의 선별배지를 이용하였다.

성분	농도
가수분해 전분(soluble starch)	1.0 %
박토 소이톤(bacto soytone)	1.0 %
한천	2 %

이 변이주를 다시 돌연변이원인 250∼280 nm 자외선을 이용하여 상기 방법에 의해 변이주 선별을 반복함으로써 20g/L 반코마이신이 첨가된 선별배지에서 성장하며 반코마이신 생성능력이 모균주보다 2배 이상 증가된 변이주 아미코라톱시스 오리엔탈리스 BNG607(기탁번호 KCCM-10293호)을 선별하였다..

본 발명에서 분리된 변이주의 배양방법과 분석방법은 다음과 같다.

본 발명 변이주의 배양 방법은 실시예의 기재와 같이 32∼36℃, 230∼270 rpm에서 4∼5일간 배양하였다. 반코마이신의 농도는 역상컬럼(Reversed phase column, YMC, Japan)이 장착된 HPLC의 Ultraviolet Detector(254 nm, Waters 486 tunable absorbance detector, USA)를 이용하여 측정하였다.

이때, 용매는 물, 아세토니트릴, 트리에틸아민, 테트라하이드로퓨란을 88.9 : 10 : 0.2 : 1 로 섞어 인산으로 pH 3.2가 되도록 조정하여 사용하였고, 유속은 1.0 mL/min이었다. 균체농도는 배양액 10 mL을 450 g에서 10분간 원심분리하여 PMV (Packed Mycelium Volume)을 측정하였다. 용존산소의 농도는 Ingold사(Swiss, polarographic type)의 용존산소 전극을 사용하여 측정하였다.

친주 아미코라톱시스 오리엔탈리스(ATCC-19775호)와 가장 높은 반코마이신 생산성을 나타내는 본 발명 변이주 아미코라톱시스 오리엔탈리스 BNG607, 아미코라톱시스 KFCC-10990호(대한민국 특허등록 제246,094호, 1999년 12월 3일)와의 반코마이신에 대한 내성 차이는 표 2와 같고 형태적, 생리적, 생화학적 특성은 아래 표 3과 같았다.

본 발명 변이주 아미코라톱시스 오리엔탈리스 BNG607, 아미코라톱시스 KFCC-10990호 및 친주와의 반코마이신에대한 내성 비교

균주	반코마이신(g/L)
	0	0.5	1.0	5.0	10.0	15.0	20.0	25.0	30.0	35.0
친주(ATCC-19795)	+++	+++	++	+	-	-	-	-	-	-
변이주(KFCC-1099)	+++	+++	++	++	+	-	-	-	-	-
변이주(BNG607)	+++	+++	+++	+++	+++	++	+	-	-	-

본 발명의 효과는 글라이코펩타이드계 항생제인 반코마이신을 과량 생산하는 아미코라톱시스 오리엔탈리스 미생물 변

이주를 분리하고, 그 분리된 변이주를 멜라닌 생합성 저해제를 함유하는 최적 배지 조성에서 최적 배양 조건으로 발효배양시키고 반코마이신을 분리 정제함으로써 고수율 고순도로 반코마이신을 발효 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 구체적인 실시예는 청구항을 살펴보면 더욱 자세히 알수 있다.

Claims (4)

1. 고순도 고수율로 반코마이신을 생성하는 아미코라톱시스 오리엔탈리스 변이주 BNG 607(기탁번호 KCCM-10293호)
2. 야생주 아미코라톱시스 오리엔탈리스 ATCC-19795를 NTG(N-methyl-N'-nitroN-nitrosoguanidine)을 사용하여 인공돌연변이시켜 반코마이신에 대한 자기내성 향상 균주를 분리하고, 다시 이 변이주를 NTG를 사용하여 인공돌연변이시켜 반코마이신에 대한 자기 내성 및 반코마이신 생성 능력 향상 균주를 분리하는 것을 특징으로 하는 아미코라톱시스 오리엔탈리스 BNG607(기탁번호 KCCM-10293호)의 균주 분리 방법
3. 성장배지에서 종배양된 아미코라톱시스 오리엔탈리스 BNG607(기탁번호 KCCM-10293호)를 12∼18% 덱스트린, 2.2∼3.8% 콩가루, 1.9∼2.9% 감자단백, 0.10∼0.14% 염화나트륨, 소량의 미네랄과 비타민 농도를 조절시킨 배양 배지에서 배양 발효시키고 반코마이신을 분리 정제시킴을 특징으로 하는 고수율 반코마이신 제조방법
4. 제 3항에 있어서, 상기 배양 배지는 초기 질소원으로 콩가루 및 감자단백의 농도를 각각 2∼4(w/v)%로 조절하고, 1∼100 mg/L의 칼슘(CaCl 2 ·2H2 O)이나 1∼100 mg/L의 피리독신(pyridoxine)을 더욱 첨가시킨 것을 특징으로 하는 제조방법