KR101888072B1 - 메나퀴논-７ 생성능이 향상된 신균주 바실러스 서브틸리스 ｂｓｍ-ｋ０２ 및 이를 이용한 메나퀴논-７의 대량 생산 방법 - Google Patents

메나퀴논-７ 생성능이 향상된 신균주 바실러스 서브틸리스 ｂｓｍ-ｋ０２ 및 이를 이용한 메나퀴논-７의 대량 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 메나퀴논-7(MK-7) 생성능을 가지는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) BSM-K02 돌연변이 균주(KCTC13028BP) 및 이를 이용한 메나퀴논-7의 대량 생산 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 바실러스 서브틸리스 속(Bacillus subtillis sp.) 균주에 자외선(UV) 또는 NTG(nitrosoguanidine)를 처리하여 돌연변이를 유발하고, 상기 균주로부터 메나디온(menadione)에 대한 내성을 지니고, 방향족 아미노산(aromatic amino acid)에 대한 저해를 받지 않는 돌연변이 균주를 선별하고, 상기 선별된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) BSM-K02 돌연변이 균주(KCTC13028BP)를 이용하여 최적화된 배양 배지 및 배양 조건 하에서 메나퀴논-7을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 신균주 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주는 비타민 K2, 즉 메나퀴논-7의 생산능이 우수하며, 본 발명에 따른 최적화된 배양 배지 및 배양 조건으로 하에서, 상기 균주로부터 메나퀴논-7을 대량 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 메나퀴논-7의 제조 단가 또한 현저히 감소시킬 수 있다.

Description

메나퀴논-７ 생성능이 향상된 신균주 바실러스 서브틸리스 ＢＳＭ-Ｋ０２ 및 이를 이용한 메나퀴논-７의 대량 생산 방법{Novel Bacillus subtilis BSM-KO2 having improved menaquinone-7 productivity and method for mass production of menaquinone-7 by using thereof}
본 발명은 메나퀴논-7(MK-7) 생성능을 가지는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) BSM-K02 돌연변이 균주(KCTC13028BP) 및 이를 이용한 메나퀴논-7의 대량 생산 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 바실러스 서브틸리스 속(Bacillus subtillis sp.) 균주에 자외선(UV) 또는 NTG(nitrosoguanidine)를 처리하여 돌연변이를 유발하고, 상기 균주로부터 메나디온(menadione)에 대한 내성을 지니고, 방향족 아미노산(aromatic amino acid)에 대한 저해를 받지 않는 돌연변이 균주를 선별하고, 상기 선별된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) BSM-K02 돌연변이 균주(KCTC13028BP)를 이용하여 최적화된 배양 배지 및 배양 조건 하에서 메나퀴논-7을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.
비타민 K(vitamin K)는 나프토퀴논(napthoquinone) 링 구조를 가진 지용성 비타민으로, 천연으로부터는 비타민 K1(필로퀴논, phylloquinone)과 비타민 K2(메나퀴논, menaquinone) 두 종류를 얻을 수 있다. 구체적으로, 식물로부터는 비타민 K1을 얻을 수 있고, 미생물로부터는 비타민 K2를 얻을 수 있다. 이러한 비타민 K2는 나프토퀴논에 붙은 이소프레닐(isoprenyl) 측쇄 길이에 따라 메나퀴논-1(menaquinone-1) ~ 메나퀴논-14(menaquinone-14)로 나눌 수 있으며, 상업적으로는 메나퀴논-4(menaquinone-4)와 메나퀴논-7(menaquinone-7)이 주로 이용되고 있다. 이중 메나퀴논-7(menaquinone-7)은 미생물 생산 외 화학 합성으로도 생산되고 있다. 화학 합성으로 메나퀴논-7을 생산하는 경우에는 측쇄인 이소프레닐(isoprenyl) 유닛(unit)에 트랜스형(trans-form)과 이성질체(isomer)인 시스형(cis-form)이 존재하는 반면, 미생물로 메나퀴논-7을 생산하는 경우에는 이소프레닐(isoprenyl) 유닛(unit)에 시스형(cis-form)이 존재하지 않는 모두 트랜스형(all trans-form) 구조이다. 이러한 측쇄의 구조적 차이는 메나퀴논-7의 흡수율과 생물활성(bioactivity)에 영향을 주며, 미생물로부터 생산된 메나퀴논-7이 화학 합성으로 생산된 메나퀴논-7에 비하여 흡수율과 생물활성(bioactivity)이 높은 것으로 알려져 있다.
이러한 비타민 K는 Gla-단백질의 글루타메이트(glutamate)를 감마-카르복실글루타믹산(γ-carboxyglutamic acid)으로 합성하기 위한 중요한 인자로 알려져 있다(MJ Shearer, British J. Haemaltol ., 75(2): 156-162, 1990). 특히, 비타민 K2, 즉 메나퀴논-7은 골아세포(osteoblast) 형성을 촉진시키고 파골세포(osteoclast)를 감소시켜, 골형성(osteoblastgenesis)을 돕고 골흡수(osteoclastogenesis)는 막아주는 역할을 한다. 뿐만 아니라, 체내 칼슘 이용에 특별한 단백질인 오스테오칼신(osteocalcin) 및 매트릭스 Gla 단백질(martrix Gla protein, MGP)을 활성화 시켜 혈관에 발생하는 칼슘 경화 방지, 뼈 골절 방지 및 골다공증 예방에 사용되고 있다(Y Koshihara et.al., J. Endocrinol ., 176(3): 339-348, 2003; Cranenburg E.C.M. et.al., J. Vasc . Res., 45(5): 427-436, 2008).
최근 노년층의 인구가 증가됨에 따라 골절과 같은 골다공증 질환이 증가되고 있는 추세이며 이로 인한 사회 경제적 비용이 증가되고 있다. 이를 예방하기 위하여 호르몬 보충요법과 비타민 D와 K2를 섭취를 권장하고 있지만, 고기, 계란, 발효식품 등에서 섭취할 수 있는 비타민 K2의 양은 미미한 수준이다(한국등록특허 10-1196338). 일본 전통음식인 나토(natto)에는 나토 100g당 800~900 ㎍의 메나퀴논-7이 포함되어 있어, 메나퀴논-7을 가장 풍부하게 가지고 있는 식품으로 알려져 있다(MD Collins et.al., Micobiol . Mol . Bio. Rev., 45(2): 316-354, 1981). 하지만 많은 사람들이 나토 섭취에 익숙하지 않아 최근에 미국에서 권장하는 일일권장섭취량 1 ㎍/kg(체중, body weight)/day 섭취량보다 적은 양의 비타민 K2를 섭취하고 있다(Sarah L. Booth et.al., J. Nutr ., 128(5): 785-788, 1998). 이러한 이유로 인하여 많은 건강 소식지에서는 미생물이 생산하는 발효제품 섭취를 권장하고 있으며, 서구의 많은 회사들 또한 비타민 K2 함유 제품을 시판하고 있는 실정이다.
현재까지 비타민 K2 생산 균주로는 플라보박테리움(Flavobacterium), 락토바실러스(Lactobacillus), 프로피오니박테리아(Propionibacteria), 락토코커스(Lactococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 바실러스(Bacillus) 등이 알려져 있으며, 각각의 미생물들이 주로 생산하는 비타민 K2의 종류는 다양하다. 상기의 미생물 중 바실러스(Bacillus)의 바실러스 서브틸리스 속(Bacillus subtilis sp.)이 비타민 K2의 메나퀴논-7을 주로 생산하는 것으로 알려져 있다. 특히, 상기 미생물이 생성하는 비타민 K2의 90~96%는 메나퀴논-7 형태이다(한국등록특허 10-1196338). 이에 따라, 현재까지 비타민 K2의 메나퀴논-7 생산에 관한 연구는 주로 바실러스 속(Bacillus sp.)을 이용하여 진행되었으며, 바실러스 서브틸리스 나토(Bacillus subtillis natto) 균주가 비타민 K2, 즉 메나퀴논-7을 많이 생산하는 것으로 알려져 있다.
메나퀴논-7의 생합성 경로는 대장균(E. coli)과 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis)를 이용한 연구에 의하여 밝혀져 있다. 메나퀴논-7 생합성은 퀴논 골격(Quinone skeleton)을 만드는 대사회로에서 만들어진 1,4-디하이드록시-2-나프토 산(1,4-Dihydroxy-2-naphthoic acid, DHNA)과, 아이소프렌 단위(isoprene unit)를 만드는 대사회로에서 만들어진 폴리프레닐 피로인산(Polyprenyl pyrophosphate)이 헵타프레닐 다이포스페이트 합성효소(heptaprenyl diphosphate(HDP) synthase)에 의하여 DHNA에 측쇄로 단위(isoprene unit)와 결합하면서 만들어진다(Sato T. et.al., J. Biosci . Bioeng ., 91(1): 16-20, 2001). 상기 헵타프레닐 다이포스페이트 합성효소(heptaprenyl diphosphate(HDP) synthase)는 두 개의 컴포넌트(component)로 이루어져 있으며, 컴포넌트 Ⅰ(component I)이 컴포넌트 Ⅱ(component Ⅱ)와 결합될 때, 퀴논 골격(Quinone skeleton)에 아이소프렌 단위(isoprene unit)를 결합시킨다. 한편, 배지 내 방향족 아미노산(Aromatic amino acid)인 L-페닐알라닌(L-phenylalanine), L-트립토판(L-tryptophan), L-타이로신(L-tyrosine)의 농도가 높으면 퀴논 골격의 생성을 저해하는 것으로 알려져 있다(Y. Tsukamoto. et.al., Biosci . Biotechnol . Biochem ., 65(9): 2007-2015, 2001). 이러한 메나퀴논-7은 전자전달계(electron transport system)나 산화적 인산화(oxidative phosphorylation) 과정에서 산화환원 반응물로 작용하며, 박테리아 세포막(plasma membrane)을 구성하는 것으로 알려져 있다(Rowland B. et.al., Gene, 167(1-2):105-109, 1995).
한편, 바실러스 서브틸리스 속(Bacillus subtilis sp.)을 이용한 비타민 K2, 즉 메나퀴논-7의 생산 연구는 주로 바실러스 서브틸리스 나토(Bacillus subtillis natto) 균주를 돌연변이 시켜 고상배양(solid cultivation)이나 정치배양(stationary culture)을 통하여 이루어진다. 그러나 현재까지 바실러스 서브틸리스 속(Bacillus subtilis sp.) 균주를 이용하여 액상배양을 통한 메나퀴논-7의 생산 연구는 거의 알려져 있지 않은 실정이다.
이와 관련된 연구들을 살펴보면, Sato 등은 나토(natto)에서 분리한 바실러스 서브틸리스 나토(Bacillus subtillis natto) MH-1의 메나디온(menadione) 내성 돌연변이주인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) K3-176을 10% 대두 추출물, 5% 글리세린(glycerine), 0.5% 효모 추출물이 함유된 배지에서 120시간 배양하여 35 ㎎/ℓ의 메나퀴논-7(menaquinone-7, MK-7)을 얻었고, 생산성(productivity)은 시간(hr)당 0.29 ㎎/ℓ 이였다. 또한, 상기 균주의 메나퀴논-7 생성 능력인 단위세포당 비생산성(specific productivity)은 10 ㎎-MK7/g-cell 이였다(T Sato. et.al., J. Ind . Microbiol . Biotech., 26(3): 115-120, 2001).
또한, 상기 모균, 바실러스 서브틸리스 나토(Bacillus subtillis natto) MH-1으로부터 얻은 다이페닐아민(diphenylamine) 내성 돌연변이주인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) D200-41을 상기와 동일한 배지에 0.05% 제2인산칼륨(Potassium Phosphate, Dibasic; K2HPO4)을 첨가하여 24시간 배양한 후, 추가로 120시간 정치배양을 하여 60 ㎎/ℓ의 메나퀴논-7(menaquinone-7, MK-7)을 얻었고, 생산성(productivity)은 시간(hr)당 0.41 ㎎/ℓ 이였다(T Sato. et.al., J. Biosci. Bioeng ., 91(1): 16-20, 2001).
Berenjian 등도 나토(natto)에서 분리한 바실러스 서블틸리스 나토(Bacillus subtillis natto) 균주를 발효 조건 최적화를 통하여 5% 효모 추출물, 5% 글리세린(glycerine), 18.9% 대두 펩톤, 0.06% 제2인산칼륨(K2HPO4) 배지에서 120시간 배양하여 226 ㎎/ℓ의 메나퀴논-7(menaquinone-7, MK-7; 비타민 K2)을 얻었으며, 생산성(productivity)은 시간(hr)당 1.8 ㎎/ℓ 이였다. 또한, 상기 균주의 메나퀴논-7 생성 능력인 단위세포당 비생산성(specific productivity)은 16 ㎎-MK7/g-cell 이였다(Aydin Berenjian et.al., Appl . Biochem . Biotech., 172(3): 1347-1357, 2014).
Puri 등은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) MTCC 2756를 10% 대두분, 0.5% 효모 추출물, 0.05% 제2인산칼륨(K2HPO4), 5% 글리세린(glycerine)이 함유된 배지에서 상기 균주를 16시간 성장시킨 후, 메나퀴논-7(menaquinone-7, MK-7; 비타민 K2)의 전구체인 1-나프톨(1-naphthol)과 트윈 80(tween 80)을 각각 배지 내에서 농도가 0.2% 및 0.1%가 되도록 첨가하였다. 첨가 후 8시간 추가 배양하여 14.4 ㎎/ℓ의 메나퀴논-7(menaquinone-7, MK-7; 비타민 K2)을 얻었으며, 생산성(productivity)은 시간(hr)당 0.6 ㎎/ℓ 이였다(A. Puri. et.al., Songklanakarin. J. Sci. Technol., 37(3): 283-289, 2015).
상기와 같이 비타민 K2, 즉 메나퀴논-7(menaquinone-7, MK-7) 생산 연구는 주로 나토(natto)에서 분리한 바실러스 서브틸리스 나토(Bacillus subtillis natto) 균주에 의하여 이루어지고 있으나, 배양액 내의 유기질소원(organic nitrogen source)의 농도가 높을 뿐만 아니라 발효시간이 길어 제조 단가가 높고 생산성이 낮아 상업적 생산에 어려움이 존재한다. 또한, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) 균주를 돌연변이 시킴에 따라, 발효시간 단축 및 유기질소원의 농도를 줄일 수 있을지라도, 메나퀴논-7의 농도가 낮아 상업적 생산에 적용하기에는 한계가 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 비타민 K2, 즉 메나퀴논-7 생성능이 향상된 신균주 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 균주를 선별하고, 상기 균주로부터 메나퀴논-7을 생산하는 데 있어 최적화된 배지 및 배양 조건을 확립함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
한국등록특허 10-1196338
MJ Shearer, British J. Haemaltol., 75(2): 156-162, 1990 Y Koshihara et.al., J. Endocrinol., 176(3): 339-348, 2003 Cranenburg E.C.M. et.al., J. Vasc. Res., 45(5): 427-436, 2008 MD Collins et.al., Micobiol. Mol. Bio. Rev., 45(2): 316-354, 1981 Sarah L. Booth et.al., J. Nutr., 128(5): 785-788, 1998 Sato T. et.al., J. Biosci. Bioeng., 91(1): 16-20, 2001 Y. Tsukamoto. et.al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 65(9): 2007-2015, 2001 Rowland B. et.al., Gene, 167(1-2):105-109, 1995 T Sato. et.al., J. Ind. Microbiol. Biotech., 26(3): 115-120, 2001 T Sato. et.al., J. Biosci. Bioeng., 91(1): 16-20, 2001 Aydin Berenjian et.al., Appl. Biochem. Biotech., 172(3): 1347-1357, 2014 A. Puri. et.al., Songklanakarin. J. Sci. Technol., 37(3): 283-289, 2015
본 발명의 목적은 메나퀴논-7(MK-7) 생성능을 가지는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) BSM-K02 돌연변이 균주(KCTC13028BP) 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) BSM-K02 돌연변이 균주(KCTC13028BP)를 배양하는 것을 포함하는 메나퀴논-7(MK-7)의 대량 생산 방법을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비타민 K2인 메나퀴논-7(MK-7) 생성능을 가지는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) BSM-K02 돌연변이 균주(KCTC13028BP) 및 상기 균주를 이용하여 메나퀴논-7(MK-7)을 대량 생산 하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 비타민 K2인 메나퀴논-7(MK-7) 생성능을 가지는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) BSM-K02 돌연변이 균주(KCTC13028BP)를 제공한다.
상기 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) BSM-K02 돌연변이 균주(KCTC13028BP)는 자외선(UV) 또는 NTG(nitrosoguanidine) 처리하여 돌연변이를 유발하고, 메나디온(menadione)에 대한 내성 및 고농도의 방향족 아미노산(aromatic amino acid)에 의한 비타민 K2 생성이 저해 받지 않는 신규한 바실러스 서브틸리스 돌연변이 균주이다.
상기 신균주 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) BSM-K02는 2016년 5월 25일 한국생명공학연구원에 수탁번호 KCTC13028BP로 기탁되었으며, 우수한 비타민 K2, 즉 메나퀴논-7(MK-7) 생성능을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) BSM-K02 돌연변이 균주(KCTC13028BP)는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) BSM-Control 균주에 자외선(UV) 또는 NTG(nitrosoguanidine)를 처리하여 돌연변이를 유발하고, 상기 균주로부터 메나디온(menadione)에 대한 내성을 지니고, 방향족 아미노산(aromatic amino acid)에 대한 저해를 받지 않는 균주를 선별한 것으로, 비타민 K2, 즉, 메나퀴논-7(MK-7) 생성능이 모균주인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) BSM-Control 균주에 비해 우수함을 확인하였다(도 3 및 도 4).
상기 비타민 K3인 "메나디온(menadione)"은, 비타민 K2인 메나퀴논-7(menaquinone-7, MK-7)의 헤드(head) 부분인 퀴논 골격(quinone skeleton) 구조로, 고농도의 메나디온에 대한 내성을 지니는 균주는 다량의 퀴논 골격이 생산되는 동안 여러 가지 요인에 의해 생산 저해를 받지 않는 균주로 예상할 수 있다.
상기 메나디온(menadione)에 대한 내성을 지닌 돌연변이 균주는, 이에 제한되지는 않으나, 5 내지 20 ppm, 바람직하게는 15 ppm 농도의 메나디온을 처리하여 선별할 수 있다.
상기 "방향족 아미노산(aromatic amino acid)"은, 이에 제한되지는 않으나, L-타이로신(L-tyrosine), L-트립토판(L-tryptophan), L-페닐알라닌(L-phenylalanine) 일 수 있으며, 상기 방향족 아미노산의 농도가 높으면 비타민 K2, 즉 메나퀴논-7의 헤드 부부인 퀴논 골격(quinone skeleton)의 생성이 저해될 수 있다.
상기 방향족 아미노산(aromatic amino acid)에 의한 비타민 K2 생성이 저해 받지 않는 돌연변이 균주는, 100 내지 150 ppm, 바람직하게는 125 ppm 농도의 L-타이로신(L-tyrosine)을, 50 내지 100 ppm, 바람직하게는 62.5 ppm 농도의 L-트립토판(L-tryptophan)을, 50 내지 100 ppm, 바람직하게는 62.5 ppm 농도의 L-페닐알라닌(L-phenylalanine)을 처리하여 선별할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) BSM-Control에 자외선(UV) 또는 NTG(nitrosoguanidine)를 처리하여 돌연변이를 유발한 후, 메나디온(menadione)이 함유된 TGY 한천 배지(1% 트립톤(tripton), 0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨(NaCl), pH7.0)에서 성장한 메나디온 내성 균주를 L-타이로신(L-tyrosine), L-트립토판(L-tryptophan), L-페닐알라닌(L-phenylalanine)이 포함된 TGY 배지에 접종하여 비타민 K2, 즉 메나퀴논-7 생성능이 우수한 신규한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) BSM-K02 돌연변이 균주(KCTC13028BP)를 최종 선발하였다(표 1).
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) BSM-K02 돌연변이 균주(KCTC13028BP)를 배양하는 것을 포함하는 메나퀴논-7(MK-7)의 대량 생산 방법을 제공한다.
상기 균주는 탄소원, 유기질소원 및 무기질소원이 포함된 배지에서 배양될 수 있다.
상기 배지는 탄소원으로서 슈크로스(sucrose), 유기질소원으로서 효모 추출물, 무기질소원으로서 황산암모늄((NH4)2SO4 ), 제1인산칼륨(K2HPO4) 및 황산마그네슘(MgSO4)과, 이외 염(salt)으로서 염화칼슘(CaCl2) 및 황산망간(MnSO4·H2O)을 함유하는 배지일 수 있다. 구체적으로, 상기 배지는 탄소원인 슈크로스와 유기질소원인 효모 추출물이 1 : 0.1 내지 0.5 중량비로 함유될 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 1 : 0.3 중량비로 함유될 수 있다. 또한, 탄소원인 슈크로스와 무기질소원인 황산암모늄((NH4)2SO4)은 1 : 0.06 내지 0.33 중량비로 함유될 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 1 : 0.06 중량비로 함유될 수 있다. 탄소원인 슈크로스와 무기질소원인 제1인산칼륨(K2HPO4)은 1 : 0.016 내지 0.050 중량비로 함유될 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 1 : 0.05 중량비로 함유될 수 있다. 한편, 탄소원인 슈크로스와 무기질소원인 황산마그네슘(MgSO4)은 1 : 0.016 내지 0.080 중량비로 함유될 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 1 : 0.016 중량비로 함유될 수 있다.
상기 배지는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) BSM-K02 돌연변이 균주(KCTC13028BP)로부터 비타민 K2, 즉 메나퀴논-7의 생산성을 증가시킬 수 있는, 최적화(optimization) 된 배지일 수 있다.
상기 배양은, 이에 제한되지는 않으나, 배양이 진행되는 동안 pH 조절 없이 배양 온도 39 내지 44℃, 통기속도 0.1 내지 1 vvm, 교반 속도 400 내지 1,100 rpm에서 수행되는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 배양 온도는 43℃일 수 있으며, 통기 속도는 0.5 vvm일 수 있으며, 교반 속도는 600 rpm 일 수 있다. 상기 배양 온도를 벗어나는 경우 균체 성장에 문제가 발생할 수 있고, 상기 통기 속도 및 교반 속도 범위를 벗어나는 경우에는 폴리머 생산에 의해 배양 배지 내의 점도가 높아져 정제 공정의 어려움이 발생할 수 있다.
상기 배양은, 배양이 진행되는 동안 pH를 조절하지 않는 것을 특징으로 하며, 상기 'pH 조절 없이'란 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) BSM-K02 돌연변이 균주(KCTC13028BP) 배양시 초기 pH 6.4 내지 6.8에서, 배양이 진행되는 동안 pH 5.5 내지 6.0으로 감소하게 되고, 이후 균체가 용해(lysis)되면서 pH가 상승하게 되는 양상을 나타내는데, 배양 동안 이러한 pH 변화에 대하여 염산(HCl) 또는 가성소다(NaOH) 처리 없이 그대로 놓아두는 것을 의미한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 슈크로스(sucrose), 효모 추출물, 황산암모늄((NH4)2SO4), 제1인산칼륨(K2HPO4) 및 황산마그네슘(MgSO4)을 함유하는 배지를 이용하여, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) BSM-K02 돌연변이 균주(KCTC13028BP) 배양 시, 배양 중에 pH를 조절하지 않고 배양 온도를 초기 37℃에서 배양 6시간 후 43℃로 배양 온도를 변경(shift)하여 비타민 K2, 즉 메나퀴논-7의 생산 정도를 분석해 본 결과, 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주가 모균주인 바실러스 서브틸리스 BSM-Control 균주에 비하여 균체당 메나퀴논-7의 생성 능력인 비산출율(specific yield)은 1.7배 증가하고, 생산성은 1.9배 증가하였음을 확인하였다(도 4 및 표 8).
본 발명의 일실시예에 따른 방법에 의하면, 배양 24시간 후, 5.8 g/ℓ의 균체를 수득하게 되며, 21.8 ㎎/ℓ의 비타민 K2, 즉 메나퀴논-7을 생산할 수 있어 생산성은 시간(hr)당 메나퀴논-7(MK-7)이 0.91 ㎎/ℓ(0.91 ㎎ MK-7/ℓ/hr) 임을 확인하였으며, 균체당 메나퀴논-7의 생성 능력인 비산출율(specific yield)은 3.8 ㎎ MK-7/g-cell 임을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통해, 최적화된 배양 조건에서 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주를 이용하여 비타민 K2, 즉 메나퀴논-7을 생산할 시, 모균주인 바실러스 서브틸리스 BSM-Control 균주에 비하여 메나퀴논-7 생산성을 1.9배 이상 증가시켜 비타민 K2를 대량 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 메나퀴논-7 생산에 관한 종래 기술에 비하여 유기질소원의 농도 또한 3배~8배 절감할 수 있어 메나퀴논-7을 생산하는 데 있어 제조 단가 또한 현저히 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다(도 4 및 표 8).
본 발명의 신균주 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주는 비타민 K2, 즉 메나퀴논-7의 생산능이 우수하며, 본 발명에 따른 최적화된 배양 배지 및 배양 조건으로 하에서, 상기 균주로부터 메나퀴논-7을 대량 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 메나퀴논-7의 제조 단가 또한 현저히 감소시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 메나디온(menadione)의 처리 농도에 따른 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) BSM-Control 균주의 생존율 곡선(curve)을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 방향족 아미노산(aromatic amino acid) 함유 농도에 따른 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) Control 균주로부터 생성된 상대적 메나퀴논-7(menaquinone-7, MK-7; 비타민 K2)의 농도 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 자외선(UV) 및 NTG(nitrosoguanidine; N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) 처리에 의한 메나디온(menadione) 내성 바실러스 서브틸리스 BSM-Control 돌연변이 균주의 메나퀴논-7(menaquinone-7, MK-7; 비타민 K2) 생성능 분포 곡선을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주(A) 및 모균주인 바실러스 서브틸리스 BSM-Control 균주(B)로부터 생산된 메나퀴논-7(menaquinone-7, MK-7; 비타민 K2)의 농도 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 여기에서, DO는 용존산소량(dissolved oxygen)이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 비타민 K2인 메나퀴논-7 생성능이 향상된 균주 선별
비타민 K2, 즉 메나퀴논-7(menaquinone-7, MK-7) 생성능이 향상된 신규한 돌연변이 균주를 선별하고자, 바실러스 서브틸리스 속(Bacillus subtillis sp.) 균주에 돌연변이를 유도하기 위한 자외선(UV) 또는 NTG(nitrosoguanidine; N-메틸-N'-니트로-N-니트로구아니틴(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine))를 처리하고, 비타민 K3인 메나디온(menadione)에 대한 내성 및 고농도 방향족 아미노산(aromatic amino acid)에 의한 메나퀴논-7의 생성 저해 정도를 평가하여 최종적으로 비타민 K2인 메나퀴논-7 생성능이 향상된 균주를 선별하였다. 구체적으로 하기와 같이 실험을 수행하였다.
실시예 1-1: 메나디온 ( menadione ) 처리 농도에 따른 바실러스 서브틸리 스( Bacillus subtillis ) BSM-Control 균주의 생존율 분석
비타민 K3인 메나디온(menadione)은 비타민 K2인 메나퀴논-7(menaquinone-7, MK-7)의 헤드(head) 부분인 퀴논 골격(quinone skeleton) 구조로, 고농도의 메나디온에 대한 내성을 지니는 균주는 다량의 퀴논 골격이 생산되는 동안 여러 가지 요인에 의해 생산 저해를 받지 않는 균주로 예상할 수 있다.
이에, 우선 메나퀴논-7 생성능이 향상된 신규한 바실러스 서브틸리스 돌연변이 균주를 선별하기 위한 실험 조건을 확립하기 위해, 바실러스 서브틸리스 돌연변이주의 메나디온에 대한 내성 균주를 선별하기 위한 최적의 메나디온 처리 농도를 선정하고자 하였다. 이때, 야생형(wild type)의 바실러스 서브틸리스 균주에 NTG(nitrosoguanidine)를 처리하여 1차적으로 돌연변이를 유발한 균주를 준비하였으며, 상기 균주를 바실러스 서브틸리스 BSM-Control로 명명하고 모균주로서 사용하였다.
구체적으로, 바실러스 서브틸리스 돌연변이주의 메나디온 내성 균주를 선별하기 위하여, 상기 준비한 바실러스 서브틸리스 BSM-Control 균주의 메나디온 처리 농도에 따른 생존율을 조사하였다. 이를 위하여 상기 균주를 TGY 배지(1% 트립톤(tripton), 0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨(NaCl), pH7.0)에 접종하여 37℃에서 OD660 값이 0.2~0.5가 될 때까지 성장시킨 후 균체를 회수하였다. 상기 회수한 균체를 각각 0 ppm, 2.5 ppm, 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm, 20 ppm 농도의 메나디온이 첨가된 TGY 한천 배지(한천 1.5% 첨가)에 도말하였다. 이때 회수한 균체는 0.85% 소금물로 세척한 후 OD660 값을 1.0으로 조절하여 메나디온이 첨가된 TGY 한천 배지에 도말하였다. 도말 후, 37℃에서 24시간 동안 배양하여 상기 균주의 생존율 곡선(curve)을 작성하였다.
그 결과, 하기 도 1에 나타낸 바와 같이, 메나디온을 10 ppm 농도로 처리시 98.7% 사멸율이 확인되었고, 메나디온을 15 ppm 농도로 처리시 99.9%의 사멸율이 확인되었다.
이에, 메나퀴논-7 생성능이 향상된 신규한 바실러스 서브틸리스 돌연변이 균주를 선별하기 위해, 상기 결과를 바탕으로 바실러스 서브틸리스 BSM-Control 균주의 메나디온 내성 균주 선별을 위한 최적의 메나디온 처리 농도를 15 ppm으로 선정하고, 바실러스 서브틸리스 BSM-Control 균주의 메나디온 내성 균주를 선별하기 위해서는 메나디온이 15 ppm 농도로 첨가된 TGY 한천 배지를 사용하기로 하였다.
실시예 1-2: 방향족 아미노산(aromatic amino acid) 함유 농도에 따른 바실 러스 서브틸리스 ( Bacillus subtillis ) BSM -Control 균주로부터 생성된 상대적 메나퀴논-7의 농도 분석
배지 내 방향족 아미노산(Aromatic amino acid)인 L-페닐알라닌(L-phenylalanine), L-트립토판(L-tryptophan), L-타이로신(L-tyrosine)의 농도가 높으면 퀴논 골격(quinone skeleton)의 생성을 저해하는 것으로 알려져 있다.
이에, 메나퀴논-7 생성능이 향상된 신규한 바실러스 서브틸리스 돌연변이 균주를 선별하기 위한 실험 조건을 확립하기 위해, 방향족 아미노산에 의한 메나퀴논-7의 생성 저해 정도를 평가하여 최적의 방향족 아미노산, 즉, L-페닐알라닌, L-트립토판, L-타이로신의 배지 내 최적의 함유 농도를 선정하고자 하였다.
구체적으로, 메나퀴논-7 생산 시, 방향족 아미노산에 의한 메나퀴논-7의 생산 저해가 해제된 돌연변이주를 선별하기 위하여, TGY 배지에 L-트리톱판, L-페닐알라닌, L-타이로신을 각각 0 ppm, 30 ppm, 62.5 ppm, 125 ppm, 250 ppm의 농도로 첨가하여 바실러스 서브틸리스 BSM-Control의 메나퀴온-7 생성 능력을 조사하였다. 이를 위하여 상기 균주를 1차 TGY 배지(1% 트립톤(tripton), 0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨(NaCl), pH7.0)에서 12시간 성장시킨 후, 상기 각각의 방향족 아미노산이 농도별로 함유된 TGY 배지에 10% 접종하여 72시간 동안 배양하여 성장시켰다. 이때 배양 조건으로, 배양 온도는 37℃ 이였으며, 교반 속도는 140 rpm 이였다.
한편, 메나퀴논-7 분석을 위해서는, 우선 배양된 균체를 원심분리하고 침전된 균체에 균체 무게와 동량의 아이소프로판올(IPA, isopropanol)을 첨가하고, 균체 무게의 2배의 헥산(hexane)을 첨가하여 20분간 추출하였다. 추출한 후, 원심분리기를 이용하여 균체를 제거하고 상등액을 0.22 ㎛ 필터로 여과하여 회수하였다. HPLC(Shimazu LC- 20AD) 분석을 통해, 상기 회수한 여과액에 포함되어 있는 메나퀴논-7 농도를 측정하였다. 이때, 메나퀴논-7 농도는 메나퀴논-7의 표준곡선을 이용하여 분석하였으며, HPLC 분석 조건은 Shim-pack GIS-ODS 컬럼(MG 5㎛, size 4.6㎜ I.D.×150㎜)을 사용하여 에탄올과 메탄올이 7:3 비율로 조성된 유기 용매를 1㎖/min 유속으로 흘려 자외선 검출기 248㎚ 파장에서 메나퀴논-7의 농도를 측정하였다.
그 결과, 하기 도 2에서 나타낸 바와 같이, 방향족 아미노산이 첨가되지 않은 TGY 배지에 비하여 L-타이로신(tyrosine) 125 ppm, L-트립토판(tryptophan) 62.5 ppm, L-페닐알라닌(phenylalanine) 62.5 ppm의 농도로 TGY 배지에 첨가하였을 때, 메나퀴논-7이 거의 생산되지 않음을 확인하였다.
이에, 상기 결과를 근거로 방향족 아미노산의 저해를 받지 않는, 메나퀴논-7 생성능이 향상된 신규한 바실러스 서브틸리스 돌연변이 균주를 선별하기 위해, L-타이로신, L-트립토판, 및 L-페닐알라닌의 배지 내 최적의 함유 농도를 각각 125 ppm, 62.5 ppm, 및 62.5 ppm으로 선정하고, L-타이로신, L-트립토판, 및 L-페닐알라닌이 각각 125 ppm, 62.5 ppm, 및 62.5 ppm 농도로 첨가된 TGY 한천 배지를 사용하기로 하였다.
실시예 1-3: 비타민 K2인 메나퀴논-7 생성능이 우수한 돌연변이 후보 균주 선별
상기 실시예 1-1 및 실시예 1-2에서 메나퀴논-7(menaquinone-7, MK-7; 비타민 K2) 생성능이 향상된 신규한 바실러스 서브틸리스 돌연변이 균주를 선별하기 위한 실험 조건을 확립하였다. 구체적으로, 바실러스 서브틸리스 BSM-Control 균주의 메나디온 내성 균주 및 방향족 아미노산의 저해를 받지 않는 균주 선별을 위해, TGY 한천 배지에 메나디온을 15 ppm 농도로 첨가하고, 방향족 아미노산인 L-타이로신, L-트립토판, 및 L-페닐알라닌을 각각 125 ppm, 62.5 ppm, 및 62.5 ppm 농도로 첨가하기로 하였다.
이에, 바실러스 서브틸리스 BSM-Control 균주로부터 메나퀴논-7 생산이 우수한 돌연변이 균주를 선별하기 위하여, 1차적으로 메나디온 내성 돌연변이 균주를 선별하고, 이를 L-타이로신, L-트립토판, 및 L-페닐알라닌이 각각 125 ppm, 62.5 ppm, 및 62.5 ppm의 농도로 첨가된 TGY 배지에서 균체를 성장시켜 메나퀴논-7 농도를 측정하였다.
구체적으로, 바실러스 서브틸리스 BSM-Control 균주를 TGY 배지에 접종하여 OD660 값이 0.2~0.5가 될 때까지 배양한 후, 돌연변이를 유도하기 위해 10 ㎖의 배양액을 취하여 플레이트(plate, 9×15mm) 상에서 자외선(UV)을 2분간 처리하고 무광조건에서 3시간 동안 안정화시켰다. 안정화시킨 돌연변이주를 4,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 균체를 회수한 후, 0.85% 소금물을 사용하여 3회 세척하였다. 상기 세척된 균체에 10 ㎖의 0.85% 소금물을 첨가하여 혼합한 후 15 ppm 농도의 메나디온이 첨가된 TGY 한천 배지에 도말하였다. 도말하여 배양한 후, 생존된 균주를 회수하였으며, 이를 방향족 아미노산이 첨가된 TGY 배지에서 72시간 동안 배양하였다. 이때 배양 조건으로, 배양 온도는 37℃ 이였으며, 교반 속도는 140 rpm 이였다. 72시간 동안 배양한 후, 메나퀴논-7의 농도를 측정하였다.
한편, 돌연변이를 유도하기 위한 물질인 NTG(nitrosoguanidine; N-메틸-N'-니트로-N-니트로구아니틴(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)) 처리에 의한 메나디온 내성 돌연변이 균주 선별을 위해, 상기 자외선 처리 조건과 동일한 조건에서 성장한 바실러스 서브틸리스 BSM-Control 균주를 1 ㎖ 취하여 원심분리하였다. 상기 원심분리 후 회수된 균체에 150 ppm 농도의 NTG가 포함된 0.85% 소금물 1 ㎖을 첨가하여, 37℃의 온도 및 교반 속도 150 rpm 조건에서 30분간 NTG를 처리하였다. 상기 NTG가 처리된 돌연변이주를 4,000rpm으로 10분간 원심분리하여 균체를 회수한 후, 0.85% 소금물을 사용하여 3회 세척하였다. 상기 세척된 균체에 1 ㎖의 0.85% 소금물을 첨가하여 혼합한 후 15 ppm 농도의 메나디온이 첨가된 TGY 한천 배지에 도말하였다. 도말하여 배양한 후, 생존된 균주를 회수하였으며, 이를 방향족 아미노산이 첨가된 TGY 배지에서 72시간 동안 배양하였다. 이때 배양 조건으로, 배양 온도는 37℃ 이였으며, 교반 속도는 140 rpm 이였다. 72시간 동안 배양한 후, 메나퀴논-7의 농도를 측정하였다.
그 결과, 하기 도 3의 A에 나타낸 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 BSM-Control 균주의 자외선 처리에 의한 메나디온 내성 균주의 메나퀴논-7 생선 능력은 모균주에 비하여 160% 이상 향상된 돌연변이주가 2종 확인되었으며, 돌연변이주 43%가 모균주보다 메나퀴논-7 생성 능력이 우수한 돌연변이 균주임을 확인하였다.
한편, 하기 도 3의 B에 나타낸 바와 같이, NTG 처리에 의해서는 26%가 모균주에 비하여 메나퀴논-7 생성 능력이 우수하였으며, 모균주보다 메나퀴논-7 생성 능력이 140% 이상 향상된 균주가 1종 확인되었다.
상기의 결과를 근거로 자외선 처리에 의한 메나디온 내성 돌연변이 균주 2종과 NTG 처리에 의한 메나디온 내성 돌연변이 균주 3종을 메나퀴논-7(menaquinone-7, MK-7; 비타민 K2) 생성능이 우수한 돌연변이 후보 균주로 선별하였다.
이하, 실시예 1-4에서는 플라스크 배양을 통하여 상기 선별한 후보 균주 5종의 메나퀴논-7 생성 능력을 최종 확인하였다.
실시예 1-4: 비타민 K2인 메나퀴논-7 생성능이 우수한 신규한 돌연변이 균주인, 바실러스 서브틸리스 BSM -K02 균주의 최종 선별
상기 실시예 1-3에서 선별한, 메나퀴논-7(menaquinone-7, MK-7; 비타민 K2) 생성능이 우수한 돌연변이 후보 균주 총 5종을 각각 플라스크 배양하여 메나퀴논-7 생성 능력을 최종 확인하였다. 이때, 상기 돌연변이 균주 5종은 바실러스 서브틸리스 BSM-K01~K05로 명명하였다.
구체적으로, 상기와 같이 명명한 돌연변이 균주 5종을 각각 2% 포도당(glucose), 0.2% 황산마그네슘(magnesium sulfate, MgSO4), 2% 효모 추출물, 1% 황산암모늄(ammonium sulfate, (NH4)2SO4), 0.25% 제1인산칼륨(potassium phosphate, monobasic; KH2PO4), 0.04% 염화칼슘(calcium chloride, CaCl2), 0.035% 황산망간(mananese sulfate, MnSO4 ·H2O)으로 조성된 플라스크 배지에서 72시간 동안 배양하였다. 이를 통하여 각각의 상기 5종 균주의 비타민 K2, 즉 메나퀴논-7의 생성 능력을 조사하였다. 이때, 종균은 TGY 배지에서 12시간 동안 성장시킨 후, 상기 플라스크 배양액에 10% 접종하였으며, 종균 및 플라스크 배양은 배양 온도 37℃ 및 교반 속도 140 rpm의 조건에서 수행되었다.
그 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1-3에서 1차적으로 선별된 자외선 또는 NTG 처리에 의한 바실러스 서브틸리스 메나디온 내성 돌연변이 균주는 플라스크 배양에서도 모균주인 바실러스 서브틸리스 BSM-Control 균주에 비하여 메나퀴온-7 생성 능력이 33~50% 이상 향상됨을 확인하였다.
이는, 돌연변이 균주 선별 시, 메다니온에 대한 내성 뿐만 아니라 방향족 아미노산의 저해를 덜 받는 균주를 선별하였기에, 종래 돌연변이 균주 선별 방법에 비하여 안정적으로 메나퀴논-7 능력을 유지할 수 있는 돌연변이 균주를 선발할 수 있음을 알 수 있었다.
상기의 결과를 바탕으로, 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주를 비타민 K2 생성능이 우수한 신규한 돌연변이 균주로 최종 선발하였으며, 이를 한국생명공학연구원에 기탁하여 2016년 5월 25일 바실러스 서브틸리스 신균주로써 기탁번호(KCTC 13028BP)를 부여받았다.
이하, 실시예 2에서는 상기 최종 선발한 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주를 이용하여, 메나퀴논-7 고생산을 위한 최적화된 배지 조성 및 배양 온도 등의 조건을 확립하였다.
자외선 또는 NTG 처리에 의한 바실러스 서브틸리스 메나디온 내성 돌연변이 균주의 플라스크 배양 결과
No. 균주명 돌연변이 처리법 메나퀴논-7 농도
(㎎/ℓ)
대조군
(control)		 Bacillus Subtilis BSM-Control - 3.13
1 Bacillus Subtilis BSM-K01 자외선(UV)/
메나디온(menadione) 내성 		4.70
2 Bacillus Subtilis BSM-K02 자외선(UV)/
메나디온(menadione) 내성 		4.72
3 Bacillus Sbutilis BSM-K03 NTG/
메나디온(menadione) 내성 		4.32
4 Bacillus subtilis BSM-K04 NTG/
메나디온(menadione) 내성 		4.06
5 Bacillus subtilis BSM-K05 NTG/
메나디온(menadione) 내성 		4.00
실시예 2: 비타민 K2인 메나퀴논-7 고생산을 위한 바실러스 서브틸리스 BSM -K02 돌연변이 균주의 배양 조건 최적화
상기 실시예 1-4에서 최종 선발한 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주를 이용하여, 비타민 K2, 즉 메나퀴논-7을 고생산하고자, 최적화된 배지 조성 및 배양 온도 등의 조건을 확립하였다. 상세하게는, 바실러스 서브틸리스 BSM-K02의 배지 최적화를 위하여, 우선 탄소원(carbon source)을 선정한 후 유기질소원(organic nitrogen source), 무기질소원(inorganic nitrogen source)의 공급원인 황산암모늄(ammonium sulfate, (NH4)2SO4), 칼륨(potassium, K)과 인(phosphorus, P)의 공급원인 제1인산칼륨(potassium phosphate, monobasic; K2HPO4), 마그네슘(magnesium, Mg)의 공급원인 황산마그네슘(magnesium sulfate, MgSO4)의 조성비를 최적화하였으며, 최적의 배양 온도를 선정하였다. 구체적으로 하기와 같이 실험을 수행하였다.
실시예 2-1: 비타민 K2인 메나퀴논-7 생성능이 우수한 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주 배양을 위한 탄소원의 선별
바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주를 이용하여, 비타민 K2, 즉 메나퀴논-7의 고생산을 위한 배양 배지 조성을 최적화하고자, 우선 탄소원(carbon source)을 선정하였다.
구체적으로 탄소원 선정을 위하여, 탄소원으로서 포도당(glucose), 슈크로스(sucrose), 프락토스(fructose), 및 글리세린(glycerine) 각각을 플라스크 배지(0.2% 황산마그네슘(MgSO4), 2% 효모 추출물, 1% 황산암모늄((NH4)2SO4), 0.25% 제1인산칼륨(K2HPO4), 0.04% 염화칼슘(calcium chloride, CaCl2), 0.035% 황산망간(MnSO4·H2O), pH 7.0)에 3% 첨가하여 140시간 동안 배양을 수행하면서 상기 균주의 메나퀴논-7 생성 능력을 조사하였다. 이때, 종균은 TGY 배지에서 12시간 동안 성장시킨 후, 상기 플라스크 배양액에 10% 접종하였으며, 종균 및 플라스크 배양은 배양 온도 37℃ 및 교반 속도 140 rpm의 조건에서 수행되었다.
그 결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 슈크로스(sucrose)를 탄소원으로 사용하는 경우가 포도당, 프락토스 및 글리세린과 같은 다른 탄소원을 사용하는 경우에 비하여 메나퀴논-7 생성 능력이 1.2~1.7배 높음을 확인하였으며, 균체 성장 또한 제일 우수함을 확인하였다. 특히, 글리세린(glycerine)을 탄소원으로 사용하는 경우 균체는 거의 성장하지 못하여 메나퀴논-7이 전혀 생산되지 않음을 확인하였다.
상기의 결과를 바탕으로, 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주 배양을 위한 탄소원으로 슈크로스를 선정하였다.
탄소원 종류에 따른 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주의 메나퀴논-7 생산 결과
탄소원 OD 660 메나퀴논-7 농도
(㎎/ℓ)
포도당(glucose) 3.2 3.31
슈크로스(sucrose)* 5.4 4.03
프락토스(fructose) 2.7 2.36
글리세린(glycerin) 1.1 0.00
실시예 2-2: 비타민 K2인 메나퀴논-7 생성능이 우수한 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주 배양을 위한 유기질소원의 배지 내 함유량 선정
상기 실시예 2-1의 결과를 바탕으로 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주 배양을 위한 배지의 탄소원으로 슈크로스를 선정하였으며, 상기 배양 배지 내 유기질소원의 함유량을 선정하기 위하여, 상기 선정한 탄소원 슈크로스 대비 유기질소원인 효모 추출물의 조성비를 조사하였다. 이때 배양 방법은 상기 실시예 2-1의 배양 방법과 동일하게 수행하였으며, 단, 배지 조성시, 효모 추출물의 농도를 탄소원인 슈크로스 대비 0.01(농도 0.03%)~1(농도 3%)의 비율로 조절하여 변화시켰다.
그 결과, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 탄소원인 슈크로스 대비 유기질소원인 효모 추출물의 조성비가 0.50(농도 1.5%)일 때까지, 균체 농도(OD660 값)는 유기질소원인 효모 추출물의 조성비가 증가할수록 증가함을 확인하였다. 또한, 탄소원인 슈크로스 대비 유기질소원인 효모 추출물의 조성비가 0.50 이상인 경우에는 균체 농도(OD660 값)가 일정함을 확인하였다.
한편, 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주로부터 생산된 메나퀴논-7의 농도는, 탄소원인 슈크로스 대비 유기질소원인 효모 추출물의 조성비가 0.3(농도 1%)일 때, 최대치인 4.06 ppm을 나타내었으나, 탄소원인 슈크로스 대비 유기질소원인 효모 추출물의 조성비가 증가할수록 메나퀴논-7의 생산 농도가 현저히 감소함을 확인하였다.
상기 결과를 바탕으로, 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주 배양을 위한 배지 내 유기질소원의 최적의 함유량은, 탄소원인 슈크로스 대비 유기질소원인 효모 추출물의 조성비가 1:0.3(농도 1.00%)인 것을 최적의 비율로 결정하였다.
탄소원인 슈크로스 대비 유기질소원인 효모 추출물의 조성비에 따른 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주의 성장 정도 및 메나퀴논-7 생산 결과
탄소원 대비 효모추출물 조성비(농도, %) OD 660 메나퀴논-7 농도(㎎/ℓ)
0.01(0.03%) 0.3 1.32
0.10(0.30%) 3.2 3.03
0.30(1.00%)* 5.5 4.06
0.50(1.50%) 7.0 3.93
0.70(2.10%) 7.3 1.32
1.00(3.00%) 7.4 0.80
실시예 2-3: 비타민 K2인 메나퀴논-7 생성능이 우수한 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주 배양을 위한 무기질소원의 배지 내 함유량 선정
상기 실시예 2-1의 결과를 바탕으로 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주 배양을 위한 배지의 탄소원으로 슈크로스를 선정하였으며, 상기 배양 배지 내 무기질소원의 함유량을 선정하기 위하여, 상기 선정한 탄소원 슈크로스 대비 무기질소원인 황산암모늄, 칼륨과 인의 공급원인 제1인산칼륨 및 마그네슘 공급원인 황산마그네슘의 조성비를 조사하였다. 상세하게는, 무기질소원인 황산암모늄의 농도는 탄소원인 슈크로스 대비 0.000(농도 0.00%)~0.500(농도 1.50%)의 비율로, 제1인산칼륨의 농도는 탄소원인 슈크로스 대비 0.000(농도 0.00%)~0.100(농도 0.30%)의 비율로, 황산마그네슘의 농도는 탄소원인 슈크로스 대비 0.000(농도 0.00%)~0.080(농도 0.25%)의 비율로 조절하여 변화시켰으며, 상기 각각의 무기염류 변화가 비타민 K2, 즉 메나퀴논-7 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 이때 플라스크 배양 방법은 상기 실시예 2-1의 배양 방법과 동일하게 수행하였으며, 단, 배지 조성시, 탄소원으로 3% 슈크로스와 유기질소원인 효모 추출물(효모 엑기스) 1%를 첨가하였다.
그 결과, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 무기질소원으로서 황산암모늄의 경우, 탄소원인 슈크로스 대비 황산암모늄의 조성비가 0.500(농도 1.50%)일 때, 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주에서 생산된 상대적 메나퀴논-7의 생산(%)이 현저히 감소함을 확인하였으며, 균체 농도(OD660 값) 또한 감소함을 확인하였다.
무기질소원으로서 제1인산칼륨에 의한 상대적 메나퀴논-7의 생산(%)은 탄소원인 슈크로스 대비 제1인산칼륨의 조성비가 0.016(농도 0.05%)일 때부터, 상대적 메나퀴논-7의 생산(%)이 증가됨을 확인하였으며, 탄소원인 슈크로스 대비 제1인산칼륨의 조성비가 0.050(농도 0.15%)일 때, 상대적 메나퀴논-7의 생산(%) 최대값을 나타냄을 확인하였다. 또한, 탄소원인 슈크로스 대비 제1인산칼륨의 조성비가 0.050 이상으로 증가할수록 감소함을 확인하였으나, 균체 성장(OD660 값)에는 제1인산칼륨의 영향이 없음을 확인하였다.
한편, 무기질소원으로서 황산마그네슘에 의한 상대적 메나퀴논-7의 생산(%)은 탄소원인 슈크로스 대비 황산마그네슘의 조성비가 0.016(농도 0.05%)일 때 최대치를 나타내었으며, 균체 농도(OD660 값) 또한 탄소원인 슈크로스 대비 황산마그네슘의 조성비가 0.016(농도 0.05%)일 때 최대치를 나타냄을 확인하였다. 그러나, 황산마그네슘에 의한 상대적 메나퀴논-7의 생산(%)은 영향을 받지 않는 것으로 확인되었다.
상기 결과를 바탕으로, 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주 배양을 위한 배지 내 무기질소원의 최적의 함유량은, 탄소원인 슈크로스 대비 무기질소원인 황산암모늄의 조성비가 1:0.060(농도 0.20%), 탄소원인 슈크로스 대비 무기질소원인 제1인산칼륨의 조성비가 1:0.050(농도 0.15%), 탄소원인 슈크로스 대비 무기질소원인 황산마그네슘의 조성비가 1:0.016(농도 0.05%)인 것을 각각 최적의 비율로 결정하였다.
탄소원인 슈크로스 대비 무기질소원인 황산암모늄, 제1인산칼륨, 황산마그네슘의 조성비에 따른 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주의 성장 정도 및 메나퀴논-7 생산 결과
무기염류 탄소원 대비 조성비
( 농도,% ) 		OD 660 상대적 메나퀴논-7 생산
(%)


황산암모늄
((NH4)2SO4)

 0.000(0.00%) 3.4 95
0.060(0.20%) 5.6 100
0.160(0.50%) 5.6 97
0.330(1.00%) 4.2 94
0.500(1.50%) 3.6 80



제1인산칼륨
(K2HPO4)


 0.000(0.00%) 3.4 21
0.006(0.02%) 3.7 28
0.016(0.05%) 4.1 88
0.033(0.10%) 4.7 90
0.050(0.15%)* 4.9 100
0.080(0.25%) 4.9 74
0.100(0.30%) 4.1 50


황산마그네슘
(MgSO4)


 0.000(0.00%) 4.4 98
0.016(0.05%) 4.8 100
0.030(0.10%) 4.2 97
0.050(0.15%) 4.2 96
0.060(0.20%) 3.9 96
0.080(0.25%) 3.8 98
실시예 2-4: 최적화한 바실러스 서브틸리스 BSM -K02 돌연변이 균주의 배양 배지를 이용한 메나퀴논-7의 고생산
상기 실시예 2-1 내지 실시예 2-3의 결과를 바탕으로, 탄소원으로 3%의 슈크로스가, 유기질소원으로 1%의 효모 추출물이, 무기질소원으로 0.2%의 황산암모늄, 0.15%의 제1인산칼륨 및 0.05%의 황산마그네슘이 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주 배양을 위한 최적의 배지 내에 포함되는 것으로 결정하였다.
이에, 상기 최적화한 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주의 배양 배지를 사용함에 따라, 상기 균주로부터 비타민 K2, 즉 메나퀴온-7을 고생산 할 수 있는지 확인하기 위하여, 상기 일련의 결과를 통해 결정한 상기 최적화 배지와 종래 기존 배지를 이용하여 신균주 바실러스 서브틸리스 BSM-K02로부터 생산된 비타민 K2, 즉 메나퀴온-7의 생산 정도를 플라스크 배양을 통해 비교하였다. 이때, 배양 조건은 상기 실시예 2-1의 배양 방법과 동일하게 수행하였으며, 최적화 배지는 배양 배지 내에 3%의 슈크로스, 1%의 효모 추출물, 0.2%의 황산암모늄, 0.15%의 제1인산칼륨, 0.05%의 황산마그네슘, 0.04%의 염화칼슘, 및 0.035%의 황산망간이 포함되도록 제조하였다. 한편, 기존 배지는 배양 배지 내에 3%의 포도당, 2%의 효모 추출물, 1%의 황산암모늄, 0.25%의 제1인산칼륨, 0.04%의 염화칼슘, 및 0.035%의 황산망간이 포함되도록 제조하였다.
그 결과, 하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 최적 배지를 이용한 경우, 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주로부터의 메나퀴논-7 생산은 46% 증가함을 확인하였으며, 균체당 메나퀴논-7의 생성 능력인 비산출율(specific yield)은 12% 증가함을 확인하였다. 이는 기존 배지에서 모균주, 바실러스 서브틸리스 BSM-Control 균주의 메나퀴논-7 생산에 비하여 메나퀴논-7 농도가 91% 증가된 결과임을 확인하였다.
기존 배지와 최적 배지를 이용한, 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주로부터의 메나퀴논-7 생산 비교 결과
기존 배지 최적 배지
균체 농도
(g/ℓ) 		메나퀴논-7 농도
(㎎/ℓ) 		비산출율
(Specific yield)
[메나퀴논-7(MK-7)(㎎)
/균체(cell)(g)] 		균체 농도
(g/ℓ) 		메나퀴논-7 농도
(㎎/ℓ) 		비산출율
(Specific yield)
[메나퀴논-7(MK-7)(㎎)
/균체(cell)(g)]
1.00 4.08 4.08 1.30 5.98 4.60
실시예 2-5: 비타민 K2인 메나퀴논-7 고생산을 위한 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주의 배양 pH 조건 선정
상기 실시예 2-4의 최적화한 배지를 근거로, 배양 배지 내 탄소원인 슈크로스를 10%로 증가시키고, 이에 따라 유기질소원 및 무기질소원으로서 효모 추출물, 황산암모늄, 제1인산칼륨, 및 황산마그네슘의 조성비가 각각 탄소원인 슈크로스 대비 1:0.3(농도 1.00%), 1:0.060(농도 0.20%), 1:0.050(농도 0.15%), 및 1:0.016(농도 0.05%) 비율이 되도록 조절하여 최적 배지를 제조하였다. 상기 제조한 배지를 이용하여 신규한 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주를 5ℓ 발효조에서 배양하였다.
이때, pH 조절에 따른 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주의 메나퀴논-7 생산 정도를 조사하기 위해, 배양 중에 pH를 조절하지 않거나, 5N 가성소다(NaOH)를 이용하여 pH 6.8로 조절하여, pH 6.8로 조절한 경우와 조절하지 않은 경우에 대하여 메나퀴논-7 생산 정도를 조사하였다.
한편, 배양 중에 pH를 조절하지 않는 경우, 초기 pH는 6.4였으며, 배양이 진행될수록 pH가 감소하기 시작하여 pH 5.5 ~6.0으로 pH 값이 감소함을 확인하였다. 이후, 균체가 용해(lysis) 됨에 따라 pH가 서서히 상승하였으며, pH를 6.8로 조절하게 되는 경우 균체의 용해 속도가 증가하여 메나퀴논-7의 생성이 감소하는 것으로 나타났다.
구체적으로, pH 6.8로 조절한 경우와, 조절하지 않은 경우, 즉 배양을 진행하는 동안 변화하는 pH에 대하여 가성소다(NaOH) 처리 없이 pH 변화를 그대로 놓아 둔 경우에 대하여 메나퀴논-7 생산 정도를 조사하기 위해 사용한 최적화 배지는 배양 배지 내에 10%의 슈크로스, 3%의 효모 추출물, 0.6%의 황산암모늄, 0.5%의 제1인산칼륨, 0.15%의 황산마그네슘, 0.04%의 염화칼슘, 및 0.035%의 황산망간이 포함되도록 제조하였다. 한편, 배양 발효조건은 배양 온도 37℃, 통기 속도 0.5 vvm 이었으며, 교반 속도는 600 rpm 이였다. 종균은 TGY 배지에서 배양 온도 37℃ 및 교반 속도 140 rpm의 조건하에서 16시간 동안 성장시킨 후, 상기 5ℓ 발효조의 최적화 배지에 4% 접종하여 실험을 수행하였다.
pH 6.8로 조절한 경우와 조절하지 않은 경우에 대하여 메나퀴논-7 생산 정도를 조사해 본 결과, 하기 표 6에 나타낸 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주를 이용하여 메나퀴논-7을 생산하는 경우, 배양 중 pH를 조절하지 않는 경우가 pH 6.8로 조절한 경우에 비하여 발효시간이 3배 단축됨을 확인하였다. 또한, 메나퀴논-7 생산은 균체의 용해(lysis) 속도가 느려져 1.7배 증대되었으며, 이에 따라 생산성은 시간(hr)당 메나퀴논-7(MK-7)이 0.5 ㎎/ℓ(0.5 ㎎ MK-7/ℓ/hr)로 5배가 증가한 것을 확인하였다. 즉, pH를 조절하지 않은 경우, 배양 24시간 후 최종 균체 농도는 5.23 g/ℓ 이였으며, 최대 메나퀴논-7 농도는 11.27 ㎎/ℓ 이였다.
그러나, 균체당 메나퀴논-7의 생성 능력인 비산출율(specific yield)은 pH를 조절하지 않는 경우가 pH 6.8로 조절한 경우에 비하여 1.2배 감소한 2.3 ㎎ MK-7/g-cell 이였다. 이는, pH를 조절하지 않은 경우, 최대 메나퀴논-7을 생산하는 시점에 균체 농도가 5.23 g/ℓ로, pH 조절에 의한 최대 메나퀴논-7을 생산하는 시점의 균체 농도인 2.36 g/ℓ 에 비하여 2.2배 증가하였기 때문이다.
즉, 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주를 이용하여 메나퀴논-7 발효를 진행할 시, 배양 10시간 이후에는 균체가 용해(lysis) 되기 시작하여 균체 농도가 감소하게 되며, 이러한 용해(lysis) 속도는 pH를 조절하는 경우가 pH를 조절하지 않는 경우에 비하여 빠르게 진행되어 배양 24시간째 균체 농도는 pH를 조절하지 않은 경우에 비하여 2배 정도 감소하게 됨을 알 수 있었다. 이로 인하여 pH를 조절하게 되는 경우, 메나퀴논-7의 생산 속도도 느려지게 되고, 농도도 낮아지게 됨을 알 수 있었다.
따라서, 상기 결과를 바탕으로, 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주 배양 시, 비타민 K2, 즉 메나퀴논-7 고생산을 위해서는 pH 조절 없이 배양하는 것이 최적의 배양 조건임을 알 수 있었다.
발효 배양 중 pH 조절에 따른 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주의 메나퀴논-7 생산 결과
pH 조절(pH 6.8) pH 조절하지 않음
발효시간(시간, hr) 72 24
최대 균체 농도(g/ℓ) 16.1 12.3
최종 균체 농도(g/ℓ) 2.36 5.23
최대 메나퀴논-7 농도(㎎/ℓ) 6.93 11.97
비산출율(Specific yield)
[메나퀴논-7(MK-7)(㎎)/균체(cell)(g)]		 2.9 2.3
시간(hr)당 메나퀴논-7 생산성
[메나퀴논-7(MK-7)(mg)/ℓ]		 0.1 0.5
실시예 2-6: 비타민 K2인 메나퀴논-7 고생산을 위한 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주의 배양 온도 조건 선정
상기 실시예 2-5에서 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주의 배양 시, pH를 조절하지 않는 것이 최적의 배양 조건임을 확인하였다.
이에, 배양 온도 조절에 따른 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주의 메나퀴논-7 생산 정도를 조사하기 위해, 5ℓ 발효조에서 상기 균주 배양 시, pH 조절 없이, 37℃, 40℃, 43℃, 및 45℃의 온도 조건만 변화를 주고, 상기 온도 변화에 따른 신규한 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주의 메나퀴논-7 생산 정도를 조사하였다. 이때, 배지 조성, 배양 및 종균 조건은 상기 실시예 2-5와 동일하게 수행하였다.
그 결과, 하기 표 7에 나타낸 바와 같이, 배양 온도 변화에 따른 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주의 메나퀴논-7 생산은 배양 온도 증가에 따라 증가함을 확인하였으며, 배양 온도가 43℃일 때 최대치인 18.9 ㎎/ℓ를 나타냄을 확인하였다. 또한, 균체당 메나퀴논-7의 생성 능력인 비산출율(specific yield) 및 생산성도 상기 43℃의 온도 조건에서 최대치를 나타내었으며, 구체적으로 균체당 메나퀴논-7의 생성 능력인 비산출율(specific yield)은 3.6 ㎎ MK-7/g-cell 이였으며, 생산성은 시간(hr)당 메나퀴논-7(MK-7)이 0.79 ㎎/ℓ(0.79 ㎎ MK-7/ℓ/hr) 임을 확인하였다. 이를 통해, 기존 37℃의 배양 온도 조건에 비하여 균체당 메나퀴논-7의 생성 능력인 비산출율(specific yield) 및 생산성이 1.6배 증가한 것을 알 수 있었다.
따라서, 상기 결과를 바탕으로, 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주 배양 시, 비타민 K2, 즉 메나퀴논-7 고생산을 위해서는 pH 조절 없이, 43℃의 온도 조건에서 배양하는 것이 최적의 배양 조건임을 알 수 있었다.
배양 온도 변화에 따른 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주의 메나퀴논-7 생산 결과
37℃ 40℃ 43℃* 45℃
발효시간(시간, hr) 24 24 24 24
최대 균체농도(g/ℓ) 12.3 13.2 13.1 10.9
최종 균체농도(g/ℓ) 5.23 5.23 5.23 3.30
최대 메나퀴논-7 농도(㎎/ℓ) 11.97 13.81 18.90 9.67
비산출율(Specific yield)
[메나퀴논-7(MK-7)(㎎)/균체(cell)(g)]		 2.3 2.6 3.6 2.9
시간(hr)당 메나퀴논-7 생산성
[메나퀴논-7(MK-7)(mg)/ℓ]		 0.50 0.57 0.79 0.40
실시예 2-7: 최적화한 바실러스 서브틸리스 BSM -K02 돌연변이 균주의 배양 조건에서의 메나퀴논-7의 생산
상기 실시예 2-6에서 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주 배양 시, 비타민 K2, 즉 메나퀴논-7 고생산을 위해서는 pH 조절 없이, 43℃의 온도 조건에서 배양하는 것이 최적의 배양 조건임을 확인하였다. 이에, 상기 실시예 2-6에서 구축한 최적의 배양 조건하에서 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주의 메나퀴논-7 생산 정도를 조사하고자 하였다.
구체적으로, 5ℓ 발효조에서 상기 신규한 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주 배양 시, pH 조절 없이, 초기 37℃의 온도 조건에서 6시간 동안 배양한 후, 6시간째 배양 온도 조건을 43℃로 변화(shift)시켰으며, 이에 따른 상기 균주의 메나퀴논-7 생산 정도를 조사하였다. 이때, 대조군으로는 모균주인 바실러스 서브틸리스 BSM-Control 균주를 사용하였으며, 배지 조성, 배양 및 종균 조건은 상기 실시예 2-6과 동일하게 수행하였다.
그 결과, 하기 도 4에 나타낸 바와 같이, 최적의 배양 조건 하에서, 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주는 모균주인 바실러스 서브틸리스 BSM-Control 균주와 비슷한 메나퀴논-7 발효 형태를 보임을 확인하였다. 그러나, 메나퀴논-7 생산 능력은 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주가 모균주인 바실러스 서브틸리스 BSM-Control 균주와 비교하여 2배 이상 증가되었으며, 발효 배양 24시간 후, 21.8 ㎎/ℓ의 비타민 K2, 즉 메나퀴논-7을 생산함을 확인하였다. 이는, 모균주인 바실러스 서브틸리스 BSM-Control 균주의 메나퀴논-7의 발효 농도인 11.4 ㎎/ℓ에 비하여 1.9배 증가하였음을 알 수 있었다.
최적의 배양 조건 하에서, 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주와 모균주인 바실러스 서브틸리스 BSM-Control 균주의 메나퀴논-7 생산 비교 결과
바실러스 서브틸리스 BSM-K02
(돌연변이 균주) 		바실러스 서브틸리스
BSM -Control
( 모균주 )
발효시간(시간) 24 24
최대 균체농도(g/ℓ) 14.0 15.1
최종 균체농도(g/ℓ) 5.8 5.1
최대 메나퀴논-7 농도(㎎/ℓ) 21.8 11.4
비산출율(Specific yield)
[메나퀴논-7(MK-7)(㎎)/균체(cell)(g)]		 3.8 2.2
시간(hr)당 메나퀴논-7 생산성
[메나퀴논-7(MK-7)(mg)/ℓ]		 0.91 0.48
이러한 결과는, 상기 표 8에 나타낸 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주가 모균주인 바실러스 서브틸리스 BSM-Control 균주에 비하여 균체당 메나퀴논-7의 생성 능력인 비산출율(specific yield)은 1.7배 증가하고, 생산성은 1.9배 증가하였음을 알 수 있었다.
상기 결과를 통해, 최적화된 배양 조건에서 바실러스 서브틸리스 BSM-K02 돌연변이 균주를 이용하여 비타민 K2, 즉 메나퀴논-7을 생산할 시, 모균주인 바실러스 서브틸리스 BSM-Control 균주에 비하여 메나퀴논-7 생산성을 1.9배 이상 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라, 메나퀴논-7 생산에 관한 종래 기술에 비하여 유기질소원의 농도 또한 3배~8배 절감할 수 있어 메나퀴논-7을 생산하는 데 있어 경제적 비용을 감소시킬 수 있다.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC13028BP
수탁일자 : 20160525

Claims (8)

  1. 삭제
  2. 메나디온(menadione)에 대한 내성을 지니고, 방향족 아미노산(aromatic amino acid)인 L-페닐알라닌(L-phenylalanine), L-트립토판(L-tryptophan) 및 L-타이로신(L-tyrosine)에 대한 저해를 받지 않으며, 수탁번호 KCTC13028BP로 기탁된, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) BSM-K02 돌연변이 균주를 탄소원으로 슈크로스(sucrose), 유기질소원으로 효모 추출물, 무기질소원으로 황산암모늄(ammonium sulfate, (NH4)2SO4), 제1인산칼륨(potassium phosphate, monobasic; K2HPO4) 및 황산마그네슘(magnesium sulfate, MgSO4)을 포함하는 배지에 접종하여, 배양이 진행되는 동안 pH 조절 없이 39 내지 44℃의 온도 조건하에서 6 내지 24시간 동안 배양하는 것을 포함하는 메나퀴논-7(MK-7)의 대량 생산 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제2항에 있어서, 상기 배지는 탄소원인 슈크로스와 유기질소원인 효모 추출물이 1 : 0.1 내지 0.5 중량비로 함유되고, 탄소원인 슈크로스와 무기질소원인 황산암모늄((NH4)2SO4)이 1 : 0.06 내지 0.33 중량비로 함유되고, 탄소원인 슈크로스와 무기질소원인 제1인산칼륨(K2HPO4)이 1 : 0.016 내지 0.050 중량비로 함유되고, 탄소원인 슈크로스와 무기질소원인 황산마그네슘(MgSO4)이 1 : 0.016 내지 0.080 중량비로 함유되는 것인 메나퀴논-7(MK-7)의 대량 생산 방법.
  8. 삭제
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