KR100373510B1

KR100373510B1 - 테이코플라닌을 생산하는 미생물

Info

Publication number: KR100373510B1
Application number: KR10-2000-0045815A
Authority: KR
Inventors: 장준환; 유원일; 이광섭; 김덕열
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2000-08-08
Filing date: 2000-08-08
Publication date: 2003-02-25
Also published as: KR20020012658A

Abstract

본 발명은 테이코플라닌(teicoplanin)을 생산하는 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스(Actinoplanes teichomyceticus) ATCC 31121을 친주로 하여 인공돌연변이법 및 단일 포자 분리법에 따라 처리하여 친주의 형질을 개량함으로써 친주에 비해 테이코플라닌 생산능이 향상된 변이주(악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 CJP 20003)에 관한 것이다.

Description

테이코플라닌을 생산하는 미생물 {Teicoplanin producing microorganism}

본 발명은 테이코플라닌(teicoplanin)을 생산하는 미생물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스(Actinoplanes teichomyceticus) ATCC 31121의 변이주로서 기존의 균주에 비해 테이코플라닌 생산능이 향상된 미생물에 관한 것이다.

테이코플라닌은 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 종에 속하는 균주에 의해 생산되는 글리코펩티드계 항생제로서 거의 모든 그람 양성 세균성 질환의 치료에 사용되며, 페니실린이나 세파로스포린계의 항생제에 저항성이 있는 세균성 질환에 광범위하게 사용된다. 또한 수술환자 및 고령환자, 면역력이 약한 사람에게 치명적인 메치실린 내성 포도상구균(MRSA)의 치료에 사용되는 유일한 항생제인 반코마이신과 유사한 효능을 가지며, 반감기가 길어서 1일 1회 투여 및 근육주사가 가능한 고부가가치 항생제이다.

테이코플라닌은 야생 미생물인 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 ATCC 31121을 동화가능한 탄소원, 질소원 및 무기염이 함유된 배지 중에서 배양시켜 배지로부터 회수된 생성물을 정제하여 제조해 왔다. 그러나, 이러한 방법은 발효 농도가 50㎎/ℓ 이하로 매우 낮아서 생산비용이 높고, 산업적인 생산에 어려움이 많았다. 따라서, 이러한 문제를 고려하여 테이코플라닌의 생산능이 크게 향상된 변이주를 제공할 필요성이 대두되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 ATCC 31121의 형질을 개량함으로써 기존의 균주가 보유하고 있는 테이코플라닌의 생산능이 크게 향상된 변이주를 제공하는 데 있다.

본 발명에 따른 테이코플라닌을 생산하는 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 CJP 20003은 야생주인 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 ATCC 31121을 친주로 하여 돌연변이원으로 자외선 처리에 의한 인공돌연변이법과 단일 포자 분리법을 이용하여 획득되는 테이코플라닌을 고농도로 생산하는 변이주이다. 변이주 선별 방법은 자외선 처리 후 살아남은 균주를 포자 크기, 색깔, 형태의 변화에 따라 각각 분리하고, 탄소원, 질소원 및 무기염을 원료로 한 액체 배지에서 호기적으로 배양하여, 배양액을 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)로 역가를 확인한 후, 친주보다 역가가 크게 향상된 변이주를 분리하는 방법으로, 수차례 반복 실험하여 확인한 결과, 테이코플라닌의 역가가 야생균주보다 약 18배(911㎎/ℓ) 이상 향상된 변이주를 선별한다.

실시예 1

변이주 분리 방법

변이주의 분리는 친주인 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 ATCC 31121을 사면배지(표 1의 ②), 28℃에서 15일 동안 배양한 후, 멸균된 0.5% 탄산칼슘 10㎖을 가하고 균사체를 긁어내 유리솜과 No.2 필터페이퍼로 채워진 깔때기에 통과시켜 균사체를 여과 분리하여 포자 현탁액을 조제하였다. 이 포자 현탁액을 빛을 완전히 차단시킨 상태에서 30W 자외선 램프를 사용하여 30cm의 거리에서 4분 동안 자외선을 조사하였다. 이때 사멸율은 97.5%였다. 자외선을 조사한 현탁액을 빛을 차단시킨 채 4℃에서 2시간 방치 후 희석액(표 2)을 이용하여 희석시켜 평판배지(표 1의 ①)에 도말한 후 28℃에서 2주일 배양 후 나타나는 포자를 크기, 색깔, 형태의 변화에 따라 선택하여 각각 평판배지에서 2주일간 배양하였다.

이와 같이 분리된 변이주들을 삼각플라스크를 이용하여 전배양배지(표 1의 ③)에서 2일 배양 후, 종배양배지(표 1의 ④)에 10% 접종하여 7일간 배양하여 HPLC 정량분석을 통하여 테이코플라닌 농도가 가장 높은 변이주를 얻은 후, 단일 포자 분리법을 통하여 농도가 가장 높고 안정된 변이주를 선별하였다.

종류	조성
① 평판배지(Agar plate)	완두콩가루(Pea meal) 3.0%, 포도당 1.0%, 소금 0.5%, 한천(Agar) 2.0%, pH 7.3, 증류수 93.5%
② 사면배지(Agar slant)	완두콩가루(Pea meal) 3.0%, 포도당 1.0%, 소금 0.5%, 한천(Agar) 2.0%, pH 7.3, 증류수 93.5%
③ 전배양배지	포도당 2.5%, 육즙(meat extract) 0.4%, 효모즙 0.1%, 대두가루 1.0%, 펩톤 0.4%, 소금 0.25%, 탄산칼슘 0.5%, pH 7.3, 증류수 94.85%
④ 종배양배지	포도당 1.0%, 맥아즙 2.0%, 효모즙 0.4%, 면실가루 1.0%, pH 7.3, 증류수 95.6%

종류	조성
포도당	1.0%
맥아즙	2.0%
효모즙	0.4%
증류수	96.6%
pH	7.3

선별한 변이주를 5회 이상 배양한 결과, 균의 특성 및 역가가 안정한 것으로 판명되었다.

선별한 변이주의 피드백 제어(feedback inhibition) 농도를 확인하기 위해서 평판배지(표 1의 ②)에 테이코플라닌을 농도별로 첨가한 후, 상기에서 선별된 변이주와 야생주인 ATCC 31121을 한줄로 그어서 균의 생장을 확인하는 피드백 제어 정도를 비교하였다. 변이주와 야생주의 피드백 제어 실험 결과를 표 3에 기재하였다.

테이코플라닌 농도(㎎/ℓ)	50	100	200	300	400	500
변이주(CJP 20003)	++++	++++	+++	++	+	-
야생주(ATCC 31121)	+	-	-	-	-	-

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 야생주는 테이코플라닌이 50mg/ℓ 이상 함유된 배지에서는 생장이 되지 않았으나, 본 발명에서 선별된 변이주는 400mg/ℓ 농도의 테이코플라닌이 함유된 배지에서 생장이 확인되었다.

선별한 변이주 형태의 특성은 배양 중에 원형의 바탕에 별(☆) 모양으로 볼록하게 솟아올랐으며, 포자의 색깔은 백색에 약한 미색을 나타냈고, 그람 양성을보인다. 배양학적 특성은 배양액이 갈색을 나타냈으며, 충분한 통기량으로 용존 산소를 높게 유지시켜야 했다. 생리학적 특성으로 최적의 pH는 6.5~8.2, 온도 25~36 ℃에서 성장하는 호기성 균주이다.

본 발명에서 분리한 신규 변이주의 배양학적 특성, 생리학적 특성 및 탄소원이용도를 각각 표 4, 표 5 및 표 6에 기재하였다.

변이주의 배양학적 특성

배지	성장	균사색	배면색	수용성 색소
무기염-녹말(No1 Gause)	보통	흰색	무색	없음
쟈펙 글루코스 한천배지	좋음	흰색	밝은 갈색	엷은 노랑
쟈펙 슈크로스 한천배지	좋음	크림	밝은 갈색	크림
글루코스-아스파라긴 한천배지	보통	크림	무색	없음
글리세롤-나이트레이트 한천배지 린덴반	좋음	크림	크림	없음
오트밀 한천배지	좋음	크림	크림	없음
트립톤-펩톤-글루코스 한천배지(No2 Gause)	보통	크림	크림	없음
감자 한천배지	보통	크림	크림	없음
ISP-2	좋음	크림	크림	밝은 갈색
ISP-3	좋음	크림	크림	없음
ISP-4	좋음	크림	밝은 크림	없음
ISP-5	좋음	크림	밝은 크림	없음
ISP-6	나쁨	크림	없음	없음
ISP-7	보통	크림	크림	연한 갈색

변이주의 생리학적 특성

성장 pH 범위	3.5∼8.5
티로신 반응	-
멜라닌 색소	+
질산기 환원반응	-
젤라틴의 용해	-
우유의 응고	-
우유의 펩톤화	- (+)
녹말의 가수분해	+
셀룰로즈 분해	-
칼슘말레이트 가수분해	+ (-)
요소분해	+
인산분해효소의 생산	+
50℃, 8시간의 생존율	+
※, ( )은 야생주(ATCC 31121)의 데이타

변이주의 탄소원 이용도

탄소원	이용
아라비노즈	+
글루코스	++
갈락토스	++
슈크로스	++
락토스	+
람노스	+(-)
자일로즈	+
라피노즈	-
※, ( )은 야생주(ATCC 31121)의 데이타

본 발명에서 선별된 신규의 변이주는 우유의 펩톤화가 없었고, 칼슘말레이트의 가수분해가 있었으며, 람노스의 탄소원을 이용하는 등의 배양학적 특성(표 4), 생리학적 특성(표 5) 및 탄소원이용도(표 6)를 종합해 보면, 친주인 ATCC 31121과는 다른 새로운 균주로 판명되어 이 변이주를 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 CJP 20003이라 명명하고, 사단법인 한국 종균협회에 기탁하였다(수탁번호 KFCC-11187).

실험예 1

변이주의 테이코플라닌 생성 확인 실험

사용 균주: 변이주 CJP 20003

배양 방법: 전배양배지(표 1의 ③) 50㎖를 삼각플라스크에 분주하고, 121℃에서 20분간 가압 살균한다. 평판배지에서 2주일간 자란 배지(균주포함) 조각(0.5cm X 0.5cm)을 살균된 전배양배지에 식균하여 28℃에서 회전 교반 배양기를 분당 250 회전속도로 2일간 배양하였다. 상기 조성의 종배양배지(표 1의 ④) 50㎖을 500㎖ 삼각플라스크에 넣어 121℃에서 20분간 가압 살균한 후 배양이 완료된 전배양액 10%(5㎖)를 접종하여 28℃에서 회전 교반 배양기로 분당 250 회전속도로 7일간 배양하였다. 균체의 성장은 발효액 10㎖을 취하여 450g에서 10분간 원심분리 후 PMV(Packed Mycellium Volume)로 측정하였다. 이 때 배양액의 pH는 7.41, PMV는 34%였다. 테이코플라닌 분석은 워터스C18 컬럼(3.9mm X 300mm)과 시마주 (shimadzu)사의 고압 액체 크로마토그래피 기기(Model LC-10AD)를 사용하고, 주사용 테이코플라닌(타고시드)을 표준 물질로 사용하는 고압 액체 크로마토그래피 분석법을 이용하였다. 이 배양액 600㎕에 400㎕의 노말-프로판올을 가하여 혼합하고 15분 내지 30분간 흔들고 원심분리하여 HPLC 분석법으로 정량하였다. 그 결과를 표 7에 기재하였다.

친주와 변이주의 역가 비교

균주	역가
친주(ATCC 31121)	50 ㎎/ℓ이하
변이주(CJP 20003)	911 ㎎/ℓ

상기 표 7에 나타난 바와 같이, 배양액 중의 테이코플라닌의 농도가 911mg/ℓ로 야생균주에 비해 약 18배 이상 생성되었다.

따라서, 본 발명에 의하면 테이코플라닌 생산능이 향상된 미생물을 제공하여 보다 저렴한 생산비로 보다 안정적인 고부가가치의 테이코플라닌을 생산할 수 있는 효과가 있다.

이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

Claims

고농도의 테이코플라닌을 생산하는 미생물 CJP 20003(한국 종균협회 수탁번호 KFCC-11187).
제 1 항의 고농도의 테이코플라닌을 생성하는 미생물 CJP 20003(한국 종균협회 수탁번호 KFCC-11187)을 이용하여 테이코플라닌을 생성하는 방법.