JP4248485B2 - テイコプラニンの産生のための微生物およびプロセス - Google Patents
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Description
テイコプラニンは、Actinoplanes teichomyceticusによって産生される抗生物質の1つであり、バンコマイシン−リストセチンファミリーの糖ペプチド抗生物質に分類されている。その機構は、細胞壁生合成を阻害することであり、そしてメチシリン耐性Staphylococcus aureus、コアグラーゼ陰性Staphylococcus、ClostrdiumおよびEnterococcusなどのグラム陽性抗生物質耐性病原体に対して投与されている。
本発明の目的は、韓国微生物保存センター(Korean Culture Center of Microorganism)に受託番号KCCM−10601で寄託された変異株Actinoplanes teichoplanes BNG2315を用いて、テイコプラニンを最大限産生するための醗酵方法を提供することである。この方法は、以下の工程を包含する: i)グルコース15g/L〜25g/L、デキストリン40g/L〜80g/L、ペプトン4g/L〜6g/L、ナタネ粗引き粉(meal)16g/L〜20g/L、ダイズ粉16g/L〜20g/L、MgSO4・7H2O 0.4g/L〜0.6g/L、CaCO3 4g/L〜6g/L、およびNaCl 1.0g/L〜1.4g/Lを含む産生培地上で、該培地の曝気速度が1分間当たり、1培地容量につき、空気0.5〜2.0容量である条件で変異株細胞を醗酵させる工程;ii)該変異株細胞および他の残渣を、該醗酵培地から取り除く工程;およびiii)工程ii)の該醗酵培地からテイコプラニンを単離および回収する工程。
上記変異株は、Actinoplanes teichomyceticusに属することが、細胞の脂肪酸分析および16s rDNA配列分析などの分類学的調査を通じて決定された。
(テイコプラニン産生微生物の単離)
変異株Actinoplanes teichomyceticus BNG 23を、大韓民国雪嶽山から収集した土壌サンプルから、キャピラリーチューブ法により単離した。上記の土壌サンプルからの微生物を、Actinomycetalesのメンバーの同定のための選択培地上に接種した。ついで、分類学的な特性によってActinomycetalesのメンバーとして選択された候補培養物を、グルコース、デキストリン、ダイズ粉、ジャガイモタンパク質、および鉱物塩を含む水性栄養培地中で増殖させた。この培養ブロスを濾過し、そして高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により、テイコプラニンのアッセイについて標準的なプロトコールを用いて分析した。テイコプラニン産生体として選択された候補培養物を、0.3%(v/v)のS.aureusの水性懸濁物(1mlあたり106細胞を含む)を接種したDifco Nobel寒天培地上で実施される微生物アッセイに供した。最後に、テイコプラニン産生体として選択された候補培養物を、分類学的に同定し、そして培養物によって産生されたテイコプラニンとして推定された化合物を、その物理化学的特性に関して分析した。
(テイコプラニンの高産生変異株の単離)
上記母株よりもさらに効率よくテイコプラニンを産生する変異株を単離するために、変異誘発のための処理を紫外線照射によって行った。母株を、オートミール寒天スラントにおいて32℃で12日間培養した。通常の生理食塩水緩衝液を、このスラントに加え、そしてこれらを激しく混合し、ついで、懸濁物をNo.2 Wattman Paperを用いて濾過した。胞子懸濁物を、30W 紫外線ランプによる紫外線照射に供し、そして暗所にて2時間4℃で静置した。胞子懸濁物を、100mg/Lテイコプラニンを含むソイトン(soytone)寒天培地上に移し、そして7日間32℃でインキュベートした。
(産生培地の組成)
(変異株Actinoplanes teichomyceticus BNG 2315の分類学的同定)
新たに単離したテイコプラニン産生株を細胞脂肪酸、細胞壁組成および16s rDNA配列の分析によって分類学的に同定した。細胞脂肪酸の分析は、Actinoplanes teichomyceticusとの98%の類似性を示し、そしてこの株のジアミノピメリン酸(diaminopimeric acid)は、Actinoplanes teichomyceticusのジアミノピメリン酸と同じくメソ体である。特に、この新たに単離されたテイコプラニン産生株の16s rDNAの配列は、Actinoplanes teichomyceticusの16s rDNA配列と99%の相同性を示す。結果として、この新たに単離されたテイコプラニン産生株は、Actinoplanes teichomyceticusに属すると決定された。しかし、この株は、米国特許第4,239,751号に記載される株Actinoplanes teichomyceticusとは、以下に記載されるいくつかの培養特性および生理学的特性によって明らかに区別される。従って、この変異株は、Actinoplanes teichomyceticus BNG 2315と割当てられ、そしてブダペスト条約の下で、韓国微生物保存センター(Korea Culture Center of Microorganism)に受託番号KCCM−10601として寄託された。
(変異株Actinoplanes teichomyceticus BNS 2315の培養特性)
(1)肉眼試験
オートミール寒天培地で生成するコロニーのサイズは、直径3〜4mmである。コロニーの形状は、十分に規定されかつ規則的な輪郭であり、淡橙色を有する中心のドーム様の隆起である。明るい橙色〜深橙色の植物性菌糸体が、培地のほとんどで生成される。しかし、この植物性菌糸体の色は、ジャガイモ、スキムミルクおよびavena酵母寒天培地では淡褐色である。いくつかの培地では、淡褐色の可溶性色素が生成される。長菌糸から生成された十分に発達した気中菌糸体が、いくつかの培地で見出される。
(培養特性(32℃で14日間インキュベートした))
ほとんどの培地で多量に生成された胞子嚢は、主に、コロニーのドーム上で見出される。この胞子嚢は、球形〜楕円形であり、規則的な輪郭を有し、15〜20μmの範囲の直径を有する。胞子嚢柄は、真っ直ぐであり、直径約15μmおよび2μmである。高度に運動性の胞子は、球形〜楕円形であり、直径1.5〜2μmである。植物性菌糸体は、直径0.5〜1μmの薄い、ねじれた分枝状の菌糸から構成される。
(変異株Actinoplanes techomyceticus BNG 2315の生理学的特性)
変異株Actinoplanes teichomyceticus BNG 2315の生理学的特性を、他のテイコプラニン生成体と比較した。表3は、炭素源の使用を報告する。
(糖質の使用)
(生理学的特性)
(好気性醗酵によるテイコプラニンの産生)
テイコプラニンの産生のために、変異株Actinoplanes teichomyceticus BNG 2315を、同化可能な炭素源、窒素源、および無機塩源を含む、水性栄養培地中にて好気条件下で醗酵させる。より具体的には、Actinoplanes teichomyceticus BNG 2315を、実質的な菌糸体増殖が存在するまで、5〜9の範囲のpH値にて、より好ましくはpH7にて、栄養培地中で好気的に前培養する。そのフラスコを、28〜34℃にて、より好ましくは32℃にて、24〜48時間振盪し、その後、その前培養物を、最終濃度5〜10%にてジャー発酵槽に接種するために使用する。上記栄養培地の例として、前培養物は、表5に示されるような以下の組成(g/L)を有し得る。
(前培養培地の組成)
(種培養培地の組成)
(産生培地の組成)
(テイコプラニンについての生産性の比較)
(テイコプラニンA2複合体の組成)
本発明は、新たな単離変異株培養物Actinoplanes teichomyceticus BNG 2315を提供する。この培養物は、以前に報告された微生物(例えば、Actinoplanes teichomyceticu nov.sp.ATCC31121)よりも約60倍を超えて高い生産性でテイコプラニンを産生する能力を有する。本発明はまた、変異株Actinoplanes teichomyceticus BNG 2315を、炭素源、窒素源および鉱物塩を含む培養培地中で用いて好気条件でテイコプラニンを産生するための醗酵プロセスを提供する。
Claims (2)
- 韓国微生物保存センター(Korean Culture Center of Microorganism)に受託番号KCCM−10601で寄託されたアクチノプラネス テイコミセチクス(Actinoplanes teichomyceticus)BNG 2315を用いる、テイコプラニンの最大産生のための醗酵方法であって、該方法は、以下の工程:
i)グルコース15g/L〜25g/L、デキストリン40g/L〜80g/L、ペプトン4g/L〜6g/L、ナタネ粗引き粉16g/L〜20g/L、ダイズ粉16g/L〜20g/L、MgSO4・7H2O 0.4g/L〜0.6g/L、CaCO3 4g/L〜6g/L、およびNaCl 1.0g/L〜1.4g/Lを含む産生培地上で、該培地の曝気速度が1分間当たり、1培地容量につき、空気0.5容量〜2.0容量である条件で、アクチノプラネス テイコミセチクス(Actinoplanes teichomyceticus)BNG 2315細胞を醗酵させる工程;
ii)該細胞および他の残渣を、該醗酵培地から取り除く工程;および
iii)工程ii)の該醗酵培地からテイコプラニンを単離および回収する工程
を包含する、方法であって、
ここで、醗酵に使用される該アクチノプラネス テイコミセチクス(Actinoplanes teichomyceticus)BNG 2315細胞は、グルコース25g/L〜35g/L、酵母抽出物2.0g/L〜3.0g/L、ダイズ粉7.0g/L〜11.0g/L、ナタネ粗引き粉7.0g/L〜11.0g/L、NaCl 1.0g/L〜1.4g/L、CaCl2 0.08g/L〜0.12g/L、MgSO4・7H2O 0.4g/L〜0.6g/LおよびCaCO3 4g/L〜6g/Lを含む種培養培地において前培養される、方法。 - 韓国微生物保存センターに受託番号KCCM−10601で寄託されている、単離されたアクチノプラネス テイコミセチクス(Actinoplanes teichomyceticus)BNG 2315。
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