KR100421712B1 - 반코마이신 생성 아미코라톱시스 오리엔탈리스 변이주 및이를 이용한 반코마이신의 발효 제조방법 - Google Patents
반코마이신 생성 아미코라톱시스 오리엔탈리스 변이주 및이를 이용한 반코마이신의 발효 제조방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100421712B1 KR100421712B1 KR10-2001-0050184A KR20010050184A KR100421712B1 KR 100421712 B1 KR100421712 B1 KR 100421712B1 KR 20010050184 A KR20010050184 A KR 20010050184A KR 100421712 B1 KR100421712 B1 KR 100421712B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- vancomycin
- orientalis
- strain
- culture
- mutant
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 글라이코펩타이드계 항생제인 반코마이신을 과량 생산하는 아미코라톱시스 오리엔탈리스(Amycolatopsis orientalis) 미생물 변이주를 개발하고, 이 변이주를 이용한 고생산성의 반코마이신 제조 방법을 제공하는 것으로, 야생주에 인공돌연변이를 통해 변형시켜 반코마이신 내성 및 반코마이신 생산능이 향상된 아미코라톱시스 오리엔탈리스 균주를 개발하고, 무기염류, 비타민, 멜라닌 생합성 저해제 등의 미량원소를 함유하는 배지조성 및 배양조건을 최적화 함으로써 고수율로 반코마이신을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
Description
본 발명은 글라이코펩타이드계 항생제인 반코마이신(vancomycin)을 발효, 생산하는 아미코라톱시스 오리엔탈리스 (Amycolatopsis orientalis) (한국미생물보존협회 기탁번호 KCCM-10293호로 기탁) 변이주 및 그 변이주를 이용하여 덱스트린 등의 탄소원, 콩가루 또는 감자단백 등의 질소원 및 무기질 미량원소 등의 배지 조성 및 배양 조건 최적화를 수행함으로써 고수율, 고생산성으로 반코마이신을 발효 생성하는 방법에 관한 것이다.
반코마이신은 글라이코펩타이드계의 항생제로서 병원균 세포벽의 합성을 저해하는 항균 기작을 갖는다. 모든 그람양성 세균성 질환의 치료에 사용되며 페니실린이나 세파로스포린계의 항생제에 저항성이 있는 세균성 질환에 광범위하게 사용된다. 또한 수술 환자 및 고령 환자, 면역력이 약한 사람에게 치명적인 메치실린 내성 황색 포도상 구균(MRSA)을 치료하는 유일한 항생제로 사용되고 있는 고부가가치 항생제이다.
반코마이신을 제조하기 위한 공지의 방법들의 발효농도는 매우 낮다. 미국 특허 제3,067,099호에서 개시한 반코마이신의 발효 생성 기술은 균주의 역가가 0.2 mg/mL로 매우 낮고 생산비용이 높은 단점이 있었다.
이를 해결하기 위해 반코마이신 생성 수율이 높은 각종 변이주를 개발하였는 바, 대한민국 특허 공개공보 제93-13090호에서는 노카르디아 속 변이주 KFCC-10745호를 개발하여 발효 배양시켜 반코마이신을 발효 생성하였으며, 또한 대한민국 특허 공개공보 제93-13091호에서도 노카르디아 속 변이주 KFCC-10744호를 개발하여 발효 배양시켜 반코마이신을 발효 생성하였다. 한편, 대한민국 특허 공개공보 제93-13090호에서는 상기 변이주 KFCC-10745호를 질소원으로 글루텐 및 대두박을 1.0∼2.0% 함유한 배양액에서 배양하여 반코마이신을 고수율로 축적시켜 제조하는 방법을 개시하고 있다.
그러나, 상기 노카르디아 속 변이주(최근 아미코라톱시스 속으로 속명 변경)들은 균주의 역가가 6.1 mg/mL 정도로 현저히 개선되기는 하였으나, 불순물의 함량이 높고 독성이 강하여 그 상용화가 현실적으로 어려울 뿐만 아니라 여전히 생산비용이 높은 단점이 있었던 것이다.
따라서 본 발명의 목적은 반코마이신의 생산성이 크게 향상된 새로운 변이주를 분리 개발하고, 그 변이주를 이용하여 질소원, 탄소원, 무기질 미량원소 등을 지닌 신규한 배지 조성의 배지에서 최적 배양조건으로 발효 배양을 수행하고, 발효 배양조에서 반코마이신만을 효율적으로 분리 정제함으로써 고수율 고순도로 반코마이신을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
따라서, 본 발명자들은 아미코라톱시스 오리엔탈리스 변이주를 이용하여 질소원의 농도를 적절히 조절하고, 멜라닌 생합성 억제제와 같은 특수한 미량원소를 적정 농도로 첨가하면 반코마이신의 생산성이 증가됨을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 글라이코펩타이드계 항생제인 반코마이신을 과량 생산하는 아미코라톱시스 오리엔탈리스 미생물 변이주를 분리하고, 그 분리된 변이주를 최적 배지 조성에서 최적 배양 조건으로 발효 배양시키고 반코마이신을 분리 정제함으로써 고수율 고순도로 반코마이신을 발효 제조하고자 하는 것이다.
따라서 본 발명의 목적은 고순도 고수율로 반코마이신을 생성하는 아미코라톱시스 오리엔탈리스 변이주 BNG 607(기탁번호 KCCM-10293호)을 제공하는 것이다.
또한, 상기 변이주의 분리방법은 야생주 아미코라톱시스 오리엔탈리스 ATCC-19795를 NTG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)을 사용하여 인공돌연변이시켜 반코마이신에 대한 자기내성 향상 균주를 분리하고, 다시 이 변이주를 NTG (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)을 사용하여 인공돌연변이시켜 반코마이신에 대한 자기 내성 및 반코마이신 생성 능력 향상 균주를 분리시킨다.
한편, 성장배지에서 종배양된 아미코라톱시스 오리엔탈리스 BNG607(기탁번호 KCCM-10293호)을 12∼18% 덱스트린, 2.2∼3.8% 콩가루, 1.9∼2.9% 감자단백, 0.10∼0.14% 염화나트륨, 소량의 미네랄과 비타민, 멜라닌 생합성 제해제 농도를 조절시킨 배양 배지에서 배양 발효시키고 반코마이신을 분리 정제시킴을 특징으로 한다.
또한, 상기 배양 배지는 초기 질소원으로 콩가루 및 감자단백의 농도를 각각 2∼4(w/v)%로 조절하고, 1∼100 mg/L의 칼슘(CaCl2·2H2O)이나 1∼100 mg/L의 피리독신(pyridoxine)을 더욱 첨가시킨 것을 특징으로 하고, 1∼100 mg/L의 칼슘과 1∼100 mg/L의 피리독신(pyridoxine), 1∼100 mg/L의 멜라닌 생합성 억제제를 더욱 첨가한 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 배양 배지는 1∼100 mg/L의 아부틴(arbutin), 하이드로퀴논(hydroquinone), 트리사이클라졸(tricyclazole) 등의 멜라닌 생합성 저해제를 더욱 첨가한 것을 특징으로 한다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
상기 변이주는 야생주 아미코라톱시스 오리엔탈리스 ATCC-19795호를 모균주로 사용하여 NTG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)을 사용하여 인공돌연변이시켜 반코마이신에 의해 성장이 억제되는 바실러스 속 배양액을 분주하여 동 균주를 배양 후 억제환의 크기가 모균주보다 큰 변이주 가운데 콜로니의 크기, 색깔, 형태 변화에 따라 변이주를 분리시켜 반코마이신 내성 향상주를 분리하고, 다시 NTG (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)을 사용하여 인공돌연변이시켜 재차 반코마이신 내성 향상 및 반코마이신 생성능력 향상 균주를 분리함을 특징으로 한다.
또한 미생물에 의하여 반코마이신을 생산할 때 질소원 및 미량원소가 결핍 또는 과잉시에 배양시간이 경과함에 따라 반코마이신의 생산성이 낮아지는 단점이 있으나, 이러한 단점을 극복하기 위해 질소원, 미네랄 이온 또는 비타민의 농도를 조절하여 반코마이신의 생산성을 증가시킨 것이다.
본 발명의 변이주 분리 방법은 다음과 같다. 반코마이신 생산균주인 아미코라톱시스 오리엔탈리스 ATCC-19795 모균주로부터 돌연변이원으로 NTG (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)을 사용하는 인공 돌연변이법과 단일 콜로니 분리방법을 이용하여 반코마이신 생성 능력이 향상된 변이주를 획득하였다.
본 발명은 아미코라톱시스 오리엔탈리스 야생주에 인공돌연변이를 통해 반코마이신 생합성 과정을 변형시켜 반코마이신에 내성을 나타내며, 반코마이신 생성능력이 향상된 특성을 지니는 반코마이신 고생산성 균주를 분리한 후 배양 조건을 최적화하는 것으로 구성된다.
야생주 아미코라톱시스 오리엔탈리스 균주의 포자 현탁액에 돌연변이원인 NTG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)을 처리하였다. 돌연변이 처리한 포자 현탁액을 생리식염수로 적절히 희석하여 반코마이신이 0.1∼50 g/L 첨가된 선별배지에 도말하여 28∼32℃에서 4일간 배양하였다. 모균주보다 높은 반코마이신 농도에서 성장한 콜로니를 반코마이신이 첨가되지 않은 평판배지에 옮겨 28∼32℃에서 3일간 배양 후 반코마이신에 의해 성장이 억제되는 바실러스 써브틸리스(Bacillus subtilis,ATCC-6633) 배양액을 분주하여 28∼32℃에서 20∼28시간 배양하였다. 모균주보다 생장 억제환의 크기가 큰 변이주 가운데 콜로니 크기, 콜로니 색깔, 콜로니 형태 변화에 따라 변이주를 분리하여 삼각플라스크 및 발효조에서 확인 실험을 거쳐 모균주보다 반코마이신 생성 능력이 향상된 균주를 선별하였다. 반코마이신에 내성이 증가된 균주 가운데 반코마이신 생성능력이 향상된 변이주를 1차적으로 선별하기 위해 바실러스 써브틸리스(Bacillus subtilis,ATCC-6633)를 이용하였으며, 배지는 표 1의 선별배지를 이용하였다.
| 성분 | 농도 |
| 가수분해 전분(soluble starch) | 1.0 % |
| 박토 소이톤(bacto soytone) | 1.0 % |
| 한천 | 2 % |
이 변이주를 다시 돌연변이원인 250∼280 nm 자외선을 이용하여 상기 방법에 의해 변이주 선별을 반복함으로써 20 g/L 반코마이신이 첨가된 선별배지에서 성장하며 반코마이신 생성능력이 모균주보다 2배 이상 증가된 변이주 아미코라톱시스 오리엔탈리스 BNG607(기탁번호 KCCM-10293호)을 선별하였다.
본 발명의 변이주 아미코라톱시스 오리엔탈리스 BNG607은 2001년 7월 11일 서울특별시 서대문구 홍제1동 361-221호에 소재하는 한국미생물보존협회에 기탁번호 KCCM-10293호로 부다페스트 조약에 의거 국제기탁하였다.
본 발명에서 분리된 변이주의 배양방법과 분석방법은 다음과 같다.
본 발명 변이주의 배양 방법은 실시예의 기재와 같이 32∼36℃, 230∼270 rpm에서 4∼5일간 배양하였다. 반코마이신의 농도는 역상컬럼(Reversed phase column, YMC, Japan)이 장착된 HPLC의 Ultraviolet Detector(254 nm, Waters 486 tunable absorbance detector, USA)를 이용하여 측정하였다.
이때, 용매는 물, 아세토니트릴, 트리에틸아민, 테트라하이드로퓨란을 88.9 : 10 : 0.2 : 1 로 섞어 인산으로 pH 3.2가 되도록 조정하여 사용하였고, 유속은 1.0 mL/min이었다. 균체농도는 배양액 10 mL을 450 g에서 10분간 원심분리하여 PMV (Packed Mycelium Volume)을 측정하였다. 용존산소의 농도는 Ingold사(Swiss, polarographic type)의 용존산소 전극을 사용하여 측정하였다.
친주 아미코라톱시스 오리엔탈리스(ATCC-19775호)와 가장 높은 반코마이신 생산성을 나타내는 본 발명 변이주 아미코라톱시스 오리엔탈리스 BNG607, 아미코라톱시스 KFCC-10990호(대한민국 특허등록 제246,094호, 1999년 12월 3일)와의 반코마이신에 대한 내성 차이는 표 2와 같고 형태적, 생리적, 생화학적 특성은 아래 표 3과 같았다.
| 균주 | 반코마이신(g/L) | |||||||||
| 0 | 0.5 | 1.0 | 5.0 | 10.0 | 15.0 | 20.0 | 25.0 | 30.0 | 35.0 | |
| 친주(ATCC-19795) | +++ | +++ | ++ | + | - | - | - | - | - | - |
| 변이주(KFCC-10990) | +++ | +++ | ++ | ++ | + | - | - | - | - | - |
| 변이주(BNG607) | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | ++ | + | - | - | - |
| 특성 | 친주(ATCC-19795) | 변이주(KFCC-10990) | 본 발명 변이주(KCCM-10293) |
| 균사 형태 | 가지형 | 가지형 | 가지형 |
| 콜로니 색깔 | 노란색 | 흰색 | 흰색 |
| 포자생성 | + | + | + |
| Gram 염색 | + | + | + |
| 산소 요구성 | 호기성 | 호기성 | 호기성 |
| 영양 요구성 | - | - | - |
| 운동성 | - | - | - |
| 온도 | 25-37℃ | 28-38℃ | 23-35℃ |
| pH | 6.5-8.0 | 6.8-8.0 | 5.5-7.5 |
| Glucose 이용 | + | + | + |
| Fructose 이용 | + | + | + |
| Maltose 이용 | + | + | + |
| Raffinose 이용 | - | - | - |
표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 변이주는 최적 배양 온도가 모균주 및변이주(KFCC-10990)에 비해 2℃ 이상 낮았고 최적 pH 역시 0.5∼1.0 정도 낮은 특성을 나타내었다.
본 발명을 실시예에 따라 상술하면 다음과 같다.
(실시예 1) 삼각플라스크에서 친주 및 본 발명 변이주의 반코마이신 생산력 비교 실험
선별된 균주의 반코마이신 생산성을 다음과 같은 조건에서 비교하였다. 선별된 각각의 균주들을 50 mL의 생산배지(표 4)가 담긴 500 mL 삼각플라스크에 접종하여 250 rpm, 34℃에서 96∼120시간 동안 배양하였다. 세포를 제거한 배양액을 HPLC로 분석하여 반코마이신 생산능을 조사하였고, 반코마이신 생산능이 가장 높은 본 발명 변이주(기탁번호 KCCM-10293호)를 선별하였으며 그 결과는 아래 표 5와 같다.
| 성분 | 농도 |
| 덱스트린(dextrin) | 10 % |
| 콩가루(soybean flour) | 1.8 % |
| 감자단백(potato protein) | 1.8 % |
| 염화나트륨(NaCl) | 0.12 % |
| 균주 | 생장(PMV) | 반코마이신(g/L) |
| 친주(ATCC-19795) | 28 | 3.3 |
| 본 발명 변이주(KCCM-10293) | 40 | 6.1 |
(실시예 2) 반코마이신 발효 생성 시험(덱스트린 농도 변화에 따른 반코마이신 생산 실험)
7L 발효조에서 덱스트린 농도에 따른 본 발명 변이주 아미코라톱시스 오리엔탈리스의 반코마이신 생산 실험을 수행하였다.
종 배양 : 보관된 아미코라톱시스 오리엔탈리스의 단일 군락을 전 배양 배지 50 mL가 들어있는 500 mL 플라스크에 접종하여 진탕배양기에서 250 rpm, 30℃로 24시간 동안 배양하였다. 0.1 mL의 배양액을 100 mL의 종배지가 들어있는 500 mL의 플라스크에 접종하여 250 rpm, 30℃로 60시간 동안 배양하였다. 200 mL의 배양액을 4000 mL의 생산배지가 들어있는 7L의 발효조에 접종하여 900 rpm, 34℃, pH 7.5로 120시간 동안 배양하였다.
| 성분 | 농도 |
| 포도당(Glucose) | 1.7 % |
| 맥아추출물(Malt extract) | 0.3 % |
| 효모추출물(Yeast extract) | 0.3 % |
| 펩톤(Peptone) | 1.1 % |
| 성분 | 농도 |
| 덱스트린(Dextrin) | 5.0 % |
| 콩가루(Soybean flour) | 0.5 % |
| 감자단백(potato protein) | 0.5 % |
| 칼슘카보네이트(CaCO3) | 0.3 % |
본 배양 : 7L 발효조(한국발효기(주))에서 본 배양을 수행하였다. 배양에서 5∼20%의 덱스트린이 함유된 생산 배지의 부피가 4L이었고 발효과정 중에 교반속도는 용존산소가 20% 이상 유지되도록 700∼900 rpm으로 조절하였으며, 통기량은 1vvm으로 조절하였다. pH는 발효 전 과정 동안 7.5로 조절하였고 배양온도는 34℃이었다. 초기 덱스트린의 농도를 달리하여 실험한 결과 표 8과 같았고 15% Dextrin 농도에서 최적의 생산성이 나타났다.
| 덱스트린(%) | 반코마이신(g/L) | 생산성(g/L·h) |
| 5 | 6.1 | 0.050 |
| 10 | 7.2 | 0.060 |
| 15 | 7.5 | 0.062 |
| 20 | 7.0 | 0.058 |
(실시예 3) pH 변화에 따른 반코마이신 생성 시험
7L 발효조에서 배양온도를 34℃로 하여 여러 pH별 실험을 수행하였다. 배양방법과 발효배지는 실시예 2와 같으며, 5.5∼8.0 사이로 pH를 달리하여 배양한 결과 표 9와 같았다.
| pH | 반코마이신(g/L) | 생산성(g/L·h) |
| 5.5 | 6.0 | 0.050 |
| 6.5 | 7.2 | 0.060 |
| 7.5 | 8.0 | 0.066 |
| 8.0 | 4.0 | 0.033 |
(실시예 4) 온도 변화에 따른 반코마이신 생성 시험
7L 발효조에서 pH를 7.5로 하여 여러 배양온도별 실험을 수행하였다. 배양방법과 발효배지는 실시예 2와 같으며, 23∼37℃ 사이로 온도를 달리하여 배양한 결과 표 10과 같았다.
| 온도 | 반코마이신(g/L) | 생산성(g/L·h) |
| 23 | 5.5 | 0.045 |
| 28 | 8.0 | 0.066 |
| 32 | 8.5 | 0.070 |
| 37 | 4.4 | 0.036 |
(실시예 5) 질소원(콩가루) 농도 변화에 따른 반코마이신 생성 시험
7L 발효조에서 pH 7.5, 온도 34℃로 하여 여러 질소원(콩가루) 농도별 실험을 수행하였다. 배양방법과 발효배지는 실시예 2와 같으며, 초기 질소원(콩가루)의 농도를 1.0∼3.5% 사이로 달리하여 배양한 결과 표 11과 같았고, 3% 콩가루 농도에서 최적의 생산성이 나타났다.
| 질소원(콩가루)(%) | 반코마이신(g/L) | 균체량(PMV)(%) | 생산성(g/L·h) |
| 1.0 | 7.5 | 38 | 0.062 |
| 1.8 | 8.5 | 42 | 0.073 |
| 2.4 | 9.0 | 46 | 0.075 |
| 3.0 | 9.2 | 45 | 0.076 |
| 3.5 | 8.9 | 41 | 0.074 |
(실시예 5) 질소원(감자단백) 농도변화에 따른 반코마이신 생성 시험
7L 발효조에서 pH 7.5, 온도 34℃로 하여 여러 질소원(감자단백) 농도별 실험을 수행하였다. 배양방법과 발효배지는 실시예 2와 같으며, 초기 질소원(감자단백)의 농도를 1.0∼3.5% 사이로 달리하여 배양한 결과 표 12와 같았고, 2.4% 감자단백 농도에서 최적의 생산성이 나타났다.
| 질소원(감자단백)(%) | 반코마이신(g/L) | 균체량(PMV)(%) | 생산성(g/L·h) |
| 1.0 | 8.0 | 43 | 0.066 |
| 1.8 | 9.0 | 46 | 0.075 |
| 2.4 | 9.5 | 46 | 0.079 |
| 3.0 | 9.2 | 42 | 0.076 |
| 3.5 | 7.5 | 38 | 0.062 |
(실시예 6) CaCl2·2H2O의 농도 변화에 따른 반코마이신 생성 시험
7L 발효조에서 pH 7.5, 온도 34℃로 하여 여러 CaCl2·2H2O 농도별 실험을 수행하였다. 배양방법과 발효배지는 실시예 2와 같으며, 초기 CaCl2·2H2O의 농도를 0∼100 mg/L 사이로 달리하여 배양한 결과 표 13과 같았고, 40 mg/L 농도에서 최적의 생산성이 나타났다.
| CaCl2·2H2O(mg/L) | 반코마이신(g/L) | 균체량(PMV)(%) | 생산성(g/L·h) |
| 0 | 9.5 | 46 | 0.079 |
| 10 | 9.8 | 48 | 0.081 |
| 20 | 10.3 | 50 | 0.085 |
| 40 | 10.9 | 55 | 0.090 |
| 80 | 8.9 | 42 | 0.074 |
| 100 | 8.5 | 42 | 0.070 |
(실시예 7) 피리독신 농도 변화에 따른 반코마이신 생성 시험
7L 발효조에서 pH 7.5, 온도 34℃로 하여 여러 피리독신 농도별 실험을 수행하였다. 배양방법과 발효배지는 실시예 2와 같으며, 초기 피리독신의 농도를 0∼100 mg/L 사이로 달리하여 배양한 결과 표 14와 같았고, 50 mg/L 농도에서 최적의 생산성이 나타났다.
| 피리독신(mg/L) | 반코마이신(g/L) | 균체량(PMV)(%) | 생산성(g/L·h) |
| 0 | 9.5 | 46 | 0.079 |
| 10 | 10.8 | 46 | 0.091 |
| 20 | 11.2 | 50 | 0.093 |
| 40 | 11.5 | 52 | 0.095 |
| 50 | 12.1 | 56 | 0.100 |
| 80 | 10.6 | 50 | 0.088 |
| 100 | 10.6 | 51 | 0.088 |
(실시예 8) 칼슘(CaCl2·2H2O) 및 피리독신(Pyridoxine) 첨가에 따른 반코마이신 생성 시험
7L 발효조에서 pH 7.5, 온도 34℃로 하여 최적 농도의 칼슘(CaCl2·2H2O)과 피리독신을 함께 첨가하여 실험을 수행하였다. 배양방법과 발효배지는 실시예 2와 같으며, 초기 칼슘(CaCl2·2H2O)의 농도는 40 mg/L, 초기 피리독신의 농도는 50 mg/L이었다. 배양 결과 108시간 후에 12.5 g/L의 반코마이신을 생산하여 생산성 0.118 g/L-h를 나타내었다.
(실시예 9) 멜라닌 생합성 저해제의 첨가에 따른 반코마이신 생성 시험
7L 발효조에서 pH 7.5, 온도 34℃로 하여 여러 멜라닌 생합성 제해제 첨가 실험을 수행하였다. 배양방법과 발효배지는 실시예 2와 같으며, 멜라닌(melanin) 생합성 저해제는 아부틴(arbutin), 하이드로퀴논(hydroquinone), 트리사이클라졸(tricyclazole)을 각각 50 mg/L 농도로 첨가하였다. 각각의 멜라닌 생합성 저해제를 첨가하여 배양한 결과 표 15와 같았고, 아부틴, 하이드로퀴논, 트리사이클라졸을 50 mg/L 농도로 첨가한 경우 멜라닌 생합성 저해제를 첨가하지 않은 경우보다 각각 37.6%, 44.8%, 28.0% 반코마이신 생산이 증가하였다.
| 멜라닌 생합성 저해제(50 mg/L) | 반코마이신(g/L) | 균체량(PMV)(%) | 생산성(g/L·h) |
| 0 | 8.0 | 43 | 0.066 |
| 아부틴 | 9.0 | 46 | 0.075 |
| 하이드로퀴논 | 9.5 | 46 | 0.079 |
| 트리사이클라졸 | 9.2 | 42 | 0.076 |
본 발명의 효과는 글라이코펩타이드계 항생제인 반코마이신을 과량 생산하는 아미코라톱시스 오리엔탈리스 미생물 변이주를 분리하고, 그 분리된 변이주를 멜라닌 생합성 저해제를 함유하는 최적 배지 조성에서 최적 배양 조건으로 발효 배양시키고 반코마이신을 분리 정제함으로써 고수율 고순도로 반코마이신을 발효 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
Claims (6)
- 고순도 고수율로 반코마이신을 생성하는 아미코라톱시스 오리엔탈리스 변이주 BNG 607(기탁번호 KCCM-10293호)
- 야생주 아미코라톱시스 오리엔탈리스 ATCC-19795를 NTG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)을 사용하여 인공돌연변이시켜 반코마이신에 대한 자기내성 향상 균주를 분리하고, 다시 이 변이주를 NTG를 사용하여 인공돌연변이시켜 반코마이신에 대한 자기 내성 및 반코마이신 생성 능력 향상 균주를 분리하는 것을 특징으로 하는 아미코라톱시스 오리엔탈리스 BNG607(기탁번호 KCCM-10293호)의 균주 분리 방법
- 성장배지에서 종배양된 아미코라톱시스 오리엔탈리스 BNG607(기탁번호 KCCM-10293호)를 12∼18% 덱스트린, 2.2∼3.8% 콩가루, 1.9∼2.9% 감자단백, 0.10∼0.14% 염화나트륨, 소량의 미네랄과 비타민 농도를 조절시킨 배양 배지에서 배양 발효시키고 반코마이신을 분리 정제시킴을 특징으로 하는 고수율 반코마이신 제조방법
- 제 3항에 있어서, 상기 배양 배지는 초기 질소원으로 콩가루 및 감자단백의 농도를 각각 2∼4(w/v)%로 조절하고, 1∼100 mg/L의 칼슘(CaCl2·2H2O)이나 1∼100 mg/L의 피리독신(pyridoxine)을 더욱 첨가시킨 것을 특징으로 하는 고수율 반코마이신 제조방법
- 성장배지에서 종배양된 아미코라톱시스 오리엔탈리스 BNG607(기탁번호 KCCM-10293호)를 12∼18% 덱스트린, 2.2∼3.8% 콩가루, 1.9∼2.9% 감자단백, 0.10∼0.14% 염화나트륨, 1∼100 mg/L의 칼슘과 1∼100 mg/L의 피리독신(pyridoxine), 소량의 멜라닌 생합성 저해제를 첨가시킨 배양 배지에서 배양 발효시키고 반코마이신을 분리 정제시킴을 특징으로 하는 고수율 반코마이신 제조방법
- 제 5항에 있어서, 상기 배양 배지는 1∼100 mg/L의 아부틴(arbutin), 하이드로퀴논(hydroquinone), 트리사이클라졸(tricyclazole) 등의 멜라닌 생합성 저해제를 더욱 첨가한 것을 특징으로 하는 고수율 반코마이신 제조방법
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2001-0050184A KR100421712B1 (ko) | 2001-08-21 | 2001-08-21 | 반코마이신 생성 아미코라톱시스 오리엔탈리스 변이주 및이를 이용한 반코마이신의 발효 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2001-0050184A KR100421712B1 (ko) | 2001-08-21 | 2001-08-21 | 반코마이신 생성 아미코라톱시스 오리엔탈리스 변이주 및이를 이용한 반코마이신의 발효 제조방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20010100063A KR20010100063A (ko) | 2001-11-14 |
| KR100421712B1 true KR100421712B1 (ko) | 2004-03-12 |
Family
ID=45774412
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR10-2001-0050184A KR100421712B1 (ko) | 2001-08-21 | 2001-08-21 | 반코마이신 생성 아미코라톱시스 오리엔탈리스 변이주 및이를 이용한 반코마이신의 발효 제조방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100421712B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190018081A (ko) * | 2017-08-10 | 2019-02-21 | 한국생산기술연구원 | 반코마이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 반코마이신 제조 방법 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105168260B (zh) * | 2015-08-27 | 2018-08-17 | 浙江工业大学 | 拟无枝酸菌wp1在制备革兰氏菌活性抑制剂中的应用 |
| CN105505833B (zh) * | 2016-01-23 | 2018-12-25 | 雅赛利(台州)制药有限公司 | 一种万古霉素培养基及制备万古霉素的方法 |
-
2001
- 2001-08-21 KR KR10-2001-0050184A patent/KR100421712B1/ko not_active IP Right Cessation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190018081A (ko) * | 2017-08-10 | 2019-02-21 | 한국생산기술연구원 | 반코마이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 반코마이신 제조 방법 |
| KR101982236B1 (ko) | 2017-08-10 | 2019-05-27 | 한국생산기술연구원 | 반코마이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 반코마이신 제조 방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20010100063A (ko) | 2001-11-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1170358B1 (en) | L-arginine producing Escherichia coli and method of producing L-arginine | |
| KR20080075979A (ko) | 아미코라톱시스 오리엔탈리스 변이주 및 이를 이용한반코마이신 염산염의 제조방법 | |
| KR100421712B1 (ko) | 반코마이신 생성 아미코라톱시스 오리엔탈리스 변이주 및이를 이용한 반코마이신의 발효 제조방법 | |
| KR100422305B1 (ko) | 리보플라빈을 생산하는 미생물 및 이를 이용한리보플라빈의 생산방법 | |
| KR100422307B1 (ko) | 리보플라빈을 생산하는 미생물 및 이를 이용한리보플라빈의 생산방법 | |
| KR20200091580A (ko) | 반코마이신의 제조방법 | |
| KR100344016B1 (ko) | 5'-크산틸산을 생산하는 미생물 | |
| KR100515186B1 (ko) | 테이코플라닌 고생산 변이주 에티노플레네스 테이코마이세티쿠스를 이용한 테이코플라닌의 발효 제조방법 | |
| KR100724699B1 (ko) | 엘-발린의 공업적 제조에 이용되는 신규한 코리네박테리움글루타미컴 및 동 균주를 이용한 엘-발린의 제조방법 | |
| KR100949312B1 (ko) | 안스라닐산염에 대한 내성을 갖는 대장균 균주를 이용한ｌ-트립토판 제조 방법 | |
| KR100373510B1 (ko) | 테이코플라닌을 생산하는 미생물 | |
| EP1671640A1 (en) | Mutant strain of Actinoplanes teichomyceticus for the production of teicoplanin | |
| WO2000001840A1 (en) | Fermentation process to produce clavulanic acid at a low concentration of free amino acids | |
| KR20010089981A (ko) | 5'-크산틸산을 생산하는 미생물 | |
| KR910004371B1 (ko) | 미생물에 의한 세팔로스포린c의 제조방법 | |
| KR100511048B1 (ko) | 바실러스 리케니포르미스 ｇｎ-ｍ１０ 변이주 및 이를 이용한 프로테아제의 생산방법 | |
| KR930008970B1 (ko) | 반코마이신을 생산하는 미생물 | |
| KR20040076836A (ko) | 테이코플라닌 고생산 변이주 에티노플레네스테이코마이세티쿠스 | |
| KR930008969B1 (ko) | 반코마이신을 생산하는 미생물 | |
| US7432080B2 (en) | Process for the production of teicoplanin | |
| KR960004036B1 (ko) | 세팔로스포린 c를 생산하는 미생물 및 이를 이용한 세팔로스포린 c의 제조방법 | |
| KR100364105B1 (ko) | 배지 농도 및 배양 조건 최적화를 통한 에리스리톨의제조방법 | |
| KR100246094B1 (ko) | 불순물의 함량이 감소된 고역가 반코마이신을 생산하는 미생물 | |
| KR20020074812A (ko) | 테이코플라닌을 생산하는 미생물 | |
| KR20050055175A (ko) | 리보플라빈을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 리보플라빈의 생산방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee | ||
| R401 | Registration of restoration | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20130220 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20140225 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20160225 Year of fee payment: 13 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |