KR100246094B1 - 불순물의 함량이 감소된 고역가 반코마이신을 생산하는 미생물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아미콜라톱시스 오리엔탈리스(Amycolatopsis orientalis, 과거에는 Nocardia orientalis로 명명) 종에 속하는 변이주로서 불순물의 함량이 크게 감소되고, 반코마이신의 역가가 현저히 향상된 미생물에 관한 것이다.

본 발명에서는 아미콜라톱시스 오리엔탈리스 ATCC 19795를 인공 돌연변이법을 사용하여 균주를 개량하여, 독성이 강하고 부작용을 일으킬 수 있는 불순물의 함량을 줄이고 반코마이신의 농도는 향상시킴으로써 고순도의 반코마이신을 최종 제품으로 생산함을 특징으로 한다.

Description

[발명의 명칭]

불순물의 함량이 감소된 고역가 반코마이신을 생산하는 미생물

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 불순물의 함량이 크게 감소하고 반코마이신의 역가가 현저히 향상된 신규 미생물에 관한 것이다. 본 발명의 특징은 자체 생성물인 반코마이신에 내성을 가지며 주탄소원으로 산화전분, 포도당, 주 질소원으로 콩가루, 감자단백을 원료로 한 영양배지에서 호기적으로 배양하여 배양액중에 반코마이신의 생성을 고농도로 축적시키고 인체에 독성이 강하고 부작용을 일으킬 수 있는 불순물(‘X물질’이라 명명, 정제후 남아있는 반코마이신을 제외한 최대 불순물)을 적게 함유하는 미생물에 관한 것이다.

반코마이신은 아미콜라톱시스 오리엔탈리스(Amycolatopsis orientalis, 과거에는 Nocardia orientalis로 명명) 종에 속하는 균주에 의해 생산되는 글리코펩타이드계의 항생제로서 병원균 세포벽의 합성을 저해하는 항균 기작을 가지므로 모든 그람 양성 세균성 질환의 치료에 사용되며 페니실린이나 세파스포린계의 항생제에 저항성이 있는 세균성 질환에 광범위하게 사용된다. 또한 수술 환자 및 고령환자, 면역력이 약한 사람에게 치명적인 MRSA(메치실린 내성 황색 포도상구균)를 치료하는 유일한 항생제로 사용되고 있는 고부가가치 항생제이다.

반코마이신을 제조하기 위한 공지의 방법들의 발효 농도는 꽤 낮다. 미합중국 특허 명세서 제3,067,009호에서 밝힌 균주의 역가는 0.2mg/㎖로 낮아 생산 비용이 높은 단점이 있다. 또한 기존의 제일제당 반코마이신 생산 균주는 발효 배양액중 X물질의 함량이 높아 최종제품에 기준치 이상의 X물질이 종종 포함되어 있었다. 그러므로 이러한 문제점을 고려하여 본 발명의 목적은 반코마이신의 생산력이 크게 향상되고, 독성 물질인 X물질의 생성이 저하된 새로운 균주를 발명하여 산업적으로 대량의 고순도 반코마이신을 제조하는데 있다.

본 발명의 변이주 분리 방법은 제일제당 대소공장에서 사용하는 반코마이신 생산균주인 아미콜라톱시스 오리엔탈리스 ATCC 19795를 모주로 사용하여 돌연변이원으로 자외선을 사용하는 인공 돌연변이법과 단일 콜로니 분리방법(Monocolony isolation)을 이용하여 불순물의 함량이 낮아지고 반코마이신 생성 능력이 향상된 변이주를 획득하였다. 변이주 선별 방법은 자외선 처리후 살아남은 균주를 반코마이신에 의해 성장이 억제되는 바실러스 써브틸리스(Bacillus subtilis ATCC 6677)의 배양액을 분주하여 30℃에서 24시간 배양후 나타나는 억제환의 크기가 모주보다 큰 변이주 가운데 콜로니 크기, 콜로니 색깔, 콜로니 형태 변화에 따라 변이주를 분리하여 삼각플라스크 및 발효조를 통한 수차례의 확인 실험을 거쳐 모주보다 반코마이신 역가는 2g/ℓ 이상 증가하였으며 불순물의 함량은 35% 이상 감소한 변이주를 선별하여 CJ10-2(KFCC 10990)라 명명하였다. 이 미생물은 1997년 10월 6일에 기탁번호 KFCC 10990호로 사단법인 한국 종균협회에 기탁하였다. 이 변이주는 20계대 이상 배양 결과, 반코마이신의 역가가 안정되고 불순물의 함량이 적은 우수한 변이주로 판명되었다.

본 발명자들이 선별한 변이주의 형태적 특징은 균사 형태가 가지형이며, 포자의 색깔은 야생주가 노란색인데 반해 변이주는 흰색이며, 그람(Gram) 양성을 보인다. 본 발명의 모주(ATCC 19795)와 변이주(KFCC 10990)의 형태적 특징을 포함하는 미생물학적 특징은 하기 표 1과 같다.

[표 1]

생리학적 특성으로 최적의 pH 가 6.5∼8.0, 온도는 25∼35℃에서 성장하는 호기성 균주이다. 본 발명의 모주(ATCC 19795)와 변이주(KFCC 10990)의 생리학적 특성은 하기 표 2와 같다.

[표 2]

본 발명자들이 선별한 변이주의 배양적 특징은 특별한 색소는 생성하지 않고 갈색의 배양액 색깔을 나타내며, 충분한 통기량을 공급하여 용존 산소 부족(Dissolved oxygen limitation)이 일어나지 않도록 해야하며, pH 조절시 초기에는 pH 7.6 부근에서 조절하다가 24시간 이후에는 pH 7.0 근처에서 pH 를 조절하여야 한다.

본 발명을 통하여 얻어지는 효과는 산업적 발효의 측면에서 기존의 제일제당 대소공장의 반코마이신 생산성이 30%이상 향상되고, 유럽약전의 순도 기준이 높아짐에 따른 반코마이신의 순도가 향상되고(95% 이상) 불순물 함량이 적은(최대 불순물 1.0% 이하) 반코마이신을 안정적으로 생산할 수 있게 되었다.

균체의 성장은 발효액 10㎖을 취하여 450g에서 10분간 원심분리후 PMV(Packed mycelium volume)를 측정하였다. 전체 당은 Bertland 법에 의하여 환원당을 정량하였다. 반코마이신 정성 분석은 Cosmosil C₁₈column(4.6×250mm)과 Shimadzu(Model LC-10AD) HPLC 기기를 사용하는 HPLC 분석법을 이용하였다(USP X X II).

본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세한 과정을 서술하면 다음과 같다.

(주 1) 평판배지(Agar plate)

가용성 전분 1.0%, 소이톤(soytone) 1.0%, 아가(Agar) 2.0%, pH 7.0

(주 2) 사면배지(Agar slant)

포도당 1.0%, 효모즙 0.3%, 맥아즙 0.3%, 펩톤 0.5%, pH 7.2

(주 3) 전배양 배지

포도당 1.7%, 효모즙 0.3%, 맥아즙 0.3%, 펩톤 1.1%, pH 7.8

(주 4) 종배양 배지

전분 5.0%, 감자단백 0.5%, 콩가루 0.5%, 탄산칼슘(CaCO₃) 0.3%, pH 7.6

(주 5) 본배양 배지

가수분해 전분 12.5%, 포도당 0.9%, 감자단백 1.8%, 콩가루 1.8%, 염화나트륨 0.12%, pH 7.6

[실시예 1]

[돌연변이에 의한 저함량의 불순물 및 고역가의 반코마이신을 생성하는 변이주 분리방법]

변이주의 분리는 모주인 아나콜라톱시스 오리엔탈리스 ATCC 19795를 (주2)배지에 배양후 멸균된 식염수 10㎖를 가하고 균사체를 긁어낸 유리솜을 넣은 주사기에 통과시켜 균사체를 여과 분리하여 포자 현탁액을 조제한다. 이 포자 현탁액에 빛을 완전히 차단시킨 상태에서 25W UV lamp를 사용하여 자외선을 일정 거리에 두고 90초간 조사하여 사멸율이 97.5%가 되었다. 자외선을 조사한 현탁액을 빛을 차단시킨채 4℃에서 2시간 방치한 후 멸균된 식염수를 이용하여 희석시켜 (주1)배지에 도말한 후 30℃에서 4일 배양후 반코마이신에 의해 성장이 억제되는 바실러스 써블틸리스 ATCC 6677의 배양액을 분주하여 30℃에서 하루 더 배양하였다. 이때 나타나는 억제환의 크기가 모주보다 큰 변이주 가운데 콜로니 크기가 아주 작고 하얀 빛깔을 띠는 콜로니를 선택하여 (주2)배지에서 5∼7일간 배양하였다.

이와 같이 분리된 아나콜라톱시스 오리엔탈리스 ATCC 19795 변이주들을 삼각플라스크를 이용하여 (주3)배지에서 1일 배양후 (주4)배지에 접종하여 약 24-27시간 배양시킨 배양액을 (주5)배지에 4% 접종한 후 72시간 동안 배양하여 HPLC 정량분석을 통하여 반코마이신 역가가 향상되고 불순물 함량이 적은 변이주를 얻은후, 이 변이주를 수 차례의 단일콜로니 분리방법(Monocolony isolation)을 통하여 균의 성질이 안정된 변이주를 얻게 되어 아나콜라톱시스 오리엔탈리스 CJ10-2라 명명하였으며, 이 균주를 1997년 10월 6일자로, 사단법인 한국 종균협회에 기탁번호 KFCC 10990호로 기탁하였다.

[표 3]

[실시예 2]

[삼각플라스크에 의한 모주 및 본 발명 변이주의 반코마이신과 불순물 X의 생산력 비교]

·사용균주:모주 ATCC 19795, 변이주 CJ10-2

·전배양 배지:(주3)배지

·종배양 배지:(주4)배지

·본배양 배지:(주5)배지

·배양 방법:상기 조성의 전배양 배지 20㎖을 250㎖ 진탕용 삼각 플라스크에 분주하고 121℃에서 15분간 가압 살균하였다. 이때 포도당은 별도로 살균후 5㎖씩 첨가하였다. (주1)배지에서 7일간 자란 각 균주를 식균하여 30℃에서 회전 교반 배양기를 RPM 200조건으로 24시간 배양하였다. 상기 조성의 종배양 배지 25㎖를 500㎖ 삼각플라스크에 넣어 121℃에서 30분간 가압 살균후 배양이 완료된 전배양액을 4% 접종하여 30℃에서 27시간 배양하였다. 본배양 배지 20㎖을 500㎖ 삼각플라스크에 넣어 121℃에서 30분간 가압 살균한다. 이때 가수분해 산화전분 및 포도당은 별도로 살균후 5㎖씩 첨가하였으며, 멸균된 1N 수산화나트륨을 이용하여 pH 를 7.6으로 조절한 후, 종배양 배양액을 4% 접종하여 각 균주당 5개의 본배양 배지에 접종하여 34℃에서 회전 교반 배양기를 RPM 220조건으로 72시간 배양하였다. 그 결과는 표 4와 같으며, 이때 USP 반코마이신을 표준 물질로 사용하여 HPLC 분석방법으로 정량하였다.

[표 4]

[실시예 3]

[발효조에 의한 모주 및 본 발명 변이주의 반코마이신과 불순물 X의 생산성 비교]

·사용균주:모주 ATCC 19795, 변이주 CJ10-2

·전배양 배지:(주3)배지

·종배양 배지:(주4)배지

·본배양 배지:(주5)배지

·배양 방법:상기 조성의 전배양 배지 40㎖을 500㎖ 진탕용 삼각 플라스크에 분주하고 121℃에서 15분간 가압 살균한다. 이때 포도당은 별도로 살균후 10㎖씩 첨가하였다. (주1)배지에서 7일간 자란 각 균주를 식균하여 30℃에서 회전 교반 배양기를 RPM 200조건으로 27시간 배양하였다. 2.5ℓ 발효조에 종배양 배지 1ℓ를 채운후 121℃에서 30분 동안 가압 살균하였다. 식균전의 배지의 pH 를 7.6으로 조절한 후 배양이 완료된 전배양 4%를 식균하여 종배양을 실시하였다. 배양 온도 30℃, RPM 400, 통기량 0.5VVM에서 PMV가 15%로 될 때까지 배양하였다. 본배양 배지 2.1ℓ를 5ℓ 발효조에 넣어 121℃에서 30분간 가압 살균하였다. 살균후, 가수분해 전분과 포도당을 각각 0.6ℓ씩 첨가하였다. 식균전의 배지의 pH 를 멸균된 1N 수산화나트륨을 사용하여 pH 를 7.6으로 조절한 후 배양이 완료된 종배양액을 준비된 본배양 조에 10% 식균하였다. 배양 온도 34℃, 통기량 1.0VVM의 조건에서 용존 산소가 최초의 30%이상 유지되도록 RPM을 400에서 700까지 조절하며, 배양초기에는 pH 7.6 근처에서 배양하다가 24시간 이후에는 10% H₂SO₄를 이용하여 pH 7.0으로 조절하면서 72시간 배양하였다. 그 결과는 표 5와 같으며, 이때 USP 반코마이신을 표준물질로 사용하여 HPLC 분석방법으로 정량하였다.

[표 5]

[실시예 4]

[본 발명 변이주의 발효 조건의 최적화]

아나콜라톱시스 오리엔탈리스 변이주 CJ10-2의 균주 특성을 최대한 발휘하기 위하여 5ℓ 발효조에서 다양한 발효 조건으로 실험하여 최적의 조건을 찾는 작업을 수행하였다. 접종량의 변화, 배양 온도의 변화, 다양한 pH 조절, 질소원 대체 실험, 전구체 첨가 실험을 수행하였다. 특히 반코마이신 변이주의 pH 조절 및 접종량(Seed volume) 변화 실험을 통해 발효 역가의 향상을 이룰 수 있는 최적 조건을 찾을 수 있었다. 발효조의 pH 조절시 불순물을 적게 나오게 하기 위해서는 pH 7.6이하에서 pH 의 조절이 되어야 하고, 24시간 이후 pH 7.0근처에서 pH 를 조절할 경우 반코마이신의 발효 역가는 높아지고 불순물의 함량은 적어지는 결과를 얻었다. RPM은 용존 산소량이 30%이상 유지되도록 초기 400에서 700까지 단계적으로 상승시켰다.

[표 6]

[실시예 5]

[본 발명 변이주의 대량 생산에의 적용]

·사용균주:변이주 CJ10-2

·전배양 배지:(주3)배지

·종배양 배지:(주4)배지

·본배양 배지:(주5)배지

·배양 방법:상기 조성의 전배양 배지 900㎖을 2ℓ 진탕용 삼각플라스크 3개에 각각 300㎖씩 분주하고 121℃에서 15분간 가압 살균하였다. -70℃에 보관중인 균주를 상온에서 녹여 0.1% 식균한 후 30℃에서 회전교반기를 RPM200 조건으로 27시간 배양하였다. 1000ℓ 발효조에 종배양 배지 800ℓ를 채운후 121℃에서 30분 동안 가압 살균하였다. 식균전의 배지의 pH 를 7.6으로 조절한 후 배양이 완료된 전배양액 0.1%를 식균하여 종배양을 실시하였다. 배양온도 30℃, RPM 80, 통기량 0.5VVM에서 PMV가 15%로 될 때까지 배양하였다. 10kℓ 발효조에 본배양 배지 7kℓ를 채운후 121℃에서 30분 동안 가압 살균하였다. 이때 가수분해전분과 포도당은 별도로 살균후 0.65kℓ를 첨가하였다.

식균전의 배지의 pH 를 7.6으로 조절한 후, 배양이 완료된 종배양을 준비된 생산 배양조에 10% 식균하였다. 배양 온도 34℃, 내압 0.5kg/cm², 통기량 1.0VVM의 조건에서 DO값이 30% 이상 유지되도록 RPM을 80에서 120으로 조절하며, 배양초기에는 pH 7.6근처에서 배양하다가 24시간 이후에는 10% H₂SO₄를 이용하여 pH 7.0으로 조절하면서 72시간 동안 배양하였다. 그 결과는 표 7와 같으며, 이때 USP 반코마이신을 표준물질로 사용하여 HPLC 분석방법으로 정량하였다.

[표 7]

Claims (4)

1. 고순도의 반코마이신을 고농도로 생산하는 아미콜라톱시스 오리엔탈리스 (Amycolatopsis orientali) 변이주 CJ10-2(기탁번호:KFCC 10990).
2. 온도 30-35℃에서, 0 내지 24시간 동안에는 pH 7.4 내지 pH 7.8에서, 24시간 이후에는 pH 7.0 내지 pH 7.2에서 제1항에 따른 변이주 CJ10-2(기탁번호:KFCC 10990)를 배양하는 방법.
3. 제2항에 있어서, 온도 34℃인 방법.
4. 제2항에 있어서, 0 내지 24시간 동안에는 pH 7.6, 24시간 이후에는 pH 7.0인 방법.