KR0122428B1 - 디(d)형 젖산 생산 미생물 및 이를 이용한 디(d)형 젖산의 생산방법 - Google Patents

디(d)형 젖산 생산 미생물 및 이를 이용한 디(d)형 젖산의 생산방법

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KR0122428B1 KR1019940004034A KR19940004034A KR0122428B1 KR 0122428 B1 KR0122428 B1 KR 0122428B1 KR 1019940004034 A KR1019940004034 A KR 1019940004034A KR 19940004034 A KR19940004034 A KR 19940004034A KR 0122428 B1 KR0122428 B1 KR 0122428B1
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정홍채
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김은영
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본 발명은 유전공학적인 방법으로 발효경로를 변형시켜 D형 젖산만을 대량으로 생산하도록 변형된 대장균 및 이를 혐기적 조건 또는 산소 제한 조건에서 배양하여 D형 젖산을 대량 생산하는 발효 방법에 관한 것이다.

Description

디(D)형 젖산 생산 미생물 및 이를 이용한 디(D)형 젖산의 생산방법
제1도는 본 발명의 D형 젖산 생산 대장균을 혐기적 조건에서 배양하여 D형 젖산을 고농도로 생산한 결과를 나타낸 그래프이고,
제2도는 본 발명의 D형 젖산 생산 대장균을 산소 제한 조건에서 배양하여 D형 젖산을 고농도로 생산한 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 D형 젖산만을 대량으로 생산하는 대장균(Escherichia coli) 및 이를 배양하여 D형 젖산을 고농도로 생산하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 유전공학적인 방법으로 발효경로를 변형시켜 D형 젖산만을 대량으로 생산하도록 변형된 대장균 및 이를 혐기적 조건 또는 산소 제한 조건에서 배양하여 D형 젖산을 대량 생산하는 발효방법에 관한 것이다.
젖산은 식품 분야, 의약분야, 화장품 분야 등 산업 분야에서 다양하게 이용되어 그 요구량이 크게 증가하고 있다. 식품 분야에서는 청량음료 제조, 제과, 제빵 및 청주 제조용으로 사용되고, 의약 분야에서는 칼슘 및 철분의 강화제 및 장내 소독용 등으로 사용되며, 산업적으로는 젖산 유도체가 농약 합성의 중간 유도체로 사용되거나 페인트, 잉크 등에 첨가물로서 사용된다(Vickroy, Comprehensive Biotechnology Vol. 3, 1 st edition, 761-776(1985)).
젖산은 그의 광학적 성질에 따라 D형과 L형으로 나뉘는데 화학합성법으로는 D형과 L형이 혼합된 형태로 생산되고 젖산균을 이용한 직접 발효법으로는 젖산균의 성질에 따라 D형, L형 또는 혼합형이 생산된다. D형 젖산 폴리머는 의료분야에서 생체적 합성 재료용으로 사용될 뿐 아니라 에스테르화 및 염소화 하므로서 광학활성 제초제로서도 사용된다. 특히, 제초제가 광학활성을 갖는다면 약효가 훨씬 향상되고 적은 살포량으로도 동일한 효과를 나타낸다는 것이 확인되어 D형 젖산의 수요가 증가하고 있다. 그러나, 직접 발효법으로 생산된 젖산은 대부분이 L형이거나, D, L 혼합형이 많고 순수한 D형의 생산은 어려운 실정이다. 이를 극복하기 위하여 곰팡이(Rhizopus 등)를 이용하거나 고초균(Bacillus laevolacticus 등)을 이용하기도 하지만 그 결과는 산업적으로 성공하지 못했다.
한편, 포메토(Pometto III) 등은 최근 젖산균의 변이주를 이용하여 포도당으로부터 직접 발효법으로 최종농도 117g/ℓ로 순수한 D형 젖산을 생산하였음을 보고하였다(J. Industrial Microbiol, 11, 23-28(1992)). 그러나, 직접 발효법은 낮은 pH에서 생산균이 증식하게 되므로 젖산에 의한 저해 현상이 커서 고농도로 젖산균을 증식 유지하고 젖산을 생산하기가 어려운 단점이 있다. 또한, 젖산균은 생육이 늦고 그 영양요구성이 복잡하여 거의 모든 젖산균이 비타민 B를 요구하고 또한 많은 종류의 아미노산을 증식인자로 요구한다(Stanier 등, The Microbial World, 5th edition, 496-501(1986), Prentice-Hall, USA). 한편, 대장균은 영양 요구성이 간단하고, 생육이 빠르고, 이용할 수 있는 기질 또한 다양하며 발효에 응용하기 쉽다.(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 1, 414-417, Williams & Wilkins, USA).이에 본 발명자들은 상기 방법들의 단점을 극복하고 미생물로부터 D형 젖산만을 순수하게 생산하기 위해 D형 젖산만을 생산하는 대장균 균주를 제조하고 그를 배양하여 D형 젖산을 대량 생산할 수 있는 발효 방법을 개발하므로서 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 D형 젖산만을 선택적으로 대량 생산할 수 있는 대장균 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 대장균 균주를 배양하여 D형 젖산을 대량 생산할 수 있는 발효 방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
D형 젖산, 포름산, 알코올, 숙신산 등을 생산하는 혼합 발효형(mixed acid fermentation) 장내세균인 대장균을 이용하여 D형 젖산을 특이적으로 생산하려면 해당 과정을 통해 생성된 피루브산의 농도를 높이거나 배양액의 pH를 낮춰 D형 젖산 탈수소 효소(D-lactate dehydrogenase)의 활성을 높여야 한다(Clark, FEMS Microbiol, Rev. 63, 223-234(1989)). 그러나, 이 경우에도 D형 젖산이 다른 유기산과의 혼합형으로 생산되므로 대장균의 발효 경로 중 초산 경로를 차단하여 세포내의 피루브산 농도를 상대적으로 증가시키고 혐기적 조건이나 산소제한 상태로 배양하여 세포내로 유입된 탄소원의 대사흐름을 D형 젖산쪽으로 유도한다. 초산 경로의 차단은 초산합성에 필요한 효소인 포스포아세틸트랜스퍼라제(phosphoacetyltransferase, pat)와 아세테이트 키나아제(acetate kinase, ack)중 첫번째 효소를 암호화하는 유전자에 가나마이신(kanamycin) 표식단편 DNA를 P1 파아지를 이용한 형질도입법으로 삽입하여 효소의 활성을 유전학적으로 제거하므로서 이루어진다.
구체적으로는, 대장균 OW1(KCTC 2308)으로부터 pta :: TnphoA'-1 유전형을 갖도록 제조한 표식유전자를 갖는 공여세포 대장균 OW1 pta :: TnphoA'-1(한국과학기술원 생명과학과 미생물 유전학실)을 TGC배지(0.1% 포도당 및 10mM 염화 칼슘을 포함하는 박토-트립톤 액체배지(Bacto-tryptone broth)에서 배양한 후 배양액에 P1 파아지를 접종하여 용균액을 얻는다. 이렇게 얻은 P1 용균액은 정상 바이러스와 형질 도입 바이러스 입자를 갖게 된다.
수용 세포 대장균 LB 배지(박토-트립톤(Bacto-tryptone) 10g/L, 박토-효모엑기스(Bacto-yeast extract) 5g/L, 소금(NaCl) 5g/L, pH=7.2)에서 배양한 후 원심분리하여 세포를 분리하고 상기와 같이 얻은 P1 용균액을 접종시켜 수용세포를 P1 파아지로 감염시켰다. 감염시킨 세포를 가나마이신이 들어 있는 LB 평판 배지에 도말한 후 생성된 세포 군락으로부터 초산생산 결핍균을 선별한다. 본 발명의 대장균을 제조하기 위한 수용 세포로서는 대장균 RR1(KCTC 1473), EJ500(한국과학기술원 생명과학과 미생물 유전학실), HB101(KCTC 1467) 등이 이용될 수 있으며, 그 중 대장균 RR1이 바람직하다.
본 발명에서 제조된, D형 젖산을 생산할 수 있는 초산 생산 결핍 변이대장균 RR1 pta :: TnphoA'-1은 93년 11월 24일 자로 한국과학기술연구원 유전공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 0095BP로서 기탁되었다.
위에서 제조된 초산 생산 결핍 대장균을 이용하여 실시예 2의 표1과 같은 배지에서 종균 배양을 실시하고 동일 배지를 주배양 배지로 사용하여 처음에는 호기적 조건에서 다음에는 혐기적 조건 또는 산소 제한 조건으로 전환하여 발효를 수행한다. 호기적 조건으로 배양할 때, 생산균은 초산 생산이 유전학적으로 결핍되었으므로 호기적 조건에서의 주 대사산물인 초산 생산이 거의 없고, 포름산과 에탄올 또한 축적하지 않는다. 배양액중의 세포농도가 10∼30g/ℓ가 되는 시기에 배양액 중에 질소가스를 불어넣어 완전한 혐기적 조건으로 전환시키거나, 교반속도 및 통기 속도를 낮추어 산소 제한 조건으로 전환시켜 배양을 계속한다. 산소 제한 조건에서 교반 속도는 100∼500rpm의 범위 내일 수 있고, 약 200rpm 정도가 바람직하며, 통기 속도는 0.1∼0.5ℓ/분, 특히 0.3ℓ/분 정도가 바람직하다. 상기 발효들에서는, 발효중간에 부족한 탄소원을 보충하기 위해 배지내 글루코스 농도가 10g/ℓ 이하가 될 때마다 70% 포도당 용액을 첨가하며, 일정시간 후, 유입된 탄소원은 70% 이상의 수율로 D형 젖산을 고농도로 배양액중에 축적한다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 하기 실시예들은 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 어느 면으로든 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
[실시예1]
D형 젖산 생산 대장균의 제조
대장균 OW1로부터 초산을 탄소원으로 사용할 수 있는 변이주 OW1 Ace+를 선별하고, 이를 모균주로하여 P1 형질도입법으로 pta :: TnphoA'-1의 유전형을 갖는 대장균 OW1 pta :: TnphoA'-1을 제조하였다. 상기에서 제조한 유전자의 공여세포 대장균 OW1 pta :: TnphoA'-1을 2ml TGC 배지에 하룻밤 배양한 배양액을 다시 3ml TGC 배지에 1% 접종하여 35℃에서 1시간 정도 재배양하였다. 600nm에서의 흡광도가 약 0.15가 되면 P1 파아지(1010pfu/ml)를 50ml를 첨가하여 2-3시간 동안 방치하였다. 배양액이 맑아지면 0.1ml의 클로로포름을 넣고 혼합하여 3000g에서 10분 동안 원심분리한 후 상등액을 취해 형질도입 P1용균액으로 사용하였다.
수용세포 대장균 RR1은 LB 배지에서 하룻밤 배양한 gn 3000g에서 10분간 원심분리하여 침전된 세포만을 취하고 배양액 부피의 절반 정도되는 10mM MgSO4와 5mM CuCl2용액을 첨가하여 현탁시킨다.
4개의 튜브에 수용세포 RR1 현탁액을 0.1ml씩 넣은 후, 여기에 공여세포 대장균 OW1 pta :: TnphoA'-1로부터 얻은 p1 용균액을 각각 0㎕, 10㎕, 50㎕, 100㎕씩 넣고 혼합하여 상온에서 20분 동안 방치했다. 상기 혼합물에 1M 구연산 나트륨 100㎕를 넣고 1400 rpm에서 30분 동안 원심 분리하여 침전물을 취한후, 1M 구연산 나트륨 100㎕에 재현탁시킨다. 다시 원심 분리하여 LB 배지 0.9ml와 100mM 구연산 나트륨 0.1ml를 첨가하여 37℃에서 한 시간 동안 방치한 후 35μg/ml의 가나마이신이 들어 있는 LB 평판배지에 도말하여 배양하였다. 초산생산 결핍 변이주의 증식속도 차이에 의해 작은 군락크기의 대장균을 초산 생산 결핍 변이주(RR1 pta :: TnphoA'-1)로서 선택하였다.
[실시예2]
혐기적 조건에서의 D형 젖산의 생산
실시예1에서 제조된 초산 생산 결핍 대장균을 이용하여 하기 표1에 나타낸 배지성분을 이용하여 종균 배양 및 주배양을 실시하였다.
미량원소 *
홈이 있는 500ml 플라스크에 100ml의 배지를 넣고 본 발명의 대장균을 접종한 후 37℃의 진탕배양기에서 호기적으로 하룻밤 동안 종균배양하여 배양기에 최종부피의 3%가 되도록 접종하였다.
본 배양은 5리터 발효배양기에서 배양액의 부피를 3리터로 하고 배양온도는 37℃, pH는 7.0으로 조정하여 수행하였다. 배양의 호기적 조건을 유지하기 위하여 교반속도는 800 내지 1000rpm으로 통기속도는 2 내지 3ℓ/분으로 변화시키면서 배양하였다. 부족한 탄소원을 보충하기 위해 배양액중 포도당의 농도가 10g/ℓ이하가 되면 70%의 농축된 포도당액 200ml를 배양액에 첨가하였다.
배양액중 세포농도가 10g/ℓ가 되었을 때 배양기에 질소가스를 불어 넣어 완전한 혐기적 조건에서 D형 젖산의 생산을 유도하였고, 그 결과는 제1도에 나타내었다. 혐기적 조건으로 전환한 후 약 45시간만에 D형 젖산이 리터당 60그램 이상 배양액에 축적되었다.
[실시예3]
산소제한 조건에서의 D형 젖산생산
상기한 실시예 2와 동일한 배지 및 균주를 이용하여 동일 조건으로 호기적 배양을 수행하다가 배양액중 세포 농도가 10g/ℓ가 되었을 때 시기에 교반속도를 200rpm으로, 통기속도를 0.3ℓ/분으로 낮추어 산소제한 조건으로 전환시켰다. 실시예 2와 마찬가지로 부족한 탄소원의 보충을 위해 배양액중 포도당의 농도가 10g/ℓ 이하가 되면 70%의 농축된 포도당액 200ml를 배양액에 첨가하였다. 산소 제한 조건에서는 산소제한이 시작된 후 60시간만에 리터당 60그램 이상의 D형 젖산이 배양액내에 축적되었다.

Claims (5)

  1. D형 젖산을 대량 생산하는 초산 생산 결핍 변이주 대장균.
  2. 제1항에 있어서, 대장균 RR1 pta :: TnphoA'-1(기탁번호 : KCTC 0095BP).
  3. 제1항 또는 제2항의 대장균을 배양하여 D형 젖산을 대량으로 생산하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 배양이 혐기적 조건 또는 산소 제한 조건하의 배양을 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 산소 제한 조건이 교반속도 200rpm, 통기속도 0.3ℓ/분으로 이루어지는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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DE102010031152A1 (de) 2010-04-20 2011-10-20 Hyundai Motor Company Verfahren zum Herstellen einer optisch aktiven D-Milchsäure unter Verwenden von Nebenprodukten, die bei einem Reispolierprozess erzeugt wurden
KR101540742B1 (ko) * 2013-11-27 2015-07-30 롯데케미칼 주식회사 미세조류를 질소원으로 이용한 락틱산의 생산 방법

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