KR100949312B1 - 안스라닐산염에 대한 내성을 갖는 대장균 균주를 이용한ｌ-트립토판 제조 방법 - Google Patents

안스라닐산염에 대한 내성을 갖는 대장균 균주를 이용한ｌ-트립토판 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 안스라닐산염에 대한 내성을 갖는 대장균 균주 및 이를 이용한 L-트립토판 제조 방법에 관한 것으로, 안스라닐산염 내성을 갖는 변이주는 모균주인 CJ285에 돌연변이 유발원을 처리하고, 안스라닐산염을 함유한 LB 고체 배지에서 성장하는 균주를 분리하여 배양하고, 균주간의 L-트립토판 생산능력을 비교하여, L-트립토판 생산능력이 향상된 균주를 선별함으로써 L-트립토판의 발효농도 및 수율이 증가하는 돌연변이 대장균 균주를 제공하며, 상기 균주를 배지에서 배양하고, 배양물중에 L-트립토판을 축적시키고, 그로부터 L-트립토판을 회수함을 특징으로 하는 L-트립토판의 제조방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.
L-트립토판, 안스라닐산염, 대장균

Description

안스라닐산염에 대한 내성을 갖는 대장균 균주를 이용한 Ｌ-트립토판 제조 방법 {A microorganism of Escherichia genus having enhanced L-tryptophan productivity resistant to anthranilate and a method of producing L-tryptophan using the same}
본 발명은 L-트립토판 생산능력을 가지며, L-트립토판을 생산 중간물질인 안스라닐산염(anthranilate)에 대한 내성이 부여되어 L-트립토판 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 L-트립토판 생산방법에 관한 것이다.
L-트립토판은 필수 아미노산의 일종으로 사료첨가제, 수면효과나 정신 안정효과가 있어 수액제 등의 의약품 원료 및 건강식품소재 등으로 널리 사용되어 왔으며, 화학합성법, 효소반응법, 발효법 등을 이용하여 생산되고 있다.
그러나, 화학합성법의 경우 고온, 고압의 조건이 필요하며 그 산물에 D형과 L형이 혼재하기 때문에 정제과정이 쉽지 않다. 효소반응법의 경우, 예컨대 일본에서 공고된 바 있는 마쓰이 도오아쓰이 특허 (대한민국 특허 공고 90-005773)에서의 효소반응법의 경우는 기질로 사용되는 인돌과 세린의 가격이 고가일 뿐만 아니라 사용되는 효소의 안정성에 문제가 있었다. 따라서 현재는 미생물을 이용한 직접 발효법에 의한 생산방법을 주로 사용하고 있다.
한편 종래의 미생물에 의한 트립토판의 생산은 대장균과 코리네박테리움 등 여러 다양한 미생물의 영양요구성 균주와 조절부위 변이 균주에서 이루어져 왔으며, 1980년대에 들어서면서부터 유전자 재조합 기술이 급격히 발달하여 대사과정과 그 조절 기작들이 자세히 규명됨에 따라 많은 연구자들이 유전자 조작 기법을 이용하여 우수한 재조합 균주들을 개발하는데 큰 성과를 거두었고 고도의 생산성 향상을 가져왔다.
미생물을 이용한 직접 발효법으로 트립토판을 생산하는 국내특허로는 트립토판 유사체 내성을 갖거나 영양 요구성을 갖는 변이 균주를 이용한 경우 (대한민국 특허공고 87-1813, 90-8251, 92-7405)와 재조합 균주를 이용한 경우 (대한민국 특허 공고 90-5772, 91-5672)가 각각 공지되어 있다.
한편, 이러한 트립토판 유사체 내성균주들은 주로 트립토판 생합성 과정에서 효소들의 피드백 저해를 극복하는 것을 주된 목표로 하였고, 재조합 균주들 역시 트립토판 생합성 과정에서 효소들의 클로닝에 목표를 두었으며, 모두 실제로 괄목할 만한 성과를 가져왔다. 그러나 종래의 대장균 인공변이주를 이용한 L-트립토판 생산 방법은 값싼 배양기질을 사용하여 발효법에 의해 L-트립토판을 생산하는 장점은 있었지만, 결정적으로 트립토판의 생산성이 낮다는 문제점이 있었다. 또한 본 발명자들은 당사에서 개발하여 보유하고 있는 CJ285 (대한민국 공개특허공보 10-2005-0059685) 균주의 경우에도 발효법에 의해 L-트립토판을 산업적으로 생산하기에는 생산성이 낮은 것으로 판단하고, 유전자 재조합 기술을 통하여 트립토판 생산성을 보다 극대화하기 위하여 모균주로서 우수한 인공변이주의 확보가 필요하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 목적은 안스라닐산염(anthranilate)에 대한 내성을 부여하여, L-트립토판 생산능이 향상된 대장균 균주를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 L-트립토판 생산을 위한 돌연변이 균주를 포도당이 함유된 발효배지에서 직접 발효법으로 배양함으로써 고농도, 고수율의 L-트립토판 생산방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 상기 목적은 안스라닐산염(anthranilate) 내성을 갖는 변이주는 모균주인 CJ285를 돌연변이 유발원인 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아니딘 (N-methyl-N-nitro-N-itrosoguanidine)을 처리하고, 안스라닐산염 2g/L의 농도를 함유한 LB (Lurina-Bertani. 조성: 박토 트립톤 10g/l, 박토 효모엑기스 5g/l, 염화나트륨 10g/l) 고체 배지에서 성장하는 균주를 분리하여 안스라닐산염 내성을 갖는 변이주를 순수 배양하고, 균주간의 L-트립토판 생산능력을 비교 선별한 다음 본 발명의 L-트립토판 생산능력이 향상된 균주를 획득함으로써 달성하였다.
본 발명은 아스라닐산염에 대한 내성이 부여되고 L-트립토판 생산능력이 향상된 것을 특징으로 하는 L-트립토판 생산 미생물을 제공한다.
특히, 아스라닐산염에 대한 내성이 부여되고 L-트립토판 생산능력이 향상된 것을 특징으로 하는 L-트립토판을 생산하는 미생물이 대장균인 것을 특징으로 한 다.
또한, 아스라닐산염에 대한 내성이 부여되고 L-트립토판 생산능력이 향상된 것을 특징으로 하는 L-트립토판을 생산하는 미생물이 대장균 CA04-0027P(수탁번호 KCCM 10904P)를 제공함에 있다.
본 발명은, 안스라닐산염에 대한 내성 및 L-트립토판 생산능력을 갖는 미생물을 배지에서 배양하고, 배양물중에 L-트립토판을 축적시키고, 그로부터 L-트립토판을 회수함을 특징으로 하는 L-트립토판의 제조방법을 제공함에 있다.
또한 본 발명은, 안스라닐산염에 대한 내성 및 L-트립토판 생산능력을 갖는 대장균 CA04-0027P(수탁번호 KCCM 10904P)를 배지에서 배양하고, 배양물 중에 L-트립토판을 축적시키고, 그로부터 L-트립토판을 회수함을 특징으로 하는 L-트립토판의 제조방법을 제공함에 있다.
본 발명은 아스라닐산염에 대한 내성이 부여되고 L-트립토판 생산능력이 향상된 것을 특징으로 하는 대장균 균주와, 상기 미생물을 배지에서 배양하고, 배양물 중에 L-트립토판을 축적시키고, 그로부터 L-트립토판을 회수함을 특징으로 하는 L-트립토판의 제조방법에 관한 것이다.
L-트립토판을 생산하는 대장균을 인공 돌연변이시켜 트립토판 생합성 경로의 중간물질인 안스라닐산염에 대한 내성을 부여한 결과, 모균주에 비해 돌연변이 균주에서 L-트립토판의 발효농도 및 수율이 증가하는 돌연변이 대장균 균주를 제공하 는 뛰어난 효과가 있다.
이하, 본 발명이 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 안스라닐산염(anthrnailate)에 대한 내성을 가지는 인공 돌연변이 균주 제작
안스라닐산염에 대한 내성을 가지는 인공 돌연변이 균주를 제작하기 위해 모균주인 CJ285를 LB (Lurina-Bertani. 조성: 박토 트립톤 10g/L, 박토 효모엑기스 5g/L, 염화나트륨 10g/L) 배지 25mL을 함유하는 250mL 플라스크에 접종하고 37 ℃에서 15시간 동안 진탕 배양 (220 rmp) 하였다. 이를 다시 LB (Lurina-Bertani. 조성: 박토 트립톤 10g/L, 박토 효모엑기스 5g/L, 염화나트륨 10g/L) 배지 25mL을 함유하는 250mL 플라스크에 1mL의 배양액을 접종하고 37℃에서 셀수가 107-108/mL 될 때까지 진탕배양(220 rpm)하였다.
배양 종료 후 3500rpm에서 10분간 원심분리 후 상층액을 제거하고, 0.1M의 시트레이트완충액(pH 5.5)로 세 번 세척한 다음, 0.1M 시트레이트완충액 20mL에 현탁 한 후, 돌연변이 유발물질인 N-메틸-N'-니트로-N-니트로로소구아니딘(N-methyl-N-nitro-N-itrosoguanidine)을 최종농도가 500ul/mL이 되게 첨가한 후, 37 ℃에 20 분간 진탕배양( 220rpm)하였다.
배양액을 3500rpm에서 5분간 원심분리 후, 0.1M 포스페이트완충액으로 세 번 세척을 하고, 0.1M 포스페이트완충액 1mL에 현탁하였다. 이 현탁액을 LB (Lurina-Bertani. 조성: 박토 트립톤 10g/L, 박토 효모엑기스 5g/L, 염화나트륨 10g/L) 고체 배지에 25mL/L의 안스라닐산염과 2g/L 안스라닐산염을 포함하고 있는 배지에 도말하여 안스라닐산염에 대한 내성을 가지는 균주 7종을 획득하였다.
모균주인 CJ285와 본 발명의 안스라닐산염 내성 변이주 7종을 이용하여 안스라닐산염에 대한 내성을 시험하기 위하여 LB (Lurina-Bertani. 조성: 박토 트립톤 10g/L, 박토 효모엑기스 5g/L, 염화나트륨 10g/L) 고체 배지에서 밤새 배양한 후, 2g/L 안스라닐산염을 함유하는 LB 고체배지에 2일간 배양했을 때의 상기 각 균주의 성장도를 표 1에 나타냈다.
모균주(CJ285)와 돌연변이 균주의 안스라닐산염 내성도
안스라닐산염 (g/L) 모균주 CJ285 변이주 7종
0 +++ +++
2 - +++
+++ : 충분한 성장 - : 성장하지 않음
실시예 2: L-트립토판 생산능력이 향상된 균주의 선별
모균주 CJ285와 NTG 처리를 통해 확보한 인공 돌연변이균주들의 콜로니를 백금이로 이용하여 LB (Lurina-Bertani. 조성: 박토 트립톤 10g/L, 박토 효모엑기스 5g/L, 염화나트륨 10g/L) 고체 배지에서 밤새 배양한 후, 성장한 균주를 표 2의 생산배지 25mL를 함유하는 250mL플라스크에 한 백금이 씩 접종하였다.
플라스크 역가배지
조성 농도(g/L)
글루코오스 (glucose) 60
효모 추출물 (Yeast extract) 2.5
암모늄 설페이트 ((NH4)2SO4) 10
마그네슘 설페이트 (MgSO4H20) 1
구연산 나트륨 (Sodium citrate) 5
소디움 클로라이드 (NaCl) 1
타이로신 (L-tyrosine) 0.1
페닐알라닌 (L-phenylalanine) 0.15
칼슘 카르보네이트 (CaCO3) 40
포타슘 디히드로겐포스페이트 (K2HPO4) 1
상기의 생산배지에 25mg/L의 카나마이신(kanamycin)과 2g/L의 안스라닐산염을 추가로 배지에 첨가하여 배지를 조성한다. 이 배지에 균주 접종 후 37℃, 200rpm에서 48시간 동안 배양하고, 그로부터 얻어진 L-트립토판 생산량을 비교 분석하여 표 3에 나타내었다.
트립토판 농도 비교
균주 L-트립토판 (g/L)
CJ285 3.41
NTG1 6.35
NTG2 3.92
NTG3 5.82
NTG4 3.60
NTG5 0.97
NTG6 1.53
NTG7 1.73
L-트립토판 생산량을 비교 분석하여, L-트립토판 생산능력이 향상된 균주를 선별하였다. 안스라닐산염에 대한 내성을 갖는 7종의 돌연변이주 중에서 가장 트립토판 생산성이 높은 NTG1 균주를 CA04-0027P로 명명하고 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 KCCM 10904P를 얻었다.
실시예3 : 안스라닐산염의 내성을 가진 인공 돌연변이 균주의 L-트립토판 생산성 비교
안스라닐산염의 내성을 가지는 것으로 판단 되어지는 CA04-0027P(수탁번호 KCCM 10904P) 균주와, L-트립토판 생산균주인 CJ285를 LB (Lurina-Bertani. 조성: 박토 트립톤 10g/L, 박토 효모엑기스 5g/L, 염화나트륨 10g/L) 고체 배지에서 밤새 배양한 후, 상기의 생산배지 25mL을 함유하는 250mL플라스크에 한 백금이 씩 접종하였다. 상기의 생산배지에는 카나미이신이 첨가된다. 균주 접종 후 37℃, 200rpm에서 48시간 동안 배양하고, 그로부터 얻어진 L-트립토판 생산량을 비교하였다.
표 4에 나타난 대로 안스라닐산염의 내성을 가지는 CA04-0027P(수탁번호 KCCM 10904P) 균주의 트립토판 농도가 모균주인 CJ285에서보다 18% 이상 증가하였다.
트립토판 농도 비교
균주 L-트립토판(g/L)
CJ285 10.68
CA04-0027P(수탁번호 KCCM 10904P) 12.64

Claims (4)

  1. 안스라닐산염에 대한 내성이 부여되고 L-트립토판 생산능을 가지는 것을 특징으로 하는 L-트립토판을 생산하는 대장균 CA04-0027P(수탁번호 KCCM 10904P).
  2. 삭제
  3. 안스라닐산염에 대한 내성 및 L-트립토판 생산능력을 갖는 대장균 CA04-0027P(수탁번호 KCCM 10904P)를 배지에서 배양하고, 배양물 중에 L-트립토판을 축적시키고, 그로부터 L-트립토판을 회수함을 특징으로 하는 L-트립토판의 제조방법.
  4. 삭제
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