JPH0584067A - 発酵法によるイノシンの製造法 - Google Patents
発酵法によるイノシンの製造法Info
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- JPH0584067A JPH0584067A JP24881391A JP24881391A JPH0584067A JP H0584067 A JPH0584067 A JP H0584067A JP 24881391 A JP24881391 A JP 24881391A JP 24881391 A JP24881391 A JP 24881391A JP H0584067 A JPH0584067 A JP H0584067A
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- JP
- Japan
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- inosine
- guanosine
- xanthosine
- microorganism
- bacillus subtilis
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Abstract
(57)【要約】
【目的】発酵法による工業的に有利なイノシンの製造法
を開発する。 【構成】バチルス属に属しグアノシン、キサントシン、
イノシンとグアノシンまたはイノシンとキサントシンを
生産する能力を有しかつアデニン要求性である微生物
を、微生物由来のＤＮＡジャイレース阻害剤耐性遺伝子
およびＩＭＰデヒドロゲナーゼ低発現性遺伝子をコード
するＤＮＡにより形質転換した微生物、該微生物を培地
に培養し、培養物中にイノシンを生成蓄積せしめ、これ
を採取することを特徴とするイノシンの製造法。 【効果】本発明によると、イノシンを収率よく工業的に
有利に製造できる。
を開発する。 【構成】バチルス属に属しグアノシン、キサントシン、
イノシンとグアノシンまたはイノシンとキサントシンを
生産する能力を有しかつアデニン要求性である微生物
を、微生物由来のＤＮＡジャイレース阻害剤耐性遺伝子
およびＩＭＰデヒドロゲナーゼ低発現性遺伝子をコード
するＤＮＡにより形質転換した微生物、該微生物を培地
に培養し、培養物中にイノシンを生成蓄積せしめ、これ
を採取することを特徴とするイノシンの製造法。 【効果】本発明によると、イノシンを収率よく工業的に
有利に製造できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は化学調味料として広く用
いられている５'−イノシン酸（５'−ＩＭＰ）の製造原
料として、また医薬品として重要な物質であるイノシン
を有利に製造する方法、その製造に用いられる新規微生
物に関する。
いられている５'−イノシン酸（５'−ＩＭＰ）の製造原
料として、また医薬品として重要な物質であるイノシン
を有利に製造する方法、その製造に用いられる新規微生
物に関する。
【０００２】
【従来の技術】発酵法によるイノシンの製造法に関して
は、アデニン要求性であるか、さらにそれに加えて各種
の薬剤耐性を付与したバチルス属菌（特公昭５５−２９
５６号、特公昭５７−４１９１５号、特開昭５９−４２
８９５号）やブレビバクテリウム属菌（特公昭５１−５
０７５号）等を用いる方法が知られている。
は、アデニン要求性であるか、さらにそれに加えて各種
の薬剤耐性を付与したバチルス属菌（特公昭５５−２９
５６号、特公昭５７−４１９１５号、特開昭５９−４２
８９５号）やブレビバクテリウム属菌（特公昭５１−５
０７５号）等を用いる方法が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このよ
うな方法でさえも、イノシンおよびグアノシンが共通の
生合成経路で作られて来ることから、イノシン生産菌株
の育種、生産培養の過程において生産能が増大しても、
グアノシンが併産することがあり、培養液から、イノシ
ンを単離するためには繁雑な精製操作が必要であった。
そこで、さらに優れた菌株の育種法ならびにより効率的
な製造法の開発が望まれていた。
うな方法でさえも、イノシンおよびグアノシンが共通の
生合成経路で作られて来ることから、イノシン生産菌株
の育種、生産培養の過程において生産能が増大しても、
グアノシンが併産することがあり、培養液から、イノシ
ンを単離するためには繁雑な精製操作が必要であった。
そこで、さらに優れた菌株の育種法ならびにより効率的
な製造法の開発が望まれていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らはこのような
現状に鑑み、生産菌の有するＩＭＰデヒドロゲナーゼ活
性がグアノシンの蓄積と関与しているという事実に着目
し、該酵素遺伝子を低く発現させてイノシンを選択的に
著量蓄積せしめることによって、イノシンの収量増大を
図ることを目的として鋭意研究を行った。その結果、そ
のＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子が低発現であるか、ま
たはそのＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子が厳密にフィー
ドバック制御を受けているためにグアノシン蓄積量の少
ない菌株より得られたＩＭＰデヒドロゲナーゼ低発現性
遺伝子を含むＤＮＡを用いて、アデニン要求性であり、
イノシンのほかにグアノシン、キサントシンを、または
グアノシンもしくはキサントシンだけを生産する能力を
有するバチルス属菌を形質転換することにより、イノシ
ンを著量蓄積する菌株を容易に造成できることを見いだ
し、該菌株を用いることにより容易にかつ著量にイノシ
ンを生成蓄積させることができる製造方法を確立するに
至った。すなわち、本発明は、バチルス属に属しグアノ
シン、キサントシン、イノシンとグアノシンまたはイノ
シンとキサントシンを生産する能力を有しかつアデニン
要求性である微生物を、微生物由来のＤＮＡジャイレー
ス阻害剤耐性遺伝子およびＩＭＰデヒドロゲナーゼ低発
現性遺伝子をコードするＤＮＡにより形質転換した微生
物および該微生物を培地に培養し、培養物中にイノシン
を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするイ
ノシンの製造法に関する。以下、本発明について詳細に
説明する。
現状に鑑み、生産菌の有するＩＭＰデヒドロゲナーゼ活
性がグアノシンの蓄積と関与しているという事実に着目
し、該酵素遺伝子を低く発現させてイノシンを選択的に
著量蓄積せしめることによって、イノシンの収量増大を
図ることを目的として鋭意研究を行った。その結果、そ
のＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子が低発現であるか、ま
たはそのＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子が厳密にフィー
ドバック制御を受けているためにグアノシン蓄積量の少
ない菌株より得られたＩＭＰデヒドロゲナーゼ低発現性
遺伝子を含むＤＮＡを用いて、アデニン要求性であり、
イノシンのほかにグアノシン、キサントシンを、または
グアノシンもしくはキサントシンだけを生産する能力を
有するバチルス属菌を形質転換することにより、イノシ
ンを著量蓄積する菌株を容易に造成できることを見いだ
し、該菌株を用いることにより容易にかつ著量にイノシ
ンを生成蓄積させることができる製造方法を確立するに
至った。すなわち、本発明は、バチルス属に属しグアノ
シン、キサントシン、イノシンとグアノシンまたはイノ
シンとキサントシンを生産する能力を有しかつアデニン
要求性である微生物を、微生物由来のＤＮＡジャイレー
ス阻害剤耐性遺伝子およびＩＭＰデヒドロゲナーゼ低発
現性遺伝子をコードするＤＮＡにより形質転換した微生
物および該微生物を培地に培養し、培養物中にイノシン
を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするイ
ノシンの製造法に関する。以下、本発明について詳細に
説明する。
【０００５】本発明にいうＩＭＰデヒドロゲナーゼ低発
現性遺伝子とは、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子自体が
低発現性であるものの他、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝
子をフィードバック制御する遺伝子を合わせ持ち、その
ためＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子が低発現であるもの
も含む。本発明に用いられるＤＮＡ供与菌は、そのＤＮ
Ａが後記の受容菌として用いられるバチルス属菌のＤＮ
Ａと相同性が高いものであれば良い。また、該供与菌は
必ずしもイノシン、グアノシン、キサントシンまたはこ
れらのプリン塩基を生産する能力を有している必要はな
い。
現性遺伝子とは、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子自体が
低発現性であるものの他、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝
子をフィードバック制御する遺伝子を合わせ持ち、その
ためＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子が低発現であるもの
も含む。本発明に用いられるＤＮＡ供与菌は、そのＤＮ
Ａが後記の受容菌として用いられるバチルス属菌のＤＮ
Ａと相同性が高いものであれば良い。また、該供与菌は
必ずしもイノシン、グアノシン、キサントシンまたはこ
れらのプリン塩基を生産する能力を有している必要はな
い。
【０００６】このようなＤＮＡ供与菌としてはバチルス
・ズブチリス（Bacillus subtilis)、バチルス・プミル
ス（Bacilluspumilus）などのバチルス属菌が挙げられ
る。具体的にはバチルス・ズブチリス（Bacillus subti
lis）ＢＭ１０３２（ＩＦＯ１４５５９，ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−１２４２）、バチルス・ズブチリス（Bacillussubt
ilis）１６８（ＢＧＳＣ１Ａ１）、バチルス・ズブチリ
ス（Bacillus subtilis）No. １１５（ＩＦＯ１４１８
７，ＦＥＲＭ ＢＰ−１３２７）、バチルス・ズブチリ
ス（Bacillus subtilis）ＭＩ １１４［ジーン（Gen
e），２４，２５５］、バチルス・プミルス（Bacillus
pumilus）ＡＴＣＣ７０６１株等が挙げられる。なお、
上記のＢＧＳＣ番号はザ・バチルス・ジェネティック・
ストック・センター（The Bacillus Genetic Stock Cen
ter）における、ＩＦＯ番号は財団法人発酵研究所（Ins
titute For Fermentation, Osaka）における、ＦＥＲＭ
ＢＰ番号はブタペスト条約のもとでの工業技術院微生
物工業研究所（ＦＲＩ）における、ＡＴＣＣ番号はジ・
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（TheA
merican Type Culture Collection）における受託番号
をそれぞれ示す。
・ズブチリス（Bacillus subtilis)、バチルス・プミル
ス（Bacilluspumilus）などのバチルス属菌が挙げられ
る。具体的にはバチルス・ズブチリス（Bacillus subti
lis）ＢＭ１０３２（ＩＦＯ１４５５９，ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−１２４２）、バチルス・ズブチリス（Bacillussubt
ilis）１６８（ＢＧＳＣ１Ａ１）、バチルス・ズブチリ
ス（Bacillus subtilis）No. １１５（ＩＦＯ１４１８
７，ＦＥＲＭ ＢＰ−１３２７）、バチルス・ズブチリ
ス（Bacillus subtilis）ＭＩ １１４［ジーン（Gen
e），２４，２５５］、バチルス・プミルス（Bacillus
pumilus）ＡＴＣＣ７０６１株等が挙げられる。なお、
上記のＢＧＳＣ番号はザ・バチルス・ジェネティック・
ストック・センター（The Bacillus Genetic Stock Cen
ter）における、ＩＦＯ番号は財団法人発酵研究所（Ins
titute For Fermentation, Osaka）における、ＦＥＲＭ
ＢＰ番号はブタペスト条約のもとでの工業技術院微生
物工業研究所（ＦＲＩ）における、ＡＴＣＣ番号はジ・
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（TheA
merican Type Culture Collection）における受託番号
をそれぞれ示す。
【０００７】後の形質転換株を効率的に取得するため
に、これらのＤＮＡ供与菌に受容菌が有していない各種
の薬剤耐性を付与しておくことが有効である。このこと
により、ＤＮＡで形質転換した菌株をその薬剤を含有す
る寒天培地上で容易に選択することができる。ここで用
いる薬剤としてはアミノ酸アナログ、核酸アナログなど
の抗菌物質であればよいが、染色体上でＩＭＰデヒドロ
ゲナーゼ遺伝子の近傍に耐性変異を付与することのでき
る薬剤が最も良い。このような薬剤としてＤＮＡジャイ
レース阻害剤が挙げられる。該ＤＮＡジャイレース阻害
剤の具体例としてナリジキシン酸、オキソリン酸、ノボ
ビオシン、クーママイシンＡ１などが挙げられる。目的
とする薬剤耐性株の造成、単離は自然変異によって、も
しくは紫外線照射、人工変異剤（例えば、エチルメタン
スルホン酸、ニトロソグアニジンなど）処理などの変異
誘導処理を施した後、親株が生育しないような濃度の薬
剤を含む寒天培地で培養し、生育したコロニーを選択す
る。
に、これらのＤＮＡ供与菌に受容菌が有していない各種
の薬剤耐性を付与しておくことが有効である。このこと
により、ＤＮＡで形質転換した菌株をその薬剤を含有す
る寒天培地上で容易に選択することができる。ここで用
いる薬剤としてはアミノ酸アナログ、核酸アナログなど
の抗菌物質であればよいが、染色体上でＩＭＰデヒドロ
ゲナーゼ遺伝子の近傍に耐性変異を付与することのでき
る薬剤が最も良い。このような薬剤としてＤＮＡジャイ
レース阻害剤が挙げられる。該ＤＮＡジャイレース阻害
剤の具体例としてナリジキシン酸、オキソリン酸、ノボ
ビオシン、クーママイシンＡ１などが挙げられる。目的
とする薬剤耐性株の造成、単離は自然変異によって、も
しくは紫外線照射、人工変異剤（例えば、エチルメタン
スルホン酸、ニトロソグアニジンなど）処理などの変異
誘導処理を施した後、親株が生育しないような濃度の薬
剤を含む寒天培地で培養し、生育したコロニーを選択す
る。
【０００８】ＤＮＡ供与菌からの染色体ＤＮＡは公知の
方法、例えばフェノールを用いた抽出法（H. Saito and
K. Miura, Biochem. Biophy. Acta., ７２，６１９）
に従うか、もしくはこれに準じた抽出方法によりえるこ
とができる。この該ＤＮＡによる形質転換に用いられる
受容菌としては、該ＤＮＡと相同組換えを行える形質転
換能を有するバチルス属菌であれば良いが、イノシン生
産能の高い形質転換株を得る目的からはイノシンとグア
ノシン、イノシンとキサントシン、あるいはグアノシン
かキサントシンだけを蓄積でき、形質転換能を有し、病
原性がなく、工業的にも安全に使用されてきた歴史があ
るという観点から、特に、バチルス・ズブチリス（Baci
llus subtilis）から変異誘導されたアデニン要求性で
あり、イノシンとグアノシン、イノシンとキサントシ
ン、グアノシンまたはキサントシン生産菌株はさらに好
ましい受容菌として用いることができる。
方法、例えばフェノールを用いた抽出法（H. Saito and
K. Miura, Biochem. Biophy. Acta., ７２，６１９）
に従うか、もしくはこれに準じた抽出方法によりえるこ
とができる。この該ＤＮＡによる形質転換に用いられる
受容菌としては、該ＤＮＡと相同組換えを行える形質転
換能を有するバチルス属菌であれば良いが、イノシン生
産能の高い形質転換株を得る目的からはイノシンとグア
ノシン、イノシンとキサントシン、あるいはグアノシン
かキサントシンだけを蓄積でき、形質転換能を有し、病
原性がなく、工業的にも安全に使用されてきた歴史があ
るという観点から、特に、バチルス・ズブチリス（Baci
llus subtilis）から変異誘導されたアデニン要求性で
あり、イノシンとグアノシン、イノシンとキサントシ
ン、グアノシンまたはキサントシン生産菌株はさらに好
ましい受容菌として用いることができる。
【０００９】具体例としては、バチルス・ズブチリス
（Bacillus subtilis）ＮＡ−６０１１（ＩＦＯ １４
１８９，ＦＥＲＭ ＢＰ−２９１）、バチルス・ズブチ
リス（Bacillus subtilis）ＮＡ−６０１２（ＩＦＯ
１４１９０，ＦＥＲＭ ＢＰ−２９２）、バチルス・ズ
ブチリス（Bacillus subtilis）ＮＡ−６１２８（ＩＦ
Ｏ １４３７３，ＦＥＲＭ ＢＰ−６１７）、バチルス
・ズブチリス（Bacillussubtilis）ＮＡ−７８２１（Ｉ
ＦＯ １４３６８，ＦＥＲＭ ＢＰ−６１８）などが例
示される。これらのバチルス属菌の形質転換は公知の方
法［シイ・アナグノストポウロス アンド ジェイ・ス
ピツァイツェン，ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
〔C. Anagnostopoulos and J. Spizizen, J. Bacterio
l., ８１，７４１（１９６１）〕］か、もしくはそれに
準じた方法で行うことができる。このような本発明の形
質転換株の例としては、後記の実施例で得られたバチル
ス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＮＡ−６３０１
（ＩＦＯ １５２２５，Ｆ ＥＲＭ ＢＰ−３５７６）
が挙げられる。なお、該菌株は１９９１年９月９日付で
ＩＦＯに、また、１９９１年９月２４日付でＦＲＩに各
々寄託されている。
（Bacillus subtilis）ＮＡ−６０１１（ＩＦＯ １４
１８９，ＦＥＲＭ ＢＰ−２９１）、バチルス・ズブチ
リス（Bacillus subtilis）ＮＡ−６０１２（ＩＦＯ
１４１９０，ＦＥＲＭ ＢＰ−２９２）、バチルス・ズ
ブチリス（Bacillus subtilis）ＮＡ−６１２８（ＩＦ
Ｏ １４３７３，ＦＥＲＭ ＢＰ−６１７）、バチルス
・ズブチリス（Bacillussubtilis）ＮＡ−７８２１（Ｉ
ＦＯ １４３６８，ＦＥＲＭ ＢＰ−６１８）などが例
示される。これらのバチルス属菌の形質転換は公知の方
法［シイ・アナグノストポウロス アンド ジェイ・ス
ピツァイツェン，ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
〔C. Anagnostopoulos and J. Spizizen, J. Bacterio
l., ８１，７４１（１９６１）〕］か、もしくはそれに
準じた方法で行うことができる。このような本発明の形
質転換株の例としては、後記の実施例で得られたバチル
ス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＮＡ−６３０１
（ＩＦＯ １５２２５，Ｆ ＥＲＭ ＢＰ−３５７６）
が挙げられる。なお、該菌株は１９９１年９月９日付で
ＩＦＯに、また、１９９１年９月２４日付でＦＲＩに各
々寄託されている。
【００１０】本発明で得られる形質転換株を培養する培
地としては、炭素源、窒素源、無機塩類の他、必要に応
じてアミノ酸、核酸、ビタミン類などの栄養源を含有す
る培地が用いられる。例えば、炭素源としては、グルコ
ース、シュクロース、マルトース、澱粉、澱粉糖化液、
糖蜜などが用いられる。窒素源としてはペプトン、コー
ンスティープリカー、大豆粉、乾燥酵母、尿素などの有
機窒素源のほかに硫酸、硝酸、塩酸、炭酸、リン酸など
のアンモニア塩やアンモニアガス、アンモニア水などの
無機窒素源がそれぞれ単独もしくは混合して用いられ
る。その他の栄養源としては、菌の生育に必要な各種の
無機塩類、アミノ酸類、ビタミン類などが適宜選択の
上、それぞれ単独もしくは混合して用いられる。アデニ
ン源としては、アデニン、アデノシン、アデニル酸、核
酸はもとより、それらを含有する微生物菌体やその抽出
物などが用いられる。さらには培地には必要に応じてシ
リコンオイル、ポリアルキレングリコールエーテルなど
の消泡剤や界面活性剤などを添加することができる。培
養は通常、振盪あるいは通気撹拌深部培養などの好気的
条件下で行われる。培地のpＨは通常４乃至９の範囲が
好ましい。培養中にpＨの変動が観察される場合はこれ
を好ましい範囲に修正するために、硫酸、炭酸カルシウ
ム、水酸化ナトリウム、アンモニアガス、アンモニア水
などを適宜添加してよい。培養温度は通常２０℃乃至４
５℃の範囲から使用される微生物の生育およびイノシン
の蓄積に好適な温度が選択される。培養は実質的にイノ
シンの蓄積量が最大になるまで行われるが、通常、２４
時間乃至１４４時間の培養で目的を達することができ
る。培養物からイノシンを単離採取するには、すでに公
知にされている通常の精製手段、例えば沈殿法、イオン
交換樹脂や活性炭によるクロマトグラフィー法などの分
離精製法が用いられる。
地としては、炭素源、窒素源、無機塩類の他、必要に応
じてアミノ酸、核酸、ビタミン類などの栄養源を含有す
る培地が用いられる。例えば、炭素源としては、グルコ
ース、シュクロース、マルトース、澱粉、澱粉糖化液、
糖蜜などが用いられる。窒素源としてはペプトン、コー
ンスティープリカー、大豆粉、乾燥酵母、尿素などの有
機窒素源のほかに硫酸、硝酸、塩酸、炭酸、リン酸など
のアンモニア塩やアンモニアガス、アンモニア水などの
無機窒素源がそれぞれ単独もしくは混合して用いられ
る。その他の栄養源としては、菌の生育に必要な各種の
無機塩類、アミノ酸類、ビタミン類などが適宜選択の
上、それぞれ単独もしくは混合して用いられる。アデニ
ン源としては、アデニン、アデノシン、アデニル酸、核
酸はもとより、それらを含有する微生物菌体やその抽出
物などが用いられる。さらには培地には必要に応じてシ
リコンオイル、ポリアルキレングリコールエーテルなど
の消泡剤や界面活性剤などを添加することができる。培
養は通常、振盪あるいは通気撹拌深部培養などの好気的
条件下で行われる。培地のpＨは通常４乃至９の範囲が
好ましい。培養中にpＨの変動が観察される場合はこれ
を好ましい範囲に修正するために、硫酸、炭酸カルシウ
ム、水酸化ナトリウム、アンモニアガス、アンモニア水
などを適宜添加してよい。培養温度は通常２０℃乃至４
５℃の範囲から使用される微生物の生育およびイノシン
の蓄積に好適な温度が選択される。培養は実質的にイノ
シンの蓄積量が最大になるまで行われるが、通常、２４
時間乃至１４４時間の培養で目的を達することができ
る。培養物からイノシンを単離採取するには、すでに公
知にされている通常の精製手段、例えば沈殿法、イオン
交換樹脂や活性炭によるクロマトグラフィー法などの分
離精製法が用いられる。
【００１１】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく
説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１２】実施例１ (１)バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＢＭ
１０ ３２株からのナリジ キシン酸耐性株の誘導 バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＢＭ１０
３２（ＩＦＯ １４５５９，ＦＥＲＭ ＢＰ−１２４
２）を５０mlの２×ＴＹ培地（１６ｇ／リットルバクト
トリプトン、１０ｇ／リットル酵母エキス、５ｇ／リッ
トル塩化ナトリウム）に接種し、３７℃で１夜培養し
た。集菌後、２mlの２×ＴＹ培地に懸濁し、５０μg／m
lのナリジキシン酸ナトリウムを含む２×ＴＹ寒天培地
に塗布し、生育してきたナリジキシン酸耐性株中より、
バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＢＭ１０
３２ＮＡＬ株を取得した。 (２)バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＢＭ
１０ ３２ＮＡＬ株の染色 体ＤＮＡの抽出 バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＢＭ１０
３２ＮＡＬ株を４０mlの２５μg／mlのナリジキシン酸
ナトリウムを含む２×ＴＹ寒天培地に接種して、３７℃
で１夜培養し、フェノールを用いる染色体ＤＮＡ抽出法
によって５mgの染色体ＤＮＡを得た。
１０ ３２株からのナリジ キシン酸耐性株の誘導 バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＢＭ１０
３２（ＩＦＯ １４５５９，ＦＥＲＭ ＢＰ−１２４
２）を５０mlの２×ＴＹ培地（１６ｇ／リットルバクト
トリプトン、１０ｇ／リットル酵母エキス、５ｇ／リッ
トル塩化ナトリウム）に接種し、３７℃で１夜培養し
た。集菌後、２mlの２×ＴＹ培地に懸濁し、５０μg／m
lのナリジキシン酸ナトリウムを含む２×ＴＹ寒天培地
に塗布し、生育してきたナリジキシン酸耐性株中より、
バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＢＭ１０
３２ＮＡＬ株を取得した。 (２)バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＢＭ
１０ ３２ＮＡＬ株の染色 体ＤＮＡの抽出 バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＢＭ１０
３２ＮＡＬ株を４０mlの２５μg／mlのナリジキシン酸
ナトリウムを含む２×ＴＹ寒天培地に接種して、３７℃
で１夜培養し、フェノールを用いる染色体ＤＮＡ抽出法
によって５mgの染色体ＤＮＡを得た。
【００１３】実施例２ (１)イノシン・グアノシン生産菌バチルス・ズブチリス
（Bacillus subtilis） ＮＡ６１２８株の形質転換 バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＢＭ１０
３２ＮＡＬ株の染色体ＤＮＡ（１０μg）で、シイ・ア
ナグノストポウロス アンド ジェイ・スピツァイツェ
ン（C. Anagnostopoulos and J. Spizizen）の方法〔ジ
ャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol.,
８１，７４１（１９６１）〕に従ってバチルス・ズブチ
リス（Bacillus subtilis）ＮＡ６１２８（ＩＦＯ １
４３７３，ＦＥＲＭ ＢＰ−６１７）株を形質転換後、
２５μg／mlのナリジキシン酸ナト リウムを含む２×Ｔ
Ｙ培地に塗布し、生育してきたナリジキシン酸耐性株中
よりバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＮＡ
−６３０１（ＩＦＯ １５２ ２５，ＦＥＲＭ ＢＰ−
３５７６）を取得した。 (２)バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＮＡ
６３ ０１株のイノシンの 生産性 表１に示す種培地２０mlを含む２００ml容三角フラスコ
に、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＮＡ
６３０１の一白金耳を接種し、３７℃で１８時間振盪
し、その１mlを〔表１〕に示す主発酵培地２０mlを含む
２００ml容ヒダ付三角フラスコに接種し、回転式振盪機
上で３７℃にて８４時間培養した。
（Bacillus subtilis） ＮＡ６１２８株の形質転換 バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＢＭ１０
３２ＮＡＬ株の染色体ＤＮＡ（１０μg）で、シイ・ア
ナグノストポウロス アンド ジェイ・スピツァイツェ
ン（C. Anagnostopoulos and J. Spizizen）の方法〔ジ
ャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol.,
８１，７４１（１９６１）〕に従ってバチルス・ズブチ
リス（Bacillus subtilis）ＮＡ６１２８（ＩＦＯ １
４３７３，ＦＥＲＭ ＢＰ−６１７）株を形質転換後、
２５μg／mlのナリジキシン酸ナト リウムを含む２×Ｔ
Ｙ培地に塗布し、生育してきたナリジキシン酸耐性株中
よりバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＮＡ
−６３０１（ＩＦＯ １５２ ２５，ＦＥＲＭ ＢＰ−
３５７６）を取得した。 (２)バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＮＡ
６３ ０１株のイノシンの 生産性 表１に示す種培地２０mlを含む２００ml容三角フラスコ
に、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＮＡ
６３０１の一白金耳を接種し、３７℃で１８時間振盪
し、その１mlを〔表１〕に示す主発酵培地２０mlを含む
２００ml容ヒダ付三角フラスコに接種し、回転式振盪機
上で３７℃にて８４時間培養した。
【表１】 ────────────────────────────── 培 地 成 分 種 培 地 主発酵培地 （ｇ／リットル） ────────────────────────────── グルコース ３０ １２０ グルタミン酸ソーダ １０ １０ 硫酸アンモニウム − ２０ 尿 酸 ３ １０ コーンスティープリカー ２０ ２０ 硫酸マグネシウム ２ ２ アデニン ０.２ ０.０７５ リン酸１水素２カリウム ２１ − 塩化カリウム − ０.５ 塩化カルシウム ２ ５ 硫酸マンガン − ０.００２５ 炭酸カルシウム − ３０ （pＨ） （７.０） （６.８） ────────────────────────────── 培養終了後のイノシンおよびグアノシンの蓄積量を高速
液体クロマトグラフィーで定量したところ、２７.０mg
／mlのイノシンと３.０mg／mlのグアノシンの蓄積が認
められた。一方、親株のバチルス・ズブチリス（Bacill
us subtilis）ＮＡ６１２８株を同様の方法で培養した
ところ、２２.０mg／mlのイノシンと８.０mg／mlのグア
ノシンを蓄積したにすぎなかった。
液体クロマトグラフィーで定量したところ、２７.０mg
／mlのイノシンと３.０mg／mlのグアノシンの蓄積が認
められた。一方、親株のバチルス・ズブチリス（Bacill
us subtilis）ＮＡ６１２８株を同様の方法で培養した
ところ、２２.０mg／mlのイノシンと８.０mg／mlのグア
ノシンを蓄積したにすぎなかった。
【００１４】
【発明の効果】本発明によれば呈味性物質として重要な
５'−イノシン酸の原料であるイノシンの蓄積比率を高
め、収率よく製造することができる。すなわち、イノシ
ンおよびグアノシン、またはイノシンおよびキサントシ
ン、あるいはグアノシンかキサントシンだけを生産する
能力を有するバチルス属菌を受容菌として、グアノシン
生産能の低い菌株由来のＤＮＡを用いて形質転換するこ
とにより、イノシン生産能が高くなった新規微生物を造
成することができる。これは例えば、育種によって生産
能が高められた菌がグアノシンを副生した時に、形質転
換法によってグアノシン副生を抑え、イノシンの蓄積量
を一層向上させることができることを意味する。
５'−イノシン酸の原料であるイノシンの蓄積比率を高
め、収率よく製造することができる。すなわち、イノシ
ンおよびグアノシン、またはイノシンおよびキサントシ
ン、あるいはグアノシンかキサントシンだけを生産する
能力を有するバチルス属菌を受容菌として、グアノシン
生産能の低い菌株由来のＤＮＡを用いて形質転換するこ
とにより、イノシン生産能が高くなった新規微生物を造
成することができる。これは例えば、育種によって生産
能が高められた菌がグアノシンを副生した時に、形質転
換法によってグアノシン副生を抑え、イノシンの蓄積量
を一層向上させることができることを意味する。
Claims (2)
- 【請求項１】バチルス属に属しグアノシン、キサントシ
ン、イノシンとグアノシンまたはイノシンとキサントシ
ンを生産する能力を有しかつアデニン要求性である微生
物を、微生物由来のＤＮＡジャイレース阻害剤耐性遺伝
子およびＩＭＰデヒドロゲナーゼ低発現性遺伝子をコー
ドするＤＮＡにより形質転換した微生物。 - 【請求項２】請求項１記載の微生物を培地に培養し、培
養物中にイノシンを生成蓄積せしめ、これを採取するこ
とを特徴とするイノシンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24881391A JPH0584067A (ja) | 1991-09-27 | 1991-09-27 | 発酵法によるイノシンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24881391A JPH0584067A (ja) | 1991-09-27 | 1991-09-27 | 発酵法によるイノシンの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0584067A true JPH0584067A (ja) | 1993-04-06 |
Family
ID=17183792
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24881391A Withdrawn JPH0584067A (ja) | 1991-09-27 | 1991-09-27 | 発酵法によるイノシンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0584067A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1700910A2 (en) | 2005-03-10 | 2006-09-13 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing Bacillus and a method for producing purine-derived substance therewith |
| WO2007125783A1 (ja) | 2006-04-24 | 2007-11-08 | Ajinomoto Co., Inc. | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| WO2007125782A1 (ja) | 2006-04-24 | 2007-11-08 | Ajinomoto Co., Inc. | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| WO2011083859A1 (ja) * | 2010-01-08 | 2011-07-14 | 協和発酵バイオ株式会社 | Ｌ－グルタミンまたはｌ－グルタミン酸の製造法 |
| US8034767B2 (en) | 2006-12-22 | 2011-10-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using a bacterium belonging to the genus Escherichia or Bacillus |
| US9012182B2 (en) | 2004-03-31 | 2015-04-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using bacterium belonging to the genus Bacillus or Escherichia |
-
1991
- 1991-09-27 JP JP24881391A patent/JPH0584067A/ja not_active Withdrawn
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9012182B2 (en) | 2004-03-31 | 2015-04-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using bacterium belonging to the genus Bacillus or Escherichia |
| EP1700910A2 (en) | 2005-03-10 | 2006-09-13 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing Bacillus and a method for producing purine-derived substance therewith |
| US7326546B2 (en) | 2005-03-10 | 2008-02-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance |
| US8298791B2 (en) | 2005-03-10 | 2012-10-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance |
| WO2007125783A1 (ja) | 2006-04-24 | 2007-11-08 | Ajinomoto Co., Inc. | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| WO2007125782A1 (ja) | 2006-04-24 | 2007-11-08 | Ajinomoto Co., Inc. | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| US8236531B2 (en) | 2006-04-24 | 2012-08-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing a purine-derived substance |
| US8409563B2 (en) | 2006-04-24 | 2013-04-02 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing a purine-derived substance |
| US8034767B2 (en) | 2006-12-22 | 2011-10-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using a bacterium belonging to the genus Escherichia or Bacillus |
| WO2011083859A1 (ja) * | 2010-01-08 | 2011-07-14 | 協和発酵バイオ株式会社 | Ｌ－グルタミンまたはｌ－グルタミン酸の製造法 |
| US8703447B2 (en) | 2010-01-08 | 2014-04-22 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Process for production of L-glutamine or L-glutamic acid |
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