JPS59130181A - アンスラニル酸耐性微生物並びにその取得法及びそれを用いたｌ−トリプトフアンの製造法 - Google Patents
アンスラニル酸耐性微生物並びにその取得法及びそれを用いたｌ−トリプトフアンの製造法Info
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- JPS59130181A JPS59130181A JP164683A JP164683A JPS59130181A JP S59130181 A JPS59130181 A JP S59130181A JP 164683 A JP164683 A JP 164683A JP 164683 A JP164683 A JP 164683A JP S59130181 A JPS59130181 A JP S59130181A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はアンスラニル酸耐性でＬ−トリプトファン生産
能を有する微生物並びに当該微生物の取得法及び当該微
生物を用いたし一トリプトファンの製造法に関する。
能を有する微生物並びに当該微生物の取得法及び当該微
生物を用いたし一トリプトファンの製造法に関する。
Ｌ−１−リブトファンは必須アミノ酸として重要な化合
物であり、特に栄養学的に不足しやすい物質であるため
その経済的な工業的製造法の開発が強く望まれている。
物であり、特に栄養学的に不足しやすい物質であるため
その経済的な工業的製造法の開発が強く望まれている。
かかる観点から従来様々の化学的又は微生物学的合成方
法が提唱されている。
法が提唱されている。
そのような１．−トリプトファンの合成方法の一例とし
て微生物を用いてアンスラニル酸からＬ−１−リブトフ
ァンを製造する方法が知られている。しかしながら、こ
の場合に比較的多量のアンスラニル酸を培養物中に添加
すると１−一トリプトファンの生合成が阻害されるため
高濃度のＬ −１−リプトファン含有培養液を得ること
が困難であり、実用化の障害となっていた。このような
問題を解決するためにアンスラニル酸耐性の微生物を用
いるＩ。
て微生物を用いてアンスラニル酸からＬ−１−リブトフ
ァンを製造する方法が知られている。しかしながら、こ
の場合に比較的多量のアンスラニル酸を培養物中に添加
すると１−一トリプトファンの生合成が阻害されるため
高濃度のＬ −１−リプトファン含有培養液を得ること
が困難であり、実用化の障害となっていた。このような
問題を解決するためにアンスラニル酸耐性の微生物を用
いるＩ。
−トリプトファンの製造法が開発されている（例えば特
公昭５３−３５１５２号公報参照）。
公昭５３−３５１５２号公報参照）。
本発明者等もかかるし−（・リプトファンの微生物学的
製造法の現状に鑑み、高濃度のアンスラニル酸を含む培
地において高濃度のし一トリプトファン培養液を製造す
ることのできる微生物をｆｌるべく鋭意研究を進め、ア
ンスラニル酸によるＬ −トリプトファン生産菌の阻害
現象が菌の生育阻害とＬ−トリプトファン生産能阻害の
二つの現象を包含していることを見出し、本発明をする
に至った。
製造法の現状に鑑み、高濃度のアンスラニル酸を含む培
地において高濃度のし一トリプトファン培養液を製造す
ることのできる微生物をｆｌるべく鋭意研究を進め、ア
ンスラニル酸によるＬ −トリプトファン生産菌の阻害
現象が菌の生育阻害とＬ−トリプトファン生産能阻害の
二つの現象を包含していることを見出し、本発明をする
に至った。
即ぢ、本発明に従えば、アンスラニル酸に耐性を有し、
かつＬ−）リプトファン生産能を有するバチルス・アミ
ロリクイファシェンス５Ｄ−３１が提供される。
かつＬ−）リプトファン生産能を有するバチルス・アミ
ロリクイファシェンス５Ｄ−３１が提供される。
本発明に従えば、また、（ｉ）バチルス・アミロリクイ
ファシェンスに属するＬ−）リプトファン生産能を有す
る微生物を人工突然変異誘発処理し、（ｉｉ）次いで得
られた変異処理微生物を５−フルオロトリプトファンを
添加した培地で生育せしめ、（市）生育した５−フルオ
ロトリプトファン耐性を有する微生物からし一トリプト
ファン生産性の高い微生物を選択し、（ｉｖ）このＬ
−） ＩＪブトファン高生産性微生物を再び人工突然変
異誘発処理し、（ｖ）得られた変異処理微生物を、Ｉ。
ファシェンスに属するＬ−）リプトファン生産能を有す
る微生物を人工突然変異誘発処理し、（ｉｉ）次いで得
られた変異処理微生物を５−フルオロトリプトファンを
添加した培地で生育せしめ、（市）生育した５−フルオ
ロトリプトファン耐性を有する微生物からし一トリプト
ファン生産性の高い微生物を選択し、（ｉｖ）このＬ
−） ＩＪブトファン高生産性微生物を再び人工突然変
異誘発処理し、（ｖ）得られた変異処理微生物を、Ｉ。
−トリプトファン要求性微生物と共に、アンスラニル酸
を含有するがＬ−）リブトファンを含まない培地で生育
せしめ、そして（ｖｉ）Ｌ−トリプトファン要求性微生
物の大きなハローを形成する該変異処理微生物のコロニ
ーからＬ−）リブトファン生産能の高い微生物を選択す
ることから成るアンスラニル酸耐性微生物、バチルス・
アミロリクイファシェンス５Ｄ−３１の取得法が提供さ
れる。
を含有するがＬ−）リブトファンを含まない培地で生育
せしめ、そして（ｖｉ）Ｌ−トリプトファン要求性微生
物の大きなハローを形成する該変異処理微生物のコロニ
ーからＬ−）リブトファン生産能の高い微生物を選択す
ることから成るアンスラニル酸耐性微生物、バチルス・
アミロリクイファシェンス５Ｄ−３１の取得法が提供さ
れる。
本発明に従えば、更に、アンスラニル酸に耐性を有しか
つＬ−）リプトファン生産能を有するノ＼チルス・アミ
ロリクイファシェンス５Ｄ−３１をアンスラニル酸又は
その塩を添加した培地で培養して培養物中にＬ−）リプ
トファンを生成せしめ、これを採取することから成るし
一トリプトファンの製造法が提供される。
つＬ−）リプトファン生産能を有するノ＼チルス・アミ
ロリクイファシェンス５Ｄ−３１をアンスラニル酸又は
その塩を添加した培地で培養して培養物中にＬ−）リプ
トファンを生成せしめ、これを採取することから成るし
一トリプトファンの製造法が提供される。
本発明者等はＬ−）リブトファン生産能を有する原株バ
チルス・アミロリクイファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ） Ｉ ＡＭ
Ｌ ５２１ヲ雷法に従ってＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いて人工突然
変異誘発処理し、この変異処理株を５−フルオロ１リプ
トフアン（５−Ｆ Ｔ’）を添加した培地で生育させて
生育した数百のコロニーについてそれぞれＬ−１−リプ
トファンの生産性を調べ、最もＬ−１〜リプトファン生
産能の高い５−ＦＴ耐性（即ち、トリプトファン濃度の
蓄積による微生物固有のフィードハック抑制機構を解除
した）菌株５Ｄ−３０を得た。この菌株５Ｄ−３０につ
いてそのアンスラニル酸による阻害現象を検討したとこ
ろ、第１図及び第２図に示すような結果を得た。
チルス・アミロリクイファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ） Ｉ ＡＭ
Ｌ ５２１ヲ雷法に従ってＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いて人工突然
変異誘発処理し、この変異処理株を５−フルオロ１リプ
トフアン（５−Ｆ Ｔ’）を添加した培地で生育させて
生育した数百のコロニーについてそれぞれＬ−１−リプ
トファンの生産性を調べ、最もＬ−１〜リプトファン生
産能の高い５−ＦＴ耐性（即ち、トリプトファン濃度の
蓄積による微生物固有のフィードハック抑制機構を解除
した）菌株５Ｄ−３０を得た。この菌株５Ｄ−３０につ
いてそのアンスラニル酸による阻害現象を検討したとこ
ろ、第１図及び第２図に示すような結果を得た。
第１図は、上記菌株５Ｄ−３０を栄養寒天斜面培地で３
５°Ｃで１６時間培養し、滅菌水１０ｍｆｆ ’を
斜面培地に入れ、菌体を懸濁し、アンスラニル酸を０．
５００，１０００．２０００及び５０００ｐｐｍ含む下
記組成の培地１００ｍｌ１を入れた５００ｍ１容三角フ
ラスコに菌体懸濁液を１．５ｍβずつ接種し、３５°Ｃ
で振盪培養を行ってＯＤ ６６０ｍμの値を一定時間毎
にサンプリングして測定した結果を示すグラフ図である
。
５°Ｃで１６時間培養し、滅菌水１０ｍｆｆ ’を
斜面培地に入れ、菌体を懸濁し、アンスラニル酸を０．
５００，１０００．２０００及び５０００ｐｐｍ含む下
記組成の培地１００ｍｌ１を入れた５００ｍ１容三角フ
ラスコに菌体懸濁液を１．５ｍβずつ接種し、３５°Ｃ
で振盪培養を行ってＯＤ ６６０ｍμの値を一定時間毎
にサンプリングして測定した結果を示すグラフ図である
。
培地組成
ブドウ糖５０ｇ、硫安５０■、Ｋ、ＨＰ ｏ４２．１ｇ
−ＫＨ２ＰＯ４１，５ｇ１Ｎａ２ＳＯ４２ｇ、、Ｍｎ
ＳＯ４・４〜６Ｈ２０２ｍｇ、、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０
５ｍｇ、Ｍ ｇ Ｓ ｏ４・７ Ｈ２Ｏ０，４ｇ、尿素
１ｇ（別滅菌）及び脱イオン水１β、ｐＨ６，８〜７．
０゜第１図の結果から初発アンスラニル酸濃度を上げて
いくと生育が遅れ、濃度２０００及び５０００ｐｐｍで
は生育が完全に抑制されていることが明らかである。
−ＫＨ２ＰＯ４１，５ｇ１Ｎａ２ＳＯ４２ｇ、、Ｍｎ
ＳＯ４・４〜６Ｈ２０２ｍｇ、、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０
５ｍｇ、Ｍ ｇ Ｓ ｏ４・７ Ｈ２Ｏ０，４ｇ、尿素
１ｇ（別滅菌）及び脱イオン水１β、ｐＨ６，８〜７．
０゜第１図の結果から初発アンスラニル酸濃度を上げて
いくと生育が遅れ、濃度２０００及び５０００ｐｐｍで
は生育が完全に抑制されていることが明らかである。
第２図は、上記菌株５Ｄ−３０を後述の例２と同様に５
βの培養槽で培養し、培養液のＯＤ ６６０ｍμが１０
を越えたところでアンスラニル酸すトリウム溶液を２０
０ ＰＰｍ前後になるように培養液に添加し、直ちに培
養液を約ＩＱｍｆｆ採取し、沸騰水中に３分間浸し、酵
素反応を停止し、直ちに水冷し、遠心分離（１００ＯＯ
Ｇ、５分）を行なって上清をとり、液体クロマトグラフ
ィーによりアンスラニル酸とトリプトファンの定量を行
なった結果を示す。以後、経時的に培養槽から培養液を
採取し、同様に操作し残存アンスラニル酸及び生成トリ
プトファンを定量した。
βの培養槽で培養し、培養液のＯＤ ６６０ｍμが１０
を越えたところでアンスラニル酸すトリウム溶液を２０
０ ＰＰｍ前後になるように培養液に添加し、直ちに培
養液を約ＩＱｍｆｆ採取し、沸騰水中に３分間浸し、酵
素反応を停止し、直ちに水冷し、遠心分離（１００ＯＯ
Ｇ、５分）を行なって上清をとり、液体クロマトグラフ
ィーによりアンスラニル酸とトリプトファンの定量を行
なった結果を示す。以後、経時的に培養槽から培養液を
採取し、同様に操作し残存アンスラニル酸及び生成トリ
プトファンを定量した。
第２図の結果から明らかなように、アンスラニル酸の減
少速度及び＋−リプトファンの生成速度は時間と共に速
くなっている。一般に酵素の反応速度は基質濃度に比例
するが、基質による酵素反応阻害のある場合には基質濃
度（アンスラニル酸濃度）が低下すると、反応速度（ア
ンスラニル酸減少速度又はトリプトファン生成速度）は
増加することが知られており、第２図の結果は゛菌株５
Ｄ−３０がアンスラニル酸によって阻害されていること
を明らかに示している。
少速度及び＋−リプトファンの生成速度は時間と共に速
くなっている。一般に酵素の反応速度は基質濃度に比例
するが、基質による酵素反応阻害のある場合には基質濃
度（アンスラニル酸濃度）が低下すると、反応速度（ア
ンスラニル酸減少速度又はトリプトファン生成速度）は
増加することが知られており、第２図の結果は゛菌株５
Ｄ−３０がアンスラニル酸によって阻害されていること
を明らかに示している。
上記第１図及び第２図に示した結果から明らかなように
、菌株５Ｄ−３０の生育阻害は１００１０００ｐｐ■／
ｍβ）より高いアンスラニル酸濃度で起きているが、ト
リプトファンの生合成能書は略１００ ｐｐｍ以下の極
めて低い濃度で起きている。
、菌株５Ｄ−３０の生育阻害は１００１０００ｐｐ■／
ｍβ）より高いアンスラニル酸濃度で起きているが、ト
リプトファンの生合成能書は略１００ ｐｐｍ以下の極
めて低い濃度で起きている。
従って、アンスラニル酸による生育阻害とトリプトファ
ンの生育阻害とは全く別の現象であり、アンスラニル酸
によるトリプトファンの合成阻害現象を解除することは
アンスラニル酸を前駆体とするトリプトファン発酵にと
っては極めて好ましいことといえる。
ンの生育阻害とは全く別の現象であり、アンスラニル酸
によるトリプトファンの合成阻害現象を解除することは
アンスラニル酸を前駆体とするトリプトファン発酵にと
っては極めて好ましいことといえる。
本発明者等は、かかる観点から、前記のようにして選択
した５ −Ｆ ’Ｆ耐性の菌株５Ｄ−３０からアンスラ
ニル酸によるトリプトファンの合成阻害現象を解除した
新菌株を以下のようにして選択した。即ち、菌株５Ｄ−
３０をＮＴＧを用いて再度人工突然変異処理を実施し、
１０３個／ｍ４前後になるように滅菌水で稀釈し、−こ
の最終稀釈液にトリプトファン要求性菌として公知のバ
チルス・ズフ゛チルス−１６８を１０１固／ｍ７！にな
るように添加した。次にアンスラニル酸１０００ ｐｐ
ｍを含有するスピザイイン（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ）寒天の
３０ Ｘ ４．０（ｃｍｌ）の平板培地にバチルス・ズ
ブチルス−１６８を含む変異処理菌稀釈液を１〜２ｍｐ
塗布した。
した５ −Ｆ ’Ｆ耐性の菌株５Ｄ−３０からアンスラ
ニル酸によるトリプトファンの合成阻害現象を解除した
新菌株を以下のようにして選択した。即ち、菌株５Ｄ−
３０をＮＴＧを用いて再度人工突然変異処理を実施し、
１０３個／ｍ４前後になるように滅菌水で稀釈し、−こ
の最終稀釈液にトリプトファン要求性菌として公知のバ
チルス・ズフ゛チルス−１６８を１０１固／ｍ７！にな
るように添加した。次にアンスラニル酸１０００ ｐｐ
ｍを含有するスピザイイン（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ）寒天の
３０ Ｘ ４．０（ｃｍｌ）の平板培地にバチルス・ズ
ブチルス−１６８を含む変異処理菌稀釈液を１〜２ｍｐ
塗布した。
３５℃で４８時間培養後に寒天平板上にコロニーが出現
し、トリプトファン生産能に応じてコロニーの周囲にバ
チルス・ズブチルス−１６８が無数に生育し、ハロー（
生育円）を形成した。３００枚の平板培地からハローの
大きいトリゾ１へファン生産能の高い変異株を拾い純粋
分離し、液体培地の振盪培養によりトリプトファン生産
能を調べ、最も生産性の高い新菌株５Ｄ−３１を選択し
た。
し、トリプトファン生産能に応じてコロニーの周囲にバ
チルス・ズブチルス−１６８が無数に生育し、ハロー（
生育円）を形成した。３００枚の平板培地からハローの
大きいトリゾ１へファン生産能の高い変異株を拾い純粋
分離し、液体培地の振盪培養によりトリプトファン生産
能を調べ、最も生産性の高い新菌株５Ｄ−３１を選択し
た。
この菌株は昭和５７年１２月１７日に工業技術院微生物
工業技術研究所に微工研菌寄第６８４０号として寄託し
た。
工業技術研究所に微工研菌寄第６８４０号として寄託し
た。
この菌の菌学的性質は原株バチルス・アミロリクイファ
シェンスＩＡＭ１５２１とアンスラニル酸によるし一ト
リプトファンの合成阻害作用及び５−ＦＴ耐性の点で相
違する以外は原株の菌学的性質と同じであった。
シェンスＩＡＭ１５２１とアンスラニル酸によるし一ト
リプトファンの合成阻害作用及び５−ＦＴ耐性の点で相
違する以外は原株の菌学的性質と同じであった。
本発明に従ってＬ−）リブＩ・ファンを製造するには、
バチルス・アミロリクイファシェンス５Ｄ−３１をアン
スラニル酸又はその塩を添加した培地中で培養すること
により実施する。栄養培地中のアンスラニル酸又はその
塩の濃度には特に限定はないが、目的Ｌ−トリプトファ
ンの収量、培養条件及び経済的観点から一般には０．１
〜１０００■／β、好ましくは５０〜３００■／βの濃
度とする。
バチルス・アミロリクイファシェンス５Ｄ−３１をアン
スラニル酸又はその塩を添加した培地中で培養すること
により実施する。栄養培地中のアンスラニル酸又はその
塩の濃度には特に限定はないが、目的Ｌ−トリプトファ
ンの収量、培養条件及び経済的観点から一般には０．１
〜１０００■／β、好ましくは５０〜３００■／βの濃
度とする。
本発明方法において使用することのできる培地としては
、゛前記微生物が培養により増殖し得るものであれば任
意のものでよく、例えば炭素源としてはブドウ糖、糖蜜
、蔗糖、デン粉、デン粉糖化液、セルロース分解物など
の糖類、酢酸、エタノール等が用いられる。窒素源とし
てはアンモニア、硫安、塩安、硝安、燐安などのアンモ
ニウム塩や尿素、硝酸塩等が適宜用いられる。無機塩と
しては燐酸、カリウム、マグネシウム、マンガン等の塩
類、例えば燐酸アンモニウム、燐酸カリ、燐酸ソーダ、
硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、苛性カ
リ等の通常の工業用薬品で良く、他に微量元素としてカ
ルシウム、亜鉛、硼素、銅、コバルト、モリブデン等の
塩類を加えても良い。
、゛前記微生物が培養により増殖し得るものであれば任
意のものでよく、例えば炭素源としてはブドウ糖、糖蜜
、蔗糖、デン粉、デン粉糖化液、セルロース分解物など
の糖類、酢酸、エタノール等が用いられる。窒素源とし
てはアンモニア、硫安、塩安、硝安、燐安などのアンモ
ニウム塩や尿素、硝酸塩等が適宜用いられる。無機塩と
しては燐酸、カリウム、マグネシウム、マンガン等の塩
類、例えば燐酸アンモニウム、燐酸カリ、燐酸ソーダ、
硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、苛性カ
リ等の通常の工業用薬品で良く、他に微量元素としてカ
ルシウム、亜鉛、硼素、銅、コバルト、モリブデン等の
塩類を加えても良い。
また微量有機栄養素としてビタミン、アミノ酸、核酸関
連物質等は菌の生育」二ば特別に必要とするものではな
いが、これらを添加したり、コーンスヂープリカー、肉
エキス、酵母エキス、ペプトン等の有機物を加えても良
い。アントラニル酸はソーダー塩、カリウム塩、アンモ
ニウム塩の水’／８１（νや遊！ｉ１１を酸のエヂルア
ルコールまたメチルアルコール／８液として添加すれば
良い。
連物質等は菌の生育」二ば特別に必要とするものではな
いが、これらを添加したり、コーンスヂープリカー、肉
エキス、酵母エキス、ペプトン等の有機物を加えても良
い。アントラニル酸はソーダー塩、カリウム塩、アンモ
ニウム塩の水’／８１（νや遊！ｉ１１を酸のエヂルア
ルコールまたメチルアルコール／８液として添加すれば
良い。
本発明方法における培養は好気的条件下に、例えば通気
ＩＷ拌や往復振盪方法によって培養することができる。
ＩＷ拌や往復振盪方法によって培養することができる。
培養条件は、特に限定はないが、一般的に言えば、温度
３０〜４０℃、ｐＨ６，０〜８．０及び１８〜７２時間
程度の条件で実施する。
３０〜４０℃、ｐＨ６，０〜８．０及び１８〜７２時間
程度の条件で実施する。
培＃液又は培養物からの目的のＬ−１−リプトファンの
採取方法は慣用方法に従って行うことかできる。例えば
、遠心分離により菌体部を除いた培養液上清からイオン
交換樹脂処理法、活性炭処理法等の操作を適宜組み合せ
てＩ、−１−リプトファンを、ｉｍ晶析することができ
る。
採取方法は慣用方法に従って行うことかできる。例えば
、遠心分離により菌体部を除いた培養液上清からイオン
交換樹脂処理法、活性炭処理法等の操作を適宜組み合せ
てＩ、−１−リプトファンを、ｉｍ晶析することができ
る。
本発明に従えば、
（１）培養開始前に培地中にアンスラニル酸を添加した
状態で菌株を接種できる、 （２）大量培養時に発酵槽内での添加アンスラニル酸の
濃度分布が局在することがあっても菌は影響を受りない
、 （３）アンスラニル酸感受性菌では、アンスラニル酸の
供給時に過供給を避けるためにアンスラニル酸供給不足
になる場合もあるが、耐生菌の場合には常に過供給培養
を行うことが可能であるためアンスラニル酸の供給不足
を解消することができる、 という優れた効果を達成することができる。
状態で菌株を接種できる、 （２）大量培養時に発酵槽内での添加アンスラニル酸の
濃度分布が局在することがあっても菌は影響を受りない
、 （３）アンスラニル酸感受性菌では、アンスラニル酸の
供給時に過供給を避けるためにアンスラニル酸供給不足
になる場合もあるが、耐生菌の場合には常に過供給培養
を行うことが可能であるためアンスラニル酸の供給不足
を解消することができる、 という優れた効果を達成することができる。
以下に本発明の詳細な説明するが、本発明の範囲をこれ
らの実施例に限定するものでないことはいうまでもない
。
らの実施例に限定するものでないことはいうまでもない
。
例１ （菌の培養分離例）
バチルス・アミロリクイファシェンスＩＡＭ１５２１を
常法に従ってＮ−メチル−Ｎ′−二１−ローＮ−二Ｉ・
ロングアニジン（ＮＴＧ） を用いて人工突然変異誘発
処理を行い、５−フルオロ〜Ｄ Ｌ −）リプトファン
耐性をイ」与せしめて得たバチルス・アミロリクイファ
シェンス５Ｄ−３０を１００ ｐｐｍのＮＴＧを用いて
雷法通り再度人工突然変異誘発処理を行なった。処理後
、遠心分離（１００００ＧＸ５分）し、菌体部をＭ／１
００１−リス緩衝液（ｐｌ＋７．０ ）に懸濁し遠心分
離することを３回繰返し、ＮＴＧを除去し、最後に菌体
部を栄養培地に懸濁し３５℃で３時間振盪培養し、トリ
ス緩衝液（Ｍ／ １００ 、ｐｔ１７．０ ）で菌を稀
釈し、菌体濃度が約１♂＋１ｌｉｌ ／ ｍρになるよ
うにした。この稀釈液にトリゾＩ・ファン要求株である
バチルスワ ・ズブチリス−１６８を１０（ｆｌｉｔ／ｍ＃程度にな
るように加えた。
常法に従ってＮ−メチル−Ｎ′−二１−ローＮ−二Ｉ・
ロングアニジン（ＮＴＧ） を用いて人工突然変異誘発
処理を行い、５−フルオロ〜Ｄ Ｌ −）リプトファン
耐性をイ」与せしめて得たバチルス・アミロリクイファ
シェンス５Ｄ−３０を１００ ｐｐｍのＮＴＧを用いて
雷法通り再度人工突然変異誘発処理を行なった。処理後
、遠心分離（１００００ＧＸ５分）し、菌体部をＭ／１
００１−リス緩衝液（ｐｌ＋７．０ ）に懸濁し遠心分
離することを３回繰返し、ＮＴＧを除去し、最後に菌体
部を栄養培地に懸濁し３５℃で３時間振盪培養し、トリ
ス緩衝液（Ｍ／ １００ 、ｐｔ１７．０ ）で菌を稀
釈し、菌体濃度が約１♂＋１ｌｉｌ ／ ｍρになるよ
うにした。この稀釈液にトリゾＩ・ファン要求株である
バチルスワ ・ズブチリス−１６８を１０（ｆｌｉｔ／ｍ＃程度にな
るように加えた。
アンスラニル酸を５００ ｐｐｍ含有するスピザイイン
寒天の平板培地（３０ｘ４０ｃＪ）に上記変異処理菌の
稀釈液１ｍβを塗布し、３５℃で４８時間放置した。４
８時間後に、生育した変異処理菌のコロニーはその周囲
にバチルス・ズブチリス１６８が無数に生育しハローを
形成した（ハ西−の大きさは変異処理菌のトリプトファ
ンの生産能に対応していると考えられる）。
寒天の平板培地（３０ｘ４０ｃＪ）に上記変異処理菌の
稀釈液１ｍβを塗布し、３５℃で４８時間放置した。４
８時間後に、生育した変異処理菌のコロニーはその周囲
にバチルス・ズブチリス１６８が無数に生育しハローを
形成した（ハ西−の大きさは変異処理菌のトリプトファ
ンの生産能に対応していると考えられる）。
３００枚の平板培地から大きいハローを形成するコロニ
ー３５４個を拾い、純粋分離し、アンスラニル酸を２０
０ ｐｐｍ含むスピザイイン培地で３５°Ｃ１２４時間
試験振盪機による振盪培養を行ない、親株バチルス・ア
ミロリクイファシェンス５Ｄ−３０と同等かあるいはそ
れ以上のｌ−リプトファンの生産性を示す１５株を得た
。
ー３５４個を拾い、純粋分離し、アンスラニル酸を２０
０ ｐｐｍ含むスピザイイン培地で３５°Ｃ１２４時間
試験振盪機による振盪培養を行ない、親株バチルス・ア
ミロリクイファシェンス５Ｄ−３０と同等かあるいはそ
れ以上のｌ−リプトファンの生産性を示す１５株を得た
。
これらの１５株についてアンスラニル酸を５００ｐｐｍ
含有するスピザイセン培地で３５°Ｃで２４時間試験管
振盪培養を行ない、同一条件で培養した親株バチルス・
アミロリクイファシェンス５Ｄ−３０と比較したところ
、トリプトファンの蓄積濃度が親株の約倍量に達する菌
株を見出し、これをバチルス・アミロリクイファシェン
ス５Ｄ−３１と命名した。
含有するスピザイセン培地で３５°Ｃで２４時間試験管
振盪培養を行ない、同一条件で培養した親株バチルス・
アミロリクイファシェンス５Ｄ−３０と比較したところ
、トリプトファンの蓄積濃度が親株の約倍量に達する菌
株を見出し、これをバチルス・アミロリクイファシェン
ス５Ｄ−３１と命名した。
スビザイイン培地
（ＮＨＪ２Ｓ０４ ２ ｇ、、に２ＨＰ ０４ １４
ｇ−Ｋ Ｈ４Ｆ ０４ ６ ｇ １クエン酸ナトリウム
・２■（２０１ｇ及び蒸留水８００ｍ１゜ これに次のものを別々に滅菌して加える。
ｇ−Ｋ Ｈ４Ｆ ０４ ６ ｇ １クエン酸ナトリウム
・２■（２０１ｇ及び蒸留水８００ｍ１゜ これに次のものを別々に滅菌して加える。
ＭｇＳＯ４−７Ｈ２００，２ｇ 蒸留水１００ｍｊ！
ブドウ糖 ５ｇ 蒸留水１００ｍβ例２（Ｌ
−）リプトファン製造例） 下記組成の液体培地２１を５ｐの培養槽に入れ、次いで
１１５℃で２０分間加熱滅菌したブイヨン培地にて３０
°Ｃで１２時間予め振盪培養したバチルス・アミロリク
イファシェンス５Ｄ−３１を上記培養槽に５％接種して
３５°Ｃで溶存酸素量を０、５ ｐｐｍ以上に保つよう
にしながら通気攪拌培養を行なった。
ブドウ糖 ５ｇ 蒸留水１００ｍβ例２（Ｌ
−）リプトファン製造例） 下記組成の液体培地２１を５ｐの培養槽に入れ、次いで
１１５℃で２０分間加熱滅菌したブイヨン培地にて３０
°Ｃで１２時間予め振盪培養したバチルス・アミロリク
イファシェンス５Ｄ−３１を上記培養槽に５％接種して
３５°Ｃで溶存酸素量を０、５ ｐｐｍ以上に保つよう
にしながら通気攪拌培養を行なった。
液体培地組成
グルコース１０％、硫安０．３％、Ｎ ａ２ＨＰ ０４
・１２Ｈ２００，５％、Ｋ Ｈ４Ｆ ｏ４ｏ、 ２％、
Ｍ ｇ Ｓ ｏ、・７Ｈ，２００，１％、ＦｅＳＯ４・
ｌＨ２Ｏ５ｐｐｍ。
・１２Ｈ２００，５％、Ｋ Ｈ４Ｆ ｏ４ｏ、 ２％、
Ｍ ｇ Ｓ ｏ、・７Ｈ，２００，１％、ＦｅＳＯ４・
ｌＨ２Ｏ５ｐｐｍ。
Ｍｎ ＳＯ４・４〜６ Ｈ２Ｏ１ｐｐｍ及びアンスラニ
ル酸３００ ｐｐｍ 培養液中のアンスラニル酸の濃度が５０ ｐｐｍ以下ま
で減少した時点から、１０％アンスラニル酸アンモニウ
ム塩溶液を、培養液中のアンスラニル酸濃度が３００
ｐｐｍ以下になるように供給速度を調節し乍ら、連続供
給した。培養途中でブドウ糖を１００ｇ追加し、アンモ
ニア水の添加で培養液のｐｌｌを７．０±０．２に保ち
つつ３０時間培養することによりＬ−１−リプトファン
が４２．９ ｇ生成した。
ル酸３００ ｐｐｍ 培養液中のアンスラニル酸の濃度が５０ ｐｐｍ以下ま
で減少した時点から、１０％アンスラニル酸アンモニウ
ム塩溶液を、培養液中のアンスラニル酸濃度が３００
ｐｐｍ以下になるように供給速度を調節し乍ら、連続供
給した。培養途中でブドウ糖を１００ｇ追加し、アンモ
ニア水の添加で培養液のｐｌｌを７．０±０．２に保ち
つつ３０時間培養することによりＬ−１−リプトファン
が４２．９ ｇ生成した。
この時のＬ −１−リプトファンの対消費糖収率は１４
．３％、対アンスラニル酸のモル収率は９８％であった
。
．３％、対アンスラニル酸のモル収率は９８％であった
。
例３ （比較例）
バチルス・アミロリクイファシェンス５Ｉ）−３０（ア
ンスラニル酸によるトリプトファン合成阻害を解除して
いない菌株）を用いて実施例２と同一条件で培養を行な
ったところ、３０時間培養することによりＬ−トリプト
ファンが２２．２ ｇ生成蓄積した。
ンスラニル酸によるトリプトファン合成阻害を解除して
いない菌株）を用いて実施例２と同一条件で培養を行な
ったところ、３０時間培養することによりＬ−トリプト
ファンが２２．２ ｇ生成蓄積した。
この時のＬ −１−リプトファンの対消費糖収率は７．
４％、対アンスラニル酸収率は８３％であった。
４％、対アンスラニル酸収率は８３％であった。
第１図ば５−ＦＴ耐性菌株５Ｄ−３０のアンスラニル酸
濃度による生育阻害又は抑制現象の経時変化を示すグラ
フ図である。 第２図は５−ＦＴ剛性菌株ＳＤ〜３０のアンスラニル酸
によるアンスラニル酸消費活性阻害及び１−リプトファ
ンの生成阻害の現象を示すグラフ図である。 □・□ 〇 −ｏ−５００ □Δ−＋０００ 一ムー２０００ 一ロー５０００ １１！Ｊ出ｊ （ｈｒン
濃度による生育阻害又は抑制現象の経時変化を示すグラ
フ図である。 第２図は５−ＦＴ剛性菌株ＳＤ〜３０のアンスラニル酸
によるアンスラニル酸消費活性阻害及び１−リプトファ
ンの生成阻害の現象を示すグラフ図である。 □・□ 〇 −ｏ−５００ □Δ−＋０００ 一ムー２０００ 一ロー５０００ １１！Ｊ出ｊ （ｈｒン
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ■、アンスラニル酸に耐性を有し、かつＬ −１−リプ
トファン生産能を有するバチルス・アミロリクイファシ
ェンス５Ｄ−３１゜ ２、 （ｉ）バチルス・アミロリクイファシェンスに
属するＬ〜トリプトファン生産能を有する微生物を人工
突然変異誘発処理し、（ｉｉ ）次いで得られた変異処
理微生物を５−フルオロトリプトファンを添加した培地
で生育せしめ、（ｉｉｉ ）生育した５−フルオロトリ
プトファン耐性を有する微生物からＬ−）リプトファン
生産性の高い微生物を選択し、（ｉｖ）このＬ−１−リ
プトノアン高生産性微生物を再び人工突然変異誘発処理
し、（ｖ）得られた変異処理微生物を、Ｌ−トップ１−
ファン要求性微生物と共に、アンスラニル酸を含有する
がＬ−トリプトファンを含まない培地で生育せしめ、そ
して（ｖｉ）ＬＬリプトファン要求性微生物の大きなハ
ローを形成する変異処理微生物のコロニーからし一トリ
プトファン生産能の高い微生物を純粋分離することを特
徴とするアンスラニル酸耐性を有しかつＬ−トリプトフ
ァン生産能を有するバチルス・アミロリクイファシェン
スＳＤ〜３１を取得する方法。 ３、アンスラニル酸に耐性を有しかつＬ〜トリプトファ
ン生産能を有するバチルス・アミロリクイファシェンス
５Ｄ−３１をアンスラニル酸又はその塩を添加した培地
で培養して培養物中にＬ−トリプトファンを生成せしめ
、これを採取することを特徴とするＬ−）リプトファン
の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP164683A JPS59130181A (ja) | 1983-01-11 | 1983-01-11 | アンスラニル酸耐性微生物並びにその取得法及びそれを用いたｌ−トリプトフアンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP164683A JPS59130181A (ja) | 1983-01-11 | 1983-01-11 | アンスラニル酸耐性微生物並びにその取得法及びそれを用いたｌ−トリプトフアンの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59130181A true JPS59130181A (ja) | 1984-07-26 |
Family
ID=11507278
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP164683A Pending JPS59130181A (ja) | 1983-01-11 | 1983-01-11 | アンスラニル酸耐性微生物並びにその取得法及びそれを用いたｌ−トリプトフアンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59130181A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100949312B1 (ko) | 2007-12-20 | 2010-03-23 | 씨제이제일제당 (주) | 안스라닐산염에 대한 내성을 갖는 대장균 균주를 이용한ｌ-트립토판 제조 방법 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5335152A (en) * | 1976-08-21 | 1978-04-01 | Lucas Industries Ltd | Electrical coil structures |
-
1983
- 1983-01-11 JP JP164683A patent/JPS59130181A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5335152A (en) * | 1976-08-21 | 1978-04-01 | Lucas Industries Ltd | Electrical coil structures |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100949312B1 (ko) | 2007-12-20 | 2010-03-23 | 씨제이제일제당 (주) | 안스라닐산염에 대한 내성을 갖는 대장균 균주를 이용한ｌ-트립토판 제조 방법 |
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