KR870001813B1

KR870001813B1 - 발효법에 의한 l-트립토판의 제조방법

Info

Publication number: KR870001813B1
Application number: KR1019850003431A
Authority: KR
Inventors: 이선복; 이인영
Original assignee: 한국과학기술원; 전학제
Priority date: 1985-05-20
Filing date: 1985-05-20
Publication date: 1987-10-13
Also published as: KR860009129A

Abstract

내용 없음.

Description

발효법에 의한 L-트립토판의 제조방법

본 발명은 대장균(Escherichina coli) 변이주(KCTC8164P)를 이용한 트립토판(L-tryptophan) 생사에 관한 것으로서 포도당 등 값싼 배양기질을 사용하여 발효법에 의해 대량의 트립토판을 생산하는 새롭고도 진보된 제조방법에 관한 것이다. 트립토판은 필수아미노산의 일종으로 식료품 및 사료 첨가제 그리고 의약용으로 그 용도가 넓은 데 비하여 그 가격이 매우 고가이기 때문에 현재는 주로 아미노산 주사제로 사용되고 있다. 그러나 트립토판은 라이신, 메치오닌과 더불어 사료첨가제로서의 효과가 매우 우수한 것으로 입증되어 경제적 제조공정이 개발되어 저렴한 가격으로 공급될 경우 그 수요가 급증될 것으로 전망되고 있다.

트립토판의 제조방법은 크게 세가지로 분류하여 화학적 합성법과 효소적 합성법 그리고 직접 발효법으로 나눌 수 있는 데 현재까지 화학합성법과 효소합성법에 의하여 트립토판이 제조되고 있다.

화학합성법은 여러가지 공법이 있으나 주로 베타-시아노프로 피온 알데히드를 출발원료로 하는 방법이 공업화되어 있다. 베타-시아노프로피온 알데히드로부터 히단토인체를 합성한 후 환원시키면 5-포로밀에칠히단토인을 얻게되는 데 이 물질을 페닐히드라진과 산존재하에 반응시키면 인돌핵을 형성하여 인도릴메칠렌히단토인을 얻게 되며 이를 알칼리에 의하여 가수분해하여 DL-트립토판을 얻고 있다. 이외에도 인돌을 출발원료로 트립토판을 합성하는 방법이 있느나 수율이 낮아 대부분 상기한 베타-시아노프로피온 알데히드를 출발원료로 사용하는 방법이 이용되고 있다. 효소합성법의 경우는 인돌과 세린을 기질로 사용하여 트립토판 신세타제를 이용하는 방법과 인돌, 암모니아 및 피루브산(pyruvic acid)을 기질로 하여 트립토판아제를 이용하는 방법이 있다. 국내에는 일본 미쓰이 도오아쓰의 효소법에 의한 L-트립토판의 제조방법이 특허공고(대한민국특허공고 83-2328)된 바 있는데 이 특허는 상기한 트립토판 신세타제 또는 트립토판아제를 사용하는 경우 DL-세린 또는 D-세린을 세린라세마제를 이용하여 D-세린의 일부를 L-세린으로 전환시켜 L-트립토판의 생성수율을 증가시킬 수 있다는 점을 특징으로 하고 있다.

상기한 화학적 합성법과 효소적 합성법은 수율은 비교적 높으나 공정상의 많은 결점이 있다. 즉, 화학적 합성법의 경우 기질이 비교적 비싸고 공정이 복잡할 뿐더러 DL-체 트립토판을 생성하게 되어 생체적으로 활성을 갖는 L-형의 트립토판을 얻기 위하여는 광학분할(optical resolution)을 해야 하는 등의 문제가 있고 효소적 합성법의 경우는 기질로 사용되는 인돌 및 세린 그리고 피루브산등이 매우 고가일 뿐아니라, 효소의 안정성등이 문제가 되고 있다.

본 발명은 이와 같은 종래에 사용되어 오던 화학적 방법 및 효소적 합성법의 결점을 해결하기 위하여 미생물 내에서의 생합성 반응을 이용 공정이 간단하고 또한 값싼 원료를 사용할 수 있는 직접 발효법에 의해서 다량의 트립토판을 생산하는 것을 특징으로 한 것이다.

실제로 미생물을 이용한 직접발효법의 경우 그 수율이 낮은 점이 문제가 되고 있는 데 본 발명에서는 이러한 문제점을 해결하여 아날로그 내성 대장균 변이주(KCTC8164P)를 이용 발효에 의해 다량의 트립토판을 제조할 수 있었다. 아날로그 내성 미생물을 이용한 트립토판의 생산은 현재까지 보고된 바로는 바실러스 서브틸리스(Agr. Biol. Chem. 37권 1991~2000 페이지(1973).) 코리네박테리움글루타미쿰(Agr. Biol. Chem. 39권 351~369페이지(1975)). 브레비박테리움 플라붐(Agr. Biol. Chem. 46권 1849~1954페이지(1982).) 등이 있으나 대장균의 경우에는 발표된 바가 없다.

본 발명에서는 대장균 변이주(KCTC8164P)를 이용하여 트립토판을 제조하였는 바, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다. 미생물 세포내에서 포도당으로부터 트립토판을 생합성 하는데는 여러단계의 효소반응을 거치며 자체적으로 정교한 제어기능을 갖고 있다. 즉, 최종산물인 트립토판 및 같은 방향족 아미노산 계열인 페닐알라닌과 타이로신에 의하여 특정단계에서 효소활성의 저해(feedback inhibition) 또는 효소 생성의 억제(feedback repression)현상이 일어난다. 이러한 제어기능을 해제하기 위하여 트립토판과 페닐알라닌 그리고 타이로신등과 그 구조가 유사한 아나로그(analogue)들을 사용한 결과 이러한 아나로그에 내성을 갖는 균주는 최종산물인 방향족 아미노산에 의한 제어 기작이 해제되어 야생균주보다 월등히 많은 양의 트립토판을 생산하였다. 변이균주를 유도하는 방법으로서는 자외선 처리기법을 사용하였으며 아날로그 물질을 포함한 선택배지에서 내성을 갖는 균주만을 분리하였다. 같은 방법으로 아날로그의 농도 및 종류를 변화시켜 여러 아날로그들에 대한 내성을 향상시킨 결과 트립토판 생산능이 더욱 향상되었다. 이때 사용한 아날로그 물질로 5-메틸 트립토판, 5-플루오로트립토판, 6-플루오로트립토판, 파라-플루오로페닐알라닌, 3-아미노 타이로신, 파라아미노 페닐알라닌, 베타-싸이에닐 알라닌, 페닐알라닌 하이드록사메이트, 아자구아닌, 술파닐 아마이드 등을 사용하였다. 한편, 전구체로서 안트라닐 산(anthranilic acid) 및 인돌을 사용해서 트립토판의 생성을 증가시키기 위하여 그에 내성을 갖는 균주를 유도하였다. 또한, 방향족 아미노산 생합성 경로상의 분기점인 코리스민산(chorismic acid) 으로 부터 트립토판으로 진행되는 생합성 양을 증가시키기 위하여 페닐알라닌과 타이로신으로 진행되는 곁가지 반응 경로를 차단시킨 영양요구성 균주(auxotroph)를 상기 기술한 아날로그에 내성을 갖는 균주로부터 유도하였다. 이러한 변이 균주(KCTC8164P)를 이용 회분석 발효시 조업 조건이 배양온도 25~50℃, pH는 4~10 그리고 통기량 1~2VVM, 교반속도 300~9000rpm 일때 30~40시간 발효후 10~15g/ℓ 의 트립토판을 축적하였다. 이때 배지에 사용되는 탄소원 및 질소원은 다음과 같다.

탄소원으로는 포도당, 과당, 유당, 글리세롤, 초산, 슈크로오스, 말토오스, 갈락토오스, 솔비톨, 만니톨, 당밀 등의 탄수화물 당류를, 질소원으로서는 염화암모늄, 황산암모늄, 탄산암모늄, 암모니아수 외에 무기 또는 유기의 암모늄염을 비롯, 효모추출물(yeast extract), 카세인 가수분해물(casamino acid 등), 펩톤, 트립톤, 옥수수 침지액(corn steep liquor)탈지 대두박 등의 천연질소 유기물질을 사용할 수 있다. 무기물질로는 인산제일수소칼륨, 인산제이수소칼륨, 황산칼륨, 황산마그네슘, 황산철, 염화칼륨, 염화철, 염화나트륨등이 사용되며 미량원소로는 붕산, 염화망간, 황산아연, 암모늄몰리브데이트 등을 사용한다.

이외에 필요에 따라 티아민, 비오틴, 파라아미노벤젠산, 피리독신, 시아노코발아민등 비타민류의 미량 첨가로 양호한 결과를 얻을 수 있다.

전술한 방법으로 배양하여 얻어진 반응생성물이 트립토판 인지를 확인하기 위하여 여지크로마토그라피로 실험한 결과 모두 표준품과 동일한 것임을 확인하였다. 이때의 사용용매는 N-부타놀, 초산, 물(4:1:2)이었으며, Rf값은 0.56이었다. 트립토판의 농도는 여지크로마토그라피방법 외에도 파라-디메칠 아미노벤조알데히드를 사용하여 620nm에서 흡광도를 측정함으로써 계산하였으며 두 방법이 일치한 결과를 나타내었다.

본 발명 방법인 대장균 변이주(KCTC 8164P)를 이용한 직접 발효법에 의한 트립토판 제조방법은 종래의 방법에 비해 다음과 같은 장점을 가지고 있다.

(1) 미생물 내의 생합성반응을 이용하기 때문에 공정이 간단하다.

(2) 상온, 상압에서 조업되기 때문에 에너지 손실이 적으며 조업이 용이하다.

(3) 주원료로 사용되는 포도당등의 가격이 매우 저렴하며 생산경비를 크게 절감시킬 수 있어 경제적 및 공업적인 트립토판 제조가 가능하다.

(4) 부산물 생성이 거의 없어 배양액으로부터의 트립토판분리 및 정제가 매우 용이하다.

(5) 생장속도가 빠른 대장균을 사용함으로써 트립토판의 생산성이 매우 높다.

본 발명의 실시에는 다음과 같다. 아래의 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 예증하여 줄 것이나 본 발명의 범위가 이에 국한된 것은 아니다.

[실시예 1]

표 1의 배지조성으로 50ml 배지를 만들어 500ml진탕용 삼각플라스크에 넣고 멸균하여 냉각시킨 후 야생종의 대장균(Escherichia coli W3110)이 동결 건조된 바이알을 깨어 넣는다. 이것을 31℃에서 350rpm으로 6시간 진탕 배양한 후에 원심분리하여 5ml의 0.85% 생리식염수로 재현탁하고 0.1M MgSO₄7ml을 첨가한 다음 2분 동안 자외선을 조사시킨 후 배지 5ml에 0.1ml씩 식균하고 18시간 배양한다. 배양액을 원심분리하여 상등액을 제거한 다음 식염수로 재현탁한 후 5-메칠트립토판을 포함한 최소배지(표 2.)의 한천평판(agar plate)에 일정량을 균일하게 부어서 배양기 안에 넣고 균체(colony)가 나타나는 것을 관찰한다.

5-메칠트립토판에 내성을 갖는 균주를 선별하여 트립토판을 생성하는 효능을 일차적으로 관찰하기 위해 발효배지(표 3.)를 포함한 시험관에 식균하고 이것을 31℃에서 350rpm으로 50시간 진탕배양한 후에 축적된 트립토판 양을 측정한다. 이때, 5-메칠트립토판 1.0g/ℓ에 내성을 갖는 우수균주는 시험관 배양에서 0.1g/ℓ의 트립토판을 축적하였다.

[표 1]

배양배지

[표 2]

최소배지

[표 3]

발효배지

^*미량원소:(NH4)6Mo7O24, 30㎛; H3BO4, 4mM

[실시예 2]

실시예 1에서 선별된 균주를 모균주로하여 실시예 1과 동일한 방법으로 5-메칠트립토판 농도 4.0g/ℓ에 내성을 갖는 균주를 선별하여 실시예 1과 동일한 방법으로 트립토판 생성효능을 관찰한 결과 시험관 배양에서 0.57g/ℓ의 트립토판을 축적하였다. 선별된 균주를 모균주로 하여 실시예 1과 동일한 방법으로 5-메칠트립토판 농도를 보다 높여 6.0g/ℓ에 내성을 갖는 균주를 선별, 시험관 배양을 한결과 모균주 보다 적은 양인 0.49g/ℓ의 트립토판을 축적하였다.

[실시예 3]

실시예 1과 동일한 방법으로 야생균주로 부터 5-플루오로 트립토판 1.0g/ℓ에 내성을 갖는 균주를 선별 시험관 배양한 결과 0.17g/ℓ의 트립토판을 축적하였다.

실시예 2와 같은 요령으로 다시 5-플루오로트립토판 농도를 2.0g/ℓ 그리고 4.0g/ℓ로 증가시켜 이에 내성을 갖는 균주를 선별, 트립토판 생성효능을 관찰한 결과 각각 0.21g/ℓ, 0.35g/ℓ의 트립토판을 축적하였다.

[실시예 4]

실시예 1과 동일한 방법으로 야생균주로부터 베타-싸이에닐 알라닌의 농도를 1.0g/ℓ, 2.0g/ℓ 그리고 4.0g/ℓ로 변화시켜서 이에 내성을 갖는 균주를 선별, 시험관 배양을 한 결과 각각 0.14g/ℓ, 0.27g/ℓ 그리고 0.19g/ℓ의 트립토판을 생성하였다.

[실시예 5]

실시예 1과 동일한 방법으로 6-플루오로트립토판, 파라-플루오로 페닐알라닌, 3-아미노타이로신, 파라-아미노 페닐알라닌, 페닐알라닌 하이드록사메이트에 내성을 갖는 균주를 야생 균주로부터 유도하였으나 야생균주가 이러한 아나로그들에 어느 정도 내성을 가지고 있었으며 유도된 아나로그 내성균주의 트립토판 생성량도 모두 0.1g/ℓ미만으로 나타났다.

[실시예 6]

실시예 2에서 선별된 0.57g/ℓ의 트립토판 축적능력을 가지고 있는 5-메칠트립토판에 내성을 갖는 균주를 모균주로 하여 베타-싸이에닐알라닌 2.0g/ℓ에 내성을 갖는 균주를 선별, 시험관 배양을 한 결과 모균주보다 낮은 0.36g/ℓ의 트립토판을 축적하였으나 이때 페닐알라닌과 타이로신은 보다 많은 양의 축적되었다. 마찬가지로 5-메칠트립토판에 내성을 갖는 균주에 다시 5-플루오로 트립토판 4.0g/ℓ에 내성을 갖는 균주를 유도한 결과 시험관 배양시 0.43g/ℓ의 트립토판을 생성하였고 이균주는 페닐알라닌과 타이로신의 생성이 적게 나타났다.

[실시예 7]

실시예 6에서 선별된 5-메칠트립토판과 5-플루오로 트립토판에 내성을 갖는 균주를 모균주로 하여 실시예 1과 동일한 방법으로 다시 베타-싸이에닐알라닌 2.0g/ℓ에 내성을 갖는 균주를 선별시험관 배양한 결과 0.76g/ℓ의 트립토판을 축적하였다.

[실시예 8]

실시예 7에서 선별된 우수 균주를 모균주로 하여 안트라닐산을 전구체로 사용시 트립토판에로의 전환을 용이하게 하기 위하여 실시예 1과 동일한 방법으로 안트라닐산 4.0g/ℓ에 내성을 갖는 균주를 선별, 시험관 배양을 한 결과 0.97g/ℓ의 트립토판을 축적하였다. 이때의 발효 배지는 표 3의 조성이외에 1g/ℓ의 안트라닐산을 첨가하여 사용하였다.

[실시예 9]

페닐알라닌 및 타이로신 생성이 억제된 영양요구성 변이균주를 아날로그 및 안트라닐산 내성을 갖는 균주로부터 유도하였는 데 실시예 8에서 얻은 균주를 실시예 1과 동일한 방법으로 배양한 후 원심분리, 재현탁하고 자외선 처리를 한 다음 페닐알라닌과 타이로신을 포함한 최소배제에 식균한 후 이를 31℃에서 350rpm으로 16시간 진탕배양 한다. 다시 원심분리, 재 현탁한 다음 앰피실린(ampicillin) 2mg/ℓ를 포함한 최소배지에서 1~2시간 배양후 후 이를 다시 원심분리 재현탁, 앰피실린 처리를 하고 이를 최종적으로 페닐알라닌과 타이로신을 포함한 안전 배지에 식균한다. 영양요구성균을 선별하기 위해 완전 배지의 한천 평판에서는 자라나 최소배지에서는 자라지 않는 균을 선별하였으며, 이렇게 선별된 균주에 의한 트립토판 생성능을 관찰하기 위해 페닐알라닌과 타이로신이 포함된 발효배지에 식균하여 실시예 1과 동일한 방법으로 시험관 배양을 하여 트립토판 생성능이 가장 우수한 변이주(KCTC8164P)를 분리하였는 바, 이 변이주는 표 3의 발효배지를 사용한 배양에서 3.2g/ℓ의 트립토판을 축적하였으며 소비된 포도당에 대한 수율은 10.4%이었다.

[실시예 10]

실시예 7에서 얻은 균주를 사용해서 회분식 발효조에서 트립토판 생산을 최적화하기 위하여 발효 조건을 변화시키면서 트립토판 생산효과를 검토하였다. 표 1의 배양배지에서 10시간 전배양(preculture)을 한 다음 표 3의 발효 배지를 포함한 발효조에 넣고 pH조절기에 의해 암모니아수를 사용하여 pH를 7.0이 되게 조절하면서 배양하였다.

발효조 내의 포도당 농도가 5g/ℓ 이하로 감소되면 미리 멸균한 30g의 포도당과 15g의 인산칼륨을 넣어 주는 페드 배치(fed-batch)식의 조업을 하였다. 배양온도 35℃, 통기량 1.3VVM, 교반속도 600~800rpm일 때 36시간 배양후 배양액중의 트립토판 농도는 시험관 배양시 보다 4배 이상 증가된 3.5g/ℓ이었다.

[실시예 11]

실시예 9에서 얻은 균주를 표 1의 배양배지 100ml을 포함한 500ml 삼각플라스크에 식균한 다음 31℃에서 350rpm으로 10시간 전배양한 배양액을 발효조 안에 집어 넣었다. 이때 발효 배지는 표 3에 배지조성 이외에 페닐알라닌과 타이로신을 각각 10mg/ℓ씩 포함하였으며 안트라닐산은 2.0g/ℓ 첨가하였다.

pH는 암모니아수를 사용하여 pH조절기에 의해서 자동적으로 7.0이 되게 하였으며 발효조 내의 포도당 농도가 5g/ℓ 이하로 감소되면 30g의 포도당과 1.5g/ℓ의 인산칼륨을 넣어주는 페드배치식의 조업을 하였다. 배양온도는 35℃, 통기량 1VVM, 교반속도 800rpm 일때 36시간 배양 후 배양액중의 트립토판의 농도는 13.6g/ℓ이었다. 이때 생산성은 0.39g/ℓ/hr이었으며 포도당 1g당 0.097g의 트립토판으로 전환되었으며 안트라닐산을 넣었을 때가 넣지않았을 때 보다 2.3g의 트립토판 생성이 증가되었고 이때 안트라닐산은 77% 전환되었다.

[실시예 12]

실시예 11과 동일한 방법으로 배양하였으며 배양 배지에 티아민, 리보플라민, 니코틴산, 판토 세닌산, 피리독신 각 4mg/ℓ와 비오틴 0.004mg/ℓ 등의 비타민류를 첨가한 결과 36시간 배양후 실시예 11의 경우 보다 트립토판 생성의 증가를 보여주었고 이때 배양액중의 트립토판 농도는 14.8g/ℓ이었다.

Claims

대장균(Escherichia coli)의 아날로그 및 전구체 내성과 영양요구성을 갖는 변이주(KCTC8164P)를 이용하여 당류 또는 전구체를 기질로 사용하는 것을 특징으로 하는 발효법에 의한 L-트립토판의 제조 방법.
제1항에 있어서, 변이주(KITC8164P)가 전구체로 사용되는 안트라닐산에 내성을 갖는 변이 균주임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 변이주(KITC8164P)가 페닐알라닌이나 타이로신 또는 페닐알라닌 및 타이로신을 요구하는 영양요구성 변이균주임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 배양온도 25~40℃, pH4~10, 통기량 1~2VVM, 교반속도 300~900rpm의 반응 조건으로 회분식 또는 페드배치식으로 발효시킴을 특징으로 하는 방법.