JPH0880198A - 光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の製造法 - Google Patents
光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の製造法Info
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- JPH0880198A JPH0880198A JP7115535A JP11553595A JPH0880198A JP H0880198 A JPH0880198 A JP H0880198A JP 7115535 A JP7115535 A JP 7115535A JP 11553595 A JP11553595 A JP 11553595A JP H0880198 A JPH0880198 A JP H0880198A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸
（以下、光学活性γＨＬＧと略す。）を工業的に有利に
製造する方法を提供する。 【構成】 アミノ基供与体存在下、ピルビン酸とグリオ
キシル酸から光学活性γＨＬＧを生成する活性を有する
生体触媒Ｉ、アミノ基供与体、ピルビン酸およびグリオ
キシル酸を水性媒体中に存在させ、生成した光学活性γ
ＨＬＧ、またはアミノ基供与体存在下、光学活性４−ヒ
ドロキシ−２−ケトグルタル酸を光学活性γＨＬＧに変
換する活性を有する生体触媒II、アミノ基供与体および
光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を水性媒
体中に存在させ、生成した光学活性γＨＬＧを該水性媒
体中より採取する光学活性γＨＬＧの製造法を提供す
る。
（以下、光学活性γＨＬＧと略す。）を工業的に有利に
製造する方法を提供する。 【構成】 アミノ基供与体存在下、ピルビン酸とグリオ
キシル酸から光学活性γＨＬＧを生成する活性を有する
生体触媒Ｉ、アミノ基供与体、ピルビン酸およびグリオ
キシル酸を水性媒体中に存在させ、生成した光学活性γ
ＨＬＧ、またはアミノ基供与体存在下、光学活性４−ヒ
ドロキシ−２−ケトグルタル酸を光学活性γＨＬＧに変
換する活性を有する生体触媒II、アミノ基供与体および
光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を水性媒
体中に存在させ、生成した光学活性γＨＬＧを該水性媒
体中より採取する光学活性γＨＬＧの製造法を提供す
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、光学活性γ−ヒドロキ
シ−Ｌ−グルタミン酸、すなわちスレオ−γ−ヒドロキ
シ−Ｌ−グルタミン酸[(2S,4S)-4-hydroxyglutamic aci
d]またはエリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸
[(2S,4R)-4-hydroxyglutamic acid]の製造法に関する。
シ−Ｌ−グルタミン酸、すなわちスレオ−γ−ヒドロキ
シ−Ｌ−グルタミン酸[(2S,4S)-4-hydroxyglutamic aci
d]またはエリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸
[(2S,4R)-4-hydroxyglutamic acid]の製造法に関する。
【０００２】光学活性−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミ
ン酸は、グルタミンシンターゼ[Khim-Farm. Zh., 18, 6
55(1984)]やシナプス前顆粒(Plesynaptic Vesicle)のグ
ルタミン酸取り込みを阻害する作用[Neurochem. Res.,
18,79(1993)]が知られており、これらの酵素や器官の研
究用試薬として有用である。また、この作用に基づく医
薬品として有用である。
ン酸は、グルタミンシンターゼ[Khim-Farm. Zh., 18, 6
55(1984)]やシナプス前顆粒(Plesynaptic Vesicle)のグ
ルタミン酸取り込みを阻害する作用[Neurochem. Res.,
18,79(1993)]が知られており、これらの酵素や器官の研
究用試薬として有用である。また、この作用に基づく医
薬品として有用である。
【０００３】
【従来の技術】従来の光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グ
ルタミン酸の製造法としては、エチル−α−アセトキシ
−β−クロロプロピオン酸とエチルアセトアミドシアン
酸から化学合成したγ−ヒドロキシグルタミン酸の４種
異性体混合物から分離する方法、ＤＬ−４−ヒドロキシ
−２−ケトグルタル酸とアンモニアにＮＡＤＰＨ存在下
哺乳動物の肝臓由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼを
作用させ合成したスレオ／エリスロ−γ−ヒドロキシ−
Ｌ−グルタミン酸の混合物から分離する方法[ バイオケ
ミ・バイオフィズ・アクタ（Biochem. Biophis. Acta.
）, 77, 133(1963)]、クサキョウチクトウ（Phlox dec
ussata）からスレオ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン
酸[(2S,4S)-4-hydroxyglutamic acid]を抽出する方法
[メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzym
ology), 17 partB, 277]、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケ
トグルタル酸とシステイン・スルフィン酸にトランスア
ミナーゼを作用させスレオ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グル
タミン酸を合成する方法[テトラヘドロン レター(Tetr
ahedron Lett.), 28, 1277 (1987)] 、Δ1-pyrroline-3
-hydroxy-5-carboxylate に牛肝臓由来のΔ1-pyrroline
dehydrogenaseを作用させて合成する方法[ジャーナル
・オブ・バイオケミストリー(J. B. C.), 235, 3504(19
60)] が知られている。
ルタミン酸の製造法としては、エチル−α−アセトキシ
−β−クロロプロピオン酸とエチルアセトアミドシアン
酸から化学合成したγ−ヒドロキシグルタミン酸の４種
異性体混合物から分離する方法、ＤＬ−４−ヒドロキシ
−２−ケトグルタル酸とアンモニアにＮＡＤＰＨ存在下
哺乳動物の肝臓由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼを
作用させ合成したスレオ／エリスロ−γ−ヒドロキシ−
Ｌ−グルタミン酸の混合物から分離する方法[ バイオケ
ミ・バイオフィズ・アクタ（Biochem. Biophis. Acta.
）, 77, 133(1963)]、クサキョウチクトウ（Phlox dec
ussata）からスレオ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン
酸[(2S,4S)-4-hydroxyglutamic acid]を抽出する方法
[メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzym
ology), 17 partB, 277]、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケ
トグルタル酸とシステイン・スルフィン酸にトランスア
ミナーゼを作用させスレオ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グル
タミン酸を合成する方法[テトラヘドロン レター(Tetr
ahedron Lett.), 28, 1277 (1987)] 、Δ1-pyrroline-3
-hydroxy-5-carboxylate に牛肝臓由来のΔ1-pyrroline
dehydrogenaseを作用させて合成する方法[ジャーナル
・オブ・バイオケミストリー(J. B. C.), 235, 3504(19
60)] が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従来の光学活性γ−ヒ
ドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の製造法は、(1) 原料が高
価である、(2) 異性体の分離工程を要し割高になる、
(3) 収量が低い、などの欠点があるため、工業的により
有利な製造法の開発が求められている。本発明の目的は
工業的に有利に光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミ
ン酸を製造する方法を提供することにある。
ドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の製造法は、(1) 原料が高
価である、(2) 異性体の分離工程を要し割高になる、
(3) 収量が低い、などの欠点があるため、工業的により
有利な製造法の開発が求められている。本発明の目的は
工業的に有利に光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミ
ン酸を製造する方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、アミノ
基供与体存在下、ピルビン酸とグリオキシル酸から光学
活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を生成する活性
を有する生体触媒（以下、生体触媒Ｉという。）、アミ
ノ基供与体、ピルビン酸およびグリオキシル酸を水性媒
体中に存在させることにより、水性媒体中に光学活性γ
−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を生成させ、生成した
光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を該水性媒
体中より採取することを特徴とする光学活性γ−ヒドロ
キシ−Ｌ−グルタミン酸の製造法（以下、製造法Ｉとい
う。）およびアミノ基供与体存在下、光学活性４−ヒド
ロキシ−２−ケトグルタル酸を光学活性γ−ヒドロキシ
−Ｌ−グルタミン酸に変換する活性を有する生体触媒
（以下、生体触媒IIという。）、アミノ基供与体および
光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を水性媒
体中に存在させることにより、水性媒体中に光学活性γ
−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を生成させ、生成した
光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を該水性媒
体中より採取することを特徴とする光学活性γ−ヒドロ
キシ−Ｌ−グルタミン酸の製造法（以下、製造法IIとい
う。）を提供することができる。
基供与体存在下、ピルビン酸とグリオキシル酸から光学
活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を生成する活性
を有する生体触媒（以下、生体触媒Ｉという。）、アミ
ノ基供与体、ピルビン酸およびグリオキシル酸を水性媒
体中に存在させることにより、水性媒体中に光学活性γ
−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を生成させ、生成した
光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を該水性媒
体中より採取することを特徴とする光学活性γ−ヒドロ
キシ−Ｌ−グルタミン酸の製造法（以下、製造法Ｉとい
う。）およびアミノ基供与体存在下、光学活性４−ヒド
ロキシ−２−ケトグルタル酸を光学活性γ−ヒドロキシ
−Ｌ−グルタミン酸に変換する活性を有する生体触媒
（以下、生体触媒IIという。）、アミノ基供与体および
光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を水性媒
体中に存在させることにより、水性媒体中に光学活性γ
−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を生成させ、生成した
光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を該水性媒
体中より採取することを特徴とする光学活性γ−ヒドロ
キシ−Ｌ−グルタミン酸の製造法（以下、製造法IIとい
う。）を提供することができる。
【０００６】なお、光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グル
タミン酸は、スレオ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン
酸[(2S,4S)-4-hydroxyglutamic acid]またはエリスロ−
γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸[(2S,4R)-4-hydroxy
glutamic acid]のことをいい、光学活性４−ヒドロキシ
−２−ケトグルタル酸は、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケ
トグルタル酸[(S)-hydroxy-2-ketoglutaric acid] また
はＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸[(R)-hydro
xy-2-ketoglutaric acid] のことをいう。
タミン酸は、スレオ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン
酸[(2S,4S)-4-hydroxyglutamic acid]またはエリスロ−
γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸[(2S,4R)-4-hydroxy
glutamic acid]のことをいい、光学活性４−ヒドロキシ
−２−ケトグルタル酸は、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケ
トグルタル酸[(S)-hydroxy-2-ketoglutaric acid] また
はＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸[(R)-hydro
xy-2-ketoglutaric acid] のことをいう。
【０００７】さらに詳しくは、生体触媒Ｉ、アミノ基供
与体、ピルビン酸およびグリオキシル酸を水性媒体中に
存在させることにより、水性媒体中にスレオ−またはエ
リスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を生成さ
せ、生成したスレオ−またはエリスロ−γ−ヒドロキシ
−Ｌ−グルタミン酸を該水性媒体中より採取することを
特徴とするスレオ−またはエリスロ−γ−ヒドロキシ−
Ｌ−グルタミン酸の製造法、および生体触媒II、アミノ
基供与体およびＬ−またはＤ−４−ヒドロキシ−２−ケ
トグルタル酸を水性媒体中に存在させることにより、水
性媒体中にスレオ−またはエリスロ−γ−ヒドロキシ−
Ｌ−グルタミン酸を生成させ、生成したスレオ−または
エリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を該水性
媒体中より採取することを特徴とするスレオ−またはエ
リスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の製造法を
提供することができる。
与体、ピルビン酸およびグリオキシル酸を水性媒体中に
存在させることにより、水性媒体中にスレオ−またはエ
リスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を生成さ
せ、生成したスレオ−またはエリスロ−γ−ヒドロキシ
−Ｌ−グルタミン酸を該水性媒体中より採取することを
特徴とするスレオ−またはエリスロ−γ−ヒドロキシ−
Ｌ−グルタミン酸の製造法、および生体触媒II、アミノ
基供与体およびＬ−またはＤ−４−ヒドロキシ−２−ケ
トグルタル酸を水性媒体中に存在させることにより、水
性媒体中にスレオ−またはエリスロ−γ−ヒドロキシ−
Ｌ−グルタミン酸を生成させ、生成したスレオ−または
エリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を該水性
媒体中より採取することを特徴とするスレオ−またはエ
リスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の製造法を
提供することができる。
【０００８】以下に本発明を詳細に説明する。製造法Ｉ
において、生体触媒Ｉ、アミノ基供与体、ピルビン酸お
よびグリオキシル酸を水性媒体中に存在させることによ
り、水性媒体中にスレオ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタ
ミン酸を生成させ、生成したスレオ−γ−ヒドロキシ−
Ｌ−グルタミン酸を該水性媒体中より採取することを特
徴とするスレオ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の
製造法を以下、製造法Ｉ−(1) といい、生体触媒Ｉ、ア
ミノ基供与体、ピルビン酸およびグリオキシル酸を水性
媒体中に存在させることにより、水性媒体中にエリスロ
−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を生成させ、生成
したエリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を該
水性媒体中より採取することを特徴とするエリスロ−γ
−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の製造法を以下、製造
法Ｉ−(2) という。
において、生体触媒Ｉ、アミノ基供与体、ピルビン酸お
よびグリオキシル酸を水性媒体中に存在させることによ
り、水性媒体中にスレオ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタ
ミン酸を生成させ、生成したスレオ−γ−ヒドロキシ−
Ｌ−グルタミン酸を該水性媒体中より採取することを特
徴とするスレオ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の
製造法を以下、製造法Ｉ−(1) といい、生体触媒Ｉ、ア
ミノ基供与体、ピルビン酸およびグリオキシル酸を水性
媒体中に存在させることにより、水性媒体中にエリスロ
−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を生成させ、生成
したエリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を該
水性媒体中より採取することを特徴とするエリスロ−γ
−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の製造法を以下、製造
法Ｉ−(2) という。
【０００９】製造法Ｉで用いられる生体触媒Ｉとして
は、微生物の培養物、菌体、菌体処理物、精製酵素また
は粗酵素のいずれでも用いることができる。該微生物と
しては、アミノ基供与体存在下、ピルビン酸とグリオキ
シル酸から光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸
を生成する活性を有する微生物であればいずれの微生物
でも用いることができる。
は、微生物の培養物、菌体、菌体処理物、精製酵素また
は粗酵素のいずれでも用いることができる。該微生物と
しては、アミノ基供与体存在下、ピルビン酸とグリオキ
シル酸から光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸
を生成する活性を有する微生物であればいずれの微生物
でも用いることができる。
【００１０】このような微生物として、シュウドモナス
属、パラコッカス属、プロビデンシア属、リゾビウム
属、モルガネラ属、エンテロバクター属、アースロバク
ター属、カウロバクター属、ミクロバクテリウム属、ク
ロトバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバ
クテリウム属、クラビバクター属またはバチルス属に属
する微生物あるいはこれら微生物の突然変異体もしくは
誘導体等があげられる。
属、パラコッカス属、プロビデンシア属、リゾビウム
属、モルガネラ属、エンテロバクター属、アースロバク
ター属、カウロバクター属、ミクロバクテリウム属、ク
ロトバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバ
クテリウム属、クラビバクター属またはバチルス属に属
する微生物あるいはこれら微生物の突然変異体もしくは
誘導体等があげられる。
【００１１】製造法Ｉ−(1) において、生体触媒Ｉとし
て用いられる微生物として好ましくは、シュウドモナス
属、パラコッカス属、プロビデンシア属、リゾビウム
属、モルガネラ属、エンテロバクター属、アースロバク
ター属、カウロバクター属、ミクロバクテリウム属、ク
ロトバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバ
クテリウム属またはクラビバクター属に属し、アミノ基
供与体存在下ピルビン酸とグリオキシル酸からスレオ−
γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を生成する能力を有
する微生物をあげることができる。
て用いられる微生物として好ましくは、シュウドモナス
属、パラコッカス属、プロビデンシア属、リゾビウム
属、モルガネラ属、エンテロバクター属、アースロバク
ター属、カウロバクター属、ミクロバクテリウム属、ク
ロトバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバ
クテリウム属またはクラビバクター属に属し、アミノ基
供与体存在下ピルビン酸とグリオキシル酸からスレオ−
γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を生成する能力を有
する微生物をあげることができる。
【００１２】具体的には、シュウドモナス プチダ（Ps
eudomonas putida）ATCC795株、同ATCC4359株、シュウ
ドモナス オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）
ATCC8062株、シュウドモナス サッカロフィラ（Pseudo
monas saccharophila）ATCC15946株、シュウドモナス
ボレオポリス（Pseudomonas boreopolis）ATCC15452
株、シュウドモナス タエトロレンス（Pseudomonas ta
etorolens）ATCC17466株、パラコッカス デニトリフィ
カンス（Paracoccus denitrificans）ATCC19367株、プ
ロビデンシア ルスチギアニ（Providencia rustigiani
i）ATCC13159株、リゾビウム メリロティ（Rhizobium
meliloti）FERM BP-4582株、モルガネラモルガニ（Morg
anella morganii）ATCC25830株、エンテロバクター ア
エロゲネス（Enterobacter aerogenes）ATCC13048株、
アースロバクター クリスタロポイエテス（Arthrobact
er crystallopoietes）ATCC154821株、カウロバクター
クレセンタス（Caulobacter crescentus）ATCC19089
株、ミクロバクテリウムインペリアレ（Microbacterium
imperiale）ATCC8365株、クロトバクテリウムシトレウ
ム（Curtobacterium citreum）ATCC15828株、ブレビバ
クテリウム アンモニアゲネス（Brevibacterium ammon
iagenes）ATCC6871株、クラビバクターミシガネンセ（C
lavibacter michiganense）ATCC10202株、クラビバクタ
ー ラチャイ（Clavibacter rathayi）ATCC13659株、ク
ラビバクター トリティチ（Clavibacter tritici）ATC
C11402 株などがあげられる。
eudomonas putida）ATCC795株、同ATCC4359株、シュウ
ドモナス オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）
ATCC8062株、シュウドモナス サッカロフィラ（Pseudo
monas saccharophila）ATCC15946株、シュウドモナス
ボレオポリス（Pseudomonas boreopolis）ATCC15452
株、シュウドモナス タエトロレンス（Pseudomonas ta
etorolens）ATCC17466株、パラコッカス デニトリフィ
カンス（Paracoccus denitrificans）ATCC19367株、プ
ロビデンシア ルスチギアニ（Providencia rustigiani
i）ATCC13159株、リゾビウム メリロティ（Rhizobium
meliloti）FERM BP-4582株、モルガネラモルガニ（Morg
anella morganii）ATCC25830株、エンテロバクター ア
エロゲネス（Enterobacter aerogenes）ATCC13048株、
アースロバクター クリスタロポイエテス（Arthrobact
er crystallopoietes）ATCC154821株、カウロバクター
クレセンタス（Caulobacter crescentus）ATCC19089
株、ミクロバクテリウムインペリアレ（Microbacterium
imperiale）ATCC8365株、クロトバクテリウムシトレウ
ム（Curtobacterium citreum）ATCC15828株、ブレビバ
クテリウム アンモニアゲネス（Brevibacterium ammon
iagenes）ATCC6871株、クラビバクターミシガネンセ（C
lavibacter michiganense）ATCC10202株、クラビバクタ
ー ラチャイ（Clavibacter rathayi）ATCC13659株、ク
ラビバクター トリティチ（Clavibacter tritici）ATC
C11402 株などがあげられる。
【００１３】製造法I-(2) において、生体触媒Ｉとして
用いられる微生物として好ましくは、バチルス属に属
し、アミノ基供与体存在下ピルビン酸とグリオキシル酸
からエリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を生
成する能力を有する微生物をあげることができる。具体
的には、バチルス エスピー（Bacillus sp.）S16株（F
ERM BP-4647）をあげることができる。
用いられる微生物として好ましくは、バチルス属に属
し、アミノ基供与体存在下ピルビン酸とグリオキシル酸
からエリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を生
成する能力を有する微生物をあげることができる。具体
的には、バチルス エスピー（Bacillus sp.）S16株（F
ERM BP-4647）をあげることができる。
【００１４】製造法IIで用いられる生体触媒IIとして
は、微生物の培養物、菌体、菌体処理物、精製酵素また
は粗酵素のいずれでも用いることができる。該微生物と
しては、アミノ基供与体存在下、光学活性４−ヒドロキ
シ−２−ケトグルタル酸を光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ
−グルタミン酸に変換する活性を有する微生物であれば
いずれでも用いることができる。
は、微生物の培養物、菌体、菌体処理物、精製酵素また
は粗酵素のいずれでも用いることができる。該微生物と
しては、アミノ基供与体存在下、光学活性４−ヒドロキ
シ−２−ケトグルタル酸を光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ
−グルタミン酸に変換する活性を有する微生物であれば
いずれでも用いることができる。
【００１５】このような微生物として、エシェリヒア
属、セラチア属、シュウドモナス属、アースロバクター
属またはコリネバクテリウム属に属する微生物あるいは
これら微生物の突然変異体もしくは誘導体等があげられ
る。具体的には、エシェリヒア コリ（Escherichia co
li）ATCC33625株、セラチア マルセセンス(Serratia m
arcesens) ATCC13880株、シュウドモナス クロロラフ
ィス(Psudomonas chlororaphis) ATCC9446株、アースロ
バクター プロトフォルミアエ(Arthrobacter protopho
rmiae)ATCC19271株、コリネバクテリウムグルタミクム
(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032株をあげるこ
とができる。
属、セラチア属、シュウドモナス属、アースロバクター
属またはコリネバクテリウム属に属する微生物あるいは
これら微生物の突然変異体もしくは誘導体等があげられ
る。具体的には、エシェリヒア コリ（Escherichia co
li）ATCC33625株、セラチア マルセセンス(Serratia m
arcesens) ATCC13880株、シュウドモナス クロロラフ
ィス(Psudomonas chlororaphis) ATCC9446株、アースロ
バクター プロトフォルミアエ(Arthrobacter protopho
rmiae)ATCC19271株、コリネバクテリウムグルタミクム
(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032株をあげるこ
とができる。
【００１６】より好ましくは、これら菌株の有するα−
ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ(α-ketoglutarate de
hydrogenase) 活性および光学活性４−ヒドロキシ−２
−ケトグルタル酸分解活性の少なくとも一種の活性を欠
失あるいは低下させた変異株をあげることができる。こ
のような変異株は、親株に通常の変異誘起剤処理、たと
えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジン（ＮＴＧ）などの変異剤処理、ＵＶ照射、γ線照射
による変異処理を施した後、適当な寒天平板培地上に塗
布し、生育した変異株を取得し、α−ケトグルタル酸デ
ヒドロゲナーゼ活性および光学活性４−ヒドロキシ−２
−ケトグルタル酸分解活性の少なくとも一種の活性が欠
失または親株に比べて低下した菌株を選択することによ
り得ることができる。
ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ(α-ketoglutarate de
hydrogenase) 活性および光学活性４−ヒドロキシ−２
−ケトグルタル酸分解活性の少なくとも一種の活性を欠
失あるいは低下させた変異株をあげることができる。こ
のような変異株は、親株に通常の変異誘起剤処理、たと
えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジン（ＮＴＧ）などの変異剤処理、ＵＶ照射、γ線照射
による変異処理を施した後、適当な寒天平板培地上に塗
布し、生育した変異株を取得し、α−ケトグルタル酸デ
ヒドロゲナーゼ活性および光学活性４−ヒドロキシ−２
−ケトグルタル酸分解活性の少なくとも一種の活性が欠
失または親株に比べて低下した菌株を選択することによ
り得ることができる。
【００１７】このような変異株を取得するための親株と
しては光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を
光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸に変換する
活性を有する微生物であればいずれでも用いることがで
きる。とくにEscherichia coliが好ましく、例えばEsch
erichia coli K-12 株の亜株Escherichia coli ATCC336
25をあげることができる。
しては光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を
光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸に変換する
活性を有する微生物であればいずれでも用いることがで
きる。とくにEscherichia coliが好ましく、例えばEsch
erichia coli K-12 株の亜株Escherichia coli ATCC336
25をあげることができる。
【００１８】変異株として具体的には、α−ケトグルタ
ル酸デヒドロゲナーゼ欠損変異株Escherichia coli HKK
2株（sucA, iclR, trp ）、α−ケトグルタル酸デヒド
ロゲナーゼ欠損とＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタ
ル酸分解活性低下の両変異を有するEscherichia coli H
KK27株をあげることができる。Escherichia coli HKK27
株は、ブダペスト条約に基づいて平成６年５月３１日付
で工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ
−４６８１として寄託されている。
ル酸デヒドロゲナーゼ欠損変異株Escherichia coli HKK
2株（sucA, iclR, trp ）、α−ケトグルタル酸デヒド
ロゲナーゼ欠損とＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタ
ル酸分解活性低下の両変異を有するEscherichia coli H
KK27株をあげることができる。Escherichia coli HKK27
株は、ブダペスト条約に基づいて平成６年５月３１日付
で工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ
−４６８１として寄託されている。
【００１９】生体触媒Ｉまたは生体触媒IIで用いられる
微生物を親株として、該親株の有するグルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼ(Glutamate dehydrogenase)活性よりも強
化されたグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する変
異株を取得し、該変異株を用いることにより、親株より
もより効率的な光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミ
ン酸の製造を行うことができる。
微生物を親株として、該親株の有するグルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼ(Glutamate dehydrogenase)活性よりも強
化されたグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する変
異株を取得し、該変異株を用いることにより、親株より
もより効率的な光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミ
ン酸の製造を行うことができる。
【００２０】このような変異株は、親株に通常の変異誘
起剤処理、たとえば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変異剤処理、ＵＶ
照射、γ線照射による変異処理を施した後、適当な寒天
平板培地上に塗布し、生育した変異株を取得し、グルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼ活性が親株に比べて強化された
菌株を選択することにより得ることができる。また更
に、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する菌株由
来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ
断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを用いて親株
を形質転換することによっても得られる。
起剤処理、たとえば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変異剤処理、ＵＶ
照射、γ線照射による変異処理を施した後、適当な寒天
平板培地上に塗布し、生育した変異株を取得し、グルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼ活性が親株に比べて強化された
菌株を選択することにより得ることができる。また更
に、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する菌株由
来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ
断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを用いて親株
を形質転換することによっても得られる。
【００２１】例えば、このような形質転換株は、エシェ
リヒア属、とくにエシェリヒア コリ由来のグルタミン
酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクター
ＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換す
ることにより得ることができる。グルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼ遺伝子の供給源となる微生物としては、グルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する微生物であればい
ずれでも用いることができる。とくにEscherichia coli
が好ましく、例えばEscherichia coli K-12株の亜株Esc
herichia coli ATCC33625株が好ましい。
リヒア属、とくにエシェリヒア コリ由来のグルタミン
酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクター
ＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換す
ることにより得ることができる。グルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼ遺伝子の供給源となる微生物としては、グルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する微生物であればい
ずれでも用いることができる。とくにEscherichia coli
が好ましく、例えばEscherichia coli K-12株の亜株Esc
herichia coli ATCC33625株が好ましい。
【００２２】微生物からのグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ遺伝子の単離は、常法〔バイオキミカ・エ・バイオフ
ィジカ・アクタ（Biochim. Biophys. Acta）, 72, 619
(1963)、モレキュラー・クローニング：ア・ボラトリー
・マニュアル（Molecular Cloning, A laboratory manu
al）, 第２版, コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess）(1989)〕に準じて行うことができる。
ゼ遺伝子の単離は、常法〔バイオキミカ・エ・バイオフ
ィジカ・アクタ（Biochim. Biophys. Acta）, 72, 619
(1963)、モレキュラー・クローニング：ア・ボラトリー
・マニュアル（Molecular Cloning, A laboratory manu
al）, 第２版, コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess）(1989)〕に準じて行うことができる。
【００２３】ベクターとしては宿主微生物中で自律複製
できるものであれば、ファージ・ベクター、プラスミド
・ベクターなどいずれでも用いることができる。たとえ
ば、pBR322をあげることができる。グルタミン酸デヒド
ロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡと
の組換え体ＤＮＡは、試験管内で両ＤＮＡを同一切断末
端を与える制限酵素で切断した後、ＤＮＡリガーゼで連
結反応をおこなうことによって得ることができる。
できるものであれば、ファージ・ベクター、プラスミド
・ベクターなどいずれでも用いることができる。たとえ
ば、pBR322をあげることができる。グルタミン酸デヒド
ロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡと
の組換え体ＤＮＡは、試験管内で両ＤＮＡを同一切断末
端を与える制限酵素で切断した後、ＤＮＡリガーゼで連
結反応をおこなうことによって得ることができる。
【００２４】宿主微生物としては、ＤＮＡ取り込み能を
有する微生物であれば、野生株の他に薬剤耐性、栄養要
求性などを有する変異株などいかなる菌株を用いてもよ
い。グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ
断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを用いて、宿
主微生物を形質転換し、該組換え体ＤＮＡを保有する形
質転換株を選択し、その株よりプラスミドを単離するこ
とにより、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む
組換え体プラスミドを取得することができる。形質転換
は、マニアチスらの方法〔モレキュラー・クローニング
（MolecularClorning, A Laboratory Manual ）, 250(1
982)〕等に従っておこなうことができる。出現した形質
転換株の培養菌体から組換え体プラスミドの単離はマニ
アチスらの方法〔モレキュラー・クローニング（Molecu
lar Clorning, A LaboratoryManual ）, 86(1982)〕等
に従っておこなうことができる。
有する微生物であれば、野生株の他に薬剤耐性、栄養要
求性などを有する変異株などいかなる菌株を用いてもよ
い。グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ
断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを用いて、宿
主微生物を形質転換し、該組換え体ＤＮＡを保有する形
質転換株を選択し、その株よりプラスミドを単離するこ
とにより、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む
組換え体プラスミドを取得することができる。形質転換
は、マニアチスらの方法〔モレキュラー・クローニング
（MolecularClorning, A Laboratory Manual ）, 250(1
982)〕等に従っておこなうことができる。出現した形質
転換株の培養菌体から組換え体プラスミドの単離はマニ
アチスらの方法〔モレキュラー・クローニング（Molecu
lar Clorning, A LaboratoryManual ）, 86(1982)〕等
に従っておこなうことができる。
【００２５】得られた組換え体プラスミドを用いて、生
体触媒Ｉまたは生体触媒IIとして用いることのできる微
生物をマニアチスらの方法に従って形質転換することに
より、目的のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性の強化
された形質転換株を得ることができる。具体的には、α
−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損とＬ−４−ヒド
ロキシ−２−ケトグルタル酸分解活性低下の両変異を有
し、更に、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性の増強さ
れたEscherichia coli HKK27/pHK10株をあげることがで
きる。Escherichia coli HKK27/pHK10株は、ブダペスト
条約に基づいて平成６年５月３１日付で工業技術院生命
工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４６８２として
寄託されている。
体触媒Ｉまたは生体触媒IIとして用いることのできる微
生物をマニアチスらの方法に従って形質転換することに
より、目的のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性の強化
された形質転換株を得ることができる。具体的には、α
−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損とＬ−４−ヒド
ロキシ−２−ケトグルタル酸分解活性低下の両変異を有
し、更に、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性の増強さ
れたEscherichia coli HKK27/pHK10株をあげることがで
きる。Escherichia coli HKK27/pHK10株は、ブダペスト
条約に基づいて平成６年５月３１日付で工業技術院生命
工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４６８２として
寄託されている。
【００２６】生体触媒Ｉまたは生体触媒IIとして用いら
れる微生物の培養は、通常の培養方法に従って行うこと
ができる。培養に用いられる培地は、用いる微生物が資
化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生
物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成
培地のいずれでもよい。
れる微生物の培養は、通常の培養方法に従って行うこと
ができる。培養に用いられる培地は、用いる微生物が資
化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生
物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成
培地のいずれでもよい。
【００２７】炭素源としては、用いる微生物が資化し得
るものであればよく、グルコース、フラクトース、シュ
ークロース、マルトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜
などの糖類や、酢酸、乳酸、グルコン酸などの有機酸、
あるいはエタノール、プロパノールなどのアルコール類
を用いることができる。窒素源としては、用いる微生物
が資化しうるかぎり、アンモニア、硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニ
ウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その
他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エ
キス、コーン・スチープリカー、カゼイン加水分解物、
大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびそ
の消化物等を用いることができる。
るものであればよく、グルコース、フラクトース、シュ
ークロース、マルトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜
などの糖類や、酢酸、乳酸、グルコン酸などの有機酸、
あるいはエタノール、プロパノールなどのアルコール類
を用いることができる。窒素源としては、用いる微生物
が資化しうるかぎり、アンモニア、硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニ
ウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その
他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エ
キス、コーン・スチープリカー、カゼイン加水分解物、
大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびそ
の消化物等を用いることができる。
【００２８】無機塩としては、用いる微生物が利用しう
るかぎり、リン酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸
第一鉄、硫酸マンガンなどを用いることができる。他に
微量元素としてカルシウム、亜鉛、ほう素、銅、コバル
ト、モリブデンなどの塩類を加えてもよい。また必要に
応じてチアミン、ビオチンのようなビタミン、グルタミ
ン酸、アスパラギン酸のようなアミノ酸、アデニン、グ
アニンのような核酸関連物質などを添加してもよい。
るかぎり、リン酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸
第一鉄、硫酸マンガンなどを用いることができる。他に
微量元素としてカルシウム、亜鉛、ほう素、銅、コバル
ト、モリブデンなどの塩類を加えてもよい。また必要に
応じてチアミン、ビオチンのようなビタミン、グルタミ
ン酸、アスパラギン酸のようなアミノ酸、アデニン、グ
アニンのような核酸関連物質などを添加してもよい。
【００２９】培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養
などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜３７℃が
よく、培養時間は１０〜９６時間である。培養中ｐＨ
は、５．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あ
るいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウ
ム、アンモニアなどを用いて行う。生体触媒ＩまたはII
として用いられる微生物の菌体処理物としては、菌体の
乾燥物、凍結乾燥物、界面活性剤または有機溶剤処理
物、酵素処理物、超音波処理物、機械的摩砕処理物、溶
媒処理物、菌体の蛋白質分画、菌体および菌体処理物の
固定化物などがあげられる。
などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜３７℃が
よく、培養時間は１０〜９６時間である。培養中ｐＨ
は、５．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あ
るいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウ
ム、アンモニアなどを用いて行う。生体触媒ＩまたはII
として用いられる微生物の菌体処理物としては、菌体の
乾燥物、凍結乾燥物、界面活性剤または有機溶剤処理
物、酵素処理物、超音波処理物、機械的摩砕処理物、溶
媒処理物、菌体の蛋白質分画、菌体および菌体処理物の
固定化物などがあげられる。
【００３０】本発明の製造法Ｉおよび製造法IIにおい
て、用いるアミノ基供与体としては、アンモニア、硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素などの無機アン
モニウム塩またはアスパラギン酸をはじめとする各種ア
ミノ酸などをあげることができる。アミノ基供与体の濃
度は０．１〜１００ｇ／ｌ、好ましくは１〜１０ｇ／ｌ
である。
て、用いるアミノ基供与体としては、アンモニア、硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素などの無機アン
モニウム塩またはアスパラギン酸をはじめとする各種ア
ミノ酸などをあげることができる。アミノ基供与体の濃
度は０．１〜１００ｇ／ｌ、好ましくは１〜１０ｇ／ｌ
である。
【００３１】水性媒体としては、水、リン酸塩、炭酸
塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝
液、ならびに、メタノール、エタノールなどのアルコー
ル類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケ
トン類、アセトアミドなどのアミド類などの有機溶媒を
含有した水溶液があげられる。また必要に応じてトリト
ンＸ−１００（ナカライテスク社製）やノニオンHS204
（日本油脂社製）などの界面活性剤やトルエンやキシレ
ンなどの有機溶媒を０．１〜２０ｇ／ｌ 程度添加して
もよい。
塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝
液、ならびに、メタノール、エタノールなどのアルコー
ル類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケ
トン類、アセトアミドなどのアミド類などの有機溶媒を
含有した水溶液があげられる。また必要に応じてトリト
ンＸ−１００（ナカライテスク社製）やノニオンHS204
（日本油脂社製）などの界面活性剤やトルエンやキシレ
ンなどの有機溶媒を０．１〜２０ｇ／ｌ 程度添加して
もよい。
【００３２】本発明の製造法Ｉにおいて、用いるピルビ
ン酸およびグリオキシル酸の濃度は１〜２００ｇ／ｌ、
好ましくは２０〜２００ｇ／ｌである。生体触媒Ｉによ
りピルビン酸に転換され得る化合物をピルビン酸の代替
として用いることもできる。このような化合物として、
グルコース、フラクトース、シュークロース、マルトー
ス、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜などの糖類や、酢酸、
乳酸、グルコン酸などの有機酸等をあげることができ
る。
ン酸およびグリオキシル酸の濃度は１〜２００ｇ／ｌ、
好ましくは２０〜２００ｇ／ｌである。生体触媒Ｉによ
りピルビン酸に転換され得る化合物をピルビン酸の代替
として用いることもできる。このような化合物として、
グルコース、フラクトース、シュークロース、マルトー
ス、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜などの糖類や、酢酸、
乳酸、グルコン酸などの有機酸等をあげることができ
る。
【００３３】生体触媒Ｉの濃度は０．１〜２００ｇ／
ｌ、好ましくは５〜１００ｇ／ｌ（微生物菌体換算）で
ある。水性媒体に、生体触媒Ｉ、アミノ基供与体、ピル
ビン酸およびグリオキシル酸を上記濃度添加し、温度１
５〜８０℃、好ましくは２５〜６０℃、ｐＨ３〜１１、
好ましくはｐＨ５〜９の条件下で、３０分〜８０時間反
応させ、光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を
製造することができる。
ｌ、好ましくは５〜１００ｇ／ｌ（微生物菌体換算）で
ある。水性媒体に、生体触媒Ｉ、アミノ基供与体、ピル
ビン酸およびグリオキシル酸を上記濃度添加し、温度１
５〜８０℃、好ましくは２５〜６０℃、ｐＨ３〜１１、
好ましくはｐＨ５〜９の条件下で、３０分〜８０時間反
応させ、光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を
製造することができる。
【００３４】製造法Ｉにおいて、生体触媒Ｉとして用い
られる微生物の培養初発または途中に、アミノ基供与
体、ピルビン酸およびグリオキシル酸を上記濃度添加
し、光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を製造
することもできる。本発明の製造法IIにおいて、光学活
性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸として、精製標
品、粗精製品等を用いることができる。また、微生物に
由来する生体触媒反応を利用して生成された光学活性４
−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸および光学活性４−
ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を含有する該反応液を
利用することもできる。微生物に由来する生体触媒反応
を利用した光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル
酸の製造法については後述する。用いる光学活性４−ヒ
ドロキシ−２−ケトグルタル酸の濃度は１〜２００ｇ／
ｌ、好ましくは２０〜２００ｇ／ｌである。
られる微生物の培養初発または途中に、アミノ基供与
体、ピルビン酸およびグリオキシル酸を上記濃度添加
し、光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を製造
することもできる。本発明の製造法IIにおいて、光学活
性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸として、精製標
品、粗精製品等を用いることができる。また、微生物に
由来する生体触媒反応を利用して生成された光学活性４
−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸および光学活性４−
ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を含有する該反応液を
利用することもできる。微生物に由来する生体触媒反応
を利用した光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル
酸の製造法については後述する。用いる光学活性４−ヒ
ドロキシ−２−ケトグルタル酸の濃度は１〜２００ｇ／
ｌ、好ましくは２０〜２００ｇ／ｌである。
【００３５】生体触媒IIの濃度は０．１〜２００ｇ／
ｌ、好ましくは５〜１００ｇ／ｌ（微生物菌体換算）で
ある。水性媒体に、生体触媒II、アミノ基供与体および
光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸グリオキ
シル酸を上記濃度添加し、温度１５〜８０℃、好ましく
は２５〜６０℃、ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ５〜９
の条件下で、３０分〜８０時間反応させ、光学活性γ−
ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を製造することができ
る。
ｌ、好ましくは５〜１００ｇ／ｌ（微生物菌体換算）で
ある。水性媒体に、生体触媒II、アミノ基供与体および
光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸グリオキ
シル酸を上記濃度添加し、温度１５〜８０℃、好ましく
は２５〜６０℃、ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ５〜９
の条件下で、３０分〜８０時間反応させ、光学活性γ−
ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を製造することができ
る。
【００３６】製造法IIにおいて、生体触媒IIとして用い
られる微生物の培養初発または途中に、アミノ基供与体
および光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を
上記濃度添加し、光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタ
ミン酸を製造することもできる。製造法Ｉまたは製造法
IIにより製造された光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グル
タミン酸は、通常用いられるアミノ酸の精製法を用いて
単離することができる。例えば、遠心分離により固形物
を除いた反応液上清から、イオン交換樹脂や膜処理法な
どの操作を組み合わせて、光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ
−グルタミン酸を単離することができる。
られる微生物の培養初発または途中に、アミノ基供与体
および光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を
上記濃度添加し、光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタ
ミン酸を製造することもできる。製造法Ｉまたは製造法
IIにより製造された光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グル
タミン酸は、通常用いられるアミノ酸の精製法を用いて
単離することができる。例えば、遠心分離により固形物
を除いた反応液上清から、イオン交換樹脂や膜処理法な
どの操作を組み合わせて、光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ
−グルタミン酸を単離することができる。
【００３７】〔微生物に由来する生体触媒反応を利用し
た光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の製
造〕グリオキシル酸とピルビン酸から光学活性４−ヒド
ロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する活性を有する生
体触媒（以下、生体触媒IIIという。）、ピルビン酸お
よびグリオキシル酸を水性媒体中に存在させることによ
り、グリオキシル酸を光学活性４−ヒドロキシ−２−ケ
トグルタル酸に変換することにより光学活性４−ヒドロ
キシ−２−ケトグルタル酸を製造することができる。
た光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の製
造〕グリオキシル酸とピルビン酸から光学活性４−ヒド
ロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する活性を有する生
体触媒（以下、生体触媒IIIという。）、ピルビン酸お
よびグリオキシル酸を水性媒体中に存在させることによ
り、グリオキシル酸を光学活性４−ヒドロキシ−２−ケ
トグルタル酸に変換することにより光学活性４−ヒドロ
キシ−２−ケトグルタル酸を製造することができる。
【００３８】該製造で用いられる生体触媒IIIとして
は、微生物の培養物、菌体、菌体処理物、精製酵素また
は粗酵素のいずれでも用いることができる。該微生物と
しては、グリオキシル酸とピルビン酸から光学活性４−
ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する活性を有す
る微生物であればいずれの微生物でも用いることができ
る。
は、微生物の培養物、菌体、菌体処理物、精製酵素また
は粗酵素のいずれでも用いることができる。該微生物と
しては、グリオキシル酸とピルビン酸から光学活性４−
ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する活性を有す
る微生物であればいずれの微生物でも用いることができ
る。
【００３９】具体的にはセルビブリオ属、バチルス属、
シュウドモナス属、パラコッカス属、プロビデンシア
属、リゾビウム属またはモルガネラ属に属する微生物が
あげられる。Ｄ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸
を製造する場合にはとくにセルビブリオ属またはバチル
ス属に属する微生物が好ましい。
シュウドモナス属、パラコッカス属、プロビデンシア
属、リゾビウム属またはモルガネラ属に属する微生物が
あげられる。Ｄ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸
を製造する場合にはとくにセルビブリオ属またはバチル
ス属に属する微生物が好ましい。
【００４０】具体的にはセルビブリオ ギルバス（Cell
vibrio gilvus）ATCC13127株、バチルス エスピー（Ba
cillus sp.）OC187株、バチルス エスピー（Bacillus
sp.）S16 株などがあげられる。ATCC13127株およびOC18
7株は６０〜９０℃、１５分〜２時間の熱処理を施すこ
とにより、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の
生成能を失活させることができる。また、Ｌ−４−ヒド
ロキシ−２−ケトグルタル酸の生成能を失活した株は、
セルビブリオ属またはバチルス属に属し、かつピルビン
酸または該微生物によってピルビン酸に転換され得る化
合物とグリオキシル酸からＤ−４−ヒドロキシ−２−ケ
トグルタル酸を生成する能力を有する微生物を通常の変
異処理手段、たとえば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）による通常の変異処理
により変異させ、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタ
ル酸の生成能が失活した変異株を選択することによって
も得ることができる。S16株はOC187株より変異誘導さ
れ、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の生成能
を失活した変異株である。
vibrio gilvus）ATCC13127株、バチルス エスピー（Ba
cillus sp.）OC187株、バチルス エスピー（Bacillus
sp.）S16 株などがあげられる。ATCC13127株およびOC18
7株は６０〜９０℃、１５分〜２時間の熱処理を施すこ
とにより、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の
生成能を失活させることができる。また、Ｌ−４−ヒド
ロキシ−２−ケトグルタル酸の生成能を失活した株は、
セルビブリオ属またはバチルス属に属し、かつピルビン
酸または該微生物によってピルビン酸に転換され得る化
合物とグリオキシル酸からＤ−４−ヒドロキシ−２−ケ
トグルタル酸を生成する能力を有する微生物を通常の変
異処理手段、たとえば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）による通常の変異処理
により変異させ、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタ
ル酸の生成能が失活した変異株を選択することによって
も得ることができる。S16株はOC187株より変異誘導さ
れ、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の生成能
を失活した変異株である。
【００４１】バチルス エスピー（Bacillus sp.）OC18
7株は、本発明者らによって町田市の土壌より新たに分
離された菌株であって、その菌学的性質を第１表〜第６
表に詳述する。 (A) 形態
7株は、本発明者らによって町田市の土壌より新たに分
離された菌株であって、その菌学的性質を第１表〜第６
表に詳述する。 (A) 形態
【００４２】
【表１】
【００４３】(B) 培養学的性質
【００４４】
【表２】
【００４５】(C) 生理学的性質
【００４６】
【表３】
【００４７】
【表４】
【００４８】(D) その他の諸性質
【００４９】
【表５】
【００５０】(E) 化学分類学的性質
【００５１】
【表６】
【００５２】以上の菌学的性質を有する菌について、バ
ージェイのマニュアル（Bergey's Manual of Systemati
c Bacteriology） Vol.2（1986年）の記載と照合した結
果、該菌株をバチルス属に属する細菌と同定し、OC187
株をバチルス エスピー（Bacillus sp.）OC187 と命名
した。バチルス エスピー OC187株およびS16株は、ブ
ダペスト条約に基づいて平成６年４月１９日付で工業技
術院生命工学工業技術研究所に各々ＦＥＲＭ ＢＰ−４
６４６、ＦＥＲＭ ＢＰ−４６４７として寄託されてい
る。
ージェイのマニュアル（Bergey's Manual of Systemati
c Bacteriology） Vol.2（1986年）の記載と照合した結
果、該菌株をバチルス属に属する細菌と同定し、OC187
株をバチルス エスピー（Bacillus sp.）OC187 と命名
した。バチルス エスピー OC187株およびS16株は、ブ
ダペスト条約に基づいて平成６年４月１９日付で工業技
術院生命工学工業技術研究所に各々ＦＥＲＭ ＢＰ−４
６４６、ＦＥＲＭ ＢＰ−４６４７として寄託されてい
る。
【００５３】Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸
を製造する場合にはとくにシュウドモナス属、パラコッ
カス属、プロビデンシア属、リゾビウム属またはモルガ
ネラ属に属する微生物が好ましい。さらに詳しくはシュ
ウドモナス属、パラコッカス属、プロビデンシア属、リ
ゾビウム属またはモルガネラ属に属し、ピルビン酸また
は該微生物によってピルビン酸に転換され得る化合物と
グリオキシル酸からＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグル
タル酸を生成する能力を有する微生物であればよい。Ｄ
−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を実質的に生成
しない微生物であればより好ましい。
を製造する場合にはとくにシュウドモナス属、パラコッ
カス属、プロビデンシア属、リゾビウム属またはモルガ
ネラ属に属する微生物が好ましい。さらに詳しくはシュ
ウドモナス属、パラコッカス属、プロビデンシア属、リ
ゾビウム属またはモルガネラ属に属し、ピルビン酸また
は該微生物によってピルビン酸に転換され得る化合物と
グリオキシル酸からＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグル
タル酸を生成する能力を有する微生物であればよい。Ｄ
−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を実質的に生成
しない微生物であればより好ましい。
【００５４】具体的にはシュウドモナス プチダ（Pseu
domonas putida）ATCC 795株、シュウドモナス プチダ
（Pseudomonas putida）ATCC 4359株、シュウドモナス
サッカロフィラ（Pseudomonas saccharophila）ATCC
9114株〔＝ATCC 15946株；IAM Catalogue of Strains
(1993) 〕、シュウドモナス ボレオポリス（Pseudomon
as boreopolis）ATCC 15452株、シュウドモナス タエ
トロレンス（Pseudomonas taetrolens）ATCC 17466株、
シュウドモナス オレオボランス（Pseudomonasoleovor
ans）ATCC 8062株、パラコッカス デニトリフィカンス
（Paracoccus denitrificans）ATCC 19367株、プロビデ
ンシア ルスチギアニ（Providencia rustigianii）ATC
C 13159株、リゾビウム メリロッティ（Rhizobium mel
iloti）RCR 2001株（FERM BP-4582）、モルガネラ モ
ルガニ（Morganella morganii）ATCC 25830株などがあ
げられる。
domonas putida）ATCC 795株、シュウドモナス プチダ
（Pseudomonas putida）ATCC 4359株、シュウドモナス
サッカロフィラ（Pseudomonas saccharophila）ATCC
9114株〔＝ATCC 15946株；IAM Catalogue of Strains
(1993) 〕、シュウドモナス ボレオポリス（Pseudomon
as boreopolis）ATCC 15452株、シュウドモナス タエ
トロレンス（Pseudomonas taetrolens）ATCC 17466株、
シュウドモナス オレオボランス（Pseudomonasoleovor
ans）ATCC 8062株、パラコッカス デニトリフィカンス
（Paracoccus denitrificans）ATCC 19367株、プロビデ
ンシア ルスチギアニ（Providencia rustigianii）ATC
C 13159株、リゾビウム メリロッティ（Rhizobium mel
iloti）RCR 2001株（FERM BP-4582）、モルガネラ モ
ルガニ（Morganella morganii）ATCC 25830株などがあ
げられる。
【００５５】リゾビウム メリロッティ（Rhizobium me
liloti）RCR 2001株は、ブダペスト条約に基づいて平成
６年２月２４日付で工業技術院生命工学工業技術研究所
にＦＥＲＭ ＢＰ−４５８２として寄託されている。生
体触媒III として用いられる微生物の培養は、通常の培
養方法に従って行われる。
liloti）RCR 2001株は、ブダペスト条約に基づいて平成
６年２月２４日付で工業技術院生命工学工業技術研究所
にＦＥＲＭ ＢＰ−４５８２として寄託されている。生
体触媒III として用いられる微生物の培養は、通常の培
養方法に従って行われる。
【００５６】培養に用いられる培地は、用いる微生物が
資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微
生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合
成培地のいずれでもよい。炭素源としては、用いる微生
物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラク
トース、シュークロース、マルトース、澱粉、澱粉加水
分解物、糖蜜などの糖類や、酢酸、乳酸、グルコン酸な
どの有機酸、あるいはエタノール、プロパノールなどの
アルコール類が用いられる。セルビブリオ属またはバチ
ルス属細菌を用いてＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグル
タル酸を製造する場合にはＤ−ガラクトン酸が好まし
い。
資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微
生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合
成培地のいずれでもよい。炭素源としては、用いる微生
物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラク
トース、シュークロース、マルトース、澱粉、澱粉加水
分解物、糖蜜などの糖類や、酢酸、乳酸、グルコン酸な
どの有機酸、あるいはエタノール、プロパノールなどの
アルコール類が用いられる。セルビブリオ属またはバチ
ルス属細菌を用いてＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグル
タル酸を製造する場合にはＤ−ガラクトン酸が好まし
い。
【００５７】窒素源としては、用いる微生物が資化しう
るかぎり、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、等の
各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化
合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コー
ン・スチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕およ
び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等
を使用することができる。
るかぎり、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、等の
各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化
合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コー
ン・スチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕およ
び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等
を使用することができる。
【００５８】無機塩としては、用いる微生物が利用しう
るかぎり、リン酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸
第一鉄、硫酸マンガンなどを使用できる。他に微量元素
としてカルシウム、亜鉛、ほう素、銅、コバルト、モリ
ブデンなどの塩類を加えてもよい。また必要に応じてチ
アミン、ビオチンのようなビタミン、グルタミン酸、ア
スパラギン酸のようなアミノ酸、アデニン、グアニンの
ような核酸関連物質などを添加してもよい。
るかぎり、リン酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸
第一鉄、硫酸マンガンなどを使用できる。他に微量元素
としてカルシウム、亜鉛、ほう素、銅、コバルト、モリ
ブデンなどの塩類を加えてもよい。また必要に応じてチ
アミン、ビオチンのようなビタミン、グルタミン酸、ア
スパラギン酸のようなアミノ酸、アデニン、グアニンの
ような核酸関連物質などを添加してもよい。
【００５９】培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養
などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜３７℃が
よく、培養時間は１０〜９６時間である。培養中ｐＨ
は、５．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あ
るいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウ
ム、アンモニアなどを用いて行う。生体触媒IIIとして
用いられる微生物の菌体処理物としては、菌体の乾燥
物、凍結乾燥物、界面活性剤または有機溶剤処理物、酵
素処理物、超音波処理物、機械的摩砕処理物、溶媒処理
物、菌体の蛋白質分画、菌体および菌体処理物の固定化
物などがあげられる。
などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜３７℃が
よく、培養時間は１０〜９６時間である。培養中ｐＨ
は、５．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あ
るいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウ
ム、アンモニアなどを用いて行う。生体触媒IIIとして
用いられる微生物の菌体処理物としては、菌体の乾燥
物、凍結乾燥物、界面活性剤または有機溶剤処理物、酵
素処理物、超音波処理物、機械的摩砕処理物、溶媒処理
物、菌体の蛋白質分画、菌体および菌体処理物の固定化
物などがあげられる。
【００６０】水性媒体としては、水、リン酸塩、炭酸
塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝
液、ならびに、メタノール、エタノールなどのアルコー
ル類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケ
トン類、アセトアミドなどのアミド類などの有機溶媒を
含有した水溶液があげられる。また必要に応じてトリト
ンＸ−１００（ナカライテスク社製）やノニオンHS204
（日本油脂社製）などの界面活性剤やトルエンやキシレ
ンなどの有機溶媒を０．１〜２０g/l 程度添加してもよ
い。
塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝
液、ならびに、メタノール、エタノールなどのアルコー
ル類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケ
トン類、アセトアミドなどのアミド類などの有機溶媒を
含有した水溶液があげられる。また必要に応じてトリト
ンＸ−１００（ナカライテスク社製）やノニオンHS204
（日本油脂社製）などの界面活性剤やトルエンやキシレ
ンなどの有機溶媒を０．１〜２０g/l 程度添加してもよ
い。
【００６１】用いるピルビン酸およびグリオキシル酸の
濃度は１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは２０〜２００ｇ／
ｌである。生体触媒IIIによりピルビン酸に転換され得
る化合物をピルビン酸の代替として用いることもでき
る。このような化合物として、グルコース、フラクトー
ス、シュークロース、マルトース、澱粉、澱粉加水分解
物、糖蜜などの糖類や、酢酸、乳酸、グルコン酸などの
有機酸等をあげることができる。
濃度は１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは２０〜２００ｇ／
ｌである。生体触媒IIIによりピルビン酸に転換され得
る化合物をピルビン酸の代替として用いることもでき
る。このような化合物として、グルコース、フラクトー
ス、シュークロース、マルトース、澱粉、澱粉加水分解
物、糖蜜などの糖類や、酢酸、乳酸、グルコン酸などの
有機酸等をあげることができる。
【００６２】生体触媒IIIの濃度は０．１〜２００ｇ／
ｌ、このましくは５〜１００ｇ／ｌ（微生物菌体換算）
である。水性媒体に、生体触媒III、ピルビン酸および
グリオキシル酸を上記濃度添加し、温度１５〜６０℃、
好ましくは２５〜４５℃、ｐＨ３〜１１、好ましくはｐ
Ｈ５〜９の条件下で、３０分〜８０時間反応させ、光学
活性４−ヒドロキシ−Ｌ−ケトグルタル酸を製造するこ
とができる。
ｌ、このましくは５〜１００ｇ／ｌ（微生物菌体換算）
である。水性媒体に、生体触媒III、ピルビン酸および
グリオキシル酸を上記濃度添加し、温度１５〜６０℃、
好ましくは２５〜４５℃、ｐＨ３〜１１、好ましくはｐ
Ｈ５〜９の条件下で、３０分〜８０時間反応させ、光学
活性４−ヒドロキシ−Ｌ−ケトグルタル酸を製造するこ
とができる。
【００６３】生体触媒IIIとして用いられる微生物の培
養初発または途中に、ピルビン酸およびグリオキシル酸
を上記濃度添加し、光学活性４−ヒドロキシ−Ｌ−ケト
グルタル酸を製造することもできる。光学活性４−ヒド
ロキシ−Ｌ−ケトグルタル酸は、通常用いられるアミノ
酸の精製法を用いて単離することができる。例えば、遠
心分離により固形物を除いた反応液上清から、イオン交
換樹脂や膜処理法などの操作を組み合わせて、光学活性
４−ヒドロキシ−Ｌ−ケトグルタル酸を単離することが
できる。
養初発または途中に、ピルビン酸およびグリオキシル酸
を上記濃度添加し、光学活性４−ヒドロキシ−Ｌ−ケト
グルタル酸を製造することもできる。光学活性４−ヒド
ロキシ−Ｌ−ケトグルタル酸は、通常用いられるアミノ
酸の精製法を用いて単離することができる。例えば、遠
心分離により固形物を除いた反応液上清から、イオン交
換樹脂や膜処理法などの操作を組み合わせて、光学活性
４−ヒドロキシ−Ｌ−ケトグルタル酸を単離することが
できる。
【００６４】以下に本発明の実施例を示す。
【００６５】実施例１ バクトトリプトン１０ｇ／ｌ 、酵母エキス５ｇ／ｌ
および塩化ナトリウム５ｇ／ｌを含みＮａＯＨにてｐＨ
７に調整した培地（Ｌ培地）３ｍｌを試験管に分注し、
滅菌後、第７表に示した微生物を各々接種し、３０℃で
１６時間振とう培養した。各菌株についてこの培養液１
ｍｌずつを下記のＧＭＳ培地１０ｍｌを入れ滅菌した試
験管に接種し３０℃で２０時間振とう培養した。 ＧＭＳ培地組成（１ｌあたり）： ＫＨ2ＰＯ4 ２ ｇ （ＮＨ4）2ＳＯ4 ２ ｇ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ ｍｇ ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２ ｍｇ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ ｇ ＣａＣｌ2 １０ ｍｇ 酵母エキス １ ｇ ペプトン １ ｇ グルコース ２０ ｇ ｐＨ ７．０ 培養終了後、遠心分離操作にて菌体を集め、各菌株につ
いて、滅菌した１ｍｌの反応液(a) 〔KH2PO4 3g 、NaH2
PO4 6g、NH4Cl 1g、MgSO4 ・7H2O 0.16g、NaCl5g 、CaC
l2 11mg、ピルビン酸ナトリウム100mmol およびグリオ
キシル酸100mmol を純水１ｌに含みＮａＯＨにてｐＨ
７. ０に調整した反応液〕の反応液に懸濁し、ファルコ
ン社製2059チューブ中にて３０℃で振とうし５時間反応
させた。反応終了後、遠心分離操作によって菌体を除
き、上清のγ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸をＯＤＳ
カラム（メルク社製）を用いたＨＰＬＣにより定量し
た。定量値を第７表に示す。なお、スレオおよびエリス
ロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の標準化合物は
[ ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエ
テイ（J.A.C.S.）, 79, 6192(1957)] に記載の方法によ
って調製した。
および塩化ナトリウム５ｇ／ｌを含みＮａＯＨにてｐＨ
７に調整した培地（Ｌ培地）３ｍｌを試験管に分注し、
滅菌後、第７表に示した微生物を各々接種し、３０℃で
１６時間振とう培養した。各菌株についてこの培養液１
ｍｌずつを下記のＧＭＳ培地１０ｍｌを入れ滅菌した試
験管に接種し３０℃で２０時間振とう培養した。 ＧＭＳ培地組成（１ｌあたり）： ＫＨ2ＰＯ4 ２ ｇ （ＮＨ4）2ＳＯ4 ２ ｇ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ ｍｇ ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２ ｍｇ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ ｇ ＣａＣｌ2 １０ ｍｇ 酵母エキス １ ｇ ペプトン １ ｇ グルコース ２０ ｇ ｐＨ ７．０ 培養終了後、遠心分離操作にて菌体を集め、各菌株につ
いて、滅菌した１ｍｌの反応液(a) 〔KH2PO4 3g 、NaH2
PO4 6g、NH4Cl 1g、MgSO4 ・7H2O 0.16g、NaCl5g 、CaC
l2 11mg、ピルビン酸ナトリウム100mmol およびグリオ
キシル酸100mmol を純水１ｌに含みＮａＯＨにてｐＨ
７. ０に調整した反応液〕の反応液に懸濁し、ファルコ
ン社製2059チューブ中にて３０℃で振とうし５時間反応
させた。反応終了後、遠心分離操作によって菌体を除
き、上清のγ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸をＯＤＳ
カラム（メルク社製）を用いたＨＰＬＣにより定量し
た。定量値を第７表に示す。なお、スレオおよびエリス
ロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の標準化合物は
[ ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエ
テイ（J.A.C.S.）, 79, 6192(1957)] に記載の方法によ
って調製した。
【００６６】
【表７】
【００６７】実施例２ 第８表に示した微生物を、実施例１と同様に培養し、実
施例１で用いた反応液(a) に５ｇ／ｌのアスパラギン酸
を含む反応液を用いる以外は実施例１と同様に反応を行
った。反応終了後の反応液上清中のスレオ−γ−ヒドロ
キシ−Ｌ−グルタミン酸量を第８表に示す。
施例１で用いた反応液(a) に５ｇ／ｌのアスパラギン酸
を含む反応液を用いる以外は実施例１と同様に反応を行
った。反応終了後の反応液上清中のスレオ−γ−ヒドロ
キシ−Ｌ−グルタミン酸量を第８表に示す。
【００６８】
【表８】
【００６９】実施例３E . coli（大腸菌） K-12株亜株のATCC33625株およびα
−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損変異株HKK2株
（sucA、iclR、trp ）を３ｍｌのＬ培地を含む試験管で
３７℃にて一晩培養した。この培養液２ｍｌを、グルコ
ース０．４％、コハク酸０．０５％ 、硫酸アンモニウ
ム０．２％、Ｌ−トリプトファン１００ｍｇ／ｌ 、酵
母エキス０．１％およびペプトン０．１％を加えたＭ９
培地〔Na2HPO4 6g、KH2PO4 3g 、NaCl 0.5g およびNH4C
l 1gを１ｌに含みｐＨ７．４に調整した後、別途滅菌し
た1M MgSO4 2ｍｌおよび1M CaCl2 0.1ｍｌを加えた培
地〕５０ｍｌを含む３００ｍｌ容三角フラスコに添加
し、３７℃にて８時間培養した。こうして得た培養液か
ら遠心分離によって上清を除去し、菌体を１００ｇ湿菌
体／ｌとなるように滅菌水に懸濁した。
−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損変異株HKK2株
（sucA、iclR、trp ）を３ｍｌのＬ培地を含む試験管で
３７℃にて一晩培養した。この培養液２ｍｌを、グルコ
ース０．４％、コハク酸０．０５％ 、硫酸アンモニウ
ム０．２％、Ｌ−トリプトファン１００ｍｇ／ｌ 、酵
母エキス０．１％およびペプトン０．１％を加えたＭ９
培地〔Na2HPO4 6g、KH2PO4 3g 、NaCl 0.5g およびNH4C
l 1gを１ｌに含みｐＨ７．４に調整した後、別途滅菌し
た1M MgSO4 2ｍｌおよび1M CaCl2 0.1ｍｌを加えた培
地〕５０ｍｌを含む３００ｍｌ容三角フラスコに添加
し、３７℃にて８時間培養した。こうして得た培養液か
ら遠心分離によって上清を除去し、菌体を１００ｇ湿菌
体／ｌとなるように滅菌水に懸濁した。
【００７０】一方、実施例１と同様にシュウドモナス
サッカロフィラATCC15946株をＧＭＳ培地１０ｍｌを入
れた試験管３本にて３０℃で２０時間培養した。遠心分
離操作によってこれら試験管３本分の菌体を一つに集菌
後３ｍｌの反応液に懸濁し、３０℃で５時間反応を行っ
た。この反応液を遠心分離して得た上清をSUMICHIRALOA
-5000カラム（住友化学社製）を用いたＨＰＬＣにより
分析したところ６０．５ｍＭのＬ−４−ヒドロキシ−２
−ケトグルタル酸が生成していた。Ｄ−４−ヒドロキシ
−２−ケトグルタル酸は認められなかった。なお、Ｄお
よびＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の標準化
合物は[ メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods
in Enzymology ）, 17, partB, 275] に記載の方法によ
って調製した。
サッカロフィラATCC15946株をＧＭＳ培地１０ｍｌを入
れた試験管３本にて３０℃で２０時間培養した。遠心分
離操作によってこれら試験管３本分の菌体を一つに集菌
後３ｍｌの反応液に懸濁し、３０℃で５時間反応を行っ
た。この反応液を遠心分離して得た上清をSUMICHIRALOA
-5000カラム（住友化学社製）を用いたＨＰＬＣにより
分析したところ６０．５ｍＭのＬ−４−ヒドロキシ−２
−ケトグルタル酸が生成していた。Ｄ−４−ヒドロキシ
−２−ケトグルタル酸は認められなかった。なお、Ｄお
よびＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の標準化
合物は[ メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods
in Enzymology ）, 17, partB, 275] に記載の方法によ
って調製した。
【００７１】この反応上清をファルコン社製2059チュー
ブ２本に０．４ｍｌづつ分注し、先に調製した大腸菌菌
体懸濁液を８０μｌづつ加えさらに各チューブに２０％
硫酸アンモニウム溶液４０μｌ、５０％グルコース溶液
４８μｌおよびＭ９Ｃ溶液（Na2HPO4 60g 、KH2PO4 30
g、NaCl 5g およびNH4Cl 10g を１ｌに含みｐＨ７．４
に調整）８０μｌを添加し、滅菌水で総量を０．８ｍｌ
に合わせ、３７℃で振とうし３時間反応させた。反応終
了後、遠心分離操作によって菌体を除き、上清のγ−ヒ
ドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を実施例１と同様にＨＰＬ
Ｃにより定量した。定量値を第９表に示す。
ブ２本に０．４ｍｌづつ分注し、先に調製した大腸菌菌
体懸濁液を８０μｌづつ加えさらに各チューブに２０％
硫酸アンモニウム溶液４０μｌ、５０％グルコース溶液
４８μｌおよびＭ９Ｃ溶液（Na2HPO4 60g 、KH2PO4 30
g、NaCl 5g およびNH4Cl 10g を１ｌに含みｐＨ７．４
に調整）８０μｌを添加し、滅菌水で総量を０．８ｍｌ
に合わせ、３７℃で振とうし３時間反応させた。反応終
了後、遠心分離操作によって菌体を除き、上清のγ−ヒ
ドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を実施例１と同様にＨＰＬ
Ｃにより定量した。定量値を第９表に示す。
【００７２】
【表９】
【００７３】実施例４ 大腸菌Ｋ−12株由来のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナ
ーゼ欠損変異株HKK2株（sucA、iclR、trp ）からＬ−４
−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸分解活性の低下した
変異株の誘導を行った。Ｌ培地中で対数増殖期まで培養
したHKK2株の菌体を集め、０．０５Ｍトリスーマレイン
酸緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄後、菌体濃度が約１０9
細胞／ｍｌになるように同緩衝液に懸濁した。これにＮ
ＴＧを終濃度が６００ｍｇ／ｌになるように加え、室温
で２０分間保持して変異処理を行った。この変異処理菌
体をＬ寒天培地（Ｌ培地に寒天２％を加えたもの）に塗
布した。生じたコロニー約３０００株についてＬ−４−
ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸分解活性を測定した。
即ち、各株を３ｍｌのＬ培地で３７℃、１６時間培養
し、遠心分離によって菌体を集め、５０ｍＭ KH2PO
4（ｐＨ７）緩衝液０．５ｍｌに懸濁した。これに実施
例３と同様にシュウドモナス サッカロフィラATCC1594
6株を用いて調製したＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグ
ルタル酸含有ブロス０．５ｍｌを加え、３７℃で８時間
インキュベートした。インキュベート前と後の４−ヒド
ロキシ−２−ケトグルタル酸濃度を実施例３と同様に測
定し、減少量の少ない株をＬ−４−ヒドロキシ−２−ケ
トグルタル酸分解活性の低下した株として選択した。こ
のようにしてα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損
とＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸分解活性低
下の両変異を合わせもつHKK27株を取得した。
ーゼ欠損変異株HKK2株（sucA、iclR、trp ）からＬ−４
−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸分解活性の低下した
変異株の誘導を行った。Ｌ培地中で対数増殖期まで培養
したHKK2株の菌体を集め、０．０５Ｍトリスーマレイン
酸緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄後、菌体濃度が約１０9
細胞／ｍｌになるように同緩衝液に懸濁した。これにＮ
ＴＧを終濃度が６００ｍｇ／ｌになるように加え、室温
で２０分間保持して変異処理を行った。この変異処理菌
体をＬ寒天培地（Ｌ培地に寒天２％を加えたもの）に塗
布した。生じたコロニー約３０００株についてＬ−４−
ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸分解活性を測定した。
即ち、各株を３ｍｌのＬ培地で３７℃、１６時間培養
し、遠心分離によって菌体を集め、５０ｍＭ KH2PO
4（ｐＨ７）緩衝液０．５ｍｌに懸濁した。これに実施
例３と同様にシュウドモナス サッカロフィラATCC1594
6株を用いて調製したＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグ
ルタル酸含有ブロス０．５ｍｌを加え、３７℃で８時間
インキュベートした。インキュベート前と後の４−ヒド
ロキシ−２−ケトグルタル酸濃度を実施例３と同様に測
定し、減少量の少ない株をＬ−４−ヒドロキシ−２−ケ
トグルタル酸分解活性の低下した株として選択した。こ
のようにしてα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損
とＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸分解活性低
下の両変異を合わせもつHKK27株を取得した。
【００７４】α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損
およびＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸分解活
性低下の両変異をあわせもつ菌株は、上記の方法に準じ
てHKK2株からＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸
分解活性の低下した変異株を誘導することによっても得
ることができる。
およびＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸分解活
性低下の両変異をあわせもつ菌株は、上記の方法に準じ
てHKK2株からＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸
分解活性の低下した変異株を誘導することによっても得
ることができる。
【００７５】実施例５ 大腸菌K-12株亜株ATCC33625株より常法[ バイオキミカ
・エ・バイオフィジカ・アクタ(Biochim. Biophys. Act
a), 72, 619(1963)]によりグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ遺伝子を単離した。ベクターとして使用したpBR322は
宝酒造社製の市販品を用いた。pBR322プラスミドＤＮＡ
１μｇおよびATCC33625 株染色体ＤＮＡ ３μｇを含む
制限酵素反応液（宝酒造社製Ｈバッファー）１００μｌ
に各々１６単位のPstIとClaI（いずれも宝酒造社製）を
添加し、３７℃で２時間反応後、６５℃で４０分間加温
して反応を停止させた。該反応物に、１０倍濃度のT4リ
ガーゼ緩衝液（660mM トリス、66mM MgCl2、100mM ジチ
オスレイトール、pH7.6）１２μｌ、１００ｍＭ ＡＴ
Ｐ３μｌおよびT4リガーゼ（宝酒造社製）３５０単位を
加え、１５℃で１６時間反応させた。このリガーゼ反応
物をグルタミン酸デヒドロゲナーゼおよびグルタミン酸
シンターゼ両遺伝子の欠損変異を有するPA340株〔J. Ba
cteriol., 133, 139 (1978)〕の形質転換に供した[マニ
アチスら；モレキュラー・クローニング（Molecular Cl
oning, A Laboratory Manual）, 250(1982)]。選択培地
には、Ｌ−スレオニン２５ｍｇ／ｌ、Ｌ−ロイシン２５
ｍｇ／ｌ、Ｌ−ヒスチジン２５ｍｇ／ｌ、Ｌ−アルギニ
ン２５ｍｇ／ｌ、チアミン１００μｇ／ｌ、テトラサイ
クリン１０ｍｇ／ｌおよびグルコース０．４％を含むＭ
９最少寒天培地[マニアチスら；モレキュラー・クロー
ニング（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）,
68（1982）] を用いた。出現した形質転換株の培養菌体
から[ マニアチスら；モレキュラー・クローニング（Mo
lecular Cloning, A Laboratory Manual）, 86（198
2）] に記載の方法によって、プラスミドＤＮＡを単離
した。
・エ・バイオフィジカ・アクタ(Biochim. Biophys. Act
a), 72, 619(1963)]によりグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ遺伝子を単離した。ベクターとして使用したpBR322は
宝酒造社製の市販品を用いた。pBR322プラスミドＤＮＡ
１μｇおよびATCC33625 株染色体ＤＮＡ ３μｇを含む
制限酵素反応液（宝酒造社製Ｈバッファー）１００μｌ
に各々１６単位のPstIとClaI（いずれも宝酒造社製）を
添加し、３７℃で２時間反応後、６５℃で４０分間加温
して反応を停止させた。該反応物に、１０倍濃度のT4リ
ガーゼ緩衝液（660mM トリス、66mM MgCl2、100mM ジチ
オスレイトール、pH7.6）１２μｌ、１００ｍＭ ＡＴ
Ｐ３μｌおよびT4リガーゼ（宝酒造社製）３５０単位を
加え、１５℃で１６時間反応させた。このリガーゼ反応
物をグルタミン酸デヒドロゲナーゼおよびグルタミン酸
シンターゼ両遺伝子の欠損変異を有するPA340株〔J. Ba
cteriol., 133, 139 (1978)〕の形質転換に供した[マニ
アチスら；モレキュラー・クローニング（Molecular Cl
oning, A Laboratory Manual）, 250(1982)]。選択培地
には、Ｌ−スレオニン２５ｍｇ／ｌ、Ｌ−ロイシン２５
ｍｇ／ｌ、Ｌ−ヒスチジン２５ｍｇ／ｌ、Ｌ−アルギニ
ン２５ｍｇ／ｌ、チアミン１００μｇ／ｌ、テトラサイ
クリン１０ｍｇ／ｌおよびグルコース０．４％を含むＭ
９最少寒天培地[マニアチスら；モレキュラー・クロー
ニング（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）,
68（1982）] を用いた。出現した形質転換株の培養菌体
から[ マニアチスら；モレキュラー・クローニング（Mo
lecular Cloning, A Laboratory Manual）, 86（198
2）] に記載の方法によって、プラスミドＤＮＡを単離
した。
【００７６】形質転換株の１株から得られpHK10と命名
されたプラスミドは、各種制限酵素での消化とアガロー
スゲル電気泳動による解析の結果、pBR322のPstIサイト
とClaIサイトの間に、マックファーソンらの報告したグ
ルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子[ ヌクレイック・ア
シッド・リサーチ（Nucleic Acid Res. ）, 11, 5257
（1983）] と同一構造を有する約４．２キロベースのPs
tI、ClaI ＤＮＡ断片が挿入された構造であることが示
された。pHK10を用いてPA340株を再形質転換した。選択
培地には、テトラサイクリン１０ｍｇ／ｌを含むＬ−寒
天培地を用いた。得られたテトラサイクリン耐性形質転
換コロニーを任意に５０個選び、Ｌ−スレオニン２５ｍ
ｇ／ｌ、Ｌ−ロイシン２５ｍｇ／ｌ、Ｌ−ヒスチジン２
５ｍｇ／ｌ、Ｌ−アルギニン２５ｍｇ／ｌ、チアミン１
００μｇ／ｌ、テトラサイクリン１０ｍｇ／ｌおよびグ
ルコース０．４％を含むＭ９最少寒天培地にレプリカし
たところ、すべて生育した。さらにこの再形質転換株と
宿主に用いたPA340株について、サカモトらにより記述
された方法[ ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.
Bacteriol. ）, 124, 775 (1975)] に従ってグルタミ
ン酸デヒドロゲナーゼ活性を測定した結果、PA340株に
は該酵素活性が認められなかったのに対し、pHK10を保
有するPA340株には明瞭な該酵素活性が認められた。こ
れらのことから大腸菌K-12亜株ATCC33625株のグルタミ
ン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子がクローニングされたこと
が確認された。
されたプラスミドは、各種制限酵素での消化とアガロー
スゲル電気泳動による解析の結果、pBR322のPstIサイト
とClaIサイトの間に、マックファーソンらの報告したグ
ルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子[ ヌクレイック・ア
シッド・リサーチ（Nucleic Acid Res. ）, 11, 5257
（1983）] と同一構造を有する約４．２キロベースのPs
tI、ClaI ＤＮＡ断片が挿入された構造であることが示
された。pHK10を用いてPA340株を再形質転換した。選択
培地には、テトラサイクリン１０ｍｇ／ｌを含むＬ−寒
天培地を用いた。得られたテトラサイクリン耐性形質転
換コロニーを任意に５０個選び、Ｌ−スレオニン２５ｍ
ｇ／ｌ、Ｌ−ロイシン２５ｍｇ／ｌ、Ｌ−ヒスチジン２
５ｍｇ／ｌ、Ｌ−アルギニン２５ｍｇ／ｌ、チアミン１
００μｇ／ｌ、テトラサイクリン１０ｍｇ／ｌおよびグ
ルコース０．４％を含むＭ９最少寒天培地にレプリカし
たところ、すべて生育した。さらにこの再形質転換株と
宿主に用いたPA340株について、サカモトらにより記述
された方法[ ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.
Bacteriol. ）, 124, 775 (1975)] に従ってグルタミ
ン酸デヒドロゲナーゼ活性を測定した結果、PA340株に
は該酵素活性が認められなかったのに対し、pHK10を保
有するPA340株には明瞭な該酵素活性が認められた。こ
れらのことから大腸菌K-12亜株ATCC33625株のグルタミ
ン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子がクローニングされたこと
が確認された。
【００７７】実施例６ 実施例５で作成したグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝
子含有プラスミドpHK10をHKK2株および実施例４で作成
したHKK27株に常法〔マニアチスら；モレキュラー・ク
ローニング（Molecular Cloning, A Laboratory Manua
l）, 68（1982）〕に従って形質転換し、各々HKK2/pHK1
0株、HKK27/pHK10株を得た。これらの形質転換株を実施
例３と同様に培養した。なおこれら形質転換体の培養
は、試験管、三角フラスコいずれにおいても１０ｍｇ／
ｌのテトラサイクリンを添加して実施した。このように
して得られた培養液から遠心分離によって上清を除去
し、菌体を１００ｇ湿菌体／ｌとなるように滅菌水に懸
濁した。一方、実施例３と同様にシュウドモナス サッ
カロフィラATCC15946株を用いて調製したＬ−４−ヒド
ロキシ−２−ケトグルタル酸含有ブロス上清（５９．９
ｍＭのＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を含
む）をファルコン社製2059チューブ２本に０．４ｍｌづ
つ分注し、先に調製した大腸菌菌体懸濁液を８０μｌづ
つ加えさらに各チューブに２０％硫酸アンモニウム溶液
４０μｌ、５０％グルコース溶液４８μｌおよびＭ９Ｃ
溶液８０μｌを添加し、滅菌水で総量を０．８ｍｌに合
わせ、３７℃で振とうし３時間反応させた。反応終了
後、遠心分離操作によって菌体を除き、上清のγ−ヒド
ロキシ−Ｌ−グルタミン酸を実施例１と同様にＨＰＬＣ
により定量した。定量値を第９表（実施例３参照）に示
す。
子含有プラスミドpHK10をHKK2株および実施例４で作成
したHKK27株に常法〔マニアチスら；モレキュラー・ク
ローニング（Molecular Cloning, A Laboratory Manua
l）, 68（1982）〕に従って形質転換し、各々HKK2/pHK1
0株、HKK27/pHK10株を得た。これらの形質転換株を実施
例３と同様に培養した。なおこれら形質転換体の培養
は、試験管、三角フラスコいずれにおいても１０ｍｇ／
ｌのテトラサイクリンを添加して実施した。このように
して得られた培養液から遠心分離によって上清を除去
し、菌体を１００ｇ湿菌体／ｌとなるように滅菌水に懸
濁した。一方、実施例３と同様にシュウドモナス サッ
カロフィラATCC15946株を用いて調製したＬ−４−ヒド
ロキシ−２−ケトグルタル酸含有ブロス上清（５９．９
ｍＭのＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を含
む）をファルコン社製2059チューブ２本に０．４ｍｌづ
つ分注し、先に調製した大腸菌菌体懸濁液を８０μｌづ
つ加えさらに各チューブに２０％硫酸アンモニウム溶液
４０μｌ、５０％グルコース溶液４８μｌおよびＭ９Ｃ
溶液８０μｌを添加し、滅菌水で総量を０．８ｍｌに合
わせ、３７℃で振とうし３時間反応させた。反応終了
後、遠心分離操作によって菌体を除き、上清のγ−ヒド
ロキシ−Ｌ−グルタミン酸を実施例１と同様にＨＰＬＣ
により定量した。定量値を第９表（実施例３参照）に示
す。
【００７８】実施例７ 第１０表に示した各微生物を実施例１と同様に培養し反
応液１ｍｌに懸濁して３０℃で５時間反応を行った。反
応液中に生成した４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸
（表中ＫＨＧと略記）量を実施例３と同様に測定し、第
１０表に示した。さらにこの反応液を遠心分離して得た
上清０．４ｍｌに実施例６と同様にHKK27/pHK10株の菌
体懸濁液、グルコース、硫酸アンモニウムおよびＭ９Ｃ
溶液を加え、滅菌水で総量を０．８ｍｌに合わせ３７℃
で３時間振とうし反応させた。反応終了後、遠心分離操
作によって菌体を除き、上清のγ−ヒドロキシ−Ｌ−グ
ルタミン酸（表中ＨＧと略記）をＨＰＬＣにより定量し
た。定量値を第１０表に示す。
応液１ｍｌに懸濁して３０℃で５時間反応を行った。反
応液中に生成した４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸
（表中ＫＨＧと略記）量を実施例３と同様に測定し、第
１０表に示した。さらにこの反応液を遠心分離して得た
上清０．４ｍｌに実施例６と同様にHKK27/pHK10株の菌
体懸濁液、グルコース、硫酸アンモニウムおよびＭ９Ｃ
溶液を加え、滅菌水で総量を０．８ｍｌに合わせ３７℃
で３時間振とうし反応させた。反応終了後、遠心分離操
作によって菌体を除き、上清のγ−ヒドロキシ−Ｌ−グ
ルタミン酸（表中ＨＧと略記）をＨＰＬＣにより定量し
た。定量値を第１０表に示す。
【００７９】
【表１０】
【００８０】実施例８ 実施例１と同様にシュウドモナス サッカロフィラATCC
15946株をＧＭＳ培地１０ｍｌを入れた試験管１０本に
て３０℃で２０時間培養した。遠心分離操作によってこ
れら試験管１０本分の菌体を一つに集菌後１０ｍｌの反
応液に懸濁し、３０℃で５時間反応を行った。この反応
液を遠心分離して得た上清をSUMICHIRALOA-5000カラム
（住友化学社製）を用いたＨＰＬＣにより分析したとこ
ろ６８．８ｍＭのＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタ
ル酸が生成していた。Ｄ−４−ヒドロキシ−２−ケトグ
ルタル酸は認められなかった。
15946株をＧＭＳ培地１０ｍｌを入れた試験管１０本に
て３０℃で２０時間培養した。遠心分離操作によってこ
れら試験管１０本分の菌体を一つに集菌後１０ｍｌの反
応液に懸濁し、３０℃で５時間反応を行った。この反応
液を遠心分離して得た上清をSUMICHIRALOA-5000カラム
（住友化学社製）を用いたＨＰＬＣにより分析したとこ
ろ６８．８ｍＭのＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタ
ル酸が生成していた。Ｄ−４−ヒドロキシ−２−ケトグ
ルタル酸は認められなかった。
【００８１】この反応上清を滅菌した太型試験管４本に
２．５ｍｌづつ分注し、各試験管に滅菌した下記の組成
のＭＳＣ培地０．５ｍｌ、５０％グルコース溶液０．５
ｍｌ、１０％塩化アンモニウム溶液１ｍｌを添加した。
さらにこの試験管の１本には、３ｍｌのＬ培地を含む試
験管で３０℃にて一晩培養したアースロバクター プロ
トフォルミアエATCC19271株の培養液０．５ｍｌを、１
本には同様に培養したシュウドモナス クロロラフィス
ATCC9446株の培養液０．５ｍｌを、１本には同様に培養
したセラチア マルセセンスATCC13880株の培養液０．
５ｍｌを、残りの１本には同様に培養したコリネバクテ
リウム グルタミクムATCC13032株の培養液０．５ｍｌ
を加え、３０℃にて４８時間培養した。培養終了後、遠
心分離操作によって菌体を除き、上清のγ−ヒドロキシ
−Ｌ−グルタミン酸を実施例１と同様にＨＰＬＣにより
定量した。定量値を第１１表に示す。
２．５ｍｌづつ分注し、各試験管に滅菌した下記の組成
のＭＳＣ培地０．５ｍｌ、５０％グルコース溶液０．５
ｍｌ、１０％塩化アンモニウム溶液１ｍｌを添加した。
さらにこの試験管の１本には、３ｍｌのＬ培地を含む試
験管で３０℃にて一晩培養したアースロバクター プロ
トフォルミアエATCC19271株の培養液０．５ｍｌを、１
本には同様に培養したシュウドモナス クロロラフィス
ATCC9446株の培養液０．５ｍｌを、１本には同様に培養
したセラチア マルセセンスATCC13880株の培養液０．
５ｍｌを、残りの１本には同様に培養したコリネバクテ
リウム グルタミクムATCC13032株の培養液０．５ｍｌ
を加え、３０℃にて４８時間培養した。培養終了後、遠
心分離操作によって菌体を除き、上清のγ−ヒドロキシ
−Ｌ−グルタミン酸を実施例１と同様にＨＰＬＣにより
定量した。定量値を第１１表に示す。
【００８２】ＭＳＣ培地（１ｌあたり）： ＫＨ2ＰＯ4 ２０ ｇ （ＮＨ4）2ＳＯ4 ２０ ｇ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５０ ｍｇ ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０ ｍｇ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ ｇ ＣａＣｌ2 １００ ｍｇ 酵母エキス １０ ｇ ペプトン １０ ｇ ｐＨ ７．０
【００８３】
【表１１】
【００８４】実施例９ シュウドモナス サッカロフィラATCC15946株をＬ培地
９ｍｌに接種し３０℃で１６時間振とう培養した。この
培養液全量を３００ｍｌのＧＭＳ培地に接種し２ｌ容の
三角フラスコにて３０℃、２０時間振とう培養した。得
られた培養液から菌体を遠心分離し、実施例１で用いた
反応液６０ｍｌに懸濁し、３００ｍｌ容ビーカー中で撹
拌しつつ反応を行った。反応開始６時間後にピルビン酸
ナトリウム２Ｍ溶液３ｍｌとグリオキシル酸ナトリウム
２Ｍ溶液３ｍｌを添加した。反応開始後２４時間目に遠
心分離によって反応液から菌体を除き、１次反応液上清
を得た。
９ｍｌに接種し３０℃で１６時間振とう培養した。この
培養液全量を３００ｍｌのＧＭＳ培地に接種し２ｌ容の
三角フラスコにて３０℃、２０時間振とう培養した。得
られた培養液から菌体を遠心分離し、実施例１で用いた
反応液６０ｍｌに懸濁し、３００ｍｌ容ビーカー中で撹
拌しつつ反応を行った。反応開始６時間後にピルビン酸
ナトリウム２Ｍ溶液３ｍｌとグリオキシル酸ナトリウム
２Ｍ溶液３ｍｌを添加した。反応開始後２４時間目に遠
心分離によって反応液から菌体を除き、１次反応液上清
を得た。
【００８５】一方、HKK27/pHK10株をテトラサイクリン
１０ｍｇ／ｌを加えた１０ｍｌのＬ培地で３７℃にて一
晩培養した。この培養液全量を、グルコース０．４％、
コハク酸０．０５％、硫酸アンモニウム０．２％、Ｌ−
トリプトファン１００ｍｇ／ｌ、酵母エキス０．１％、
ペプトン０．１％およびテトラサイクリン１０ｍｇ／ｌ
を加えたＭ９培地７５０ｍｌを含む２ｌ容三角フラスコ
に添加し、３７℃にて８時間培養した。こうして得た培
養液から遠心分離によって上清を除去し、菌体を１００
ｇ湿菌体／ｌとなるように滅菌水に懸濁した。
１０ｍｇ／ｌを加えた１０ｍｌのＬ培地で３７℃にて一
晩培養した。この培養液全量を、グルコース０．４％、
コハク酸０．０５％、硫酸アンモニウム０．２％、Ｌ−
トリプトファン１００ｍｇ／ｌ、酵母エキス０．１％、
ペプトン０．１％およびテトラサイクリン１０ｍｇ／ｌ
を加えたＭ９培地７５０ｍｌを含む２ｌ容三角フラスコ
に添加し、３７℃にて８時間培養した。こうして得た培
養液から遠心分離によって上清を除去し、菌体を１００
ｇ湿菌体／ｌとなるように滅菌水に懸濁した。
【００８６】上記のごとくして得たHKK27/pHK10懸濁液
８ｍｌ、５０％グルコース溶液４．８ｍｌ、２０％硫酸
アンモニウム溶液４ｍｌ、Ｍ９Ｃ溶液８ｍｌ、滅菌水
５．２ｍｌを先に調製した１次反応液５０ｍｌに添加
し、３００ｍｌ容ビーカー中で撹拌しつつ２次反応を行
った。２次反応中は７％アンモニア水にてｐＨを７に維
持した。１２時間反応後、遠心分離操作によって菌体を
除き、上清のγ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸をＯＤ
Ｓカラム（メルク社製）を用いたＨＰＬＣにより定量し
た結果、１０.3ｇ／ｌのスレオ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−
グルタミン酸が検出された。
８ｍｌ、５０％グルコース溶液４．８ｍｌ、２０％硫酸
アンモニウム溶液４ｍｌ、Ｍ９Ｃ溶液８ｍｌ、滅菌水
５．２ｍｌを先に調製した１次反応液５０ｍｌに添加
し、３００ｍｌ容ビーカー中で撹拌しつつ２次反応を行
った。２次反応中は７％アンモニア水にてｐＨを７に維
持した。１２時間反応後、遠心分離操作によって菌体を
除き、上清のγ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸をＯＤ
Ｓカラム（メルク社製）を用いたＨＰＬＣにより定量し
た結果、１０.3ｇ／ｌのスレオ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−
グルタミン酸が検出された。
【００８７】実施例１０ 実施例９で得た２次反応上清７５ｍｌを強酸性陽イオン
交換樹脂[ダウエックス50 x 8（Na型）、ダウケミカル
社製] のカラムに通塔し、アンモニアでスレオ−γ−ヒ
ドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を溶出分離し、濃縮、晶出
することにより、０．６ｇのスレオ−γ−ヒドロキシ−
Ｌ−グルタミン酸の結晶を得た。
交換樹脂[ダウエックス50 x 8（Na型）、ダウケミカル
社製] のカラムに通塔し、アンモニアでスレオ−γ−ヒ
ドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を溶出分離し、濃縮、晶出
することにより、０．６ｇのスレオ−γ−ヒドロキシ−
Ｌ−グルタミン酸の結晶を得た。
【００８８】実施例１１ バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌおよ
び塩化ナトリウム５ｇ／ｌを含みＮａＯＨにてｐＨ７に
調整した培地（Ｌ培地）３ｍｌを試験管に分注し、滅菌
後、バチルス エスピー S16株(FERM BP-4647)を接種
し、３０℃で１６時間振とう培養した。この培養液１ｍ
ｌずつを下記のＧＭＳＧ培地１０ｍｌを入れ滅菌した試
験管２本に接種し３０℃で２０時間振とう培養した。
び塩化ナトリウム５ｇ／ｌを含みＮａＯＨにてｐＨ７に
調整した培地（Ｌ培地）３ｍｌを試験管に分注し、滅菌
後、バチルス エスピー S16株(FERM BP-4647)を接種
し、３０℃で１６時間振とう培養した。この培養液１ｍ
ｌずつを下記のＧＭＳＧ培地１０ｍｌを入れ滅菌した試
験管２本に接種し３０℃で２０時間振とう培養した。
【００８９】ＧＭＳＧ培地組成（１ｌあたり）： ＫＨ2ＰＯ4 ２ ｇ （ＮＨ4）2ＳＯ4 ２ ｇ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ ｍｇ ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２ ｍｇ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ ｇ ＣａＣｌ2 １０ ｍｇ 酵母エキス １ ｇ ペプトン １ ｇ Ｄ−ガラクトン酸カルシウム ２０ ｇ ｐＨ ７．０ 培養終了後、遠心分離操作にて各々菌体を集め、滅菌し
た１ｍｌの反応液(a)に５ｇ／ｌになるようにアスパラ
ギン酸を添加した反応液１ｍｌに懸濁し、ファルコン社
製2059チューブ中にて３０℃で振とうし５時間反応させ
た。反応終了後、遠心分離操作によって菌体を除き、上
清のγ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を実施例１と同
様に定量した。定量値を第１２表に示す。
た１ｍｌの反応液(a)に５ｇ／ｌになるようにアスパラ
ギン酸を添加した反応液１ｍｌに懸濁し、ファルコン社
製2059チューブ中にて３０℃で振とうし５時間反応させ
た。反応終了後、遠心分離操作によって菌体を除き、上
清のγ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を実施例１と同
様に定量した。定量値を第１２表に示す。
【００９０】
【表１２】
【００９１】実施例１２ 大腸菌K-12株由来のATCC33625株およびα−ケトグルタ
ル酸デヒドロゲナーゼ欠損変異株HKK2株（sucA、iclR、
trp ）を３ｍｌのＬ培地を含む試験管で３７℃にて一晩
培養した。この培養液２ｍｌを、グルコース０．４％、
コハク酸０．０５％、硫酸アンモニウム０．２％、Ｌ−
トリプトファン１００ｍｇ／ｌ、酵母エキス０．１％お
よびペプトン０．１％を加えたＭ９培地５０ｍｌを含む
３００ｍｌ容三角フラスコに添加し、３７℃にて８時間
培養した。こうして得た培養液から遠心分離によって上
清を除去し、菌体を１００ｇ湿菌体／ｌとなるように滅
菌水に懸濁した。
ル酸デヒドロゲナーゼ欠損変異株HKK2株（sucA、iclR、
trp ）を３ｍｌのＬ培地を含む試験管で３７℃にて一晩
培養した。この培養液２ｍｌを、グルコース０．４％、
コハク酸０．０５％、硫酸アンモニウム０．２％、Ｌ−
トリプトファン１００ｍｇ／ｌ、酵母エキス０．１％お
よびペプトン０．１％を加えたＭ９培地５０ｍｌを含む
３００ｍｌ容三角フラスコに添加し、３７℃にて８時間
培養した。こうして得た培養液から遠心分離によって上
清を除去し、菌体を１００ｇ湿菌体／ｌとなるように滅
菌水に懸濁した。
【００９２】一方、実施例１１と同様にバチルス エス
ピー S16株(FERM BP-4647)をＧＭＳＧ培地１０ｍｌを入
れた試験管３本にて３０℃で２０時間培養した。遠心分
離操作によってこれら試験管３本分の菌体を一つに集菌
後３ｍｌの反応液(a) に懸濁し、３０℃で５時間反応を
行った。この反応液を遠心分離して得た上清をSUMICHIR
AL OA-5000カラム（住友化学社製）を用いたＨＰＬＣに
より分析したところ３９．０ｍＭのＤ−４−ヒドロキシ
−２−ケトグルタル酸が生成していた。Ｌ−４−ヒドロ
キシ−２−ケトグルタル酸は認められなかった。なお、
ＤおよびＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の標
準化合物は[メソッズ・イン・エンザイモロジー（Metho
ds in Enzymology ）, 17, partB, 275] に記載の方法
によって調製した。
ピー S16株(FERM BP-4647)をＧＭＳＧ培地１０ｍｌを入
れた試験管３本にて３０℃で２０時間培養した。遠心分
離操作によってこれら試験管３本分の菌体を一つに集菌
後３ｍｌの反応液(a) に懸濁し、３０℃で５時間反応を
行った。この反応液を遠心分離して得た上清をSUMICHIR
AL OA-5000カラム（住友化学社製）を用いたＨＰＬＣに
より分析したところ３９．０ｍＭのＤ−４−ヒドロキシ
−２−ケトグルタル酸が生成していた。Ｌ−４−ヒドロ
キシ−２−ケトグルタル酸は認められなかった。なお、
ＤおよびＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の標
準化合物は[メソッズ・イン・エンザイモロジー（Metho
ds in Enzymology ）, 17, partB, 275] に記載の方法
によって調製した。
【００９３】この反応上清をファルコン社製2059チュー
ブ２本に０．４ｍｌづつ分注し、先に調製した大腸菌菌
体懸濁液を８０μｌづつ加えさらに各チューブに２０％
硫酸アンモニウム溶液４０μｌ、５０％グルコース溶液
４８μｌおよびＭ９Ｃ溶液８０μｌを添加し、滅菌水で
総量を０．８ｍｌに合わせ、３７℃で振とうし３時間反
応させた。反応終了後、遠心分離操作によって菌体を除
き、上清のγ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を実施例
１と同様にＨＰＬＣにより定量した。定量値を第１３表
に示す。
ブ２本に０．４ｍｌづつ分注し、先に調製した大腸菌菌
体懸濁液を８０μｌづつ加えさらに各チューブに２０％
硫酸アンモニウム溶液４０μｌ、５０％グルコース溶液
４８μｌおよびＭ９Ｃ溶液８０μｌを添加し、滅菌水で
総量を０．８ｍｌに合わせ、３７℃で振とうし３時間反
応させた。反応終了後、遠心分離操作によって菌体を除
き、上清のγ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を実施例
１と同様にＨＰＬＣにより定量した。定量値を第１３表
に示す。
【００９４】
【表１３】
【００９５】実施例１３ HKK2/pHK10株、HKK27/pHK10株を実施例１２と同様に培
養した。なおこれら形質転換体の培養は、試験管、三角
フラスコいずれにおいても１０ｍｇ／ｌのテトラサイク
リンを添加して実施した。こうして得た培養液から遠心
分離によって上清を除去し、菌体を１００ｇ湿菌体／ｌ
となるように滅菌水に懸濁した。
養した。なおこれら形質転換体の培養は、試験管、三角
フラスコいずれにおいても１０ｍｇ／ｌのテトラサイク
リンを添加して実施した。こうして得た培養液から遠心
分離によって上清を除去し、菌体を１００ｇ湿菌体／ｌ
となるように滅菌水に懸濁した。
【００９６】一方、実施例１２と同様にバチルス エス
ピー S16株(FERM BP-4647)を用いて調製したＤ−４−ヒ
ドロキシ−２−ケトグルタル酸含有ブロス上清（３８．
８ｍＭのＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を含
む）をファルコン社製2059チューブ２本に０．４ｍｌづ
つ分注し、先に調製した大腸菌菌体懸濁液を８０μｌづ
つ加えさらに各チューブに２０％硫酸アンモニウム溶液
４０μｌ、５０％グルコース溶液４８μｌおよびＭ９Ｃ
溶液８０μｌを添加し、滅菌水で総量を０．８ｍｌに合
わせ、３７℃で振とうし３時間反応させた。反応終了
後、遠心分離操作によって菌体を除き、上清のγ−ヒド
ロキシ−Ｌ−グルタミン酸を実施例１と同様にＨＰＬＣ
により定量した。定量値を第１３表（実施例１２参照）
に示す。
ピー S16株(FERM BP-4647)を用いて調製したＤ−４−ヒ
ドロキシ−２−ケトグルタル酸含有ブロス上清（３８．
８ｍＭのＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を含
む）をファルコン社製2059チューブ２本に０．４ｍｌづ
つ分注し、先に調製した大腸菌菌体懸濁液を８０μｌづ
つ加えさらに各チューブに２０％硫酸アンモニウム溶液
４０μｌ、５０％グルコース溶液４８μｌおよびＭ９Ｃ
溶液８０μｌを添加し、滅菌水で総量を０．８ｍｌに合
わせ、３７℃で振とうし３時間反応させた。反応終了
後、遠心分離操作によって菌体を除き、上清のγ−ヒド
ロキシ−Ｌ−グルタミン酸を実施例１と同様にＨＰＬＣ
により定量した。定量値を第１３表（実施例１２参照）
に示す。
【００９７】実施例１４ バチルス エスピー OC187株(FERM BP-4646)を実施例１
１と同様に培養した。培養終了後、１本の試験管には８
０℃で１時間加熱する処理を施し、もう一本は３０℃に
保った。ついで遠心分離操作で各々菌体を集め、反応液
(a) １ｍｌに懸濁して３０℃で５時間反応を行った。反
応液中に生成した４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸
（表中ＫＨＧと略記）量を実施例１２と同様に測定し、
第１４表に示した。さらにこの反応液を遠心分離して得
た上清０．４ｍｌに実施例１３と同様にHKK27/pHK10株
の菌体懸濁液、グルコース、硫酸アンモニウム、Ｍ９Ｃ
溶液を加え、滅菌水で総量を０．８ｍｌに合わせ３７℃
で３時間振とうし反応させた。反応終了後、遠心分離操
作によって菌体を除き、上清のγ−ヒドロキシ−Ｌ−グ
ルタミン酸（表中HGと略記）をＨＰＬＣにより定量し
た。定量値を第１４表に示す。
１と同様に培養した。培養終了後、１本の試験管には８
０℃で１時間加熱する処理を施し、もう一本は３０℃に
保った。ついで遠心分離操作で各々菌体を集め、反応液
(a) １ｍｌに懸濁して３０℃で５時間反応を行った。反
応液中に生成した４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸
（表中ＫＨＧと略記）量を実施例１２と同様に測定し、
第１４表に示した。さらにこの反応液を遠心分離して得
た上清０．４ｍｌに実施例１３と同様にHKK27/pHK10株
の菌体懸濁液、グルコース、硫酸アンモニウム、Ｍ９Ｃ
溶液を加え、滅菌水で総量を０．８ｍｌに合わせ３７℃
で３時間振とうし反応させた。反応終了後、遠心分離操
作によって菌体を除き、上清のγ−ヒドロキシ−Ｌ−グ
ルタミン酸（表中HGと略記）をＨＰＬＣにより定量し
た。定量値を第１４表に示す。
【００９８】
【表１４】
【００９９】実施例１５ 実施例１１と同様にバチルス エスピー S16株(FERM BP
-4647)をＧＭＳＧ培地１０ｍｌを入れた試験管１０本に
て３０℃で２０時間培養した。遠心分離操作によってこ
れら試験管１０本分の菌体を一つに集菌後１０ｍｌの反
応液(a) に懸濁し、３０℃で５時間反応を行った。この
反応液を遠心分離して得た上清をSUMICHIRAL OA-5000カ
ラム（住友化学社製）を用いたＨＰＬＣにより分析した
ところ４０．６ｍＭのＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグ
ルタル酸が生成していた。Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケ
トグルタル酸は認められなかった。
-4647)をＧＭＳＧ培地１０ｍｌを入れた試験管１０本に
て３０℃で２０時間培養した。遠心分離操作によってこ
れら試験管１０本分の菌体を一つに集菌後１０ｍｌの反
応液(a) に懸濁し、３０℃で５時間反応を行った。この
反応液を遠心分離して得た上清をSUMICHIRAL OA-5000カ
ラム（住友化学社製）を用いたＨＰＬＣにより分析した
ところ４０．６ｍＭのＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグ
ルタル酸が生成していた。Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケ
トグルタル酸は認められなかった。
【０１００】この反応上清を滅菌した太型試験管４本に
２．５ｍｌづつ分注し、さらに各試験管に滅菌した下記
の組成のＭＳＣ培地０．５ｍｌ、５０％グルコース溶液
０．５ｍｌおよび１０％塩化アンモニウム溶液１ｍｌを
添加した。さらにこの試験管の１本には、３ｍｌのＬ培
地を含む試験管で３０℃にて一晩培養したアースロバク
ター プロトフォルミアエATCC19271株の培養液０．５
ｍｌを、１本には同様に培養したシュウドモナス クロ
ロラフィスATCC9446株の培養液０．５ｍｌを、１本には
同様に培養したセラチア マルセセンスATCC13880 株の
培養液０．５ｍｌを、残りの１本には同様に培養したコ
リネバクテリウム グルタミクムATCC13032株の培養液
０．５ｍｌを加え、３０℃にて４８時間培養した。培養
終了後、遠心分離操作によって菌体を除き、上清のγ−
ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を実施例１と同様にＨＰ
ＬＣにより定量した。定量値を第１５表に示す。
２．５ｍｌづつ分注し、さらに各試験管に滅菌した下記
の組成のＭＳＣ培地０．５ｍｌ、５０％グルコース溶液
０．５ｍｌおよび１０％塩化アンモニウム溶液１ｍｌを
添加した。さらにこの試験管の１本には、３ｍｌのＬ培
地を含む試験管で３０℃にて一晩培養したアースロバク
ター プロトフォルミアエATCC19271株の培養液０．５
ｍｌを、１本には同様に培養したシュウドモナス クロ
ロラフィスATCC9446株の培養液０．５ｍｌを、１本には
同様に培養したセラチア マルセセンスATCC13880 株の
培養液０．５ｍｌを、残りの１本には同様に培養したコ
リネバクテリウム グルタミクムATCC13032株の培養液
０．５ｍｌを加え、３０℃にて４８時間培養した。培養
終了後、遠心分離操作によって菌体を除き、上清のγ−
ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を実施例１と同様にＨＰ
ＬＣにより定量した。定量値を第１５表に示す。
【０１０１】ＭＳＣ培地（１ｌあたり）： ＫＨ2ＰＯ4 ２０ ｇ （ＮＨ4）2ＳＯ4 ２０ ｇ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５０ ｍｇ ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０ ｍｇ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ ｇ ＣａＣｌ2 １００ ｍｇ 酵母エキス １０ ｇ ペプトン １０ ｇ ｐＨ ７．０
【０１０２】
【表１５】
【０１０３】実施例１６ バチルス エスピー S16株(FERM BP-4647)をＬ培地９ｍ
ｌに接種し３０℃で１６時間振とう培養した。この培養
液全量を３００ｍｌのＧＭＳＧ培地に接種し２ｌ容の三
角フラスコにて３０℃、２０時間振とう培養した。得ら
れた培養液から菌体を遠心分離し、反応液(a) ６０ｍｌ
に懸濁し、３００ｍｌ容ビーカー中で撹拌しつつ反応を
行った。反応開始６時間後にピルビン酸ナトリウム２Ｍ
溶液３ｍｌとグリオキシル酸ナトリウム２Ｍ溶液３ｍｌ
を添加した。反応開始後２４時間目に遠心分離によって
反応液から菌体を除き、１次反応液上清を得た。
ｌに接種し３０℃で１６時間振とう培養した。この培養
液全量を３００ｍｌのＧＭＳＧ培地に接種し２ｌ容の三
角フラスコにて３０℃、２０時間振とう培養した。得ら
れた培養液から菌体を遠心分離し、反応液(a) ６０ｍｌ
に懸濁し、３００ｍｌ容ビーカー中で撹拌しつつ反応を
行った。反応開始６時間後にピルビン酸ナトリウム２Ｍ
溶液３ｍｌとグリオキシル酸ナトリウム２Ｍ溶液３ｍｌ
を添加した。反応開始後２４時間目に遠心分離によって
反応液から菌体を除き、１次反応液上清を得た。
【０１０４】一方、HKK27/pHK10株をテトラサイクリン
１０ｍｇ／ｌを加えた１０ｍｌのＬ培地で３７℃にて一
晩培養した。この培養液全量を、グルコース０．４％、
コハク酸０．０５％、硫酸アンモニウム０．２％、Ｌ−
トリプトファン１００ｍｇ／ｌ、酵母エキス０．１％、
ペプトン０．１％、テトラサイクリン１０ｍｇ／ｌを加
えたＭ９培地７５０ｍｌを含む２ｌ容三角フラスコに添
加し、３７℃にて８時間培養した。こうして得た培養液
から遠心分離によって上清を除去し、菌体を１００ｇ湿
菌体／ｌとなるように滅菌水に懸濁した。
１０ｍｇ／ｌを加えた１０ｍｌのＬ培地で３７℃にて一
晩培養した。この培養液全量を、グルコース０．４％、
コハク酸０．０５％、硫酸アンモニウム０．２％、Ｌ−
トリプトファン１００ｍｇ／ｌ、酵母エキス０．１％、
ペプトン０．１％、テトラサイクリン１０ｍｇ／ｌを加
えたＭ９培地７５０ｍｌを含む２ｌ容三角フラスコに添
加し、３７℃にて８時間培養した。こうして得た培養液
から遠心分離によって上清を除去し、菌体を１００ｇ湿
菌体／ｌとなるように滅菌水に懸濁した。
【０１０５】上記のごとくして得たHKK27/pHK10懸濁液
８ｍｌ、５０％グルコース溶液４．８ｍｌ、２０％硫酸
アンモニウム溶液４ｍｌ、Ｍ９Ｃ溶液８ｍｌ、滅菌水
５．２ｍｌを先に調製した１次反応液５０ｍｌに添加
し、３００ｍｌ容ビーカー中で撹拌しつつ２次反応を行
った。２次反応中は７％アンモニア水にてｐＨを７に維
持した。１２時間反応後、遠心分離操作によって菌体を
除き、上清のγ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸をＯＤ
Ｓカラム（メルク社製）を用いたＨＰＬＣにより定量し
た結果、８．６ｇ／ｌのエリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ
−グルタミン酸が検出された。
８ｍｌ、５０％グルコース溶液４．８ｍｌ、２０％硫酸
アンモニウム溶液４ｍｌ、Ｍ９Ｃ溶液８ｍｌ、滅菌水
５．２ｍｌを先に調製した１次反応液５０ｍｌに添加
し、３００ｍｌ容ビーカー中で撹拌しつつ２次反応を行
った。２次反応中は７％アンモニア水にてｐＨを７に維
持した。１２時間反応後、遠心分離操作によって菌体を
除き、上清のγ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸をＯＤ
Ｓカラム（メルク社製）を用いたＨＰＬＣにより定量し
た結果、８．６ｇ／ｌのエリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ
−グルタミン酸が検出された。
【０１０６】実施例１７ 実施例１４で得た２次反応上清７５ｍｌを強酸性陽イオ
ン交換樹脂〔ダウエックス50 x 8（Na型）、ダウケミカ
ル社製〕のカラムに通塔し、アンモニアでエリスロ−γ
−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を溶出分離し、濃縮、
晶出することにより、０．５ｇのエリスロ−γ−ヒドロ
キシ−Ｌ−グルタミン酸の結晶を得た。
ン交換樹脂〔ダウエックス50 x 8（Na型）、ダウケミカ
ル社製〕のカラムに通塔し、アンモニアでエリスロ−γ
−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を溶出分離し、濃縮、
晶出することにより、０．５ｇのエリスロ−γ−ヒドロ
キシ−Ｌ−グルタミン酸の結晶を得た。
【０１０７】
【発明の効果】本発明によれば、グルタミンシンターゼ
やプレシナプス前顆粒のグルタミン酸取り込みを阻害す
る作用が知られ、これら酵素や器官の研究用試薬および
これら作用に基づく医薬品として有用である光学活性−
γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を工業的に有利に提
供することができる。
やプレシナプス前顆粒のグルタミン酸取り込みを阻害す
る作用が知られ、これら酵素や器官の研究用試薬および
これら作用に基づく医薬品として有用である光学活性−
γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を工業的に有利に提
供することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 15/01 (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:425） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (18)
- 【請求項１】 アミノ基供与体存在下、ピルビン酸とグ
リオキシル酸から光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタ
ミン酸を生成する活性を有する生体触媒（以下、生体触
媒Ｉという。）、アミノ基供与体、ピルビン酸およびグ
リオキシル酸を水性媒体中に存在させることにより、水
性媒体中に光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸
を生成させ、生成した光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グ
ルタミン酸を該水性媒体中より採取することを特徴とす
る光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の製造
法。 - 【請求項２】 アミノ基供与体存在下、光学活性４−ヒ
ドロキシ−２−ケトグルタル酸を光学活性γ−ヒドロキ
シ−Ｌ−グルタミン酸に変換する活性を有する生体触媒
（以下、生体触媒IIという。）、アミノ基供与体および
光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を水性媒
体中に存在させることにより、水性媒体中に光学活性γ
−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を生成させ、生成した
光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を該水性媒
体中より採取することを特徴とする光学活性γ−ヒドロ
キシ−Ｌ−グルタミン酸の製造法。 - 【請求項３】 光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミ
ン酸がスレオ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸[(2
S,4S)-4-hydroxyglutamic acid]またはエリスロ−γ−
ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸[(2S,4R)-4-hydroxyglut
amic acid]である請求項１または２記載の製造法。 - 【請求項４】 ピルビン酸が生体触媒Ｉによりピルビン
酸に転換される化合物である請求項１または３記載の製
造法。 - 【請求項５】 生体触媒Ｉによりピルビン酸に転換され
る化合物がグルコース、フラクトース、マルトース、グ
リセロール、乳酸または乳酸アンモニウムでである請求
項４記載の製造法。 - 【請求項６】 生体触媒Ｉが微生物の培養物、菌体また
はそれらの処理物である請求項１、３、４または５記載
の製造法。 - 【請求項７】 微生物が、シュウドモナス属、パラコッ
カス属、プロビデンシア属、リゾビウム属、モルガネラ
属、エンテロバクター属、アースロバクター属、カウロ
バクター属、ミクロバクテリウム属、クロトバクテリウ
ム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、
クラビバクター属またはバチルス属に属する微生物であ
る請求項６記載の製造法。 - 【請求項８】 光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミ
ン酸がスレオ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸であ
り、微生物が、シュウドモナス属、パラコッカス属、プ
ロビデンシア属、リゾビウム属、モルガネラ属、エンテ
ロバクター属、アースロバクター属、カウロバクター
属、ミクロバクテリウム属、クロトバクテリウム属、ブ
レビバクテリウム属、コリネバクテリウム属またはクラ
ビバクター属に属する微生物である請求項６記載の製造
法。 - 【請求項９】 光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミ
ン酸がエリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸で
あり、微生物がバチルス属に属する微生物である請求項
６記載の製造法。 - 【請求項１０】 光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグ
ルタル酸が、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸
[(S)-4-hydroxy-2-ketoglutaric acid] またはＤ−４−
ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸[(R)-4-hydroxy-2-ket
oglutaric acid] である請求項２記載の製造法。 - 【請求項１１】 生体触媒IIが微生物の培養物、菌体ま
たはそれらの処理物である請求項２または１０記載の製
造法。 - 【請求項１２】 微生物が、エシェリヒア属、セラチア
属、シュウドモナス属、アースロバクター属またはコリ
ネバクテリウム属に属する微生物である請求項１１記載
の製造法。 - 【請求項１３】 微生物が、α−ケトグルタル酸デヒド
ロゲナーゼ（α-ketoglutarate dehydrogenase）活性お
よび光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸分解
活性の少なくとも一種の活性が低下または欠失した菌株
である請求項１２記載の製造法。 - 【請求項１４】 微生物が、グルタミン酸デヒドロゲナ
ーゼを増強された菌株である請求項７、８、９、１２ま
たは１３記載の製造法。 - 【請求項１５】 光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグ
ルタル酸が、ピルビン酸とグリオキシル酸から光学活性
４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する活性を
有する生体触媒（以下、生体触媒IIIという。）、ピル
ビン酸およびグリオキシル酸を水性媒体中に存在させる
ことにより、生成した光学活性４−ヒドロキシ−２−ケ
トグルタル酸である、請求項２、１０、１１、１２、１
３または１４記載の製造法。 - 【請求項１６】 生体触媒IIIが微生物の培養物、菌体
またはそれらの処理物である請求項１５記載の製造法。 - 【請求項１７】 微生物がセルビブリオ属またはバチル
ス属に属し、かつピルビン酸およびグリオキシル酸から
Ｄ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能
力を有する微生物である請求項１６記載の製造法。 - 【請求項１８】 微生物が、シュウドモナス属、パラコ
ッカス属、プロビデンシア属、リゾビウム属またはモル
ガネラ属に属し、かつピルビン酸およびグリオキシル酸
からＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成す
る能力を有する微生物である請求項１６記載の製造法。
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| JP15865694 | 1994-07-11 | ||
| JP11553595A JP3737157B2 (ja) | 1994-07-11 | 1995-05-15 | 光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の製造法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010193760A (ja) * | 2009-02-24 | 2010-09-09 | Kao Corp | タンパク質又はポリペプチドの製造方法 |
| JP2014508766A (ja) * | 2011-03-04 | 2014-04-10 | 北京科▲潤▼三▲聯▼生物技▲術▼有限▲責▼任公司 | 組み換え型ポリペプチド系新規抗菌薬の製造方法 |
| JP2014533511A (ja) * | 2011-11-25 | 2014-12-15 | 畿晋▲慶▼三▲聯▼（北京）生物技▲術▼有限公司Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂ， Ｌｔｄ． | 遺伝子組換え菌の組換えタンパク質を高効率で発現する方法およびそれを用いた組換えポリペプチドの調整方法 |
-
1995
- 1995-05-15 JP JP11553595A patent/JP3737157B2/ja not_active Expired - Fee Related
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