KR20080075979A - 아미코라톱시스 오리엔탈리스 변이주 및 이를 이용한반코마이신 염산염의 제조방법 - Google Patents

아미코라톱시스 오리엔탈리스 변이주 및 이를 이용한반코마이신 염산염의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글라이코펩타이드계 항생제인 반코마이신을 생성하는 아미코라톱시스 오리엔탈리스(Amycolatopsis orientalis) 변이주(한국미생물보존센터 기탁번호 KCCM-10836P호로 기탁) 및 그 변이주를 이용하여 탄소원, 질소원 및 무기질 미량원소 등의 배지 조성 및 배양 조건 최적화를 수행하고, 다단계 컬럼으로 구성된 정제 공정과 반코마이신 염산염의 결정화 과정을 개선함으로써 고수율, 고생산성으로 반코마이신 염산염을 발효 생성 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.
Figure P1020070015271
반코마이신, 아미코라톱시스 오리엔탈리스, 변이주, 발효 배양, 정제, 크로마토그래피

Description

아미코라톱시스 오리엔탈리스 변이주 및 이를 이용한 반코마이신 염산염의 제조방법{Mutant strain of Amycolaptosis orientalis and process for preparing vancomycin hydrochloride}
도 1은 본 발명의 변이주 아미코라톱시스 오리엔탈리스 BNG 716(기탁번호 KCCM-10836P호)를 이용한 배양 혼합액에 HPLC 분리 분석 결과를 나타낸 도면이다. 주 피크인 6.466분은 반코마이신의 피크를 나타낸다. 또한 이때 피크 면적인 반코마이신의 함량은 전체 혼합액의 함유 물질 중 78.447%을 나타낸다.
도 2는 친주 아미코라톱시스 오리엔탈리스(ATCC-19775호)를 이용한 배양 혼합액에 HPLC 분리 분석 결과를 나타낸 도면이다. 주 피크인 6.489분은 반코마이신의 피크를 나타낸다. 또한 이때 피크 면적인 반코마이신의 함량은 전체 혼합액의 함유 물질 중 52.080%을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예 10에 따른 방법을 이용하여 정제된 반코마이신 염산염의 HPLC 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 미국 약전에서 기재된 반코마이신 참고 표준물질(Cat. No. USP 1709007)의 HPLC 분석 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명은 글라이코펩타이드계 항생제인 반코마이신을 생성하는 아미코라톱시스 오리엔탈리스(Amycolatopsis orientalis) 변이주(한국미생물보존센터 기탁번호 KCCM-10836P호로 기탁) 및 그 변이주를 이용하여 탄소원, 질소원 및 무기질 미량원소 등의 배지 조성 및 배양 조건 최적화를 수행하고, 다단계 컬럼으로 구성된 정제 공정과 반코마이신 염산염의 결정화 과정을 개선함으로써 고수율, 고생산성으로 반코마이신 염산염을 발효 생성 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.
반코마이신은 글라이코펩타이드계의 항생제로서 병원균 세포벽의 합성을 저해하는 항균 기작을 갖는다. 모든 그람양성 세균성 질환의 치료에 사용되며 페니실린이나 세파로스포린계의 항생제에 저항성이 있는 세균성 질환에 광범위하게 사용된다. 또한 수술 환자 및 고령 환자, 면역력이 약한 사람에게 치명적인 메치실린 내성 황색 포도상 구균(MRSA)을 치료하는 유일한 항생제로 사용되고 있는 고부가가 치 항생제이다.
반코마이신을 제조하기 위한 공지의 방법들의 발효농도는 매우 낮다. 미국 특허 제3,067,099호에서 개시한 반코마이신의 발효 생성 기술은 균주의 역가가 0.2 mg/mL로 매우 낮고 생산비용이 높은 단점이 있었다.
이를 해결하기 위해 반코마이신 생성 수율이 높은 각종 변이주를 개발하였는 바, 대한민국 특허 공개공보 제93-13090호에서는 노카르디아 속 변이주 KFCC-10745호를 개발하여 발효 배양시켜 반코마이신을 발효 생성하였으며, 또한 대한민국 특허 공개공보 제93-13091호에서도 노카르디아 속 변이주 KFCC-10744호를 개발하여 발효 배양시켜 반코마이신을 발효 생성하였다. 한편, 대한민국 특허 공개공보 제93-13090호에서는 상기 변이주 KFCC-10745호를 질소원으로 글루텐 및 대두박을 1.0∼2.0% 함유한 배양액에서 배양하여 반코마이신을 고수율로 축적시켜 제조하는 방법을 개시하고 있다.
그러나, 상기 노카르디아 속 변이주(최근 아미코라톱시스 속으로 속명 변경)들은 균주의 역가가 6.1 mg/mL 정도로 현저히 개선되기는 하였으나, 불순물의 함량이 높고 독성이 강하여 그 상용화가 현실적으로 어려울 뿐만 아니라 여전히 생산비용이 높은 단점이 있었던 것이다.
이에 본 출원인은 대한민국 특허등록 제421,712호 '반코마이신 생성 아미코라톱시스 오리엔탈리스 변이주 및 이를 이용한 반코마이신의 발효 제조방법'에서 반코마이신을 과량 생산하는 아미코라톱시스 오리엔탈리스(Amycolatopsis orientalis) 미생물 변이주를 개발하고, 무기염류, 비타민, 멜라닌 생합성 저해제 등의 미량원소를 함유하는 배지조성 및 배양조건을 최적화함으로써 고수율로 반코마이신을 제조하는 방법을 개시한 바 있다.
그러나 본 발명자들은 종래에 개발된 반코마이신 생성 변이주보다 생산성이 크게 향상된 새로운 변이주를 분리 개발하고, 그 변이주를 이용하여 질소원, 탄소원, 무기질 미량원소 등을 지닌 신규한 배지 조성의 배지에서 최적 배양조건으로 발효 배양을 수행하고, 발효 배양조에서 다단계 컬럼 크로마토그래피 정제 공정 및 반코마이신 염산염 결정화 공정을 통해 고수율 고순도로 반코마이신 염산염을 제조하는 방법을 개발한 것이다.
또한 본 발명자들은 본 발명에서 분리된 아미코라톱시스 오리엔탈리스 변이주를 이용하여 질소원의 농도를 적절히 조절하고, 멜라닌 생합성 억제제와 같은 특수한 미량원소를 적정 농도로 첨가하면 반코마이신의 생산성이 증가됨을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 글라이코펩타이드계 항생제인 반코마이신을 과량 생산하는 아미코라톱시스 오리엔탈리스 미생물 변이주를 분리하고, 그 분리된 변이주를 최적 배지 조성에서 최적 배양 조건으로 발효 배양시키고 반코마이신을 분리 정제 결정화함으로써 고수율 고순도로 반코마이신 염산염을 발효 제조하고자 하는 것이다.
따라서 본 발명의 목적은 고순도 고수율로 반코마이신을 생성하는 아미코라톱시스 오리엔탈리스 변이주 BNG 716(기탁번호 KCCM-10836P호)을 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 야생주 아미코라톱시스 오리엔탈리스 ATCC-19795를 NTG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)을 사용하여 인공돌연변이시켜 반코마이신에 대한 자기내성 향상 균주를 선별 배지에서 분리하는 단계 및 상기 선별된 자기내성 향상 균주를 NTG를 사용하여 인공돌연변이시켜 반코마이신 생성능이 극대화된 변이주를 선별 배지에서 분리하는 단계로 구성된 아미코라톱시스 오리엔탈리스 변이주 BNG 716(기탁번호 KCCM-10836P호)의 분리 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 ⅰ) 아미코라톱시스 오리엔탈리스 변이주 BNG 716(기탁번호 KCCM-10836P호)을 종배양시키는 단계; ⅱ) 상기 종배양된 변이주를 12∼18% 덱스트린, 2.2∼3.8% 콩가루, 1.9∼2.9% 감자단백, 0.10∼0.14% 염화나트륨, 소량의 미네랄과 비타민, 멜라닌 생합성 제해제 농도를 조절시킨 배양 배지에서 발효 배양시키는 단계; ⅲ) 상기 발효 배양액에서 마이크로필터를 이용하여 변이주 균주를 제거하고 조 반코마이신을 수득하는 단계; 및 ⅳ) 상기 조 반코마이신을 양이온 교환수지 컬럼, 음이온 교환수지 컬럼, 소수성 흡착수지 컬럼, 활성탄, 활성 알루미나 흡착 컬럼을 통해 분리 정제시키고 염산으로 결정화시키는 단계로 구성된 반코마이신 염산염의 제조 방법을 제공하는 것이다.
또한, 상기 배양 배지는 초기 질소원으로 콩가루 및 감자단백의 농도를 각각 2∼4(w/v)%로 조절하고, 1∼100 mg/L의 칼슘(CaCl2·2H2O)이나 1∼100 mg/L의 피리독신(pyridoxine)을 더욱 첨가시킨 것을 특징으로 하고, 1∼100 mg/L의 칼슘과 1∼100 mg/L의 피리독신(pyridoxine), 1∼100 mg/L의 아부틴(arbutin), 하이드로퀴논(hydroquinone), 트리사이클라졸(tricyclazole)에서 선택된 멜라닌 생합성 억제제를 더욱 첨가한 것을 특징으로 한다.
또한 상기 조 반코마이신의 분리 정제는 강산성 양이온 교환수지 컬럼에서 반코마이신은 통액되고 불순물은 양이온 수지에 흡착되며, 약염기성 음이온 교환수지 컬럼에서 반코마이신은 통액되고 불순물은 음이온 수지에 흡착되며, 소수성 흡 착수지 컬럼에서 반코마이신은 흡착되고 이를 5∼15% 에탄올로 용출시키고, 활성탄에 분순물 흡착시 반코마이신 함유액과 탄소수 1∼4의 저급 알코올을 1 : 1로 혼합시켜 처리하고, 활성 알루미나 흡착 컬럼에서 흡착된 반코마이신을 35∼60% 이소프로판올로 용출시킴을 특징으로 한다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
상기 변이주는 야생주 아미코라톱시스 오리엔탈리스 ATCC-19795호를 모균주로 사용하여 NTG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)을 사용하여 인공돌연변이시켜 반코마이신에 의해 성장이 억제되는 바실러스 속 배양액을 분주하여 동 균주를 배양 후 억제환의 크기가 모균주보다 큰 변이주 가운데 콜로니의 크기, 색깔, 형태 변화에 따라 변이주를 분리시켜 반코마이신 내성 향상주를 분리하고, 다시 NTG (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)을 사용하여 인공돌연변이시켜 재차 반코마이신 내성 향상 및 반코마이신 생성능력 향상 균주를 분리함을 특징으로 한다.
또한 미생물에 의하여 반코마이신을 생산할 때 질소원 및 미량원소가 결핍 또는 과잉시에 배양시간이 경과함에 따라 반코마이신의 생산성이 낮아지는 단점이 있으나, 이러한 단점을 극복하기 위해 질소원, 미네랄 이온 또는 비타민의 농도를 조절하여 반코마이신의 생산성을 증가시킨 것이다.
본 발명의 변이주 분리 방법은 다음과 같다. 반코마이신 생산균주인 아미코라톱시스 오리엔탈리스 ATCC-19795 모균주로부터 돌연변이원으로 NTG (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)을 사용하는 인공 돌연변이법과 단일 콜로니 분리방법을 이용하여 반코마이신 생성 능력이 향상된 변이주를 획득하였다.
본 발명은 아미코라톱시스 오리엔탈리스 야생주에 인공돌연변이를 통해 반코마이신 생합성 과정을 변형시켜 반코마이신에 내성을 나타내며, 반코마이신 생성능력이 향상된 특성을 지니는 반코마이신 고생산성 균주를 분리한 후 배양 조건을 최적화하는 것으로 구성된다.
야생주 아미코라톱시스 오리엔탈리스 균주의 포자 현탁액에 돌연변이원인 NTG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)을 처리하였다. 돌연변이 처리한 포자 현탁액을 생리식염수로 적절히 희석하여 반코마이신이 0.1∼50 g/L 첨가된 선별배지에 도말하여 28∼32℃에서 4일간 배양하였다. 모균주보다 높은 반코마이신 농도에서 성장한 콜로니를 반코마이신이 첨가되지 않은 평판배지에 옮겨 28∼32℃에서 3일간 배양 후 반코마이신에 의해 성장이 억제되는 바실러스 써브틸리스(Bacillus subtilis, ATCC-6633) 배양액을 분주하여 28∼32℃에서 20∼28시간 배양하였다. 모균주보다 생장 억제환의 크기가 큰 변이주 가운데 콜로니 크기, 콜로니 색깔, 콜로니 형태 변화에 따라 변이주를 분리하여 삼각플라스크 및 발효조에서 확인 실험을 거쳐 모균주보다 반코마이신 생성 능력이 향상된 균주를 선별하였다. 반코마이신에 내성이 증가된 균주 가운데 반코마이신 생성능력이 향상된 변이주를 1차적으로 선별하기 위해 바실러스 써브틸리스(Bacillus subtilis, ATCC-6633)를 이용하였으며, 배지는 표 1의 선별배지를 이용하였다.
선별배지의 성분 구성표
성분 농도
가수분해 전분(soluble starch) 1.0 %
박토 소이톤(bacto soytone) 1.0 %
한천 2 %
이 변이주를 다시 돌연변이원인 250∼280 nm 자외선을 이용하여 상기 방법에 의해 변이주 선별을 반복함으로써 20 g/L 반코마이신이 첨가된 선별배지에서 성장하며 반코마이신 생성능력이 모균주보다 2배 이상 증가된 변이주 아미코라톱시스 오리엔탈리스 BNG 716(기탁번호 KCCM-10836P호)을 선별하였다.
본 발명의 변이주 아미코라톱시스 오리엔탈리스 BNG 716은 2007년 1월 12일 서울특별시 서대문구 홍제1동 361-221호에 소재하는 한국미생물보존센터에 기탁번호 KCCM-10836P호로 부다페스트 조약에 의거 국제기탁하였다.
본 발명에서 분리된 변이주의 배양방법과 분석방법은 다음과 같다.
본 발명 변이주의 배양 방법은 실시예의 기재와 같이 32∼36℃, 230∼270 rpm에서 4∼5일간 배양하였다. 반코마이신의 농도는 역상컬럼(Reversed phase column, YMC, Japan)이 장착된 HPLC의 Ultraviolet Detector(254 nm, Waters 486 tunable absorbance detector, USA)를 이용하여 측정하였다.
이때, 용매는 물, 아세토니트릴, 트리에틸아민, 테트라하이드로퓨란을 88.9 : 10 : 0.2 : 1 로 섞어 인산으로 pH 3.2가 되도록 조정하여 사용하였고, 유속은 1.0 mL/min이었다. 균체농도는 배양액 10 mL을 450 g에서 10분간 원심분리하여 PMV (Packed Mycelium Volume)을 측정하였다. 용존산소의 농도는 Ingold사(Swiss, polarographic type)의 용존산소 전극을 사용하여 측정하였다.
친주 아미코라톱시스 오리엔탈리스(ATCC-19775호)와 가장 높은 반코마이신 생산성을 나타내는 본 발명 변이주 아미코라톱시스 오리엔탈리스 BNG 716(KCCM-10836P호), 아미코라톱시스 KFCC-10990호(대한민국 특허등록 제246,094호, 1999년 12월 3일)와의 반코마이신에 대한 내성 차이는 표 2와 같고 형태적, 생리적, 생화학적 특성은 아래 표 3과 같았다.
Figure 112007013568093-PAT00002
본 발명 변이주 아미코라톱시스 오리엔탈리스 BNG 716과 친주의 형태적, 생리적, 생화학적 특성
특성 친주 (ATCC-19795) 변이주 (KFCC-10990) 본 발명 변이주 (KCCM-10836P)
균사 형태 가지형 가지형 가지형
콜로니 색깔 노란색 흰색 흰색
포자생성 + + +
Gram 염색 + + +
산소 요구성 호기성 호기성 호기성
영양 요구성 - - -
운동성 - - -
온도 25-37℃ 28-38℃ 23-35℃
pH 6.5-8.0 6.8-8.0 5.5-7.5
Glucose 이용 + + +
Fructose 이용 + + +
Maltose 이용 + + +
Raffinose 이용 - - -
표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 변이주는 최적 배양 온도가 모균주 및 변이주(KFCC-10990)에 비해 2℃ 이상 낮았고 최적 pH 역시 0.5∼1.0 정도 낮은 특성을 나타내었다.
본 발명을 실시예에 따라 상술하면 다음과 같다.
(실시예 1) 삼각플라스크에서 친주 및 본 발명 변이주의 반코마이신 생산력 비교 실험
선별된 균주의 반코마이신 생산성을 다음과 같은 조건에서 비교하였다. 선별된 각각의 균주들을 50 mL의 생산배지(표 4)가 담긴 500 mL 삼각플라스크에 접종하여 250 rpm, 34℃에서 96∼120시간 동안 배양하였다. 세포를 제거한 배양액을 HPLC로 분석하여 반코마이신 생산능을 조사하였고, 반코마이신 생산능이 가장 높은 본 발명 변이주(기탁번호 KCCM-10836P호)를 선별하였으며 그 결과는 아래 표 5와 같다.
생산 배지의 성분 구성표
성분 농도
덱스트린(dextrin) 10 %
콩가루(soybean flour) 1.8 %
감자단백(potato protein) 1.8 %
염화나트륨(NaCl) 0.12 %
친주와 본 발명 변이주의 반코마이신 생산성
균주 생장(PMV) 반코마이신 (g/L)
친주 (ATCC-19795) 28 3.3
본 발명 변이주 (KCCM-10836P) 40 6.1
도 1은 본 발명의 변이주 아미코라톱시스 오리엔탈리스 BNG 716(기탁번호 KCCM-10836P호)를 이용한 배양 혼합액에 HPLC 분리 분석 결과를 나타낸 도면이다. 주 피크인 6.466분은 반코마이신의 피크를 나타낸다. 또한 이때 피크 면적인 반코마이신의 함량은 전체 혼합액의 함유 물질 중 78.447%을 나타낸다.
도 2는 친주 아미코라톱시스 오리엔탈리스(ATCC-19775호)를 이용한 배양 혼합액에 HPLC 분리 분석 결과를 나타낸 도면이다. 주 피크인 6.489분은 반코마이신의 피크를 나타낸다. 또한 이때 피크 면적인 반코마이신의 함량은 전체 혼합액의 함유 물질 중 52.080%을 나타낸다.
이와 같은 HPLC 분석을 통해 본 발명의 변이주 아미코라톱시스 오리엔탈리스 BNG 716(기탁번호 KCCM-10836P호)의 반코마이신 생성 능력은 친주 아미코라톱시스 오리엔탈리스(ATCC-19775호)의 반코마이신 생성 능력보다 약 50% 이상 향상된 것임을 알 수 있는 것이다.
(실시예 2) 반코마이신 발효 생성 시험(덱스트린 농도 변화에 따른 반코마이신 생산 실험)
7L 발효조에서 덱스트린 농도에 따른 본 발명 변이주 아미코라톱시스 오리엔탈리스의 반코마이신 생산 실험을 수행하였다.
종 배양 : 보관된 아미코라톱시스 오리엔탈리스의 단일 군락을 전 배양 배지 50 mL가 들어있는 500 mL 플라스크에 접종하여 진탕배양기에서 250 rpm, 30℃로 24시간 동안 배양하였다. 0.1 mL의 배양액을 100 mL의 종배지가 들어있는 500 mL의 플라스크에 접종하여 250 rpm, 30℃로 60시간 동안 배양하였다. 200 mL의 배양액을 4000 mL의 생산배지가 들어있는 7L의 발효조에 접종하여 900 rpm, 34℃, pH 7.5로 120시간 동안 배양하였다.
종 배양(전 배양) 배지의 성분 구성표
성분 농도
포도당(Glucose) 1.7 %
맥아추출물(Malt extract) 0.3 %
효모추출물(Yeast extract) 0.3 %
펩톤(Peptone) 1.1 %
종 배지의 성분 구성표
성분 농도
덱스트린(Dextrin) 5.0 %
콩가루(Soybean flour) 0.5 %
감자단백(potato protein) 0.5 %
칼슘카보네이트(CaCO3) 0.3 %
본 배양 : 7L 발효조(한국발효기(주))에서 본 배양을 수행하였다. 배양에서 5∼20%의 덱스트린이 함유된 생산 배지의 부피가 4L이었고 발효과정 중에 교반속도는 용존산소가 20% 이상 유지되도록 700∼900 rpm으로 조절하였으며, 통기량은 1vvm으로 조절하였다. pH는 발효 전 과정 동안 7.5로 조절하였고 배양온도는 34℃이었다. 초기 덱스트린의 농도를 달리하여 실험한 결과 표 8과 같았고 15% Dextrin 농도에서 최적의 생산성이 나타났다.
아미코라톱시스 오리엔탈리스 속 변이주를 이용한 여러 가지 초기농도 덱스트린에서 반코마이신의 생산
덱스트린(%) 반코마이신(g/L) 생산성(g/L·h)
5 6.1 0.050
10 7.2 0.060
15 7.5 0.062
20 7.0 0.058
(실시예 3) pH 변화에 따른 반코마이신 생성 시험
7L 발효조에서 배양온도를 34℃로 하여 여러 pH별 실험을 수행하였다. 배양방법과 발효배지는 실시예 2와 같으며, 5.5∼8.0 사이로 pH를 달리하여 배양한 결과 표 9와 같았다.
여러 pH에서 아미코라톱시스 오리엔탈리스 속 변이주에 의한 반코마이신 생산
pH 반코마이신(g/L) 생산성(g/L·h)
5.5 6.0 0.050
6.5 7.2 0.060
7.5 8.0 0.066
8.0 4.0 0.033
(실시예 4) 온도 변화에 따른 반코마이신 생성 시험
7L 발효조에서 pH를 7.5로 하여 여러 배양온도별 실험을 수행하였다. 배양방법과 발효배지는 실시예 2와 같으며, 23∼37℃ 사이로 온도를 달리하여 배양한 결과 표 10과 같았다.
여러 온도에서 아미코라톱시스 오리엔탈리스 속 변이주에 의한 반코마이신 생산
온도 반코마이신(g/L) 생산성(g/L·h)
23 5.5 0.045
28 8.0 0.066
32 8.5 0.070
37 4.4 0.036
(실시예 5) 질소원(콩가루) 농도 변화에 따른 반코마이신 생성 시험
7L 발효조에서 pH 7.5, 온도 34℃로 하여 여러 질소원(콩가루) 농도별 실험을 수행하였다. 배양방법과 발효배지는 실시예 2와 같으며, 초기 질소원(콩가루)의 농도를 1.0∼3.5% 사이로 달리하여 배양한 결과 표 11과 같았고, 3% 콩가루 농도에서 최적의 생산성이 나타났다.
아미코라톱시스 오리엔탈리스 속 변이주를 이용하여 여러 가지 초기 농도의 질소원(콩가루) 에서 반코마이신의 생산
질소원(콩가루) (%) 반코마이신 (g/L) 균체량(PMV) (%) 생산성 (g/L·h)
1.0 7.5 38 0.062
1.8 8.5 42 0.073
2.4 9.0 46 0.075
3.0 9.2 45 0.076
3.5 8.9 41 0.074
(실시예 5) 질소원(감자단백) 농도변화에 따른 반코마이신 생성 시험
7L 발효조에서 pH 7.5, 온도 34℃로 하여 여러 질소원(감자단백) 농도별 실험을 수행하였다. 배양방법과 발효배지는 실시예 2와 같으며, 초기 질소원(감자단백)의 농도를 1.0∼3.5% 사이로 달리하여 배양한 결과 표 12와 같았고, 2.4% 감자단백 농도에서 최적의 생산성이 나타났다.
아미코라톱시스 오리엔탈리스 속 변이주를 이용하여 여러 가지 일정한 질소원(감자단백) 농도에서 반코마이신의 생산
질소원(감자단백) (%) 반코마이신 (g/L) 균체량(PMV) (%) 생산성 (g/L·h)
1.0 8.0 43 0.066
1.8 9.0 46 0.075
2.4 9.5 46 0.079
3.0 9.2 42 0.076
3.5 7.5 38 0.062
(실시예 6) CaCl2·2H2O의 농도 변화에 따른 반코마이신 생성 시험
7L 발효조에서 pH 7.5, 온도 34℃로 하여 여러 CaCl2·2H2O 농도별 실험을 수행하였다. 배양방법과 발효배지는 실시예 2와 같으며, 초기 CaCl2·2H2O의 농도를 0∼100 mg/L 사이로 달리하여 배양한 결과 표 13과 같았고, 40 mg/L 농도에서 최적의 생산성이 나타났다.
아미코라톱시스 오리엔탈리스 속 변이주를 이용하여 CaCl2·2H2O 농도에 따른 반코마이신의 생산
CaCl2·2H2O (mg/L) 반코마이신 (g/L) 균체량(PMV) (%) 생산성 (g/L·h)
0 9.5 46 0.079
10 9.8 48 0.081
20 10.3 50 0.085
40 10.9 55 0.090
80 8.9 42 0.074
100 8.5 42 0.070
(실시예 7) 피리독신 농도 변화에 따른 반코마이신 생성 시험
7L 발효조에서 pH 7.5, 온도 34℃로 하여 여러 피리독신 농도별 실험을 수행하였다. 배양방법과 발효배지는 실시예 2와 같으며, 초기 피리독신의 농도를 0∼100 mg/L 사이로 달리하여 배양한 결과 표 14와 같았고, 50 mg/L 농도에서 최적의 생산성이 나타났다.
아미코라톱시스 오리엔탈리스 속 변이주를 이용하여 피리독신(pyridoxine) 농도에 따른 반코마이신의 생산
피리독신 (mg/L) 반코마이신 (g/L) 균체량(PMV) (%) 생산성 (g/L·h)
0 9.5 46 0.079
10 10.8 46 0.091
20 11.2 50 0.093
40 11.5 52 0.095
50 12.1 56 0.100
80 10.6 50 0.088
100 10.6 51 0.088
(실시예 8) 칼슘(CaCl2·2H2O) 및 피리독신(Pyridoxine) 첨가에 따른 반코마이신 생성 시험
7L 발효조에서 pH 7.5, 온도 34℃로 하여 최적 농도의 칼슘(CaCl2·2H2O)과 피리독신을 함께 첨가하여 실험을 수행하였다. 배양방법과 발효배지는 실시예 2와 같으며, 초기 칼슘(CaCl2·2H2O)의 농도는 40 mg/L, 초기 피리독신의 농도는 50 mg/L이었다. 배양 결과 108시간 후에 12.5 g/L의 반코마이신을 생산하여 생산성 0.118 g/L-h를 나타내었다.
(실시예 9) 멜라닌 생합성 저해제의 첨가에 따른 반코마이신 생성 시험
7L 발효조에서 pH 7.5, 온도 34℃로 하여 여러 멜라닌 생합성 제해제 첨가 실험을 수행하였다. 배양방법과 발효배지는 실시예 2와 같으며, 멜라닌(melanin) 생합성 저해제는 아부틴(arbutin), 하이드로퀴논(hydroquinone), 트리사이클라졸(tricyclazole)을 각각 50 mg/L 농도로 첨가하였다. 각각의 멜라닌 생합성 저해제를 첨가하여 배양한 결과 표 15와 같았고, 아부틴, 하이드로퀴논, 트리사이클라졸을 50 mg/L 농도로 첨가한 경우 멜라닌 생합성 저해제를 첨가하지 않은 경우보다 각각 37.6%, 44.8%, 28.0% 반코마이신 생산이 증가하였다.
아미코라톱시스 오리엔탈리스 속 변이주를 이용하여 멜라닌 생합성 저해제(50 mg/L)의 첨가에 따른 반코마이신의 생산
멜라닌 생합성 저해제 (50 mg/L) 반코마이신 (g/L) 균체량(PMV) (%) 생산성 (g/L·h)
0 8.0 43 0.066
아부틴 9.0 46 0.075
하이드로퀴논 9.5 46 0.079
트리사이클라졸 9.2 42 0.076
(실시예 10) 반코마이신의 정제 시험
14 g/L의 농도로 반코마이신을 함유한 300 L 발효조에서 수득된 발효 배양액 200 L는 증류수 200 L와 혼합되었고 2N 염산을 첨가함으로서 pH가 2∼3으로 적정되었다. 400 L의 희석 발효 배양액은 규조토 필터를 통해 여과되어 500 L의 여과액이 수득되었다. 여과액이 수득된 후 2 N의 수산화나트륨이 첨가되어 pH 7∼8로 적정되었다.
여과액은 20 L의 강산성 양이온 교환수지(SK1B, Diaion, 일본), 20 L의 약염기성 음이온 교환수지(WA30, Diaion, 일본) 및 40 L의 소수성 흡착수지(HP20, Diaion, 일본)로 구성된 컬럼에 시간 당 60 L의 유속으로 통액되었다. 컬럼은 여과액의 로딩과 동일한 순서로 200 L의 증류수로 세척되었다. 세척 후 소수성 흡착수지에 흡착된 반코마이신은 시간 당 40 L의 유속으로 10∼15% 에탄올로 용출되었다. 반코마이신을 함유한 분획은 혼합되고, 균질화되고 나노-여과 시스템을 이용하여 100 g/L로 농축되었다.
농축액은(14 L) 동일한 부피의 이소프로판올과 혼합된 후 2 N의 수산화나트륨이 첨가되어 pH 4∼5로 적정되었다. 활성탄(840 g)이 혼합물에 첨가되었고 1시간 동안 천천히 교반된 후 규조토 필터로 여과되었다.
여과액은 산성 형태로 조건화된 9 L의 활성 알루미나(Wako, Japan)로 충전된 컬럼에 시간 당 9 L의 유속으로 통액되었다. 여과액 로딩이 완료된 후 50% 이소프로판올이 동일한 유속으로 컬럼을 통해 분출되었다. 컬럼 배출구로부터의 용액은 HPLC로 분획되고 분석되어 반코마이신의 순도를 검사하였다. 반코마이신의 93% 이상의 크로마토그래피 순도를 지닌 분획이 혼합되고 균질화되고 나노-여과 시스템에 의해 150 g/L까지 농축되었다.
93% 이상의 크로마토그래피 순도를 지닌 150 g/L 이상의 반코마이신을 함유한 농축액은 2 N 염산으로 pH 2∼3으로 적정된 후 약제 등급의 염화암모늄으로 포화된 수용액을 첨가함으로서 농축액의 전도성을 15∼20 ms/cm로 증가시켰다. 이후 농축액은 무균성이 확보할 뿐만 아니라 내독소를 제거하기 위해 0.2 ㎛의 세공을 지닌 필터로 통액된 후 20∼30℃에서 12시간 동안 정치되었다.
이후, 반코마이신 염산염이 결정화될 때까지 냉각된 무수 에탄올이 농축액에 한방울씩 첨가되었고, 결정화를 가속화시키기 위해 슬러리가 냉각기에서 12시간 동안 정치된 후 슬러리는 여과되었다. 여과된 침전물은 40℃의 진공 건조기 내에서 건조되었다. 건조된 반코마이신 염산염은 840 g의 중량을 지녔고 U.S. Pharmacopeia 28을 기반으로한 분석시 적어도 95% 이상의 크로마토그래피 순도 및 1050 U의 항균 활성을 지닌 백색의 자유롭게 용해 가능한 분말이었다. 분석 결과는 도 3 및 도 4에 나타나 있다.
도 3은 본 발명의 실시예 10에 따른 방법을 이용하여 정제된 반코마이신 염산염의 HPLC 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 미국 약전에서 기재된 반코마이신 참고 표준물질(Cat. No. USP 1709007)의 HPLC 분석 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명의 실시예 10에서 정제된 반코마이신 염산염의 경우 도 4에 나타난 표준물질 반코마이신의 HPLC 데이터와 비교하여도 그 불순물의 함량이 감소하였음을 알 수 있는 것이다.
본 발명의 효과는 글라이코펩타이드계 항생제인 반코마이신을 과량 생산하는 아미코라톱시스 오리엔탈리스 미생물 변이주를 분리하고, 그 분리된 변이주를 멜라닌 생합성 저해제를 함유하는 최적 배지 조성에서 최적 배양 조건으로 발효 배양시 키고 반코마이신을 컬럼 크로마토그래피, 활성탄, 알루미나를 통해 분리 정제시키고 염산염으로 결정화함으로써 고수율 고순도로 반코마이신 염산염을 발효 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

Claims (5)

  1. 고순도 고수율로 반코마이신을 생성하는 아미코라톱시스 오리엔탈리스 변이주 BNG 716(기탁번호 KCCM-10836P호)
  2. 야생주 아미코라톱시스 오리엔탈리스 ATCC-19795를 NTG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)을 사용하여 인공돌연변이시켜 반코마이신에 대한 자기내성 향상 균주를 선별 배지에서 분리하는 단계 및 상기 선별된 자기내성 향상 균주를 NTG를 사용하여 인공돌연변이시켜 반코마이신 생성능이 극대화된 변이주를 선별 배지에서 분리하는 단계로 구성된 아미코라톱시스 오리엔탈리스 변이주 BNG 716(기탁번호 KCCM-10836P호)의 분리 방법
  3. ⅰ) 아미코라톱시스 오리엔탈리스 변이주 BNG 716(기탁번호 KCCM-10836P호)을 종배양시키는 단계;
    ⅱ) 상기 종배양된 변이주를 12∼18% 덱스트린, 2.2∼3.8% 콩가루, 1.9∼2.9% 감자단백, 0.10∼0.14% 염화나트륨, 소량의 미네랄과 비타민, 멜라닌 생합성 제해제 농도를 조절시킨 배양 배지에서 발효 배양시키는 단계;
    ⅲ) 상기 발효 배양액에서 마이크로필터를 이용하여 변이주 균주를 제거하고 조 반코마이신을 수득하는 단계; 및
    ⅳ) 상기 조 반코마이신을 양이온 교환수지 컬럼, 음이온 교환수지 컬럼, 소수성 흡착수지 컬럼, 활성탄, 활성 알루미나 흡착 컬럼을 통해 분리 정제시키고 염산으로 결정화시키는 단계로 구성된 반코마이신 염산염의 제조 방법
  4. 제 3항에 있어서, 상기 배양 배지는 초기 질소원으로 콩가루 및 감자단백의 농도를 각각 2∼4(w/v)%로 조절하고, 1∼100 mg/L의 칼슘(CaCl2·2H2O)이나 1∼100 mg/L의 피리독신(pyridoxine)을 더욱 첨가시킨 것을 특징으로 하고, 1∼100 mg/L의 칼슘과 1∼100 mg/L의 피리독신(pyridoxine), 1∼100 mg/L의 아부틴(arbutin), 하이드로퀴논(hydroquinone), 트리사이클라졸(tricyclazole)에서 선택된 멜라닌 생합성 억제제를 더욱 첨가한 것을 특징으로 하는 반코마이신 염산염의 제조 방법
  5. 제 3항에 있어서, 상기 조 반코마이신의 분리 정제는 강산성 양이온 교환수지 컬럼에서 반코마이신은 통액되고 불순물은 양이온 수지에 흡착되며, 약염기성 음이온 교환수지 컬럼에서 반코마이신은 통액되고 불순물은 음이온 수지에 흡착되며, 소수성 흡착수지 컬럼에서 반코마이신은 흡착되고 이를 5∼15% 에탄올로 용출시키고, 활성탄에 분순물 흡착시 반코마이신 함유액과 탄소수 1∼4의 저급 알코올 을 1 : 1로 혼합시켜 처리하고, 활성 알루미나 흡착 컬럼에서 흡착된 반코마이신을 35∼60% 이소프로판올로 용출시킴을 특징으로 하는 반코마이신 염산염의 제조 방법
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