KR100425040B1

KR100425040B1 - 카텝신 비 인히비터 유도체의 분리정제방법

Info

Publication number: KR100425040B1
Application number: KR10-2002-0014877A
Authority: KR
Inventors: 이계준; 심재희; 송민철
Original assignee: 이계준
Priority date: 2002-03-19
Filing date: 2002-03-19
Publication date: 2004-03-30
Also published as: KR20030075588A

Abstract

본 발명은 신균주 스트렙토마이세스 에스피. 씨비아이 유도체를 배양하여 얻어진 배양액을 등전점으로 조절하여, 카텝신 비 인히비터 유도체를 비전하 상태로 전환 시킨후, 강 염기성 이온교환수지 칼럼 및 강산성 이온교환수지 칼럼을 차례로 통과 시키거나, 또는 역으로 강산성 이온교환수지 칼럼 및 강염기성 이온교환수지 칼럼을 차례로 통과시켜서 (-)하전된 물질 및 (+)하전된 물질을 수지에 흡착시켜서 처리한 후, 이온교환수지 칼럼을 통과한 비하전된 카텝신 비 인히비터 유도체를 분리, 정제하여 카뎁신 비 인히비터 유도체(Cathepsin B inhiotor derivative: CBI-55)를 제조하는 것이며, 카뎁신 비 인히비터 유도체를 간단히 분리 및 정제할 수 있다.

Description

카텝신 비 인히비터 유도체의 분리정제방법 {Isolation and purification method of Cathepsin B inhibitor derivative}

본 발명은 신균주 스트렙토마이세스 에스피. 씨비아이-55(Streptomyces sp. CBI - 55), 이 미생물을 이용한 카텝신 비 인히비터 유도체(Cathepsin B inhibitor derivatives; 이하 “CBI유도체“라 한다.)의 분리 및 정제 방법에 관한 것이다.

생체내에서 다양한 기능을 하는 효소들과 질병에 관련된 기작들에 관한 연구가 진행되면서, 미생물의 대사산물에서부터 새로운 생리활성물질을 찾아내려는 연구가 급진적으로 발전하고 있다.

단백질 분해효소는 세포내에서 뿐만 아니라 세포표면에서도 존재하며, 면역세포의 표면에 존재하는 단백질 분해효소는 면역세포의 활성조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.(Berquin IM and Sloane BF, (1996), Cathepsin B expression in human tumors, Adv. Exp, Med. Biol. 389 : 281-94 ; Aoyagi, T., M. Ishizuka, T. Takeuci, and H. Umezawa,(1977), Enzyme inhibitors in relation to cancer therapy. J. Antibiot. 30 : 121-132).

카텝신 B, C, H, L(Cahthepsin B, C, H, L), 트립신(trypsin), 플라스민(plasmin), 카이모트립신(chymotrypsin), 트롬빈(thrombin), 칼페인(Calpain)등과 같은 시스테인 (cysteine) 또는 세린 (serine)계의 단백질 분해효소는 인체내의 각종 염증반응(inflammation)과 혈액응고 또는 출혈증 (theimbic or haemorrhagic condition), 암의 발생과 전이, 연골의 파괴, 관절염, 근육병 (muscular disease) 등의 많은 질병과 관련되어 있음이 오래전부터 알려져 왔다.

따라서, 이러한 단백질 분해효소를 특이적으로 저해할 수 있는 물질을 생합성과 분리-정제를 한다면 질병 치료를 위해서 상당한 의미가 있는 것이다. 면역증진, 항암 의약품, 근육병 치료제, 관절염 치료제 또한 다양한 질병의 치료제로서 사용될 가능성이 높은 것이다.

현재까지 알려진 CBI의 생산균주로는 스트렙토마이세스 로제우스, 스트렙토마이세스 레티쿨리, 스트렙토마이세스 라벤둘리, 스트렙토마이세스 그리세우스 등이 있다. 하지만 이들중에서 최적화된 생산조건에서만 1.0mg/ml의 생산성을 나타내었다고 보고되었다.(Aoyagi, T., Yoshida, S., Nakamura, Y., Shigihara, Y., Hamada, M., and Takcuchi, T.(1990). Probestin. a new inhibitor of aminopeptidase M, produced by Streptomyces azureusMH663-2F6, J. Antibiot, 43:143-148. Aoyagi, T., Nagai, M., Ogawa, K., Kojima, F., Okada, M., Ikeda, T., Hamada, M., and Takeuchi, T.,(1991). Poststatin, a new inhibitor of proryl endopeptidase, produced by Streptomyces viridochromogens MH534-30F3., J. Antibiot. 44:949 955.)

이에 본 발명자들은 비정상적인 세포내의 단백질 분해와 면역세포의 활성조절에 관련이 있다고 알려진 티올계(thiol series) 단백질 분해효소 저해물질을 산생하는 방선균, 그 배양액으로부터 CBI유도체의 분리 및 대량생산에 관한 연구를 오랫동안 행하여 왔으며, 그 결과, 이 연구과정에서 배양액중에 CBI를 고농도로 산생 및 농축시키는 새로운 미생물을 찾아내어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

효소는 카텝신 B(cathepsin B)로 설정을 하여, 합성기질인 N-벤조일-L-아르기닌-p-니트로아닐라이드(N-Benzoyl-L-arginine-ρ-nitroanilide)를 사용하여 방선균 배양액에 의한 기질 분해 능력의 저해정도를 스펙트로포토메타 (spectrophotometer)를 이용하여 측정하였다.

본 발명의 목적은 CBI의 고생산성 신균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 이 신균주를 이용하여 CBI유도체의 생산방법을 제공하는 것이다.

상업적이고 경제적인 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CBI 유도체를 합성하는 미생물을 찾아내었다. 스트렙토마이세스 속 (Streptomycessp.)에 속하는 균주로써 토양에서 추출하여 분리하였으며, 그것의 특성을 규명하여 생체대사회로 (metabolic pathway)를 연구하였다. 이를 통하여 CBI 유도체를 최적으로 생산할 수 있는 균주를 찾아내었는데, 이 균주는 CBI저해효소 (CBI Inactivating Enzyme)를 생산할 수 없는 균주이다. 따라서 발효과정 중에 CBI저해효소가 생성되지 않기 때문에, 고농도의 CBI 유도체를 생산할 수 있는 능력이 있는 것이다.

CBI저해효소는 일반적으로 스트렙토마이세스 속 미생물의 배양과정 중에 생산되는데, 이 효소는 CBI를 분해하는 특징이 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서 CBI저해효소를 합성하지 못하는 돌연변이 (mutant) 균주를 찾아낸 것이 본 발명을 이루는데 중요한 바탕이 되는 것이다.

배지의 최적 조건을 찾기 위하여, 질소원으로 카자미노산 (casamino acid)의 농도를 바꾸어가며 분리한 미생물을 배양하였다. 이때 탄소원으로 글루코오스 (glucose)를 사용하였으며, 탄소원의 농도 또한 바꾸어가며 최적의 배양조건을 찾아내었다.

도 1은 이온 교환 크로마토 그램의 원리를 도면으로 나타내면 것이며,

도 2는 도 1은 최적 배지와 조건하에서 CBI발효를 행한 결과를 나타낸 도면이며,

도 3는 음이온 교환수지를 이용한 컬럼크로마토그래피를 타나낸 그래프이며,

도 4는 흡착 컬럼크로마토그래피를 나타낸 그래프이다.

1. 토양시료로부터 방선균의 분리 및 저해물질 합성균주 선별

국내 각지에서 채취한 다양한 환경의 토양시료를 건조시킨후 80℃로 1시간 열처리를 하였다. 이러한 전처리를 거친 토양시료에 멸균된 증류수를 첨가하여 베네트 아가 플레이트(Bennett agar plate)에 도말하여 배양하였다. 30℃에서 7일간 배양하여, 방선균을 분리하였다.

각 분리균주를 glucose 1%(w/v), peptone 1%(w/v), K₂HPO₄0.34%(w/v), KH₂PO₄0.1%(w/v), MgSO₄7H₂O 0.1%(w/v), NaCl 0.1%(w/v)와 증류수로 이루어진 배지에 배양하여 배양액의 카텝신 비(Cathepsin B)저해활성을 측정하였다.

이와같은 선별과정을 통하여 저해활성이 우수한 균주를 선별할 수 있었다.

저해활성이 높은 균주를 선택하여, 유전자 염기 서열 분석을 통하여 CBI저해효소 mutant를 찾아내었다.

2. 균주의 특성

(1) 형태학적 특성

포자의 형태 : 포자가 형성되지 않음.

(2) 대상균주에 대한 항생력

Bacillus subtilis : -

Saccharomyces cerevisiae : -

Aspergillus niger : -

Candida albicans : -

(3) 형태학적 특성

질산환원 : + H2S 생성 : + 지방분해 : -

펙틴가수분해 : +

(4) 항생제 내성

Penicillin G : + neomycin : + rifampicin: -

(5) 성장 및 내성

45℃ : -

(6) 질소원 이용성

페닐알라닌 : + 히스티딘 : + 시스테인 : +

발린 : +

(7) 탄소원 이용성

Glucose : + sucrose : - manitol : - xylitol : -

dextran : -

본 발명자들은 이 CBI유도체 생산균주를 2002. 2. 1일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하여 기탁번호 제 SD1009로 기탁되었다.

본 실험실에서 분리한 스트렙토마이세스 에스피. CBI-55 균주(Streptomyces sp.CBI-55 균주)는 cathepsin B inhibitor를 생합성하는 것으로 밝혀졌다.

카텝신 B 인히비터는 화학명이 2-아세틸아미노-4-메틸-펜타노인산 [1-(1-아세틸-4--구아니디노-부탈카바모일)-3-메틸-부틸]-아마이드

(2-acetylamino-4-methyl-pentanoic acid

[1-(1-acetyl-4-guanidino-butylcarbamoyl)-3-methyl-butyl]-amide)인 화학물질로 다음의 구조식을 가진다.

Cathepsin B Inhibitor(이하 “CBI”라 한다.)를 생산하는 Streptomyces sp. CBI-55 균주는 배지의 조건에 따라서 CBI의 생산량이 변화하게된다.

주로 질소원(nitrogen source)을 이루는 아미노산(amino acid)에 의해서 CBI 생합성이 조절을 받게 된다.

배지 중의 높은 농도의 포스페이트(phosphate)(1.4g/l이상)에 의해서 CBI의 생합성이 매우강한 저해를 받는 반면에, 높은 농도의 글루코오스(glucose)의 농도에 의해서는 CBI생합성이 촉진이 된다. 또한 높은 농도의 질소원(nitrogen source) 보다는 낮은 농도를 유지하는 것이 CBI생산에 적합하다.

CBI는Streptomyces sp.CBI-55의 생장과 연계되어(growth-associated) 생산된다.

글르코오스-제한 항성분배양조(Glucose-limited chemostat)에서의 kinetic study로부터, 특이 CBI 생산률(the specific CBI production rate)은 특이 생장률(specific growth rate)과 1차원적으로 연계되어(linearly related) 되어 있다.

실시예

1. 방선균의 보존 및 증식

본 단계는 방선균을 보존 및 증식을 위한 단계이다. plate에 접종한 방선균은 spore 상태로서 4℃에서 수개월간 활성이 지속되는 특징이 있다.

아래의 표 1의 배지 조성에 따라 pH 7.2인 멸균된 plates를 만든다.

균주를 베네트 플레이트(Bennett plate)에 스트리킹(streaking)하여, 30℃에서 배양(incubation)한다.

7 days 배양 후, 자주빛을 띄는 콜로니들(colonies)들이 생긴다. 이러한 single colony를 다음 단계인 seed cultrue에 사용을 하게된다.

표 1 : 방선균 보존 및 증식배지 (Bennett medium, Johnes (1949))

Reagent	percentage(%)
Yeast extract	0.1
Beef extract	0.1
Casamino acid	0.2
Glucose	1.0
Agar	1.8

2. Seed culture

시드배양(Seed culture)은 주배양(main culture)(fermentation)에 들어가기 전에, 주배양액양(main culture volume)의 1/10에 해당하는 부피로 배양하는 단계를 말한다.

아래의 표 2의 배지 조성에 맞춰 seed media를 만든다.

pH 7.2로 맞춘 후에, 500ml baffle flask에 100ml씩 나누어 담아 멸균을 한다.

Bennett plate에서 자란 single colony를 백금니로 채취를 하여, seed medium이 담긴 flask에 접종을 한다.

30℃, 150 R.P.M.(shaking speed)에서 48h 동안 배양을 한다.

표 2 : Seed culture medium 조성

Reagent	percentage(%)
Glucose	3.0
Soytone	1.8
Peptone	0.3
CaCO₃	0.4

3. 주 배양(Main culture:fermentation)

본 단계는 최종적으로 발효(fermentation)을 통하여, CBI를 생산하는 단계이다.

Seed culture에서 증식된 방선균을, fermentor에 접종을 하므로써 발효가 시작이 된다.

아래의 표 3의 주배양액( main culture medium)조성에 따라 배지를 만든다.

pH는 7.2로 유지를 시켜준다.

단, 글루코오스(glucose)는 멸균시에 염류(salts)가 존재하면 ‘갈변화’가 이루어지므로 따로 멸균하여 주배양액(main medium)에 넣어준다.

또한, 시약중에서 -SO₄group, -Cl group 그리고 -PO₄group을 갖는 시약들은서로 혼합하여 멸균을 하면 ‘침전반응’이 일어나게 된다.

따라서 이러한 시약들은 따로 멸균을 하여 main medium에 넣어준다.

main medium 준비가 끝났으면, 48h 동안 자란 seed culture broth를 접종을 한다. (main medium이 4L일 경우, seed culture 400ml을 접종을 한다.)

30℃, 200 R.P.M. (agitation speed)에서 48시간 동안 배양을 한다.

표 3: 주배양액의 조성

Reagent	percentage(%)
Casamino acid	1.0
Glucose	3.0
FeSO₄7H₂O	0.001
MgSO₄7H₂O	0.03
CuSO₄5H₂O	0.001
MnCl₂4H₂O	0.0003
CaCl₂	0.001
NaCl	0.03
KH₂PO₄	0.005

※ 위의 main culture medium은 여러번의 chemostat kinetic study를

통하여,Streptomyces sp.CBI-55의 CBI 생합성에 ‘최적화’된 배지 조성

이다.

다음의 표 4 및 도 1은 최적 배지와 조건하에서 CBI발효를 행한 결과를 나타낸 것이다.

표 4 : 최적 배지와 조건하에서 CBI-55 발효결과

Time (h)	pH	NH ₄ ⁺ (ppm)	DCW(g/ℓ)	glucose (g/ℓ)	CBI concetration (mg/ℓ)l
0	7.56	55	2.23	28.03	98
8	7.36	177	5.27	27.93	582
16	7.37	112	5.72	26.31	1267
24	7.44	61	6.69	23.57	1773
32	6.98	54	6.98	19.27	1953
40	7.23	54	7.53	18.34	1196
48	7.17	39	7.94	15.93	1416
56	7.43	35	8.60	11.60	1382
64	7.45	27	8.26	10.15	1469
72	7.64	15	7.80	8.72	1296
80	7.68	7	7.26	6.31	992

여기에 쓰인 분석(assay)방법으로는 다음과 같다.

1) pH 측정 : pH meter를 이용하여 측정.

2) NH4+ (ammonia) 농도 측정 : ammonia meter를 이용하여 측정.

3) DCW (Dried Cell Weight) : 세포건중량측정

화트만 필터페이퍼 GF/C((Whatman filter paper GF/C)를 이용하여, 배양액 5ml를 여과(filtration)한 후에 건조오븐(Drying oven)에서 24h동안 건조후에 무게를 잰다.

4) 글르코오스(Glucose)농도 측정 : DNS法을 사용한다.

3,5-디니트로살리실산(3,5-Dinitrosalicylic acid)이 환원당인 글루코오스 (glucose)의 알데히드 그룹(aldehyde group)과 반응을하여, 3-아미노-5-니트로살리실산(3-Amino-5-nitrosalicylic acid)으로 되는 반응을 이용한다.

생성된 3-Amino-5-nitrosalicylic acid는 575nm에서 흡광도를 가지게 되는데, 이것을 이용하여 spectrophtometer를 이용하여 그 glucose의 농도를 측정할 수 있다.

5) Cathepsin B inhibitor 농도 측정

Cathepsin B 와 그것의 기질(substrate)인 Nβ-벤조일-DL-아르기닌 p-니트로아닐라이드(BAPNA : Nα-Benzoyl-DL-arginine ρ-nitroanilide)의 반응을 이용한다. 여기서의 효소반응에서 Cathepsin B의 inhibitor인 CBI와 함께 반응하여, 효소의 활성을 측정함으로써 CBI의 농도를 계산한다.

이렇게 계산하여 환산한 농도를 표 4에 나타내었다.

4 . CBI-55의 분리 및 정제

기능성 펩타이드인 CBI-55의 생화학적인 성상 중에 등전점(pI=0)을 이용 한 이온 교환 크로마토그램을 수행한다. 이는 유기용매 및 완충용액을 대량 사용하지 않고 손쉽게 목표하는 물질을 무공해적이고 효과적인 방법으로 대량생산함을 목표로 한다.

또한 본 발명의 방법에서는 염을 사용하지 않는다. 그래서 염을 제거하는 단계를 생략할 수 있다.

먼저 우리가 사용한 이온 교환 크로마토 그램의 원리를 도면으로 나타내면도 2와 같다.

도 2로 본 발명의 CBI-55의 분리 및 정제 이론을 상세하게 설명한다.

도 2에서 보는 바와 같이 양이온, 음이온 교환수지에 CBI-55를 통과시킬 때 기존에 이온교환 수지와는 다른 개념으로 수행된다. 즉 기존의 이온 교환 수지는 분리, 정제하고자 하는 물질을 수지에 부착시킨 후 이온성이 강한 염을 사용함으로써 목표하는 물질을 분리 정제하고 불순물은 제거한다는 원리이나 , 본 발명의 방법은 CBI-55의 net charge를 zero 상태로 만들어 이온성을 띠지 않게 하고 이온 교환 수지에는 달라붙지 않고 통과시키며 다른 불순물은 수지에 달라붙게 함으로써 염을 쓰지 않고 분리한다. 다시 말하면 CBI-55의 소수성(hydrophobicity)은 2.8로써 소수성을 갖고 있지만, 말단기에 친수성을 갖고있다. 이분자의 net charge를 비전하(uncharged material)로 만들어 중화(neutralization)한 후 이온 교환 크로마토그램을 수행한다. 배양상등액의 (-) charge 및 (+) charge의 성질을 갖고 있는 불순물은 이온교환 수지에 흡착되며 기능성 펩타이드인 CBI-55는 그대로 빠져 나온다.

우선 배양상등액을 pH7-8 사이로 조절한 후, 3차 증류수를 사용하여 이온 교환 크로마토그램을 수행한다. 이때 사용한 수지는 강염기성(strongly base type)의 음이온교환 수지로써 아래와 같은 구조의 이온교환수지(resin)을 사용하면 어느 회사제품이든 상관없이 사용할 수 있다. 원리는 (+) charge의 물질을 일단 흡착시키며 net charge zero와 (-) charge의 물질은 용출 시킨다. 이 때 음이온 교환 수지 사용으로 인하여 균주의 미세한 DNA fragment나 의약품제조시 문제가 되는endotoxine을 동시에 제거할 수 있는 장점이 있다.

강염기형의 음이온교환수지(strongly base type anion exchange resin)

CBI-55 활성이 있는 Fraction을 모아 등전점을 조절하여 비전하(uncharge) 물질로 만든 다음 강산성 양이온교환수지(strong acid cation resin)를 사용하여 남은 (-) charge의 물질을 흡착시키고 비전하(uncharged)CBI-55만 얻어낸다. 이때 사용한 수지는 아래와 같은 구조를 갖고 있는 수지이면 어떤 회사제품이든 상관없이 사용할 수 있다.

강산성타입 양이온교환수지(strongly acid type cation exchange resin)

또는, 역으로 먼저 양이온교환수지를 통과시킨 후, 음이온교환수지를 통과시켜도 동일한 결과를 얻을 수 있다.

혹시 제거되지 않은 색소나 분자량이 큰 단백질(protein)등을 제거하기 위하여 마지막 단계인 0.2㎛의 막(membrane)(Sartorius, made in Germany)을 이용하여 여과(Filtration)하여 최종 산물인 기능성 펩타이드 CBI-55를 얻어낸다.

본 발명의 방법은 우선적으로 등전점을 조절한 물만을 사용하며, 염이 들어간 완충용액도 사용하지 않는다. 비용면에서 경제적인 무공해적 분리 및 정제 방법이라 하겠다.

본 발명에서 사용한 이온 교환 수지는 Dowex-1(Supelco, made in USA) 수지인데 0.5N NaOH 2bed 부피로 활성화시킨 후 0.5N HCl 2bed 부피로 활성화시킨다. 이 때 NaOH 반응 후 HCl 반응은 중화반응이기 때문에 열이 발생하여 수지를 손상시킬 위험이 있으므로 충분한 물로 씻어준다. 그 후 등전점과 같은 pH의 3차 증류수로써 충분히 평형화시킨다. flow rate는 1-10ml/min의 넓은 영역의 속력이 가능하며 loading양은 배양 상등액의 CBI-55 농도(1g/L)와 Dowex-1 resin의 경우 부피비 1 : 1(v/v)로 제한한다.

CBI-55활성은 트립신 용액(Trypsin solution)( type Ⅲ from Bovine Pancreas, Sigma T-8253) 0.004mg/ml 1ml, 100mM Tris-HCl(pH7.5) 1ml을 우선 CBI-55 200㎕와 2분간 30℃에서 전배양(preincubation)을 한 후 기질 Nα-Benzoyl-L-arginine ethyl ester 0.18mg/ml 1ml을 넣어 UV spectrophotometer로 OD 253nm에서활성을 측정하였다.

또한 다른 방법으로써 cathepsin B 와 CBI-55를 넣고 25℃ 5분간 preincubation한 후 BAPNA(Nα-Benzoyl-DL-Arginine p-nitroanilide)기질을 반응시켜 OD 412nm에서 활성을 측정하였다.

단백질 및 펩타이드 정량은 Bradford(1976)의 방법에 따라 정량하였다.

또한 Dowex-50W 수지도 0.5N NaOH 2bed 부피로 활성화시킨 후 0.5N HCl 2bed 부피로 활성화시킨다. 이 때 NaOH 반응 후 HCl 반응은 중화반응이기 때문에 열이 발생하여 수지를 손상시킬 위험이 있으므로 충분한 물로 씻어준다. 그 후 등전점과 같은 pH의 3차 증류수로써 충분히 평형화시킨다. flow rate는 1-10ml/min의 넓은 영역의 속력이 가능하며 loading양은 배양 상등액의 CBI-55 농도(1g/L)와 Dowex-50W 수지의 경우 부피비 1 : 1(v/v)로 제한한다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.

마지막 단계로 물을 제거하고 CBI를 농축하기 위하여 R/O membrane을 통과시킨 후 흡착 수지를 수행한다.. 대부분의 펩타이드는 흡착 크로마토그래피에 의한 방법으로써 물질을 우선 정제 분리해준다. 이의 단점은 목표하는 물질을 흡착 수지에 일단 붙인 다음 소수성/친수성 용매를 조절함으로써 용출하는 방법인데 용출의 효과를 높이기 위해서 이소프로파놀(isopropanol), 부탄올(butanol), 헥산(hexane)등의 발암물질의 유기용매를 대량 사용하게 된다.

그러나 본 발명의 방법은 마지막 단계에서 부피를 줄여 흡착수지를 사용하기 때문에 대량 분리시에도 많은 양의 흡착수지나 유기용매를 사용하지 않아도 되는 장점이 있다. 흡착 수지는 분자량이 적은 배양 시 사용한 일가이온이나 이가 이온, 다가 염류 및 물, 을 제거하기 위하여 흡착 수지를 사용한다. 이때 사용한 유기용매는 isopropanol 50-100%를 사용하며 Evaporator(EYELA Rotary vacuum evaporator)를 사용하여 유기용매를 제거해준다.

흡착 수지는 XAD-4, 또는 XAD-7의 수지를 사용하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.

Evaporation한 물질은 LC-MS, HPLC등으로 순도를 확인한다.

LC-MS는 Shiseido caocell park RP-18, 5um, 4.6 x 150mm의 컬럼을 사용하며 Electrospray 방식으로 MS를 수행하였다.

HPLC는 Waters μBondapak C18 3.9 x 150mm 컬럼을 사용하여 순도를 확인하였다.

본 발명에 의하여 신규의 스트렙토마이세스 에스피. CBI-55(기탁번호 : KCTC SD1009)를 배양하여 얻어진 카텝신 B 인히비터(Cathepsin B inhiotor : CBI-55)를 간단히 분리 및 정제할 수 있다.

Claims

신규의 스트렙토마이세스 에스피. CBI-55(기탁번호 : KCTC SD1009)를 배양하여 얻어진 카텝신 B 인히비터 유도체(Cathepsin B inhiotor derivative: CBI-55)를 제조하는 방법에 있어서, 배양액을 등전점으로 조절하여, 카텝신 B 인히비터 유도체를 비전하 상태로 전환 시킨후, 강 염기성 이온교환수지 칼럼 및 강산성 이온교환수지 칼럼을 차례로 통과 시키거나, 또는 역으로 강산성 이온교환수지 칼럼 및 강염기성 이온교환수지 칼럼을 차례로 통과시켜서 (-)하전된 물질 및 (+)하전된 물질을 수지에 흡착시켜서 처리한 후, 이온교환수지 칼럼을 통과한 비하전된 카텝신 B 인히비터 유도체를 분리정제하여 카텝신 B 인히비터 유도체(Cathepsin B inhiotor derivative: CBI-55)를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 배양액을 pH 7-8로 조절하여 카텝신 B 인히비터 유도체 를 비하전상태로 전환시킨후, 강염기성 이온교환수지 칼럼 및 강산성 이온교환수지를 통과 시키거나, 또는 역으로, 강산성 이온교환수지 칼럼 및 강염기성 이온교환수지 칼럼을 차례로 통과시켜서 (-)하전된 물질 및 (+)하전된 물질을 수지에 흡착시켜서 제거한 후 얻어진 비하전된 카텝신 B 인히비터 유도체를 등전점으로 조절된 정제수로 세척한후, 분리 정제하여 카텝신 B 인히비터 유도체(Cathepsin B inhiotor derivative: CBI-55)를 제조하는 방법.