KR0185332B1

KR0185332B1 - 피리독사틴의 타이프iv 콜라게네이즈 저해제 및 종양세포 생육 저해제로서의 용도 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR0185332B1
Application number: KR1019950049648A
Authority: KR
Inventors: 고영희; 전효곤; 이호재; 이충환; 정명철
Original assignee: 김은영; 한국과학기술연구원
Priority date: 1995-12-14
Filing date: 1995-12-14
Publication date: 1999-05-01
Also published as: KR970032866A; KR100197749B1

Abstract

본 발명은 토양에서 카우노피크니스 알바(Chaunopycnis alba) PT-262 균주(수탁번호 KCTC 0209 BP)를 분리하여 배양한 후 타이프 IV 콜라게네이즈의 활성을 저해하는, 하기 구조식(I)의 화합물을 제조하고 동 화합물을 유효 성분으로 하는 타이프 IV 콜라게네이즈 활성 저해제 및 종양 세포 생육 저해제로서의 용도에 관한 것이다.

Description

피리독사틴의 타이프 IV 콜라게네에즈 저해제 및 종양 세포 생육 저해제로서의 용도와 그의 제조 방법

제1도는 카우노피크니스 알바(Chaunopycnis alba) PT-262 균주의 전자 현미경 사진을 나타낸다.

본 발명은 구조식(I)의 피리독사틴 [3-(2-에테닐-4,6-다이메틸사이클로헥실)-1,4-다이하이드록시-2(1수소)-피리디논]의 타이프IV 콜라게네이즈(type IV collagenase) 활성 저해제로서의 용도에 관한 것이다.

또한 본 발명은 피리독사틴의 종양 세포 생육 저해제로서의 용도에 관한 것이다.

또한 본 발명은 카우노피크니스 알바(Chaunopycnis alba) PT-262 균주로부터 피리독사틴을 분리ㆍ제조하는 방법에 관한 것이다.

좀 더 상세히 말하자면 본 발명은 토양에서 카우노피크니스 알바(Cahunopycnis alba) PT-262 균주(수탁번호 KCTC 0209 BP)를 분리하여 배양한 후, 종양세포의 전이에 관여하는 효소인 타이프IV 콜라게네이즈의 활성을 저해하는 화합물 피리독사틴을 제조하고, 동 화합물을 타이프IV 콜라게네이즈 활성 저해제 및 종양세포 생육 저해제로서 사용하고자 하는 것이다.

암환자가 사망하게 되는 것은 초기 종양에 의한 것이 아닌 주로 종양 세포의 침윤과 전이에 의한다. 암의 전이 과정에 있어서 중요한 점은 종양세포가 정상적으로는 통과할 수 없는 지지 구조체인 세포외 기질(extracellular matrix)과 기저막(basement membrane)에 있는 단백질이 분해되는 것이다(Cell, 64, 327-336, 1991). 특히, 종양세포 전이과정에서 첫번째 장벽은 기저막인데 이는 주로 타이프IV 콜라겐으로 구성된다.

타이프IV 관라게네이즈는 세포간질 금속단백분해효소(matrix metalloproteinase) 중의 하나로서 타이프IV 콜라겐(typeIV collagen)을 분해하는 작용을 하기 때문에 암의 전이 과정에 있어서 중요한 장벽인 타이프IV 콜라겐으로 구성된 기저막을 분해할 수 있는 가장 중요한 효소로 알려져 있다(TIBTECH., 10, 200-207, 1992). 따라서 이러한 특성을 갖는 타이프IV 콜라게네이즈에 특이적으로 작용하는 저해 물질의 개발은 암의 전이와 관련하여 암의 치료뿐만 아니라 콜라겐성 연결 조직의 분해가 중요한 원인이 되는 류마티스성 관절염 및 치근막염 등과 같은 질병의 치료에도 매우 유용하다.

지금까지 몇 가지 종류의 타이프IV 콜라게네이즈 저해제가 보고되어 있다. 먼저 종양세포가 분비하는 단백질성의 세포 유래 저해제(TIMP)가 있는데, 이는 분자량이 큰 특성으로 인하여 약제로의 개발에는 어려움이 있다. 타이프IV 콜라게네이즈의 g 활성을 저해하는 약제인 바티마스태드(batimastat)와 펩타이드 유도체(GM 6001) 등도 암의 전이를 억제한다고 보고되었다. 또한 미생물이 생산하는 타이프IV 콜라게네이즈저해제로서 방선균으로 부터 분리된 메트라이스타틴(matlystatin)이 있고, 이는 섬유육종세포(fibrosarcoma)의 침윤을 저해한다고 보고되었다.(J. Biol. Chem., 266, 13070-13075, 1991; Cancer Res., 53, 2087-2091, 1993; Cancer Res., 54, 4715-4718 1994; J. Antibiotics., 45, 1723-1732, 1992)

본 발명자들은 암세포의 전이와 관련하여 타이프IV 콜라게네이즈 저해 활성을 갖는 물질을 찾기 위해 여러 가지 미생물 배양액을 탐색한 결과, 곰팡이 카우노피크니스 알바 PT-262(Chaunopycnis alba PT-262) 균주로부터 타이프IV 콜라게네이즈 저해 활성을 갖는 물질을 발견하고, 이 물질을 분리ㆍ확인한 결과 피리독사틴 [3-(2-에테닐-4,6-다이메틸사이클로헥실)-1,4-다이하이드록시-2(1수소)-피리디논] 임을 발견하였다. 또한 본 발명자들은 [3-(2-에테닐-4,6-다이메틸사이클로헥실)-1,4-다이하이드록시-2(1수소)-피리디논] 및 이의 유도체를 유효성분으로 하는 타이프IV 콜라게네이즈 활성 저해제 및 종양 생육 저해제를 개발하였다.

[3-(2-에테닐-4,6-다이메틸사이클로헥실)-1,4-다이하이드록시-2(1수소)-피리디논]는 기지의 물질로 테시마(Teshima) 등이 아크레모니움(Acremonium) 속 균주로 부터 분리하여 피리독사틴(pyridoxatin)으로 명명하였다. 피리독사틴은 지금까지 유리기 보집체(free radical scavenger)로서 이용되었고 또한 지질 과산화를 저해하는 작용이 있다고 보고되었다(J. Antibotics, 44, 685-687, 1991). 그러나 피리독사틴이 타이프IV 콜라게네이즈 저해 활성 및 종양세포 생육 저해 작용을 나타낸다는 보고는 지금까지 없었다.

이에 본 발명자들은 피리독사틴이 타이프IV 콜라게네이즈 활성을 저해하고 또한 생체외(in vitro)에서 종양 세포의 생육을 저해하는 새롭고 획기적인 사실을 최초로 발견하고, 이를 이용하는 타이프IV 콜라게네이즈 활성 저해제 및 종양세포 생육 저해제를 제조할 수 있음을 밝혀 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명은 카우노피크니스 알바 PT-262 균주를 배양하고, 그 배양액 또는 그의 균사체로부터 하기 구조식(I)의 피리독사틴을 분리ㆍ제조하는 방법을 제공함에 목적이 있다.

피리독사틴 : [3-(2-에티닐-4,6-다이메틸사이크로헥실)-1,4-다이하이드록시-2(1-수소)-피리디논]

또한 본 발명은 구조식(I)의 화합물 피리독사틴 또는 이의 유도체를 유효성분으로 하는 조성물의 타이프IV 콜라게네이즈 활성 저해제 및 종양세포 생육 저해제로서의 용도를 제공함에 목적이 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 화합물 피리독사틴 [3-(2-에테닐-4,6-다이메틸사이클로헥실)-1,4-다이하이드록시-2(1수소)-피리디논]의 타이프IV 콜라게네이즈(type IV collagenase) 활성 저해제로서의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 화합물 피리독사틴의 종양 세포 생육 저해제로서의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 카우노피크니스 알바(Chaunipycnis alba) PT-262 균주로부터 피리독사틴을 분리ㆍ제조하는 방법에 관한 것이다.

상기 화합물 피리독사틴은 토양에서 분리한 곰팡이 균주로부터 분리할 수 있다. 이 균주를 균학적 성상에 따라 동정한 결과, 카우노피크니스 알바(Chaunopycnis alba) 속에 속하는 것을 확인하고(Persoonia, 2, 75-79, 1980), 본 균주를 카우노피크니스 알바 PT-262로 명명하였다. 카우노피크니스 알바 PT-262 균주의 전자현미경 사진이 제1도에 제시되어 있다. 본 균주의 균학적 성상은 하기 표 1과 같다.

본 발명은 카우노피크니스 알바 PT-262 균주를 1995년 11월 17일에 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 KCTC 0209 BP). 상기 균주는 곰팡이의 특성상 그 성상이 변하기 쉬우므로, 카우노피크니스 알바 PT-262의 돌변연이주(자연발생 또는 유발생), 형질융합체 또는 유전자 재조합체이라도 본 발명의 화합물인 피리독사틴의 생산성이 있는 카우노피크니스 알바 균은 모두 본 발명에 포함된다.

카우노피크니스 알바 PT-262 균주를 통상 미생물이 이용하는 영양원을 함유하는 배지에서 배양하여 피리독사틴을 생산한다. 배지의 탄소원은 가용성 전분, 락토스 등을 사용하고 질소원은 대두박, 어분, 펩톤 등을 사용한다. 필요에 따라서 황산 마그네슘 및 기타 무기염류를 첨가하는 것도 유효하다. 배양 방법으로는 호기적인 조건에서의 배양법, 특히 액침 배양법이 적당하다. 배양은 23℃내지 28℃의 온도 범위에서 행한다. 배양이 완료되면 배양액을 원심분리하여 배양 상등액을 제거하고 균사체를 용매 추출하여, 흡착 크로마토그래프겔, 여과 크로마토그래피 및 고압 액체 크로마토그래피 등의 과정을 거쳐 목적 화합물을 정제한다.

배양 공정 이나 정제 과정 중 본 발명의 화합물의 확인은 타이프IV 콜라게네이즈 활성 저해에 기준을 두어 다음과 같이 행한다.

활성 검색 효소인 타이프IV 콜라게네이즈는 인간 신경교아세포종의 무혈청 배양액으로부터 황산 암모늄염 침전, 겔 여과 크로마토그래피, 젤라틴 친화 크로마토그래피, 렉틴 친화 크로마토그래프, 헤파린 친화 고압 액체 크로마토그래피 등의 과정을 통해서 분자량 72,000 달톤(Da)의 타이프IV 콜라게네이즈를 분리한다(J. Biochem. Mol. Biol., 28, 33-39, 1995).

타이프IV 콜라게네이즈 활성 검객 기질로는 7-메톡시큐마린-4-아세틸-프로린-로이신-글리신-로이신-[3-(2,4-다이니트로페닐)-2,3-다이아미노프로필]-알라닌-알지닌-아미드(시그마사 제품)를 사용하여 시료를 마이크로플레이트(microplate)에 넣고, 50mM 트리스염산 완충용액(pH 7.5)에, 미리 1mM 아미노페닐 머큐릭아세테이트(aminophenyl mercyricacetate)로 활성화시킨 효소를 넣어 마이크로플레이트 리더(microplate reader)가 장착된 형광분석기(spectrofluorometer, 퍼킨엘마사 LS-50B)로 여기(excitation) 328㎚, 발광(emission) 393㎚에서 형광량을 측정하고, 이 마이크로 플레이트에 기질을 넣어 37℃에서 30분간 반응을 시킨 후 다시 형광량을 측정하여 타이프IV 콜라게네이즈 저해율(%)을 계산하고, IC값은 효소 활성 저해율이 50%에 달하는 저해제의 농도로 결정한다.

분리한 화합물의 생체외에서 종양 세포주에 대한 생육 저해 활성은 다음과 같이 확인한다. 각 종양 세포주를 마이크로플레이트에 3×10개씩 분주하여 1일간 배양하여 시료를 첨가하고 다시 2일간 배양한 후 세포를 고정시키고 슬포로다민 B 염색시약으로 세포의 단백질을 염색한 후 트리스 염산 완충용액(pH 10.5)에 녹여 570㎚에서 흡광도를 측정하여 세포 증식 저해도를 계산하였고, ED값은 세포 증식 저해율이 50%에 달하는 저해제의 농도로 결정한다.

한편 화학적 합성방법에 의해서도 피리독사틴과 동일하거나 유사한 타이프IV 콜라게네이즈 저해 활성 및 종양세포 생육 저해 활성을 갖는 유도체를 제조할 수 있다. 그 제조 방법 또는 구조의 변화가 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것이고 상기 저해제로서의 효과가 유사할 경우 이들 역시 본 발명의 범위에 포함되며 이러한 유도체는 카우노피크니스 알바 PT-262 균주 또는 그의 돌연변이주, 형질 융합체 또는 유전자 재조합체 등의 배양을 통해서도 얻어진다.

또한 본 발명의 피리독사틴 화합물 또는 그의 유도체를 유효성분으로 하는 타이프IV 콜라게네이즈 활성 저해제 및 종양세포 생육 저해제는 항전이제 및 종양 억제제로의 개발이 가능하다. 또한 본 발명의 저해제와 유사한 활성기를 갖는 하이드록삼산(hydroxamic acid) 유도체들이 리보뉴클레오타이드 리덕테이즈(ribonucleotide reductase)의 저해 활성을 나타낸다는 사실로 부터(Cancer Res., 39, 844-851, 1979) 본 발명의 타이프IV 콜라게네이즈 활성 저해제 및 종양세포 생육 저해제도 유사한 저해 효과를 나타낼 것을 알 수 있다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.

하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

[균주의 배양]

종 배지 및 생산 배지로서 가용성 전분 2%, 락토스 1%, 대두박 2.5%, 효모 엑기스 0.1%, 육엑기스 0.1%, 염화나트륨 0.1%, 황산마그네슘ㆍ7수염 0.05%, 글리세롤 0.5%를 함유한 배지를 사용하였다. 살균 전의 pH는 모두 6.0으로 조절하여 사용하였다. 종배양으로서 500㎖의 삼각 플라스크에 100㎖씩 분주한 종 배지를 121℃에서 20분간 살균하고 이것에 카우노피크니스 알바 PT-262 균주의 사면배양 1-2 백금이를 접종하고 25℃에서 7일간 통기하에 180rpm 교반속도로 배양하였다.

[실시예 2]

[균주 생성 물질의 분리 및 정제]

상기 실시예 1의 배양액을 6000rpm으로 원심분리하여 배양상등액을 제거한 후 균사체를 얻었다. 균사체를 아세톤으로 3회 추출하여 추출물을 여과지로 여과한 후, 감압하여 용매를 제거하고 다시 소량의 물에 녹여 부탄올로 2차 추출하였다. 부탄올 추출물을 농축한 후 10% 메탄올 용액에 녹여 엠씨아이 겔(MCl-gel,CHP20P)에 흡착시켜 10%에서 100%의 메탄올로 선형 농도구배를 실시하여 저해 활성 부분을 모아 농축시킨 후, 소량의 메탄올에 녹여 세파덱스(Sephadex) LH-20에서 100% 메탄올로 전개시켜 겔 크로마토그래피를 행하였다. 활성부분을 농축하여 고압 액체 크로마토그래피(컬럼; YMC-pack ODS-AQ, 용출액; 60% 메탄올 유속; 1.2㎖/분, 검출; 290㎚)하여 체류시간 13분 근처에서 균주 생성 물질을 순수하게 분리하였다. 용매를 감압건조기로 제거한 후 냉동건조하여 흰색의 분말로 조제하였다.

[실시예 3]

[균주 생성 활성물질의 구조결정]

본 발명의 화합물의 구조분석을 위하여 핵자기 공명 스펙트럼, 자외선 흡수 스펙트럼, 적외선 흡수 스펙트럼, 질량분석 등을 실시하였다. 그 결과, 카우노피크니스 알바 PT-262 균주가 생산하는 활성물질의 이화학적 특성은 표 2와 같다.

활성물질은 백색분말로서 메탄올, 에틸아세테이트 등의 유기용매에는 잘 녹았으나, 물에는 녹지 않았다. 염화철(FeCl)에 양성반응을 나타내어 아로마틱 하이드록시기 또는 하이드록삼산기가 존재함을 나타내었다. 메탄올에서 자외선 최대 흡수파장은 217, 289㎚이었고, 산이 첨가된 경우 214, 247, 267㎚로, 알칼리가 첨가된 경우 231, 266, 295㎚로 변이가 일어났다. 이온 스프레이 질량분석 결과, 분자량은 263으로 나타났고, 적외선 흡수스펙트럼 결과 6각형의 아로마틱 환 구조가 있음을 알 수 있었고, 핵자기 공명 스펙트럼을 분석한 결과(표 3), 싸이클로헥산과 피리딘 부분을 포함함을 알 수 있었고, 최종적으로 활성물질의 구조가 식(I)의 피리독사틴 임을 알 수 있었다.

[실시예 4]

[타이프IV 콜라게네이즈 저해 활성]

실시예 2에서 얻은 균주 생성 물질을 50mM의 트리스염산 완충용액[100mM 염화나트륨, 0.01% 브리즈-35, 5mM 염화칼슘(pH 7.5)] 80㎕와 다이메틸설폭사이드(DMSO)에 녹이고 2㎕를 취하여 96공 마이크로플레이트(microplate)에 넣은 후, 미리 1mM의 아미노페닐 머큐릭아세테이트(aminophenyl mercyricacetate)로 37℃에서 15분간 활성화시킨 10㎕의 타이프IV 콜라게네이즈(최종농도 1nM)를 넣어 마이크로 플레이트 리더(microplate reader)가 장착된 형광분석기(spectrofluorometer)로 여기 328㎚, 발광 393㎚에서 형광량을 측정하고, 마이크로플레이트 각각의 공에 형광기질인 7-메톡시큐마린-4-아세틸-프로린-로이신-글리신-로이신-[3-(2,4-다이니트로페닐)2-3,-다이아미노프로필]-알라닌-알지닌-아미드(시그마사 제품) 1㎕(최종농도 10μM)를 넣어 37℃에서 30분간 반응시킨 후 다시 형광량을 측정하였다. 효소 저해율(%)은 다음과 같은 식으로 계산하였으며, IC값은 효소 활성저해율이 50%에 달하는 저해제의 농도로 결정한다.

분리된 균주 생성 물질의 형광 합성 기질을 이용한 타이프IV 콜라게네이즈 IC₅₀값은 4㎍/㎖ 이었고, 이를 몰농도로 환산하면 15μM이었다. 그러나 같은 금속단백분해효소인 아미노펩티데이즈 M에는 저해 역가가 없었다.

[실시예 5]

[종양세포 생육 저해 활성]

종양 세포주에 대한 세포외 생육 저해 활성은 먼저 각 종양 세포주를 10%의 태아 송아지 혈청(fetal calf serum)이 포함된 RPMI 1640 배지에서 5% CO₂, 37℃에서 배양한 후, 0.05% 트립신과 0.53 mM의 EDTA 용액으로 처리하여 단일 세포현탁을 만들어 5%의 태아 송아지 혈청이 포함된 RPMI 1640 배지에 재현탁시켜 마이크로플레이트에 세포 현탁액(3×10⁴개/㎖) 180㎕를 분주하여 CO₂배양기에서 1일 동안 배양한다. 1일 후 실시예 2에서 얻은 균주 생성 물질 20㎕를 처리하여 다시 2일간 배양한 후, 50%의 삼염화초산(trichroloacetic acid) 50㎕로 세포를 고정시키고, 증류수로 세척한다. 여기에 1% 초산에 용해된 0.4% 슬포로다민 B(sulforrhodamin B) 용액 100㎕를 첨가하여 세포의 단백질에 결합하도록 30분간 상온에서 반응시켰다. 30분 후 슬포로다민 B 용액을 제거하고 1% 초산으로 세척하여 건조시킨 후 10mM 트리스염산 완충용액(pH 10.5) 100㎕를 가하여 용해시키고 570㎚에서 마이크로플레이트 리더로 흡광도를 측정하였다. 각 종양 세포주와 본 발명의 균주 생성 물질의 화합물의 농도에 따른 흡광도의 평균 및 표준편차를 구하여 대조구에 대한 세포증식 저해도를 계산하였고, ED₅₀값은 세포증식 저해율이 50%에 달하는 저해제의 농도로 결정하였다. 발명의 균주 생성 물질의 각종 인간 종용 세포주에 대한 항종양 활성은 표 4와 같다.

* 마우스 유래 세포주

각 조직에 따른 20종류의 종양 세포주에 따른 생육 저해 효과를 조사한 결과, 본 발명의 화합물은 멜라노마를 비롯한 여러 종양 세포주에서 1㎍/㎖ 이하의 낮은 ED값을 나타내어 항종양 활성이 우수한 것으로 나타났다. 또한 정상 세포인 마우스 유래 NIH3T3 세포주에서는 종양 세포주에 비해 높은 ED값을 나타내었고, 조직에 따른 특이성은 없는 것으로 나타났다.

상기한 바와 같이 본 발명을 통하여 구조식(I)의 화합물은 타이프IV 콜라게네이즈 활성 및 종양 세포의 생육을 저해하므로 암의 전이와 관련하여 암의 치료외에도, 콜라겐성 연결 조직의 분해가 중요한 원이이 되는 류마티스성 관절염 및 치근막염 등과 같은 질병의 치료에 매우 유용하다.

또한 본 발명의 화합물 또는 그의 유도체를 유효성분으로 하는 화합물은 타이프IV 콜라게네이즈 활성 저해제 및 종양세포 생육 저해제로서 그 효능 이 뛰어나므로, 암 환자에게 있어서 유용한 항전이제 내지는 종양 억제제로의 개발이 가능하다.

Claims

구조식(I)의 화합물(피리독사틴, pyridoxatin)을 유효성분으로 하는 타이프IV 콜라게네이즈 활성 저해제.
상기 구조식(I)의 화합물을 유효성분으로 하는 종양 세포 생육 저해제.