KR0125142B1 - 신규의 루펩틴 생산균주와 그의 배양방법 - Google Patents

신규의 루펩틴 생산균주와 그의 배양방법

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Abstract

본 발명은 루펩틴을 경제적으로 대량 생산할 수 있는 스트렙토마이세스 엑스폴리아투스에 속하는 신규 미생물과 그 미생물을 이용하여 루펩틴을 제조하는 것으로, 더욱 상세하게는 루펩틴과 그 유도체를 합성하는 미생물로서 한국과학기술연구원 유전공학센터 유전자 은행에 KCTC 8624P로 기탁된 스트렙토마이세스 엑스폴리아투스 SMF9413 및 질소원으로 카자미노산, 카지톤, 펩톤중 1종 이상을 사용하여 상기 미생물을 배양하는 것으로 이루어지는 루펩틴의 생산방법에 관한 것이다.

Description

신규의 루펩틴 생산균주와 그의 배양방법
제 1 도는 스트렙토마이세스 엑스폴리아투스 SMF 9413으로부터 분리 정제한 파파인 저해물질의 아미노산 분석결과이다.
아미노산 분석은 아미노산 자동분석기(Beckman system 6300 High performance analyzer)를 사용하여 수행하였다.
이소류신과 류신의 리텐션 타임(retention time)은 각각 42.9분과 44.1분이었다.
제 2 도는 스트렙토마이세스 엑스폴리아투스 SMF 9413으로부터 분리 정제한 파파인 저해물질의 UV 흡수 스펙트럼이다.
제 3 도는 스트렙토마이세스 엑스폴리아투스 SMF 9413으로부터 분리 정제한 파파인 저해물질의 FT-IR 스펙트럼이다.
제 4 도는 스트렙토마이세스 엑스폴리아투스 SMF 9413으로부터 분리 정제한 파파인 저해물질의1H-NMR 흡수 스펙트럼이다.
제 5 도는 스트렙토마이세스 엑스폴리아투스 SMF 9413으로부터 분리 정제한 파파인 저해물질을 산화시켜 HPLC로 분리한 결과를 보여주는 그림이다.
HPLC에 의한 분리는 C8컬럼(4.6×150mm)과 0.1% 트리플루오로아세테이트를 함유하는 물중의 35%에서 45%까지의 아세토니트릴 농도구배와 1ml/min의 유속을 사용하여 수행하였다.
광학밀도는 215mm에서 측정하였다.
제 6 도는 스트렙토마이세스 엑스폴리아투스 SMF 9413으로부터 분리 정제한 파파인 저해물질을 산화시켜 아미노산을 분석한 결과를 보여주는 그림이다.
아미노산분석은 아미노산 자동분석기(Backman system 6300 High performance analyer)를 사용하여 수행하였다.
이소류신, 류신과 아르기닌의 리텐션 타임은 각각 42.9분, 44.1분과 122.8분이었다.
(a) 물질 1
(b) 물질 2
(c) 물질 3
제 7a, 7b, 7c 도는 각각 물질 1,2,3의 FAB-mass 단편화 패턴을 보여주는 그림이다.
n - 니트롤벤질알콜을 매트릭스로 하여 VG Auto Spec Q질량분석기를 사용하여 FAB-MS를 수행하였다.
제 8 도는 스트렙토마이세스 엑스폴리아투스 SMF 9413에 의해 생산되는 루펩틴 유도체의 예상구조.
(a) Acetyl-Leu-Leu-Arginal(물질 1)
(b) Acetyl-ILe-Leu-Arginal(물질 2)
(c) Acetyl-Leu-ILe-Arginal(물질 3)
제 9 도는 스트렙토마이세스 엑스폴리아투스 SMF 9413의 주사 전자현미경사진이다.
본 발명은 루펩틴을 경제적으로 대량 생산할 수 있는 스트렙토마이세스속에 속하는 새로운 미생물과 루펩틴 생산방법에 관한 것이다.
생체내에서 다양한 기능을 하는 효소들과 질병에 관련된 기작들에 관한 연구가 진척되면서 미생물 대사 산물로부터 새로운 생리활성 물질을 찾아내려는 연구가 급진적으로 발전하고 있다.
단백질 분해효소는 세포내에서 뿐만 아니라 세포표면에 존재하며, 면역세포의 표면에 존재하는 단백질 분해 효소는 면역세포의 활성조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
트롬빈, 트롬보키나아제, 카텝신 B, C, H, L, 트립신, 플라스민, 키모트립신과 같은 씨올(thiol) 또는 세린(serine)계의 단백질 분해효소는 인체내의 각종 염증(inflammation)혈전 또는 출혈증(thrimbic of taemorrhagic condition), 암의 발생과 전이, 골다공증, 연골의 파괴등과 관련되어 있음이 오래전부터 알려져 왔다.
따라서, 이러한 단백질 분해효소를 선택적으로 저해할 수 있는 물질을 분리한다면 면역증진, 항암 의약품으로서, 또한 상기 증세의 치료제로서 사용될 가능성이 높다. 특히 이러한 단백질 분해요소 저해물질중의 하나인 루펩틴은 항소염작용, 항혈전작용, 항암작용, 면역증진작용 등 광범위한 의학적 효과를 나타내는 물질로 많은 연구가 진행되고 있어 의약품으로서의 임상응용 가능성이 높다.
또한 100mg당 20만원 가량의 고부가가치 상품으로 그 경제적 이용가치가 매우 높다.
현재까지 알려진 루펩틴의 생산균주는 스트렙토마이세스 로제우스, 스트렙토마이세스 로제오크로모게네스, 스트렙토마이세스 레티쿨리, 스트렙토마이세스 씨오루테우스, 스트렙토마이세스 라벤둘리, 스트렙토마이세스 노보리토엔시스, 스트렙토마이세스 그리세우스 등이 있으며 가장 연구가 많이된 스트렙토마이세스 로제우스의 경우 최적화된 생산조건에서 0.3-1.0mg/ml의 생산성을 나타내었다고 보고되었다.
따라서 본 연구자는 비정상적인 세포내의 단백질 분해와 면역세포의 활성조절에 관련이 있다고 알려진 씨올계 단백질 분해효소 저해물질을 방선균 배양으로부터 분리하고자 하였으며, 이 과정에서 배양액중에 루펩틴을 고농도로 농축시키는 새로운 미생물을 찾아내게 되어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
목표효소는 파파인으로 설정하고, 형광성 합성기질(chromogenic synthertic substrate)인 p-Glu-Phe-Leu-p-Nitroanilide를 사용하여 방선균 배양액에 의한 기질분해 능력의 저해정도를 ELISA 해독기를 이용하여 측정하였다.
본 발명의 목적은 첫째 루펩틴 고생산성 균주를 제공하는데 있다.
둘째 취득한 균주를 이용한 루펩틴 고생산성 발효공정을 제공하는데 있다.
상술한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 루펩틴과 그 유도체를 합성하는 미생물로 한국과학기술연구소 유전공학센터 유전자 은행에 1994년 10월 5일자로 KCTC8624P호로 기탁된 스트렙토마이세스속의 신규 미생물인 스트렙토마이세스 엑스폴리아투스(Streptomyces exfoliatus SMF9413)균주를 제공한다.
또한 본 발명은 배지의 질소원으로 카자미노산, 펩톤, 카지톤중 1종 이상을 사용하여 상기 미생물을 배양하여 배지중에 루펩틴을 고농도로 축적하는 방법을 제공한다.
이때 탄소원으로는 글루코오스, 글리세롤, 시트레이트, 람노오스, 말토오스, 덱스트린 또는 전분이 사용된다.
본 발명의 미생물에 의한 루펩틴 생산은 인산염의 농도가 증가할수록 감소하며 배양액내의 무기인산염의 농도가 15g/1이하인 것이 바람직하다.
본 발명의 배양방법을 사용했을 경우 배지내 루펩틴의 농도가 4.2g/1까지나 되었다.
이하 본 발명이 미생물 및 그의 배양방법에 대하여 하기의 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.
그러나, 이들 실시예는 본 발명을 더욱 용이하게 이해하도록 하기 위해 제공되는 것일뿐, 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진자에 의해서는 본원의 특허청구번위를 벗어나지 않는 범위내에서의 여러가지 변행, 개량 또는 개선등이 행하여질 수 있음은 자명하다.
먼저, 본 발명의 미생물을 분리 및 동정하였던 공정과 본 발명의 균주가 루펩틴을 합성한다는 사실을 밝힌 실시예를 기술한다.
[실시예 1]
파파인 저해물질 합성균주의 분리, 동정
가) 토양시료로부터 방선균의 분리 및 저해물질 합성균주선별
국내각지에서 취득한 다양한 환경의 토양시료를 건조시킨 후 80℃로 1시간 열처리를 하였다.
이러한 전처리를 거친 토양시료에 멸균된 증류수를 적당히 첨가하여 희석하고 베네트 아가평판(Bennett agar plate)에 도말하였다.
30℃에서 7일간 배양후 1,000여개의 방선균을 분리하였다. 각 분리균주를 글루코오스 1%(W/V), 펩톤 1%(W/V), K2HPO40.34%(W/V), KH2PO40.1%(W/V), MgSO4, 7H2O 0.1%(W/V) NaCl 0.1%와 증류수로 이루어진 배지에 배양하여 배양액의 파파인 저해활성을 측정하였다.
이와같은 선별과정을 통해 저해활성이 우수한 14균주를 선별할 수 있었다.
이러한 14균주의 배양액을 분자량 3,000의 한외여과를 통해 여과액의 활성을 측정한 결과 SMF9413, SMF9428, SMF9471등의 세 균주가 분자량 3,000이하의 저해물질을 합성하였다.
이중 가장 활성이 높은 SMF9413으로부터 저해물질을 분리 정제하였다.
나) 저해물질 분리 및 정제
배양액으로부터 원심분리(12,000xg, 20분)를 통하여 상등액을 취하였다. 이러한 배양 상등액을 2N NaOH를 첨가하여 상등액의 pH를10.5로 보정하였다. 활성탄을 첨가한 후 1시간 정도 흔들어준 다음 여과깔때기를 통해 활성탄을 수거하였다.
이러한 활성탄을 증류수와 이어서 80% 메탄올로 수세한 다음 에틸아세테이트 : 아세톤 : 메탄올 : 물(4 : 4 : 2 : 1)용액으로 파파인 저해물질을 추출하였다.
활성탄 흡축과정을 통해 농축된 파파인 저해물질을 Amberite XAD-4에 흡착하였다. 증류수와 이어서 50% 메탄올로 수세한 후 80% 메탄올로 추출하였다.
Amberite XAD-4 흡착과정을 통해 획득한 파파인 저해물질을 Amberite CG 50(H+) 컬럼(2.5×30cm)에 로딩한 후 증류수와 이어서 80% 메탄올로 수세하였다.
활성분획은 0.04N HCl을 첨가한 80% 메탄올로 용출시켰다.
Amberite CG 50(H+) 크로마토그라피를 통해 획득한 활성액을 농축한 후 pH를 10.5로 보정하였다.
수용이후 상태의 활성액에 부탄올을 첨가하여 파파인 저해물질을 추출하였다. 부탄올 추출 활성액을 농축한 후 부탄올 : 메탄올(95 : 5)로 평형을 이룬 실리카겔 컬럼에 로딩하였다.
부탄올 : 메탄올(95 : 5) 용매로 활성물질을 용출하였다.
실리카겔 크로마토그라피를 통해 획득한 활성액을 농축한 후 증류수에 녹인 다음 Dowex-1(Cl-) 컬럼에 로딩하였다.
증류수로 용출시켜 최종적으로 순수한 활성물질을 분리하였다.
다) 저해물질의 물리화학적 특성 및 분광학적 특성
Dowex-1(Cl-) 크로마토그라피를 통해서 얻어진 시료를 동결 건조한 결과 무색의 분말로 물과 메탄올, 부탄올, DMSO등에 잘 녹았으며 아세톤과 에틸아세테이트, 클로로포름등에는 잘 녹지 않았다.
여러가지 발색반응의 실험결과 사카구치반응과 디니트로페닌히드라진 반응에 (+) 결과를 나타내어 구아니딘기와 카보닐기를 가지고 있음을 알 수 있었으며, 닌히드린에는 (-) 반응을 나타내었다.
또한 아미노산 분석결과 류신과 이소류신의 존재를 확인할 수 있었다(제 1 도).
UV스펙트럼은 단지 말단흡수만을 나타내어 방향족 고리그룹이 없음을 알 수 있었다(제 2 도).
IR스펙트럼의 결과 1660과 1550cm-1의 흡수밴드를 나타내어 펩티드성 물질임을 알 수 있었다(제 3 도).
또한 3290cm-1의 흡수과정은 아마이드의 흡수밴드가 있음을 나타내었다.
라) 저해물질의 구조분석
1H-NMR 스펙트럼 분석결과(제 4 도) 양성자의 넓은 다중 피크를 8-8.3ppm 부근에서 확인할 수 있었다. 또한 CH3, CH2의 지방족 양성자들의 케이컬 쉬프트가 0.75-1.5ppm 사이에서 나타났는데, 이러한 결과는 류신과 이소류신의 측쇄 지방족 양성자들에 의해서 나타난 것으로 추정되었다.
또한 아세틸기의 양성자들의 케미컬 쉬프트가 1.9ppm 부근에서 나타나 CH3-CO기의 존재를 확인할 수 있었다.
또한 구아니딘기의 존재를 확인시켜 주었다.
이러한 결과를 종합적으로 고려해볼 때 분리된 시료는 류신과 이소류신을 포함하며 N-말단이 블록된 펩티드 물질로 추정되었다.
따라서 분리된 시료의 구조는 아세틸-(Leu 또는 IlE)n-X로 추정되었으며, X는 구아니딘 알데히드그룹을 포함하는 C-말단을 추정되었다.
그렇지만 류신과 이소류신의 구성비 및 갯수(n)는 확인할 수 없었다.
이러한 구조로 기존의 루펩틴과 유사함을 알 수 있었다.
이러한 C-말단 알데히드기와 구아니딘기는 세가지 형태의 이성체 형태를 나타나게 되어 그 분광학적 구조 분석에 많은 어려움을 주게 된다.
따라서 C-말단 알데히드기를 KMnO4로 산화시켜 COOH로 고정한 후 HPLC(제 5 도)로 좀더 정교하게 산화된 시료를 분리하였다.
분리한 결과 3개의 주요물질을 분취할 수 있었는데 물질 1의 아미노산 조성은 류신과 아르기닌이 2 : 1, 물질 2와 3의 아미노산 조성은 류신과 이소류신, 아르기닌이 1 : 1 : 1이었다(제 6 도).
또한 각 물질들의 분량 분석결과(M+H+)(제 7A,7B,7C 도)피크의 분자량이 443으로 나타나 물질 1은 루펩틴임을 알 수 있었고 물질 2와 3은 루펩틴 유도체임을 알 수 있었다(제 8 도).
마) 저해물질 합성균주의 동정
상기한 가)공정에서 선별된 SMF균주는 그람 양성균으로 영양균사, 기균사, 포자를 형성하였다.
포자의 형태는 제 9 도와 같으며, 균사의 세포벽에는 당이 존재않지 않고 LI형태의 디아미노피멜산이 존재하였다.
이러한 결과에서 SMF9413이 버지스 매뉴얼(Bergey, manul of ystematic bacteriology, 1986)의 분류 시스템에 따라 스트렙토마이세스속 세균으로 동정되었다. 52개의 생리적 단위형질을 분석하여 수리 동정한 결과 선별된 SMF9413은 스트렙토마이세스 엑스폴리아투스에 속하는 류펩틴을 생산하는 새로운 균주임을 확인할 수 있었다표 1.
이 SMF9413은 기존의 루펩틴 생산균주들과 종(species)가 다른 전혀 새로운 균주이다.
[표 1] SMF9413 균주의 형태학적 생리 생화학적 특성
[실시예 2]
루펩틴 생산 최적 질소원의 결정
루펩틴 생산 최적 질소원을 결정하기 위한 상기한 미생물 분리공정에 의하여 선별된 SMF9413을 하기 한 (표 2)에 기재된 여러가지 질소원과 기본배지를 50ml 함유한 진탕 플라스크에 각각 접종하고 온도 30℃의 조건으로 120rpm의 회전세이커에서 60시간 동안 진탕 배양하였다.
이와 같이 질소원을 각각 다르게 하여 배양한 SMF9413 배양액의 루펩틴 생산량을 비교하였다.
하기한 (표 2)의 결과에서 알 수 있듯이 SMF9413 균주는 카자미노산, 펩톤, 카지론등의 질소원을 첨가한 배지에서 많은 루펩틴을 생산하는 것으로 나타났다. 또한 다른 조건은 앞에서와 같게 하고 최적질소원을 판명된 카자미노산의 농도에 따른 SMF9413 균주의 루펩틴 생산성을 비교한 결과 첨가하는 카자미노산의 농도가 증가할수록 루펩틴의 생산성이 증가하다가 30g/1 이상에서는 일정하게 유지되었다(표 3).
(표 2) 질소원에 따른 루펩틴 생산량
기본배지 : 글루코오스 1%, K2HPO40.34%, KH2PO40.1%, MgSO4, 7H2O 0.1% , NaCl 0.1%
각 질소원 1%
(표 3) 카자미노산의 농도에 따른 균체량과 루펩틴 생산량
기본배지 : 포도당 1%, KH2PO40.1%, K2HPO40.34%, MgSO4, 7H2O 0.1%, NaCl 0.1%
[실시예 3]
루펩틴 생산 최적 탄소원의 결정
루펩틴 생산 최적 탄소원을 결정하기 위하여 상기한 미생물 분리공정에 의하여 선별된 균주 SMF9413을 하기한 (표 4)에 기재된 여러가지 탄소원과 질소원으로 카자미노산을 함유한 기본배지를 50ml 함유한 진탕 플라스크에 각각 접종하고 온도 30℃의 조건으로 120rpm의 회전세이커에서 60시간 동안 진탕 배양하였다.
이와 같이 탄소원을 각각 다르게 하여 배양한 SMF9413 배양액의 루펩틴 생산량을 비교하였다.
하기한 (표 4)의 결과에서 알 수 있듯이 SMF9413 균주는 포도당을 첨가한 배지에서 많은 루펩틴을 생산하는 것으로 나타났다.
또한 다른 조건은 같게하고 최적 탄소원으로 판명된 포도당의 농도에 따른 SMF9413 균주의 루펩틴 생산성을 비교한 결과 첨가하는 포도당의 농도가 증가할수록 루펩틴의 생산성이 증가하다가 50g/1 이상에서는 일정하게 유지되었다(표 5).
(표 4) 탄소원에 따른 루펩틴 생산량
기본배지 : 카자미노산 1%, K2HPO40.34%, KH2PO40.1%, MgSO4, 7H2O 0.1%
각 탄소원 1%
(표 5) 포도당의 농도에 따른 균체량과 루펩틴 생산량
기본배지 : 카자미노산 1%, KH2PO40.1%, K2HPO40.34%, MgSO47H2O 0.1%, NaCl 0.1%
[실시예 4]
최적 무기인산염의 농도결정
루펩틴 생산 최적 무기인산염의 농도를 결정하기 위하여 상기한 미생물 분리공정에 의하여 선별된 SMF9413 균주를 하기한 농도의 무기인산염과 최적 탄소원인 포도당 2.5%와 최적 질소원인 카자미노산 1%를 함유한 (표 4)의 기본배지 3L을 함유한 5L-발효조에서 온도 30℃에서, 회전속도 200rpm, 통기량 0.5VVM의 조건으로 배양하였다. 이와 같이 무기인산염의 농도를 각각 다르게 하여 배양한 SMF9413 배양액의 루펩틴 생산량을 비교하였다.
하기한 (표 6)의 결과에서 알 수 있듯이 SMF9413 균주는 인산염의 농도가 증가할수록 루펩틴의 생산성이 감소되었다.
(표 6) 무기인삼염의 농도에 따른 루펩틴 생산량
기본배지 : 글루코오스 2.5%, 카자미노산 1%, MgSO4, 7H2O 0.1%, NaCl 0.1%
[실시예 5]
루펩틴 생산성 향상을 위한 무기산염 제한 연속 발효공정
상기한 미생물 분리공정에 의하여 선별된 SMF9413 균주에 의한 루펩틴의 생산은 상기한 실시예 3,4의 결과에서 처럼 포도당의 농도 증가에 따라 그 생산성이 증가하였으며 무기인산염에 의해서 그 생산성이 억제되었고 균주의 성장과 연관되어 있었다.
따라서 본 발명의 미생물 SMF9413은 무기인산염의 제한 조건하에 균체의 성장속도를 높게 유지하면 루펩틴의 생산성이 증가할 수 있는 장점이 있다.
이러한 장점을 이용하여 그 생산성을 증가시키기 위해 무기인산염 제한 연속 발효 공정을 개발하였다.
이러한 연속 발효공정은 지금까지 루펩틴 생산을 위해 사용되지 않는 새로운 공정으로 발효 배지 조건은 포도당 1%, 카자미노산 1%, MgSO4, 7H2O 0.1%, NaCl 0.1%, PO4 -20.0025%이었으며, 발효배지 1L를 함유한 2L-발효조건에서 온도 30℃, 회전속도 200rpm, 통기량 0.5VVM의 조건으로 배양하였다.
(표 7)은 무기인산염 제한 조건하에서 희석속도(dilution rate)에 따른 루펩틴의 생산성과 생산수율, 비생산속도, 비포도당 이용속도를 나타낸 것이다.
루펩틴 생산의 최적 희석속도는 0.075h-1이었으며 최대 비생산속도는 113.8(mg g-1h-1)이었고 소모된 포도당의 양에 대한 루펩틴의 생산성(Y1pt/glc)은 3.39(g g-1)이었다.
이러한 결과로부터 연속 배양 공정이 최적화된 회분 배양에서의 최대 비생산속도 90(mg g-1h-1), 최대 Y1pt/glc은 1.41(g g-1)보다 각각 1.26배, 2.4배 높은 고생산성, 고효율성 공정임을 알 수 있었다.
[표 7] 무기인산염 제한 연속배양
기본배지 : 포도당 1%, 카자미노산 1%, K2HPO40.02%, MgSO4, 7H2O 0.1%, NaCl

Claims (5)

  1. 루펩틴과 그 유도체를 합성하는 미생물로서 한국과학기술연구원 유전공학센터 유전자 은행에 KCTC8624P로 기탁된 스트렙 토마이세스 엑스폴리아투스 SMF9413.
  2. 배지의 질소원으로 카자미노산, 카지톤, 펩톤중 1종 이상을 사용하여 제1항의 미생물을 배양하는 것으로 이루어지는 루펩틴의 생산방법.
  3. 제2항에 있어서, 배지의 탄소원은 글루코오스, 글리세롤, 시트레이트, 람노오스 말토오스, 덱스트린, 전분중 1종인 루펩틴의 생산방법.
  4. 제 2항 또는 3항에 있어서, 배지의 초기 무기인산염의 농도를 15g/1 이하로 하는 루펩틴의 생산방법.
  5. 제4항에 있어서, 무기인산염의 제한하에서 연속 배양하는 루펩틴의 생산방법.
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