JP2000507805A

JP2000507805A - 変形生合成からのクリプトフィシン

Info

Publication number: JP2000507805A
Application number: JP9510664A
Authority: JP
Inventors: モア，リチャード，イー．; ヘムシャイドト，トマス，ケイ．
Original assignee: ユニバーシティオブハワイ; ウエインステートユニバーシティ
Priority date: 1995-08-30
Filing date: 1996-08-30
Publication date: 2000-06-27
Also published as: AU709828B2; EP0850316A4; EP0850316A1; AU7109096A; AU6904896A; EP0850057A4; WO1997007798A1; BR9610214A; WO1997008334A1; EP0850057A1; CA2246117A1; JP2000501067A; CA2230540A1

Abstract

(57)【要約】細菌発酵によるクリプトフィシン化合物の製造方法を、それによって製造される新規な組成物と共に開示する。

Description

【発明の詳細な説明】変形生合成からのクリプトフィシン本発明は、一部は、ＮａｔｉｏｎａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎから助成金：Ｎｏ．ＣＨＥ−９０２４７４８の下での合衆国政府の支援を受けてなされたものであった。したがって、合衆国政府はこの発明にある一定の権利を有する。技術分野本発明は一般にクリプトフィシン化合物の製造に関し、さらに詳しくは、細菌発酵の使用によるこのような化合物の製造に関する。発明の背景クリプトフィシンは、本来シアノバクテリア（藍藻類）から単離された、構造的に関連する化合物群である。このファミリーの化合物は、例えばヴィンブラスチン、タキソール及びアドリアマイシンのような、現在用いられている抗腫瘍剤に類似した、広いスペクトルの抗腫瘍活性を有することが判明している。今までに知られたクリプトフィシン類の中で、クリプトフィシン１（クリプトフィシンＡとも呼ばれる）はシアノバクテリアのある一定のＮｏｓｔｏｃ種によって産生される主要な細胞毒である。これは薬物感受性及び薬物耐性の固体腫瘍に対して優れた活性を示している。この環状デプシペプチドは４単位：２個のヒドロキシ酸単位と２個のアミノ酸単位から成る。２個のヒドロキシ酸単位の化学量論は次の通りである：（５Ｓ，６Ｓ，７Ｒ，８Ｒ）−７，８−エポキシ−５− ヒドロキシ−６−メチル−８−フェニル−２−オクテン酸（単位Ａ）と（２Ｓ） −２−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸（単位Ｄ；ロイシン酸）。２個のアミノ酸単位の化学量論は次の通りである：（２Ｒ）−３−（３−クロロ−４−メトキシフェニル）アラニン（単位Ｂ）と（２Ｒ）−３−アミノ−２−メチルプロピオン酸（単位Ｃ）。これらの単位はＡＢＣＤ配列で連結される。Ｎｏｓｔｏｃ種のクリプトフィシン単離物の他に、クリプトフィシン・グループの他の要素は単離物を化学的に修飾することによって製造されている。さらに、他の(additional)クリプトフィシンは全合成によって製造されている。これらの非細菌性(non-bacterial)クリプトフィシンの多くは、治療用途における有益性を実証することができる活性とｉｎｖｉｖｏ安定性とを示す。しかし、商業的設定で化合物を製造するために、発酵は部分的化学合成又は全化学合成の使用よりもはるかに大きく費用効果的である。残念ながら、ネイティブな細菌発酵によって得られるクリプトフィシンの種類(variety)は限定される。したがって、公知クリプトフィシン化合物と新規なクリプトフィシン化合物の両方を細菌発酵によって得るための手段を提供することが、望ましいと考えられる。ネイティブな細菌発酵によって得られる化合物に比べたときに安定性と活性との改良された性質を示す、新規なクリプトフィシン化合物を発酵によって製造することも望ましいと考えられる。発明の開示本発明は、細菌発酵における代謝基質の制御使用によって代謝産物としてクリプトフィシン化合物を製造する方法を提供する。１態様では、本発明は、所望のクリプトフィシン化合物を製造するために充分な条件下での置換アミノ酸の存在中でクリプトフィシン化合物を産生することができる細菌を培養することを含む。本発明の態様では、所望のクリプトフィシン化合物を製造するために充分な条件下での置換アミノ酸の存在中でクリプトフィシンを産生することができる細菌を培養することによって製造される新規なクリプトフィシン化合物も提供される。典型的に、このようなクリプトフィシン化合物は安定なマクロライドを有し、有益な活性を与えることが判明している置換基を有すると考えられる。図面の簡単な説明図１は、本発明の選択されたクリプトフィシン化合物と、クリプトフィシンを特徴的に構成する４種類の異なる酸単位、２個のヒドロキシ酸基（Ａ＆Ｄ）と２個のアミノ酸基（Ｂ＆Ｄ）との一般構造を示す。図１はまた、選択された実施態様におけるヒドロキシ酸単位ＡとＤ及び２個のアミノ酸単位ＢとＣのナンバーリング系(numbering system)をも提供する；及び図２は、選択されたクリプトフィシン化合物に対して電子衝撃質量分光分析をおこなった場合に得られるフラグメントイオン種の概略図を提供する。発明の詳細な説明本発明は、細菌発酵における代謝基質の制御使用によって代謝産物としてクリプトフィシン化合物を製造する方法を提供する。１態様では、本発明は、所望のクリプトフィシン化合物を製造するために充分な条件下での置換アミノ酸の存在中でクリプトフィシンを産生することができる細菌を培養することを含む。したがって、本発明は、ネイティブな細菌発酵からのごく限定された数のクリプトフィシンの製造という問題を克服するための手段を提供する。本発明を用いることによって、クリプトフィシン化合物を産生することができる細菌の発酵によって製造される所定のクリプトフィシンを得ることができる。典型的に、このような所定クリプトフィシン化合物は安定なマクロライドを有し、有益な活性を与えることが判明している置換基を有すると考えられる。本発明によると、所望のクリプトフィシン化合物を製造するために充分な条件下での置換アミノ酸の存在中でクリプトフィシン化合物を産生することができる細菌を培養することによって製造される新規なクリプトフィシン化合物も提供される。望ましいクリプトフィシン化合物の選択クリプトフィシン１の他に、２０種類を越える異なるクリプトフィシン化合物がシアノバクテリアの１菌株（Ｎｏｓｔｏｃ種）から単離されうることが判明している。さらに、非常に多くの他のクリプトフィシン化合物が全化学合成又は半合成によって製造されている。これらの化合物の多くに対して、有益な治療的性質を与えることに最も重要である種類の化合物の構造特徴を決定するために、構造−活性関係（ＳＡＲ）研究がおこなわれている。これらのＳＡＲ研究は、ｉｎｖｉｖｏ活性が主として完全なマクロライドを前提としていることを示している。単位Ｂにおけるエポキシド基、クロロ基及び単位Ｃにおけるメチル基も重要である。ＳＡＲ研究はさらに、クリプトフィシン２１におけるように、単位Ｃにおけるメチル基の欠如が単位Ｃと単位Ｄとの間のエステル結合の不安定性を高める（それによって、マクロライドが腫瘍部位に達する前にｉｎｖｉｖｏで完全な状態で留まる確率を減ずる）ことを実証している。このエステル結合はクリプトフィシン１に比べてクリプトフィシン２１では１００倍より大きく不安定性であった。クリプトフィシン２１はクリプトフィシン１とは、単位Ｃにメチル基を含有しないことのみで異なる。クリプトフィシン１とクリプトフィシン２１はｉｎｖｉｔｒｏにおいて本質的に同じ細胞毒姓を示すが、クリプトフィシン２１はｉｎｖｉｖｏでは不活性であることが発見された。このことは、化合物が腫瘍部位に達する前に、マクロライドのＣ−Ｄエステル結合が破壊されることを示唆した。したがって、このような研究の結果に基づくと、クリプトフィシン化合物の望ましい特徴を、代謝基質の制御選択によって細菌発酵において産生される代謝産物中にエンジニアリングする(engineered)ことができる。クリプトフィシン化合物を産生することができる細菌クリプトフィシンは、本来シアノバクテリア（藍藻類）から単離された、構造的に関連する化合物群である。クリプトフィシン１（クリプトフィシンＡとも呼ばれる）はシアノバクテリアのある一定のＮｏｓｔｏｃ種によって産生される主要な細胞毒である。上述したように、ネイティブの細菌発酵によっては、限られた数の他のクリプトフィシン化合物を得ることができる。米国特許第４，９４６，８３５号に述べられているような、シアノバクテリアのＮｏｓｔｏｃ種の形態的な特徴は周知であり、Ｎｏｓｔｏｃ種を同定するための根拠はＪ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏ．，１１１：１〜６１（１９７９）に詳述されている。本発明は、例えばＮｏｓｔｏｃ種のようなクリプトフィシン化合物を産生することができる細菌を適当な条件下で培養することができることと、新規なクリプトフィシン代謝産物を、既に開示されたクリプトフィシン代謝産物と同様に、この培養物から単離することができることを提供する。本発明の実施態様では、ＧＳＶ２２４と名付けられた、Ｎｏｓｔｏｃ種菌株が、培養され、それから既知クリプトフィシンと新規なクリプトフィシンの両方が単離される菌株である。１態様では、本発明の方法はＮｏｓｔｏｃ種の任意の菌株に関し、好ましくは、非自然的に生ずるクリプトフィシン化合物を産生するＮｏｓｔｏｃ種ＧＳＶ菌株に関する。このために、Ｎｏｓｔｏｃ種のＧＳＶ２２４菌株は特許手続きのための微生物の国際的寄託に関するブタペスト条約に従って、１９９３年１０月７日に、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１２３０１，ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２，Ｕ．Ｓ．Ａ．）によってＡＴＣＣＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．５５４８３で寄託された。Ｎｏｓｔｏｃ種の他の菌株、特に、ＭｅｒｋａｎｄＣｏ．によってＡＴＣＣＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．５３７８９で既に寄託された菌株ＭＢ５３５７は、本発明の実施に用いるべく考慮された菌株である。他の微生物による場合と同様に、Ｎｏｓｔｏｃ種の特徴は変化を受ける。例えば、所定菌株(specified strain)の組換え体、変異体又は突然変異体を、例えば紫外線、Ｘ線、γ線及びＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンのような、種々な公知の物理的及び化学的な突然変異原による処置によって得ることができる。クリプトフィシン化合物を産生するという特徴を保有する所定菌株の全ての天然変異体と誘導変異体、突然変異体及び組換え体が、特許請求する発明の範囲内に含まれるように意図される。本発明のクリプトフィシン化合物は、適当な培養培地中の液内(submerged)好気性条件下でＮｏｓｔｏｃ種の菌株を、実質的な抗生物質活性(antibiotic activity)が得られるまで培養することによって製造することができる。例えば固体培地上での表面増殖のような、他の培養方法を用いて、これらの化合物を製造することもできる。所定菌株を増殖させるために用いる培養培地は、当業者に公知である多くの窒素及び炭素ソースの任意の１種と無機塩とを包含することができる。製造の経済性、最適の収率及び生成物単離の容易さが、用いるべき炭素及び窒素ソースを選択する場合に考慮すべきファクターである。培養培地に組み入れることができる栄養素無機塩には、鉄、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、クロリド、カーボネート、ホスフェート、スルフェート、ニトレート等のイオンを生成することができる慣用的な可溶性塩がある。微生物の増殖と発生のために必要である必須微量元素も培養培地中に含めることができる。このような微量元素は通常、微生物の増殖条件を満たすために充分な量で、培地の他の成分中の不純物として生ずる。発泡が問題になる場合には、例えば大規模培養培地にポリプロピレングリコール（分子量約２０００）のような、消泡剤の少量（即ち、０．２ｍｌ／ｌ）を加えることが望ましいと考えられる。かなりの量のクリプトフィシン化合物を製造するためには、タンク内での液内好気性培養を用いることができる。少量は振とうフラスコ培養によって得ることができる。大型タンクへの微生物の接種に一般に関連した代謝物産生の時間的遅延のために、栄養接種原(vegetative inoculum)を用いることが好ましい。栄養接種原は、少量の培養培地に微生物の栄養細胞糸(vegetative trichome)又は異質細胞を含有する形のフラグメントを接種して、微生物の新鮮な、活性に増殖する培養物を得ることによって用意される。栄養接種原を次により大きいタンクに移す。この栄養接種原に対して用いる培地は大規模培養又は発酵に用いた培地と同じものでよいが、他の培地を用いることもできる。細菌微生物は約２０℃〜３０℃の温度及び約１００〜約２００μｍｏｌフォトンｍ^-2秒^-1の入射照度(incident illumination intensity)（光合成的に有効な照射）において増殖することができる。この種類の好気性液内培養プロセスにおいて慣例的であるように、二酸化炭素ガスを、培養培地に通してバブルさせる無菌空気流に加えることによって培養物中に導入する。クリプトフィシン化合物を効果的に製造するために、二酸化炭素の割合は約１％（２４℃及び１気圧の圧力において）であるべきである。先行技術、特に米国特許第４，９４６，８３５号（これの内容は本明細書に援用される）はＮｏｓｔｏｃ種の培養方法を提供する。クリプトフィシン化合物の製造は、培養中に、これらの抗生物質に敏感であることが知られている微生物に対してブロス(broth)のサンプルを試験することによってフォローすることができる。１種の有用な分析用微生物はＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓである。本発明のクリプトフィシン化合物は、発酵培養条件下でのこれらの製造後に、培養物及び培養培地から当業者に公知の方法によって回収することができる。回収は一般に、最初に培養培地を濾過して、藻細胞(algal cell)を分離し、次に分離された細胞を凍結乾燥することによって達成される。凍結乾燥済み藻を例えばアセトニトリルとジクロロメタンとの混合物のような適当な溶媒によって抽出することができる。この抽出物と培養培地とに対して逆相カラム上での迅速クロマトグラフィーをおこなうことによって、クリプトフィシンを分離することができる。このクリプトフィシンは逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製することができる。本発明の新規なクリプトフィシン化合物と、既に開示されたクリプトフィシン化合物とは抗腫瘍剤として治療的に用いることができ、したがって、腫瘍性疾患を治療する方法に用いることができる。クリプトフィシン１、３、５、１３及び１５と名付けられた、５種類のクリプトフィシン化合物が米国特許第４，９４６，８３５号、第４，８４５，０８５号、第４，８４５，０８６号及び第４，８６８，２０８号に開示されており、このような化合物はＭB５３５７と名付けられた、Ｎｏｓｔｏｃ種の菌株から単離されたか、又はこのような単離された化合物から合成されたものである。本発明は変形な生合成(aberrant biosynthesis)によるこれらの化合物の製造方法を提供する。抗腫瘍剤としてのこれらの使用を開示されない他のクリプトフィシン類は、米国特許出願第０８／４００，０５７号（１９９５年３月７日出願）、国際特許出願第ＰＣＴ＼ＵＳ９４＼１４７４０号（１９９４年１２月２１日出願）、米国特許出願第０８／２４９，９５５号（１９９４年５月２７日出願）、及び米国特許出願第０８／１７２，６３２号（１９９３年１２月２１日出願）に開示されている。これらの特許出願は本明細書に援用される。代謝基質の選択クリプトフィシン１の生合成では、Ｌ−フェニルアラニンが単位Ａ（フェニルアセテートと３当量のアセテートとからアセンブルされるポリケチド）のフェニル及びエポキシド炭素の先駆体である。Ｌ−チロシンはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンのメチル基から生じるＯ−メチル基を有する単位Ｂの先駆体である。Ｌ −チロシンが単位Ｂ中に良好に組み入れられるばかりでなく、Ｌ−Ｏ−メチルチロシンも単位Ｂに良好に組み入れられ、このことはチロシンのＯ−メチル化が最初に生じ、これに続いて、Ｏ−メチルチロシン又は塩素化Ｏ−メチルチロシンのデプシペプチドへの同化が生ずることを意味する。クリプトフィシン１の生合成では、（２Ｓ，３Ｒ）−３−メチルアスパラギン酸が単位Ｃの先駆体である。しかし、（２Ｒ）−２−メチル−β−アラニンも単位Ｃ中に良好に組み入れられ、このことは（２Ｓ，３Ｒ）−３−メチルアスパラギン酸が脱炭酸されて、最初に（２Ｒ）−２−メチル−β−アラニンになり、これに続いて、（２Ｒ）−２−メチル−β−アラニンのデプシペプチドへの同化が生ずることを示唆する。クリプトフィシン１の生合成では、Ｌ−ロイシンが単位Ｄの先駆体であり、この単位中に良好に組み入れられる。Ｌ−ロイシン酸は単位Ｄに組み入れられず、このことはＬ−ロイシンがデプシペプチドシンターゼ（デプシペプチドのアセンブリをおこなう多機能酵素）に取り入れられ、単位Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ先駆体のデプシペプチドへのアセンブリ中にＬ−ロイシン中の窒素が失われ、酸素と置換されることを示唆する。既述された特性、例えば、完全なマクロライド、単位Ｂ中のエポキシド基、クロロ基及び／又は単位Ｃ中のメチル基を有する望ましいクリプトフィシン化合物を製造するために、クリプトフィシン化合物を産生することができる細菌の発酵培養のための代謝基質として、選択された置換アミノ酸を用いることができる。最も広い意味において、置換アミノ酸は、細菌発酵培養の基礎を通常形成するタンパク質アミノ酸以外の任意のアミノ酸であると考えられる。さらに通常は、このような置換アミノ酸は、適当な位置に置換基を供給して、細菌発酵培養の代謝産物として所望のクリプトフィシン化合物を形成するアミノ酸を包含する。このようなアミノ酸は、例えば、置換α−アミノ酸、置換フェニルアラニン、置換チロシン、置換Ｏ−メチルチロシン及び置換β−アラニンを包含する。典型的に置換基はクリプトフィシン代謝産物に所望の構造特徴を与えるように選択される。例えば、アリール基に結合したハロゲンはクリプトフィシン化合物の単位Ｂの望ましい特徴であると示されているので、少なくとも１つのハロゲン部分で置換されたアミノ酸が有用であると判明するであろう。一般に、アラニン又はフェニルアラニンが典型的に、ハロ置換アリール化合物によって置換される、この点で選択すべきアミノ酸である。同様に、単位Ｃにおけるメチル基は適当に置換したβ−アラニンの特徴として包含されることができる。したがって、多くの場合に、選択すべきアミノ酸はアルキル、アルコキシ、アルカリール及びアルコキシアリール化合物並びにこれらのハロ置換誘導体から成る群から選択される少なくとも１つの置換基によって置換される。したがって、本発明はＮｏｓｔｏｃ種の菌株を培養し、培養物中に予め選択された下記化合物：置換フェニルアラニン、置換β−アラニン、置換チロシン又はＯ−メチルチロシン及び置換α−アミノ酸の１種以上を導入することによる、既知クリプトフィシンと新規なクリプトフィシンとの製造方法を提供する。詳しくは、本発明は変形生合成による既に開示されたクリプトフィシン−５２、クリプトフィシン−１１０及びクリプトフィシン−１１５の製造方法と、以下で述べる新規なクリプトフィシン化合物とを提供する。例えば、シアノバクテリアを２，２−ジメチル−β−アラニンの存在下で増殖させる場合には、クリプトフィシン−５２が他のクリプトフィシンと共に製造される：シアノバクテリアをＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニンの存在下で増殖させる場合には、クリプトフィシン−１１０とクリプトフィシン−１１５が製造される：本発明の方法を用いて、図１の単位Ａのアリール基において異なる新規なクリプトフィシンを、シアノバクテリアを適当に置換したフェニルアラニンの存在下で増殖させることによって製造することができる。同様に、本発明の方法は、（１）適当に置換したチロシン又はＯ−メチルチロシンの存在下でシアノバクテリアを増殖させることによって単位Ｂにおいて、（２）適当に置換したβ−アラニンの存在下でシアノバクテリアを増殖させることによって単位Ｃにおいて、及び（３）適当に置換したα−アミノ酸の存在下でシアノバクテリアを増殖させることによって単位Ｄにおいて異なる新規なクリプトフィシンを製造することができる。本発明の新規なクリプトフィシン化合物の例は、シアノバクテリアをＤＬ−３ −（３−メチル−４−メトキシフェニル）アラニンの存在下で増殖させることによって産生されるクリプトフィシン−１８９（クリプトフィシンＢ−８とも呼ばれる）である：本発明の新規なクリプトフィシン化合物の他の２つの例は、シアノバクテリアをＤＬ−３−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）アラニンの存在下で増殖させることによって産生されるクリプトフィシン−１９０（クリプトフィシンＢ −１とも呼ばれる）とクリプトフィシン−２１０である：本発明の新規なクリプトフィシン化合物の他の例は、シアノバクテリアを（２Ｒ）−３−（３−ブロモ−４−メトキシフェニル）アラニン又は（２Ｒ）−３− （３−ブロモ−４−ヒドロキシフェニル）アラニンの存在下で増殖させることによって産生されるクリプトフィシンＢ−２である：本発明の新規なクリプトフィシン化合物の他の例は、シアノバクテリアを（２Ｒ）−３−（３，４−ジメトキシフェニル）アラニン又は（２Ｒ）−３−（３− ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）アラニン又は（２Ｒ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アラニンの存在下で増殖させることによって産生されるクリプトフィシンＢ−３である：本発明の新規なクリプトフィシン化合物の他の２つの例は、シアノバクテリアをＤＬ−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）アラニンの存在下で増殖させることによって産生されるクリプトフィシン−２０８とクリプトフィシン−２０９（クリプトフィシンＢ−４とも呼ばれる）である：本発明の新規なクリプトフィシン化合物の他の例は、シアノバクテリアをＤＬ −３−（３−フルオロ−４−ヒドロキシフェニル）アラニンの存在下で増殖させることによって産生されるクリプトフィシン−２１１である：本発明の新規なクリプトフィシン化合物の他の例は、シアノバクテリアを（２Ｒ）−３−（４−メトキシ−２−ピリジル）アラニン又は（２Ｒ）−３−（４− ヒドロキシ−２−ピリジル）アラニンの存在下で増殖させることによって産生されるクリプトフィシンＢ−５である：本発明の新規なクリプトフィシン化合物の他の例は、シアノバクテリアを（２Ｒ）−３−（４−メトキシ−３−ピリジル）アラニンの存在下で増殖させることによって産生されるクリプトフィシンＢ−６である：本発明の新規なクリプトフィシン化合物の他の例は、シアノバクテリアを（２Ｒ）−３−（４−エトキシフェニル）アラニンの存在下で増殖させることによって産生されるクリプトフィシンＢ−７である：本発明の新規なクリプトフィシン化合物の他の例は、シアノバクテリアを（３Ｓ）−３−アミノブタン酸の存在下で増殖させることによって産生されるクリプトフィシン−２１３である：本発明の新規なクリプトフィシン化合物の他の例は、シアノバクテリアを（２Ｒ）−２−エチル−β−アラニンの存在下で増殖させることによって産生されるクリプトフィシンＣ−１である：本発明の新規なクリプトフィシン化合物の他の例は、シアノバクテリアを（２Ｒ）−２−イソプロピル−β−アラニンの存在下で増殖させることによって産生されるクリプトフィシンＣ−２である：本発明の新規なクリプトフィシン化合物の他の例は、シアノバクテリアを（２Ｒ）−２−ｔ−ブチル−β−アラニンの存在下で増殖させることによって産生されるクリプトフィシンＣ−３である：本発明の新規なクリプトフィシン化合物の他の例は、シアノバクテリアを（２Ｒ）−２−ジメチルアミノ−β−アラニンの存在下で増殖させることによって産生されるクリプトフィシンＣ−４である：本発明の新規なクリプトフィシン化合物の他の例は、シアノバクテリアを（２Ｒ）−２−ジメチルアミノメチル−β−アラニンの存在下で増殖させることによって産生されるクリプトフィシンＣ−５である：本発明の新規なクリプトフィシン化合物の他の例は、シアノバクテリアを２，２−ジエチル−β−アラニンの存在下で増殖させることによって産生されるクリプトフィシンＣ−６である：本発明の新規なクリプトフィシン化合物の他の例は、シアノバクテリアを２，２−ジ（メトキシメチル）−β−アラニンの存在下で増殖させることによって産生されるクリプトフィシンＣ−７である：本発明の新規なクリプトフィシン化合物の他の例は、シアノバクテリアを１− アミノメチルシクロプロパン−１−カルボン酸の存在下で増殖させることによって産生されるクリプトフィシンＣ−８である：本発明の新規なクリプトフィシン化合物の他の２つの例は、シアノバクテリアを（２Ｓ）−２−アミノ酪酸の存在下で増殖させることによって産生されるクリプトフィシン−２１４及びクリプトフィシン−２１５である：本発明の新規なクリプトフィシン化合物の他の例は、シアノバクテリアを３− シクロプロピル−α−アラニンの存在下で増殖させることによって産生されるクリプトフィシンＤ−１である：本発明の新規なクリプトフィシン化合物の他の例は、シアノバクテリアを３− ｔ−ブチル−α−アラニンの存在下で増殖させることによって産生されるクリプトフィシンＤ−２である：本発明の新規なクリプトフィシン化合物の他の例は、シアノバクテリアを３− ビニル−α−アラニンの存在下で増殖させることによって産生されるクリプトフィシンＤ−３である：実験以下の実験開示では、他に指定しないかぎり、全ての重量はグラム（ｇ）、ミリグラム（ｍｇ）、マイクログラム（ｍｇ）、ナノグラム（ｎｇ）、ピコグラム（ｐｇ）又はモル（ｍｏｌ）で記載し、全ての濃度は体積パーセント（％）、モル（Ｍ）、ミリモル（ｍＭ）、マイクロモル（μＭ）、ナノモル（ｎＭ）又はピコモル（ｐＭ）、規定（Ｎ）として記載し、全ての体積はリットル（ｌ）、ミリリットル（ｍｌ）又はマイクロリットル（μｌ）で記載し、尺度はミリメートル（ｍｍ）で記載する。実施例１置換アミノ酸を供給するための一般的操作置換アミノ酸を用いる細菌発酵によってクリプトフィシン化合物を製造するために、選択されたアミノ酸を１５〜２５ｍｇ／ｍｌの濃度にまで０．５ＮＨＣ１中に溶解する。典型的に、この溶液の０．５ｍｌ部分を２〜４個のカーボイ(carbouy)の細菌培養物の各々に、細菌接種後の７〜１０日目に開始して２日間間隔で加える。アミノ酸溶液を７〜９回添加した後に、培養物をさらに３〜５日間増殖させてから、回収した。実施例２ＥＩ質量分光測定によるクリプトフィシンの同定高分解能質量測定値(high resolution mass measurements)を包含する質量スペクトルをＶＧ−７０ＳＥ機器（入手源？？）で電子衝突モードにおいて測定する。クリプトフィシン−１、−２、−３及び−４は図２に示すような特徴的なフラグメンテーション・パターン(fragmentation pattern)を与えることが判明した。イオンｃは単位Ａに見られるアリール基において異なる類似体を同定するために有用である。イオンａ、ｂ及びｄの比較は単位Ｂ、単位Ｃ及び／又は単位Ｄにおいて異なる類似体を同定するために有用である。実施例３クリプトフィシン５２の変形生合成標準条件下で増殖したＮｏｓｔｏｃ種ＧＳＶ２２４の９個のカーボイ（２０リットル）の各々に、２，２−ジメチル−β−アラニン（４００ｍｇ）を各１００ｍｇずつの４等分量で接種後の６日目、８日目、１４日目及び２２日目に加えた。培養物を接種後の３０日目に回収して、凍結乾燥して、１０３．６ｇの乾燥藻を得た。抽出は２リットルの４：１アセトニトリル／ジクロロメタンによって５２ｇバッチで実施した。抽出物を真空蒸発させ、残渣をＣ−１８フラッシュクロマトグラフィーによって分別した。６５：３５アセトニトリル／水によって溶出した粗クリプトフィシン画分（３００ｍｇ）に対して、Ｃ−１８上でのＨＰＬＣをおこなった（Ｅｃｏｎｏｓｉｌ，１０μ，２５０Ｘ２２ｍｍカラム，６５：３５ＭｅＣＮ／Ｈ₂Ｏ，６ｍｌ／分）。６６．５分間後に溶出した画分をシリカ上での順相ＨＰＬＣによって精製した（Ｅｃｏｎｏｓｉｌ，５μ，２５０Ｘ４．６ｍｍカラム，３：２ＥｔＯＡｃ／ヘキサン，２．５ｍｌ／分）。２１．４分間後に溶出した画分（これはクリプトフィシン−５２とクリプトフィシン−２８との混合物であった）をさらにＣ−１８上でのＨＰＬＣによって精製した（Ｅｃｏｎｏｓｉｌ，１０μ，２５０Ｘ１０ｍｍ，８５：１５メタノール／水，２ｍｌ／分）。分光比較によって信頼できる(authentic)物質と同じのクリプトフィシン−５２（２ｍｇ）が１８．４分間後に溶出した。クリプトフィシン５２のスペクトルデータは次の通りである（Ｕｎｉｔは単位を表す）：実施例４クリプトフィシン−１１０とクリプトフィシン−１１５の変形生合成標準条件下で増殖したＮｏｓｔｏｃ種ＧＳＶ２２４の２個のカーボイ（２０リットル）の各々に、一般的操作に述べたように、ＤＬ−３−（４−フルオロフェニル）アラニン（１５０ｍｇ）を加えた。回収後に、凍結乾燥した藻（２６ｇ) を１リットルの５：１ＣＨ₃ＣＮ／ＣＨ₂Ｃｌ₂によって２４時間抽出し、抽出物（１ｇ）を真空濃縮して、暗緑色固体を得た。この粗抽出物をＯＤＳ被覆シリカカラムに供給して、２５：７５ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（２５０ｍｌ）、５０：５０ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（２５０ｍｌ）、６５：３５ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（２５０ｍｌ）、８０：２０ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（５００ｍｌ）、ＣＨ₃ＯＨ（６００ｍｌ）及びＣＨ₂Ｃｌ₂（５００ｍｌ）によるフラッシュクロマトグラフィーを受けさせた。６５：３５ＣＨ₂ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（９８ｍｇ）と８０：２０ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（４５ｍｇ）によって溶出した画分を蒸発させ、さらに逆相ＨＰＬＣ（ＥｃｏｎｏｓｉｌＣ−１８，１０μ，２５０Ｘ２２ｍｍカラム，６５：３５ＭｅＣＮ／Ｈ₂Ｏ，６ｍｌ／分）によって分離した。クリプトフィシン−１１５を含有する画分は４５分＜ｔ_R＜５９分において溶出し、クリプトフィシン−１１０を含有する画分は７５分＜ｔ_R＜９０分において溶出した。順相ＨＰＬＣ（Ｅｃｏｎｏｓｉｌシリカ，５μ，２５０Ｘ４．６ｍｍカラム，５０：５０ＥｔＯＡｃ／ヘキサン，３ｍｌ／分）によって精製して、クリプトフィシン−１１０（ｔ_R ＝１４分，０．１ｍｇ）と、クリプトフィシン−１１５（１８分＜ｔ_R＜２３分，０．７ｍｇ）とを得た。単離したクリプトフィシンの¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルは合成サンプルの¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルと同じであった。クリプトフィシン−１１５：ＥＩＭＳｍ／ｚ（相対強度％）６７２（１．９，Ｍ⁺），４１２（５．８，イオンａ），２８０（１０，イオンｂ），２４５（１７，イオンｃ），１９５（５２，イオンｄ），１５５（３１），１４１（２３），１３５（１５），１０９（１００，ｐ−フルオロベンジルイオン＝フルオロトロピリウムイオン）；高分解能ＥＩＭＳ６６８．２８５３ (C₃₅Ｈ₄₂ＣｌＦＮ₂Ｏ₈として計算，△＋３．４ｍｍｕ，Ｍ⁺）．実施例５クリプトフィシン−１８９の変形生合成標準条件下で増殖したＮｏｓｔｏｃ種ＧＳＶ２２４の２個のカーボイ（２０リットル）の各々に、一般的操作に述べたように、ＤＬ−３−（３−メチル−４− メトキシフェニル）アラニン（１２０ｍｇ）を加えた。回収後に、凍結乾燥した藻（２０ｇ）を１リットルの５：１ＣＨ₃ＣＮ／ＣＨ₂Ｃｌ₂によって２４時間抽出し、抽出物（１．１ｇ）を真空濃縮して、暗緑色固体を得た。この粗抽出物をＯＤＳ被覆シリカカラムに供給して、２５：７５ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（２５０ｍｌ）、５０：５０ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（２５０ｍｌ）、６５：３５ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（２５０ｍｌ）、８０：２０ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（２５０ｍｌ）、ＣＨ₃ＯＨ（５００ｍｌ）及びＣＨ₂Ｃｌ₂（５００ｍｌ）によるフラッシュクロマトグラフィーを受けさせた。６５：３５ＣＨ₂ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（１７８ｍｇ）と８０：２０ＣＨ₃ ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（７５ｍｇ）によって溶出した画分を蒸発させ、さらに逆相ＨＰＬＣ（ＥｃｏｎｏｓｉｌＣ−１８，１０μ，２５０Ｘ２２ｍｍカラム，６５：３５ＭｅＣＮ／Ｈ₂Ｏ，６ｍｌ／分）によって分離した。クリプトフィシン−１８９を含有する画分は５０分＜ｔ_R＜６４分において溶出した。この画分（１５０ｍｇ）の順相ＨＰＬＣ（Ｅｃｏｎｏｓｉｌシリカ１０μ，２５０Ｘ１０ｍｍカラム，６０：４０ＥｔＯＡｃ／ヘキサン，３ｍｌ／分）は２．８ｍｇの純粋化合物（ｔ_R＝２８分）を与えた。クリプトフィシン−１８９の単離と同定を容易にするために、［Ｏ−メチル−² Ｈ₃］−ＤＬ−３−（３−メチル−４−メトキシフェニル）アラニンをこの藻に供給した。²Ｈ₃−標識クリプトフィシン−１８９は下記スペクトル特性を示した：実施例６クリプトフィシン−１９０とクリプトフィシン−２１０との変形生合成標準条件下で増殖したＮｏｓｔｏｃ種ＧＳＶ２２４の３個のカーボイ（２０リットル）の各々に、一般的操作に述べたように、ＤＬ−３−（３−フルオロ−４ −メトキシフェニル）アラニン（１８０ｍｇ）を加えた。回収後に、凍結乾燥した藻（３２ｇ）を１．５リットルの５：１ＣＨ₃ＣＮ／ＣＨ₂Ｃｌ₂によって２４時間抽出し、抽出物（１．２ｇ）を真空濃縮して、暗緑色固体を得た。この粗抽出物をＯＤＳ被覆シリカカラムに供給して、２５：７５ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（２５０ｍｌ）、５０：５０ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（２５０ｍｌ）、６５：３５ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（２５０ｍｌ）、８０：２０ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（５００ｍｌ）、ＣＨ₃ＯＨ（５００ｍｌ）及びＣＨ₂Ｃｌ₂（５００ｍｌ）によるフラッシュクロマトグラフィーを受けさせた。６５：３５ＣＨ₂ＣＮ／Ｈ₂Ｏと８０：２０ＣＨ₃ ＣＮ／Ｈ₂Ｏによって溶出した画分を蒸発させ、さらに逆相ＨＰＬＣ（ＥｃｏｎｏｓｉｌＣ−１８，１０μ，２５０Ｘ２２ｍｍカラム，６５：３５ＭｅＣＮ／Ｈ₂Ｏ，６ｍｌ／分）によって分離した。クリプトフィシン−１９０を含有する画分は４４分＜ｔ_R＜５０分において溶出し、クリプトフィシン−２１０を含有する画分は７５分＜ｔ_R＜９６分において溶出した。これらの２画分の順相ＨＰＬＣ（Ｅｃｏｎｏｓｉｌシリカ，５μ，２５０Ｘ４．６ｍｍカラム，２．５ｍｌ／分）によるさらなる精製は、４．３ｍｇのクリプトフィシン−１９０（４５：５５ＥｔＯＡｃ／ヘキサン，ｔ_R＝２２分）と１．５ｍｇのクリプトフィシン− ２１０（５０：５０ＥｔＯＡｃ／ヘキサン，ｔ_R＝１４．４分）を生じた。クリプトフィシン−１９０とクリプトフィシン−２１０との単離と同定を容易にするために、［Ｏ−メチル−²Ｈ₃］−ＤＬ−３−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）アラニンをこの藻に供給した。²Ｈ₃−標識クリプトフィシン−１９０は下記スペクトル特性を示した：実施例７クリプトフィシン−２０８とクリプトフィシン−２０９との変形生合成標準条件下で増殖したＮｏｓｔｏｃ種ＧＳＶ２２４の２個のカーボイ（２０リットル）の各々に、一般的操作に述べたように、ＤＬ−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）アラニン（１２０ｍｇ）を加えた。回収後に、凍結乾燥した藻（２５ｇ）を１リットルの５：１ＣＨ₃ＣＮ／ＣＨ₂Ｃｌ₂によって２４時間抽出し、抽出物（５１０ｍｇ）を真空濃縮して、暗緑色固体を得た。この粗抽出物をＯＤＳ被覆シリカカラムに供給して、２５：７５ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（２５０ｍｌ）、５０：５０ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（２５０ｍｌ）、６５：３５ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（２５０ｍｌ）、８０：２０ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（２５０ｍｌ）、ＣＨ₃ＯＨ（５００ｍｌ）及びＣＨ₂Ｃｌ₂（５００ｍｌ）によるフラッシュクロマトグラフィーを受けさせた。６５：３５ＣＨ₂ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（２０４ｍｇ）と８０：２０ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（３５ｍｇ）とによって溶出した画分を蒸発させ、さらに逆相ＨＰＬＣ（ＥｃｏｎｏｓｉｌＣ−１８，１０μ，２５０Ｘ２２ｍｍカラム，６５：３５ＭｅＣＮ／Ｈ₂Ｏ，６ｍｌ／分）によって分離した。クリプトフィシン−２０９を含有する画分は４２分＜ｔ_R＜４８．５分において溶出し、クリプトフィシン−２０８を含有する画分は６９分＜ｔ_R＜８８．５分において溶出した。クリプトフィシン−２０９を含有する画分の順相ＨＰＬＣ（Ｅｃｏｎｏｓｉｌシリカ，５μ，２５０Ｘ４．６ｍｍカラム，４５：５５ＥｔＯＡｃ／ヘキサン，３ｍｌ／分）は、＜０．１ｍｇの純粋な化合物（ｔ_R=１６．５分）を生じた。クリプトフィシン−２０８を含有する画分のＨＰＬＣ（Ｅｃｏｎｏｓｉｌシリカ，５μ，２５０Ｘ４．６ｍｍカラム，５０：５０ＥｔＯＡｃ／ヘキサン，２．５ｍｌ／分）は、＜０．１ｍｇの純粋な化合物（ｔ_R＝１２分）を生じた。クリプトフィシン−２０８とクリプトフィシン−２０９との単離と同定を容易にするために、［メチレンジオキシ−²Ｈ₂］−ＤＬ−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）アラニンをこの藻に供給した。²Ｈ₂−標識クリプトフィシン− ２０８は下記スペクトル特性を示した：² ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＨＣｌ₃）δ（炭素位置，多重性）ＵｎｉｔＢ５．８８（６，７−ＯＣ²Ｈ₂Ｏ，ｓ）：ＥＩＭＳｍ／ｚ（相対強度，帰属）６２０（５，Ｍ⁺），３９４（６８，イオンａ），３９３（４９），２６２（１２，イオンｂ），２２７（４５，イオンｃ），１７７（１００，イオンｄ），９１（７９）；高分解能ＥＩＭＳｍ／ｚ６２０．３０９０（Ｃ₃₅Ｈ₄₀Ｄ₂Ｎ₂Ｏ₈として計算，△−２．３ｍｍｕ誤差）。² Ｈ₂−標識クリプトフィシン−２０９は下記スペクトル特性を示した：実施例８クリプトフィシン−２１１の変形生合成標準条件下で増殖したＮｏｓｔｏｃ種ＧＳＶ２２４の３個のカーボイ（２０リットル）の各々に、一般的操作に述べたように、ＤＬ−３−（３−フルオロ−４ −ヒドロキシフェニル）アラニン（１８０ｍｇ）を加えた。回収後に、凍結乾燥した藻（３４ｇ）を１．５リットルの５：１ＣＨ₃ＣＮ／ＣＨ₂Ｃｌ₂によって２４時間抽出し、抽出物（１．１ｇ）を真空濃縮して、暗緑色固体を得た。この粗抽出物をＯＤＳ被覆シリカカラムに供給して、２５：７５ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（２５０ｍｌ）、５０：５０ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（２５０ｍｌ）、６５：３５ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（２５０ｍｌ）、８０：２０ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（６００ｍｌ）、ＣＨ₃ ＯＨ（６００ｍｌ）及びＣＨ₂Ｃｌ₂（５００ｍｌ）によるフラッシュクロマトグラフィーを受けさせた。６５：３５ＣＨ₂ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（３０２ｍｇ）と８０：２０ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（４９ｍｇ）によって溶出した画分を蒸発させ、さらに逆相ＨＰＬＣ（ＥｃｏｎｏｓｉｌＣ−１８，１０μ，２５０Ｘ２２ｍｍカラム，６５：３５ＭｅＣＮ／Ｈ₂Ｏ，６ｍｌ／分）によって分離した。クリプトフィシン −２１１を含有する画分はt_R＝６６分において溶出した。順相ＨＰＬＣ（Ｅｃｏｎｏｓｉｌシリカ，５μ，２５０Ｘ４．６ｍｍ，５０：５０ＥｔＯＡｃ／ヘキサン，３ｍｌ／分）によるさらなる精製は３．５ｍｇの純粋化合物（t_R＝５．５分）を生じた。クリプトフィシン−２１１：実施例９クリプトフィシン−２１３の変形生合成標準条件下で増殖したＮｏｓｔｏｃ種ＧＳＶ２２４の３個のカーボイ（２０リットル）の各々に、一般的操作に述べたように、Ｓ−３−アミノブタン酸（１８０ｍｇ）を加えた。回収後に、凍結乾燥した藻（３１ｇ）を１．５リットルの５：１ＣＨ₃ＣＮ／ＣＨ₂Ｃｌ₂によって２４時間抽出し、抽出物（１ｇ）を真空濃縮して、暗緑色固体を得た。この粗抽出物をＯＤＳ被覆シリカカラムに供給して、２５：７５ＣＨ₃ＣＮ／H₂Ｏ（２５０ｍ１）、５０：５０ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（２５０ｍ１）、６５：３５ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（２５０ｍ１）、８０：２０ＣＨ₂ ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（２５０ｍｌ）、ＣＨ₃ＯＨ（５００ｍ１）及びＣＨ₂Ｃｌ₂（５００ｍｌ）によるフラッシュクロマトグラフィーを受けさせた。６５：３５ＣＨ₂ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（２０５ｍｇ）と８０：２０ＣＨ,、ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（１０８ｍｇ）によって溶出した画分を蒸発させ、さらに逆相ＨＰＬＣ（ＥｃｏｎｏｓｉｌＣ−１８，１０μ，２５０Ｘ２２ｍｍカラム，６５：３５ＭｅＣＮ／Ｈ₂Ｏ，６ｍｌ／分）によって分離した。クリプトフィシン−２１３を含有する画分（１９２ｍｇ）は５２分＜ｔ_R＜６９分において溶出した。順相ＨＰＬＣ（Ｅｃｏｎｏｓｉｌシリカ，５μ，２５０Ｘ４．６ｍｍカラム，５０：５０ＥｔＯＡｃ／ヘキサン，２．５ｍｌ／分）によるさらなる精製は、＜０．１ｍｇの純粋化合物（ｔ_R＝？？分）を生じた。クリプトフィシン−２１３の単離と同定を容易にするために、［メチル−² Ｈ₃］−Ｓ−３−アミノブタン酸をこの藻に供給した。²Ｈ₃−標識クリプトフィシン−２１３は下記スペクトル特性を示した：²ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＨＣｌ₃）δ（炭素位置，多重性）ＵｎｉｔＣｌ．１１（Ｃ−２上のＣ²Ｈ₃）。実施例１０クリプトフィシン−２１４とクリプトフィシン−２１５との変形生合成標準条件下で増殖したＮｏｓｔｏｃ種ＧＳＶ２２４の３個のカーボイ（２０リットル）の各々に、一般的操作に述べたように、Ｓ−２−アミノブタン酸（１８０ｍｇ）を加えた。回収後に、凍結乾燥した藻（４１ｇ）を１．７リットルの５：１ＣＨ₃ＣＮ／ＣＨ₂Ｃｌ₂によって２４時間抽出し、抽出物（１ｇ）を真空濃縮して、暗緑色固体を得た。この粗抽出物をＯＤＳ被覆シリカカラムに供給して、２５：７５ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（２５０ｍｌ）、５０：５０ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（２５０ｍｌ）、６５：３５ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（２５０ｍｌ）、８０：２０ＣＨ₃ ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（２５０ｍｌ）、ＣＨ₃ＯＨ（６００ｍｌ）及びＣＨ₂Ｃｌ₂（５００ｍｌ）によるフラッシュクロマトグラフィーを受けさせた。６５：３５ＣＨ₂ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（５２９ｍｇ）と８０：２０ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（５９ｍｇ）によって溶出した画分を蒸発させ、さらに逆相ＨＰＬＣ（ＥｃｏｎｏｓｉｌＣ−１８，１０μ，２５０Ｘ２２ｍｍカラム，６５：３５ＭｅＣＮ／Ｈ₂Ｏ，６ｍｌ／分）によって分離した。クリプトフィシン−２１４を含有する画分は８７分＜ｔ_Rにおいて溶出し、クリプトフィシン−２１５を含有する画分は５３分＜ｔ_R＜６８分において溶出した。順相ＨＰＬＣによって、さらなる分離をおこなって、＜１ｍｇの不純なクリプトフィシン−２１４（Ｅｃｏｎｏｓｉｌシリカ，５μ，２５０Ｘ４．６ｍｍカラム，４５：５５ＥｔＯＡｃ／ヘキサン，２．５ｍｌ／分）（１７分＜ｔ_R＜１９．５分）と＜１ｍｇの不純なクリプトフィシン−２１５（Ｅｃｏｎｏｓｉｌシリカ，１０μ，２５０Ｘ１０ｍｍ，６０：４０ＥｔＯＡｃ／ヘキサン，３ｍｌ／分）（１０分＜ t_R＜１２分）を得た。クリプトフィシン−２１４とクリプトフィシン−２１５との単離と同定を容易にするために、［メチル−²Ｈ₃］−Ｓ−２−アミノブタン酸をこの藻に供給した。²Ｈ₃−標識クリプトフィシン−２１４は下記スペクトル特性を示した：² ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＨＣｌ₃）ＵｎｉｔＤ δ（帰属）０．７６（４−²Ｈ₃）。²Ｈ₃−標識クリプトフィシン−２１５は下記スペクトル特性を示した：²ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＨＣｌ₃）ＵｎｉｔＤ δ（帰属）０．７６（４−²Ｈ₃）。実施例１１変形生合成によって製造されるクリプトフィシンの細胞毒性クリプトフィシン−５２（ＩＣ₅₀ ４３ｐＭ）とクリプトフィシン−１１５（ＩＣ₅₀ ３９ｐＭ）とは、ヒト腫瘍細胞株ＫＢに対して、クリプトフィシン−１（ＩＣ₅₀ ９〜２９ｐＭ）よりもやや低い細胞毒性である。クリプトフィシン− １１０（ＩＣ₅₀ ４．６ｎＭ）は、クリプトフィシン−３（ＩＣ₅₀ ３．１〜４．６ｎＭ）の細胞毒性に匹敵する、ヒト腫瘍細胞株ＫＢに対する細胞毒性を有する。新規なスチレン型クリプトフィシン２０８、２１０及び２１４のＫＢに対する細胞毒性（ＭＩＣ）は１０〜１００ｎＭの範囲内である。クリプトフィシン１８９、１９０、２０９、２１１、２１３及び２１５のＫＢに対する細胞毒性は＜１ｎＭである。本明細書に引用した全ての刊行物と特許出願とは、参考文献として包含されることが明確にかつ個別に表示されているかのように、本明細書に援用される。上記では本発明を、明確にし、理解させるために例示と実施例とに基づいてある程度詳しく説明したが、この開示を考慮するならば、ある一定の変化と修正とが特許請求の要旨及び範囲から逸脱せずに本発明に加えられうることが、当業者に明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ヘムシャイドト，トマス，ケイ. アメリカ合衆国96821 ハワイ州ホノルル, アイプニストリート 640

Claims

【特許請求の範囲】１．所望のクリプトフィシン化合物を製造するために充分な条件下で、置換アミノ酸の存在下においてクリプトフィシンを産生することができる細菌の少なくとも１種の菌株を培養することを含む、クリプトフィシン化合物の製造方法。２．前記細菌がシアノバクテリアである、請求項１記載の方法。３．前記細菌がＮｏｓｔｏｃ属からの少なくとも１つの種である、請求項２記載の方法。４．前記細菌がＮｏｓｔｏｃ種の菌株ＧＳＶ２２４（ＡＴＣＣＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．５５４８３）と菌株ＭＢ５３５７（ＡＴＣＣＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．５３７８９）とから成る群から選択される、少なくとも１種の菌株である、請求項３記載の方法。５．前記置換アミノ酸がα−アミノ酸である、請求項１記載の方法。６．前記置換アミノ酸が置換フェニルアラニン、置換チロシン、置換Ｏ−メチルチロシン及び置換β−アラニンから成る群から選択される、少なくとも１種のアミノ酸である、請求項１記載の方法。７．前記置換アミノ酸が少なくとも１つのハロゲン部分によって置換されている、請求項１記載の方法。８．前記置換アミノ酸がハロ置換アリール化合物類から成る群から選択される少なくとも１つの置換基によって置換されている、請求項１記載の方法。９．前記置換アミノ酸がアルキル、アルコキシ、アルカリール及びアルコキシアリール化合物並びにこれらのハロ置換誘導体から成る群から選択される少なくとも１つの置換基によって置換されている、請求項１記載の方法。１０．少なくとも１種のクリプトフィシン化合物を製造するために充分な条件下、置換アミノ酸の存在中でネイティブクリプトフィシン化合物を産生することができる細菌の少なくとも１種の菌株を培養することによって得られるクリプトフィシン化合物であって、標準培養条件下で細菌によって産生されるこのようなネイティブクリプトフィシン化合物とは異なるクリプトフィシン化合物。１１．前記細菌がシアノバクテリアである、請求項１０記載のクリプトフィシン化合物。１２．前記細菌がＮｏｓｔｏｃ属からの少なくとも１つの種である、請求項１０記載のクリプトフィシン化合物。１３．前記細菌がＮｏｓｔｏｃ種の菌株ＧＳＶ２２４（ＡＴＣＣＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．５５４８３）と菌株ＭＢ５３５７（ＡＴＣＣＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．５３７８９）とから成る群から選択される、少なくとも１種の菌株である、請求項１０記載のクリプトフィシン化合物。１４．前記置換アミノ酸がα−アミノ酸である、請求項１０記載のクリプトフィシン化合物。１５．前記置換アミノ酸が置換フェニルアラニン、置換チロシン、置換Ｏ−メチルチロシン及び置換β−アラニンから成る群から選択される、少なくとも１種のアミノ酸である、請求項１０記載のクリプトフィシン化合物。１６．前記置換アミノ酸が少なくとも１つのハロゲン部分によって置換されている、請求項１０記載のクリプトフィシン化合物。１７．前記置換アミノ酸がハロ置換アリール化合物類から成る群から選択される少なくとも１つの置換基によって置換されている、請求項１０記載のクリプトフィシン化合物。１８．前記置換アミノ酸がアルキル、アルコキシ、アルカリール及びアルコキシアリール化合物並びにこれらのハロ置換誘導体から成る群から選択される少なくとも１つの置換基によって置換されている、請求項10記載のクリプトフィシン化合物。