WO2007000994A1 - 抗ｈｃｖ作用を有する化合物の製造方法 - Google Patents

抗ｈｃｖ作用を有する化合物の製造方法 Download PDF

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WO2007000994A1
WO2007000994A1 PCT/JP2006/312798 JP2006312798W WO2007000994A1 WO 2007000994 A1 WO2007000994 A1 WO 2007000994A1 JP 2006312798 W JP2006312798 W JP 2006312798W WO 2007000994 A1 WO2007000994 A1 WO 2007000994A1
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compound
strain
formula
group
carbon atoms
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PCT/JP2006/312798
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French (fr)
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Masahiro Aoki
Yoshie Nagahashi
Hideyuki Kato
Tatsuya Ito
Miyako Masubuchi
Toru Okuda
Original Assignee
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/34—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C07C229/36—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton containing six-membered aromatic rings with at least one amino group and one carboxyl group bound to the same carbon atom of the carbon skeleton
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C231/00—Preparation of carboxylic acid amides
    • C07C231/14—Preparation of carboxylic acid amides by formation of carboxamide groups together with reactions not involving the carboxamide groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a compound having a high replication inhibitory activity against hepatitis C virus (HCV) and useful for the prevention and treatment of viral infection, particularly liver disease caused by HCV infection.
  • HCV hepatitis C virus
  • HCV was discovered in 1989 as a major causative virus for non-A non-B hepatitis after blood transfusion.
  • HCV is an enveloped RNA virus whose genome consists of single-stranded (+) RNA and is classified into the genus Hepacivirus of the Flaviviridae family.
  • HCV progresses to chronic hepatitis, liver cirrhosis, and liver cancer, where persistent infection is often established even when infected with an adult who has developed an immune system, in order to avoid the host's immune mechanism due to unclear reasons.
  • liver cancer recurrence due to inflammation that continues in non-cancerous areas even after surgery.
  • interferon therapy is known as the only effective treatment for HCV elimination.
  • about 1Z3 of all patients are effective for interferon.
  • the response rate of interferon against HCV genotype lb is very low. Therefore, development of an anti-HCV drug that can replace or be used in combination with interferon is strongly desired.
  • ribavirin (1——D-ribofuranosyl 1 ⁇ —1, 2, 4-triazol 3-carboxyamide) has been used as a treatment for hepatitis C in combination with interferon. Although it is on the market, there is a need for further new hepatitis C drugs that still have a low effective rate. In addition, attempts have been made to eliminate viruses by enhancing the immunity of people such as interferon agonists and interleukin 12 agonists, but no effective drugs have been found yet.
  • Non-Patent Document 1 The mechanism of HCV RNA replication in this system is thought to be identical to the replication of the full-length HCV RNA genome infected with hepatocytes. Therefore, this system can be said to be a cell-based accessory system useful for identifying compounds that inhibit HCV replication.
  • F1476 strain Fusarium sp. F1476 strain belonging to filamentous fungi, and the compound and its derivatives are high in HCV. It was found to have replication inhibitory activity (Patent Document 1). This compound is also disclosed in International Publication No. W098Z56755 (Patent Document 2), and is known to have antifungal activity and immune reaction inhibitory action.
  • Patent Document 1 International Publication No. 2004Z071503 Pamphlet
  • Patent Document 2 Pamphlet of International Publication No. 98Z56755
  • Patent Document 3 International Publication No. 2005Z005372 Pamphlet
  • Non-Patent Document 1 Buoy Roman et al., Science, 1999, No. 285, 110-113
  • the present inventor added a salt of a specific amino acid derivative to the culture solution using a strain that produces the above compound (such as “F1476 strain” and its mutant strain). And a method for directly producing a derivative of the above compound in the strain. Furthermore, the present inventors have found the optimum culture conditions for directly producing the derivative of the above compound in the strain and the optimum salt of the amino acid derivative to be added, and have completed the present invention.
  • An object of the present invention is to provide a simple and useful method for producing a compound useful for the prevention and treatment of viral infections, particularly liver diseases caused by HCV infection, because of its high HCV replication inhibitory activity. .
  • the present invention provides:
  • A is a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, carbon number A linear or branched alkenyl group having 2 to 8 carbon atoms, a linear or branched alkynyl group having 2 to 8 carbon atoms, Represents an optionally substituted aryl group, or an optionally substituted heteroaryl group;
  • R 1 is a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, a linear or branched alkenyl group having 2 to 8 carbon atoms, or a carbon number having 2 to 8 carbon atoms.
  • Equation (2) [0017] Equation (2):
  • A means the same definition as the compound of the above formula (1);
  • R represents a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, a straight chain having 2 to 8 carbon atoms.
  • a chain or branched alkenyl group or a linear or branched alkynyl group having 2 to 8 carbon atoms] is added, and the above-mentioned formula is directly added to the strain.
  • the present invention relates to a method characterized by producing the compound of (1).
  • the present invention is characterized in that the length of the amino acid derivative of the formula (3) or a salt thereof is a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, particularly a methyl group. Manufacturing method Regarding the law.
  • the present invention relates to the above production method, characterized in that the amino acid derivative of formula (3) or its salt power is a hydrochloride salt of the compound of formula (3).
  • the present invention relates to the above production method, which is a phenyl group which may be substituted with A force or a linear or branched alkyloxy group having 2 to 8 carbon atoms.
  • the strain producing the compound of formula (2) is F1476 strain or a strain taxonomically or genetically equivalent to the strain, in particular, Fusarium sp. F1476 strain or a mutant thereof. It relates to a certain manufacturing method.
  • the present invention relates to the above-mentioned strain, wherein the strain producing the compound of formula (2) is a strain having one or more characteristics selected from the following a) and b), or a mutant strain thereof: It relates to the manufacturing method.
  • the strain mosquito, Fusarium incarnatum, is J3 ⁇ 4 ⁇ "; or shows the same shape as Fusarium incarnatum;
  • the sequence of the ITS region of the strain gene is more than 99% homologous to that of Fusarium sp. F1476.
  • the present invention also provides a formula (3):
  • A means the same definition as the compound of the above formula (1);
  • R represents a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, a straight chain having 2 to 8 carbon atoms. It represents a chain or branched alkenyl group or a linear or branched alkynyl group having 2 to 8 carbon atoms] or a salt thereof as a medium additive.
  • the present invention also provides a compound represented by formula (3 '):
  • A means the same definition as the compound of the above formula (1);
  • R is a hydrogen atom, a straight or branched alkyl group having 18 carbon atoms, a straight chain having 28 carbon atoms, or Represents a branched alkenyl group or a linear or branched alkynyl group having 28 carbon atoms] or a medium additive containing a salt thereof.
  • the present invention provides a simple and inexpensive production of a compound of formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof that is effective in the treatment and prevention of HCV infection such as hepatitis C. Provide a way to do this.
  • FIG. 1 is a view showing a UV spectrum of Compound 1.
  • FIG. 2 is a diagram showing an MSZMS spectrum of a sample of Compound 1.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of the morphological properties of the wet part of Strain F1476 on SNA.
  • FIG. 4 is a diagram showing an example of the morphological properties of F1476 strain in the fast part on SNA.
  • FIG. 5 A diagram showing a neighboring binding system of an internal transcribed spacer (ITS region / 466 bp) of F1476 strain.
  • FIG. 6 A diagram showing the maximum savings of the internal transcribed spacer (ITS region / 466 bp) of F1476 strain.
  • FIG. 7 This is a diagram showing a neighboring combined system of the F1476 strain in the region of Translation elongation factor 1 alpha (TEF 1-/ 677 bp).
  • FIG. 8 A diagram showing the maximum saving strain of the F1476 strain in the Translation elongation factor 1 alpha (TEF 1-/ 677 bp) region.
  • FIG. 9 A diagram showing neighboring binding lines in the Intergenic spacer (IGSZ2358bp) region of F1476 strain.
  • FIG.10 Shows the largest saving line of Intergenic spacer (IGSZ2358bp) region of F1476 strain
  • FIG. 11 is a diagram showing an MS / MS spectrum of a sample solution obtained by culturing F. incarnatum CBS 678.77.
  • the linear or branched alkyl group means a saturated hydrocarbon group having a predetermined carbon number.
  • straight-chain or branched alkyl groups having 1 to 8 carbon atoms include methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, sec-butyl, t-butynole, n pentyl, t pentyl, and isopentyl.
  • the linear or branched alkenyl group means a hydrocarbon group having a predetermined number of carbon atoms and having at least one double bond.
  • straight-chain or branched alkenyl groups having 2 to 8 carbon atoms include bull, 1-probe, allyl, 1-butur, 2-butinole, 2-methinole, 1-propenole, 1-Methinore 1-Propeninole, 1-Pentinore, 2 Pente-Nore, Pleninole, 1-Hexenore, 2-Hexenore, 5-Hexenore, 4-Metenore- 1 3-Pentinore 1 hepteninor, 6 hepteninor, 1-octenore, 2-octenyl, 7-octatur and the like.
  • the linear or branched alkyl group means a hydrocarbon group having a predetermined number of carbon atoms and having at least one triple bond.
  • alkynyl group having 2 to 8 carbon atoms include ethynyl, 1 propynyl, 2 propynyl, 1-butynyl, 2 butynyl, 3 butyninole, 1 pentinore, 2 pentinore, 3 pentinore, 4 pentinore, 1 1 Kishnore, 2 Hexnore, 3 Hexnore, 4 1 Hexnore, 5 Hexnore, 1 1 Heptynyl, 2 Heptynyl, 3 Heptynyl, 4 1 Heptynyl, 5 Heptynyl, 6-Heptynyl, 1-octyl -L, 2-octyl, 4-octyl and the like.
  • the cycloalkyl group means a cyclic saturated hydrocarbon group having a predetermined number of carbon atoms.
  • examples of the cycloalkyl group having 3 to 8 carbon atoms include a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, and a cycloheptyl group.
  • the aryl group described in the present specification means a monocyclic or polycyclic hydrocarbon group having aromaticity. Specific examples include force-induced groups such as benzene, naphthalene, anthracene, and fluorene.
  • the heteroaryl group described in the present specification has aromaticity and has 1 to 4 heteroatoms independently selected from a nitrogen atom, a sulfur atom, and an oxygen atom ( Preferably, it means a 4- to 6-membered monocyclic or 7- to 10-membered bicyclic group (preferably a monocyclic group) containing 1 or 2) as ring members.
  • Specific examples include groups from which force is induced, such as furan, thiophene, pyrrole, pyrazole, pyridine, thiazole, imidazole, pyrimidine, indole, quinoline, oxazole, isoxazole, pyrazine, triazole, thiadiazole, tetrazole, pyrazole. Can do.
  • the aralkyl group described in the present specification means the above linear or branched alkyl group substituted with the above aryl group, and specifically includes a benzyl group, a phenethyl group, and the like. Can be mentioned.
  • heteroaryl alkyl group described in the present specification means the above linear or branched alkyl group which is substituted with the above heteroaryl group.
  • halogen atom means fluorine, chlorine, bromine or iodine.
  • salts with mineral acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid; acetic acid, tartaric acid, lactic acid, citrate, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid
  • salts with organic acids such as benzene sulfonic acid, toluene sulfonic acid, naphthalene sulfonic acid and camphor sulfonic acid; salts with alkali metals or alkaline earth metals such as sodium, strength rhodium and calcium. I'll do it.
  • the salt of the amino acid derivative of formula (3) described herein does not substantially adversely affect the growth of the strain or the production of the compound of formula (1) by the strain in the medium. Also If it is, it will not specifically limit.
  • salts with mineral acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid; acetic acid, tartaric acid, lactic acid, citrate, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzene Salts with organic acids such as sulfonic acid, trifluoroacetic acid, toluene sulfonic acid, naphthalene sulfonic acid, camphor sulfonic acid; salts with alkali metals or alkaline earth metals such as sodium, potassium and calcium; ammonium salts, etc.
  • Preferred examples include hydrochloric acid, trifluoroacetic acid and sodium salt.
  • the fungus capable of producing the compound represented by the formula (2) of the present invention may be any fungus capable of producing the compound represented by the formula (2) even in a medium.
  • Fusarium sp. F1476 strain hereinafter referred to as “F1476 strain”
  • strains that are taxonomically or genetically equivalent to the strains, and mutants thereof WO 04/071503
  • Aureobasidium espiichi 'TKR2449 strain WO98 / 056755
  • strains taxonomically or genetically equivalent to the strain, and mutants thereof are preferably F1476 strain, strains taxonomically or genetically equivalent to the strains, and mutants thereof.
  • taxonically equivalent strain refers to a strain having taxonomically identical characteristics. Specifically, it refers to a strain having physiological properties equivalent to those of the F1476 strain as shown below and having the ability to produce the compound represented by the formula (2) of the present invention.
  • genetically equivalent strain refers to a strain having characteristics of genetically equivalent properties, specifically 5S, 5.8S, 18S 28S rDNA, etc. possessed by the strain A strain having the same or homology of 98% or more, preferably 99% or more, and capable of producing the compound represented by the formula (2) of the present invention.
  • Whether the strain has the ability to produce the compound represented by the formula (2) is determined by culturing the strain, separating the compound from the culture, and further purifying the separated compound as necessary. It can be confirmed by analyzing the compound or purified product.
  • a culture method As a culture method, a separation method and a purification method, a medium containing various nutrient sources and acceptable additives described in the method for producing the compound of formula (1) of the present invention described later Culture methods and culture conditions using various types; various separation methods; and various Purification methods can be employed.
  • a prenyltyrosine derivative represented by the formula (wherein R A represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, preferably a methyl group) may be added.
  • the prenyltyrosine derivative represented by the formula (4) may be used in the free form, or may be added as hydrochloride, trifluoroacetate or sodium salt, but is preferably added as hydrochloride.
  • the prenyltyrosine derivative represented by the formula (4) is preferably a hydrochloride of a compound that is an R A methyl group.
  • LCZ MS LC-MSZMS
  • TOF-MS high resolution MS analysis
  • the compound used for the analysis may be a single product or a mixture of two or more compounds, and which one to use can be appropriately selected depending on the analysis method.
  • examples of the filamentous strain having the ability to produce the compound represented by the formula (2) include the aforementioned Fusarium sp. F1476 strain.
  • the F1476 strain is a strain belonging to Fusarium incarnatum, as described in detail in Test Example 1 described later.
  • a polyphialide is a tip of a conidia-forming cell. After a conidia is formed, a part of the conidia grows or grows to form the next conidia at the tip.
  • Conidia are formed in mucus and clumps at the tip of the phialide, typically crescent-shaped (lunate) and sometimes oblong or cylindrical, with the tip extending significantly elongated. There is no chance.
  • the base of the conidia has distinct podocytes or is scarred or blunt. The cut scar is the shape of the lower part left when the upper part of the cone is cut off by a horizontal split surface.
  • Conidia have 0 to 5, preferably 2 to 4 partition walls.
  • the size of conidia is 2 with a wall conidia, length 15.5 to 19.5 / ⁇ ⁇ , width 2.5 to 3.5 m, 3 with septum conidia, length 15 5 to 37., width 2.5 to 6.5 m, 4 bulkhead conidia, length 24.0 to 37.05 ⁇ m, width 3.0 to 6.m, 5 bulkhead conidia, long
  • the length is 27.5 to 41.5 m and the width is 3.0 to 6.0 ⁇ m.
  • the “ITS region” refers to a region obtained by combining the three portions of ITS1, 5.8S, and ITS2 in the DNA sequence encoding the ribozomal RNA possessed by the strain. .
  • the following documents 1 to 3 support that it is possible to judge that two strains are homologous if the sequences of the ITS region are 99% or more homologous.
  • Document 3 is positioned as a supporting example of the same filamentous fungus (genus Aspergillus) as F1476 strain (genus Fusarium)!
  • the strain that can be used as the filamentous strain having the ability to produce the compound represented by the formula (2) in the production method of the present invention is the force belonging to Fusarium incarnatum or equivalent to Fusarium incarnatum.
  • strains in which the sequence of the ITS region of Z or its gene is 99% or more homologous to that of the F1476 strain are the strains in which the sequence of the ITS region of Z or its gene is 99% or more homologous to that of the F1476 strain.
  • the F1476 strain that can be used in the present invention is a filamentous fungus that was isolated by a washing filtration method on February 29, 2000 from fallen leaves collected on the southern slope of Kamakura Mountain on January 24, 2000. It is.
  • the growth temperature range is 10 to 30 ° C, preferably 20 to 30 ° C.
  • the viable pH range is 3 to 11, preferably 5 to 7.
  • the F1476 strain is designated as Fusarium sp. F1476 and has been deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center under the accession number FERM BP-8290 on February 4, 2003.
  • the taxonomic characteristics of the F1476 strain are as follows.
  • the strain taxonomically equivalent to the F1476 strain of the present invention refers to a strain having the following taxonomic characteristics and having the ability to produce the compound represented by the formula (2) of the present invention. .
  • the growth rate is a little worse in the dark 0.9 to 1.
  • the color is lighter beige (pale beige, Ivory, Munsell 10YR9Z2, Metwen 4A3), the back is bright reddish yellow (1 ight reddish yellow, Naples Yellow), but the color of mycelia may be dark, and the color of yellow ocher is grayish brown. — 8), and the back side is dark yellowish brown (brown skin, dark yello wish brown, Burnt Umber, Munsell 10YR3 / 6).
  • the growth temperature range is 10 to 30 ° C, and the optimum growth temperature is 20 to 30 ° C.
  • the growth pH range is pH 3 to: L 1 and the optimum pH is pH 5 to 7.
  • the conidia pattern rises vertically from the aerial hyphae, branches, and phialide is directly generated on the branch or conidia pattern to form a complex conidia formation structure. Occasionally, phialide grows directly in the aerial hyphae.
  • Conidial structures may form from mycelia that crawl on the agar surface.
  • the conidia pattern has a length of 10-30 / ⁇ ⁇ .
  • the flaride is cylindrical and usually has a pronounced cup structure at the tip, with a size of 4.0 to 20.0 X 2.5 to 3.0 m.
  • Conidia are formed in a mass of mucus at the tip of the phialide, and are typically crescent-shaped, sometimes oblong or cylindrical, and the tip does not extend significantly elongated.
  • the base of the conidia has clear podocytes or is scarred or blunt.
  • conidia have 2-4 bulkheads or no bulkhead or 1 or May have 5 bulkheads, with an average size of 19.3 X 3.8 ⁇ m, L / W 5.2. Thick film spores are not observed.
  • the complex tufted conidial structure that is formed sometimes becomes a conidial locus, and the conidia is a cylindrically-shaped fiaride tip force. 2-5 cells in a boat or crescent shape. From the above morphological characteristics, it can be seen that the strain F1476 belongs to the genus Fusarium. Therefore, this bacterium was identified as Fusarium sp. F1476 strain.
  • the "mutant strain” is a natural or artificial mutant strain of a fungus having an ability to produce the compound represented by the formula (2), such as the F1476 strain and the TKR2449 strain described above, and And a strain having the ability to produce the compound represented by formula (2).
  • a person skilled in the art can use a known method from a fungus capable of producing a compound represented by the formula (2) such as the F1476 strain, the TKR2449 strain, etc. It is easy to produce various mutant strains such as mutant strains having (for example, the ability to produce the compound represented by formula (1) or formula (2) of the present invention).
  • spore or mycelium of the fungus is used for physical irradiation such as y-ray, X-ray, ultraviolet irradiation
  • physical irradiation such as y-ray, X-ray, ultraviolet irradiation
  • chemical substances such as nitrous acid, ethyl methanesulfonate, methyl methanesulfonate, 1 methyl — 3— -tro-trosoguanidine, wash, dilute, potato dextrose agar plate, etc.
  • the mutant strain is obtained by applying it to an agar medium and culturing and isolating it.
  • each obtained strain is solid-cultured or liquid-cultured, and the cultured product is extracted with an appropriate solvent, etc., and then analyzed using an analytical instrument such as HPLC or LCZMS to evaluate the productivity of the compound of each strain.
  • an analytical instrument such as HPLC or LCZMS to evaluate the productivity of the compound of each strain.
  • a in the formula (1) is a hydrogen atom, a linear or branched alkyl having 1 to 8 carbon atoms.
  • R 1 is a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, a linear or branched alkenyl group having 2 to 8 carbon atoms, or a carbon number having 2 to 8 carbon atoms.
  • R 1 a straight-chain or branched alkynyl group having 2 to 8 carbon atoms is preferred, and in particular, a buture group such as 2-butyne 1-yl is preferred! /.
  • substituent of the above "substituted ! may! /, Aryl group or substituted !, may! /, Heteroaryl group", a halogen atom, OR 2 , carbon number 1 ⁇ 8 linear or branched alkyl group, C 2-8 linear or branched alkenyl group, C 2-8 linear or branched alkynyl group, cyano group, nitro group , Trifluoromethyl group, mono- or di-substituted with a linear or branched alkyl group, and may be an amino group, an acyl group, a linear or branched alkyl sulfol group, or a strong rubamoyl group.
  • R 2 represents a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or a trifluoromethyl group.
  • substituent fluorine, methoxy group, methyl group and dimethylamino group are preferable.
  • the optionally substituted aryl group include, for example, a linear or branched alkyloxy group having 1 to 8 carbon atoms, a phenyl group, and a nitrogen atom.
  • An optionally substituted phenyl group is exemplified, and a methoxyphenol group and a fluorophenol group are more preferred.
  • Preferable examples of the optionally substituted heteroaryl group include a pyridyl group.
  • a in the compound of the formula (1) of the present invention is preferably —OR 1 ; a phenol group substituted with a halogen atom or a methoxy group; and a pyridyl group, particularly 2-butyne 1-yloxy Butuloxy groups such as are preferred.
  • amino acid derivative of the formula (3) of the present invention is represented by the formula shown above, and this formula (
  • a in 3 represents the same definition as A of the compound of the above formula (1).
  • Examples of such amino acid derivatives of the formula (3) include free carboxylic acid in which R is a hydrogen atom, and methyl carboxylate or t-butyl ester in which R is acetyl or t-butyl.
  • amino acid derivative of the formula (3) of the present invention can be produced, for example, as follows.
  • P is a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, a linear or branched alkenyl group having 2 to 8 carbon atoms, or a linear or branched chain having 2 to 8 carbon atoms.
  • P ′ represents a protecting group for amino group
  • R 1 ′ represents a desired linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms.
  • Group 2 carbon atoms A linear or branched alkenyl group of ⁇ 8, a linear or branched alkyl group of 2 to 8 carbon atoms, a cycloalkyl group of 3 to 8 carbon atoms, an optionally substituted aryl group, An optionally substituted heteroaryl group, an optionally substituted aralkyl group, or a substituted heteroaryl alkyl group.
  • Compound 1-1 is a compound that can be easily synthesized from commercially available compounds (such as L-tyrosine t-butyl ester and L-tuccinic cinmethyl ester) or commercially available compounds (such as L-tyrosine).
  • a protecting group of an amino group such as acetyl, trifluoroacetyl, t-butoxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, 9fluorenylmethylcarbonyl, etc. gives compound 1-2 be able to.
  • the conditions for the protecting group of the amino group described in “Rotational uroups in Organic synthesis, Theodora Greene (Author), 1999, Wiley-Interscience” are used.
  • Compound 1-2 is potassium carbonate, sodium hydroxide, hydrogenated in a solvent such as jetyl ether, toluene, cyclohexane, acetone, dimethylformamide, dioxane, ethyl acetate, dimethylsulfoxide, or a mixed solvent thereof.
  • a base such as sodium
  • the desired group R can be obtained by reacting with a R as defined above bound to a halogen atom or a leaving group such as mesylate or tosylate. You can get the compound 1 ⁇ 3.
  • compound 1-3 can also be obtained by reacting compound 1-2 with R defined above substituted with a hydroxyl group under Mitsunobu reaction conditions.
  • the compound 1-4 is obtained by deprotecting the protecting group of the amino group of the compound 1-3. At this time, the condition is Protective Groups in Organic synthesis, Theodora
  • the compound 15 can be obtained by deprotecting the protecting group P of the force loxyl group of compound 14.
  • the deprotection conditions for the carboxyl-protecting group described in "Protective Groups in Organic Synthesis, The odora Greene (Author), 1999, Wiley-Interscience" are used.
  • P is a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, a linear or branched alkenyl group having 2 to 8 carbon atoms, or 2 to 8 carbon atoms.
  • a protective group for a linear or branched alkynyl group or a carboxyl group P ′ represents a protective group for an amino group
  • T represents a mesylate, toluenesulfonate, trifluoromethanesulfonate, etc.
  • Compound 1-2 obtained in Step 1-1 is mixed with various solvents such as jetyl ether, toluene, cyclohexane, acetone, dimethylformamide, dioxane, ethyl acetate, dimethyl sulfoxide, or a mixed solvent thereof.
  • various solvents such as jetyl ether, toluene, cyclohexane, acetone, dimethylformamide, dioxane, ethyl acetate, dimethyl sulfoxide, or a mixed solvent thereof.
  • a compound capable of leaving group such as acid chloride, trifluoromethanesulfonic anhydride, etc.
  • a palladium catalyst at room temperature or under heating, preferably under heating.
  • Compound 2-2 can be obtained by reacting with tin derivative, alkenyl or alkyl-l-tri- n -butyltin derivative or the like.
  • the compound 2-3 can be obtained by deprotecting the protecting group of the amino group of the compound 2-2.
  • the deprotection conditions of the protecting group of the amino group as described in “Protective Groups in Organic Synthesis, Theodor a Greene (Author), 1999, Wiley-Interscience” are used.
  • Compound 2-4 can be obtained by deprotecting the protective group P of the carboxyl group of compound 2-3.
  • the deprotection conditions for carboxyl-protecting groups as described in "Protective Groups in Organic Synthesis, The odora Greene (Author), 1999, Wiley-Interscience” are used.
  • the amino acid derivative of the formula (3) or a salt thereof in which A is a group other than those described above can also be synthesized according to the above method.
  • R is a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, a linear or branched alkenyl group having 2 to 8 carbon atoms, or a linear or branched group having 2 to 8 carbon atoms.
  • the amino acid derivative of the formula (3), which is a chain alkynyl group, or a salt thereof can be obtained by subjecting the compound obtained in the above production methods 1 and 2 to a carboxyl group deprotection reaction, ester ester, etc. It can be synthesized by subjecting it to a reaction.
  • Preferable examples of the compound of the formula (I) of the present invention include the following compounds.
  • the method for producing the compound of the formula (1) of the present invention comprises the step of growing a strain having the ability to produce the compound of the formula (2), and the amino acid derivative of the formula (3) or a salt thereof. And culturing in a medium added to a suitable medium (preferably a culture solution) to cause the strain to produce the desired compound of formula (1).
  • the medium used for the culture for producing the compound of formula (1) of the present invention is a strain having an ability to produce the compound of formula (2) (for example, F1476 strain or a mutant thereof). Any of various synthetic, semi-synthetic and natural media can be used as long as the medium contains a nutrient source that can be used.
  • the carbon source for example, glucose, fructose, ratatose, Sucrose, maltose, xylose, sucrose, starch, dextrin, glycerin
  • nitrogen sources include, for example, organic materials such as soybean flour, cottonseed flour, corn steep liquor, casein, peptone, yeast extract, meat extract, germ, pharmamedia, urea, and amino acid.
  • organic materials such as soybean flour, cottonseed flour, corn steep liquor, casein, peptone, yeast extract, meat extract, germ, pharmamedia, urea, and amino acid.
  • Inorganic nitrogen compounds such as nitrogen compounds, ammonium salts such as ammonium nitrate and ammonium sulfate.
  • the salts include inorganic salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt, and phosphate. These may be used alone or in appropriate combination.
  • An organic substance, an inorganic substance, or the like that promotes the production of the compound can be appropriately added.
  • an antifoaming agent such as silicone oil or polyalkylene glycol ether, a surfactant or the like can be added to the nutrient source-containing medium.
  • the culture conditions can be appropriately selected within a range in which the strain can grow well. Usually, it is cultured for about 5 to 10 days at a pH of 3 to 11 and a temperature of 10 to 30 ° C.
  • the various culture conditions described above can be appropriately selected according to the type and characteristics of the fungi used, external conditions, etc., and the optimum conditions can be selected.
  • An amino acid derivative of the formula (3) is added to the culture solution containing the strain thus prepared to produce the desired compound of the formula (1). That is, the amino acid of the formula (3) is added to a culture solution containing microbial cells in culture as it is, or after culturing, the cells separated from the culture solution by centrifugation or filtration are suspended in another culture solution. A derivative or a salt thereof is added and further cultured.
  • the culture medium that can be used for suspending cells is preferably the above-mentioned medium or a combination thereof! /.
  • the amino acid derivative of formula (3) or a salt thereof added to the medium is preferably a salt such as hydrochloride, trifluoroacetate or sodium salt.
  • the amount of the amino acid derivative added in the form of powder or dissolved in water or a water-soluble organic solvent such as ethanol and added to the medium is preferably 50 to 2000 mg per ml of the medium.
  • the desired formula (1) can be obtained by culturing at 25 to 30 ° C for 3 to 14 days, preferably about 5 to 10 days under shaking or aeration and stirring conditions.
  • the compound can be produced.
  • a solid culture method or liquid culture generally used for producing a biologically active substance by culturing a microorganism a solid culture method or liquid culture generally used for producing a biologically active substance by culturing a microorganism.
  • a culture method such as a method can be employed, a liquid culture method can be preferably used.
  • liquid medium 2 shown in Example 5 of the present specification the liquid medium 3 shown in Example 7, and the liquid medium 5 shown in Example 8 are included. Is mentioned.
  • the compound of the present invention is accumulated in the culture by the above-described culture method.
  • the compound accumulated in the culture can be separated from the culture by a known method and further purified as necessary.
  • the whole culture is extracted with a non-hydrophilic organic solvent such as ethyl acetate, butyl acetate, black mouth form, butanol, or methylisoptyl ketone, or a hydrophilic organic solvent such as methanol or acetone.
  • a non-hydrophilic organic solvent such as ethyl acetate, butyl acetate, black mouth form, butanol, or methylisoptyl ketone
  • a hydrophilic organic solvent such as methanol or acetone.
  • a method of extracting with the non-hydrophilic organic solvent can be employed, or the culture broth is brought into contact with an adsorbent carrier to be cultured. It is also possible to employ a method in which the compound in the liquid is adsorbed on a carrier and then eluted with a solvent.
  • the carrier include activated carbon, powdered cellulose, and adsorptive resin.
  • the above-mentioned solvent one or a combination of two or more can be used as appropriate depending on the type and nature of the carrier. You can list things.
  • the water content in the aqueous solution is a force that can be appropriately selected according to the type of carrier or water-soluble organic solvent, for example, 10 to 90% (V / V), preferably 40 to 60% (V ZV). is there.
  • the crude extract of the compound of the present invention thus separated from the culture can be subjected to a further purification step as necessary.
  • the above purification can be performed by a method usually used for separation and purification of a fat-soluble physiologically active substance.
  • a method usually used for separation and purification of a fat-soluble physiologically active substance examples include silica gel, activated alumina, activated carbon, and absorbent coagulant.
  • Column chromatography method using a carrier such as, high performance liquid chromatography method and the like.
  • examples of elution solvents include black mouth form, ethyl acetate, methanol, acetone, water, and the like. can do . Trifluoroacetic acid and acetic acid can be added to the elution solvent.
  • examples of the carrier include chemically bonded silica gel bonded with otadecyl group, octyl group, and phenol group; polystyrene-based porous polymer gel, and the like.
  • the mobile phase for example, a water-containing aqueous solution of a water-soluble organic solvent such as water-containing methanol or water-containing acetonitrile can be used. Further, trifluoroacetic acid and acetic acid can be added to the mobile phase.
  • the method for producing the compound of the formula (1) of the present invention has a desired formula directly from the microbial cells without using a complicated chemical synthesis step as compared with a conventionally known method.
  • the compound (1) is produced, and a large amount of a desired compound can be produced more easily than in the past.
  • the A force is a compound other than a prenyloxy group, which is a compound of the formula (1) of the present invention
  • the compound represented by the formula (2) in which the strain originally has the production ability may be obtained as a non-target compound.
  • the above-mentioned separation of the fat-soluble physiologically active substance is performed by a method usually used for purification, and the compound represented by formula (2) or the compound represented by formula (1) is obtained by separation. Can do.
  • the compound of (2) is allowed to be removed as necessary.
  • the thus obtained compound of the formula (1) of the present invention is used as it is, as a prodrug thereof, or as a pharmaceutically acceptable salt, as a pharmaceutical composition, particularly a liver caused by HCV. It can be used as an active ingredient of a therapeutic agent for diseases.
  • a 500 ml umbilical Erlenmeyer flask containing hydrate 0.005% and toast sawer 1.0%) was inoculated and cultured at 27 ° C for 3 days with shaking at 220 rpm to obtain a seed culture solution.
  • the obtained methanol extract 500 1 was concentrated to dryness, dissolved in 10 1 dimethyl sulfoxide and 90 1 methanol, and analyzed under analysis condition A shown in the following analysis conditions. As a result, production of compound 2 was observed.
  • Table 1 shows the types of amino acids added and the physicochemical properties of the compounds produced. The produced compound 2 is identified based on the M + H value and RT of the mass spectrum obtained by analyzing the sample under the LC / MS conditions shown in Analysis Condition 2. did.
  • Liquid A Water (0.01% trifluorosuccinic acid)
  • Liquid B Acetonitrile (0.01% trifluoroacetic acid) min% Liquid B
  • Fusarium sp.F1476 strain grown on MA slope medium (maltoestrat 1.0%, yeast etacult 0.1%, butatosoyton 0.1%, glucose 1.0%, agar 2.0%)
  • MA slope medium maltoestrat 1.0%, yeast etacult 0.1%, butatosoyton 0.1%, glucose 1.0%, agar 2.0%)
  • a spore suspension was prepared from BP-8290) using 4 ml of sterile physiological saline (the number of spores: about 5 ⁇ 10 6 / ml).
  • the resulting spore solution 0.3 ml, adjusted to 3 mg / ml 1-methyl-3-to-one 1--trosoguanidine 0.3 ml, physiological saline 2.4 ml, mixed at 27 ° C and 127 rpm for 1 hour It was shaken and mutated.
  • the treatment solution (2 ml) was centrifuged at 14000 rpm for 10 minutes, the supernatant was discarded, the spores were washed with 2 ml of sterile physiological saline, diluted, and 0.1 ml each was applied to a potato dextrose agar plate (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.). After culturing at room temperature for 5-6 days, the obtained colony was spread on a potato dextrose agar slant medium to obtain 140 mutant candidate strains.
  • the obtained cells were suspended in sterilized water, inoculated into a 50 ml polypropylene tube containing brown rice solid medium (5 g germinated brown rice, 2 ml demineralized water), and subjected to stationary culture at 27 ° C. for 192 hours. 10 ml of methanol was added to the culture thus cultured, and the mixture was shaken and stirred at 180 rpm for 20 minutes and then centrifuged at 30 OOrpm for 10 minutes to obtain a methanol extract. The obtained methanol extract 500 1 was concentrated to dryness, dissolved in 10 1 dimethyl sulfoxide and 90 1 methanol, and analyzed under analysis condition 1 shown below to screen a high-producing strain of compound 1. . As a result, a high production strain of compound 1 Fusarium sp. F1476-C193 was obtained. (Table 2) Table 2 Compound 1 productivity of F 1476 and F 1476-C 193 strains
  • Liquid A Water (0.01% trifluoroacetic acid)
  • Liquid B Acetonitrile (0.01% trifluoroacetic acid)
  • F1476 One platinum loop from the C193 strain slope culture, 100ml liquid medium 1 (glucose 2.0%, glycerol 1.5%, potato starch 1.0%, polypeptone 0.25%, yeast stratatat 0.35% , Calcium carbonate 0.5%, Sodium chloride sodium 0.3%, Zinc sulfate heptahydrate 0.005%, Copper sulfate pentahydrate 0.005%, Salty sodium manganese tetrahydrate 0. 0005 Inoculated into a 500 ml Erlenmeyer flask with a umbilical cord containing 1.0% of yeast and soot soaker, and cultured with shaking at 220 rpm at 27 ° C for 3 days to obtain a seed culture solution.
  • liquid medium 1 glucose 2.0%, glycerol 1.5%, potato starch 1.0%, polypeptone 0.25%, yeast stratatat 0.35% , Calcium carbonate 0.5%, Sodium chloride sodium 0.3%, Zinc sulfate heptahydrate 0.005%,
  • the obtained methanol extract 500 1 was concentrated to dryness, dissolved in 10 1 dimethyl sulfoxide and 90 1 methanol, and analyzed under the analysis conditions shown in Analysis Condition 2 below. As a result, production of Compound 2 was observed.
  • Compound 2 was obtained by adding amino acid 3 and compound 3 was obtained, and by adding amino acid 4, compound 4 was obtained.
  • Table 3 shows the types of amino acids added and the physicochemical properties of the compounds produced.
  • the produced compounds were analyzed for the samples 2, 3, and 4 under the LCZMS conditions shown in Analysis Condition 2, and the M + H value and RT of the mass spectrum obtained were -Identification based on matching.
  • Liquid A Water (0.01% trifluoroacetic acid)
  • Liquid B Acetonitrile (0.01% trifluoroacetic acid) min% Liquid B
  • a spore suspension of Fusarium sp. F1476-C193 strain was prepared in the same manner as in Example 2 (mutation treatment was performed using about 2 X 10 6 Zml of spore and 0.3 ml of the obtained spore solution.
  • Treatment solution 2 ml was centrifuged at 140 OOrpm for 10 minutes, the supernatant was discarded, the spores were washed with 2 ml of physiological saline, diluted, and 0.1 ml each was applied to a potato dextrose agar plate (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) at room temperature.
  • the obtained colonies were spread on a potato dextrose agar slant medium to obtain 360 mutant candidate strains, which were inoculated into a 30 ml polypropylene tube containing 10 ml of liquid medium 1.
  • the culture was incubated at 160 ° C for 7 days at 27 ° C, and 10 ml of n-butanol was added to the culture cultured in this way, shaken and stirred at 180 rpm for 20 minutes, and then centrifuged at 3 OOOrpm for 10 minutes. An n-butanol extract was obtained, and the resulting n-butanol extract was concentrated to dryness.
  • Liquid A Water (0.01% trifluoroacetic acid)
  • a seed culture solution of F 1476-G81 strain was prepared using liquid medium 1 in the same manner as in Example 2. 4 ml of this seed culture was added to liquid medium 2 potato starch 8.0%, fructose 0.14%, butatosonic 0.8%, rice bran 2.0%, magnesium sulfate heptahydrate 0.1 %) Inoculated into a 300 ml flask containing 36 ml, and cultured with shaking at 27 ° C and 220 rpm. After 72, 96, and 144 hours of culture, 0.5 ml of an aqueous solution of amino acid 5 prepared to 4 mgZml and sterilized by filtration was added, and cultured with shaking at 27 ° C and 220 rpm for 168 hours.
  • Liquid A Water (0.01% trifluoroacetic acid)
  • Liquid B Acetonitrile (0.01% trifluoroacetic acid) min% Liquid B
  • Example 2 a spore suspension of Fusarium sp. F1476-G81 strain was prepared (spore number: about 6 ⁇ 10 7 Zml). Mutation treatment was carried out in the same manner as in Example 2 using 0.3 ml of the obtained spore solution. 2 ml of the treatment solution was centrifuged at 14000 rpm for 10 minutes, the supernatant was discarded, the spores were washed with 2 ml of physiological saline, diluted, and 0.1 ml each was applied to a potato dextrose agar plate (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • the obtained colonies were spread on a potato dextrose agar slope culture medium to obtain 77 mutant candidate strains.
  • the obtained strain was inoculated into a 30 ml polypropylene tube containing 10 ml of liquid medium 1 and cultured with shaking at 160 rpm for 3 days at 27 ° C. to prepare a seed culture solution. 4 ml of this seed culture was inoculated into a 300 ml flask containing 36 ml of liquid medium 2, and cultured with shaking at 27 ° C. and 220 rpm for 7 days.
  • a seed culture solution of F 1476-H36 strain was prepared using liquid medium 1. 4 ml of this seed culture solution was added to liquid medium 3 (latatose 14.0%, glucose 0.1%, yeast educt 1.0%, Pharmamedia (traders) 2.0%, magnesium sulfate heptahydrate 0 (1%) A 300 ml flask containing 36 ml was inoculated and cultured with shaking at 27 ° C and 220 rpm.
  • One platinum loop from the slope culture of F1476-H36 strain 100 ml of liquid medium 4 (glucose 2.0%, glycerol 1.5%, potato starch 1.0%, polypeptone 0.25%, yeast educts 0.35% Inoculate a 500 ml umbilical Erlenmeyer flask containing 0.5% calcium carbonate, 0.3% sodium chloride sodium salt, 0.3% zinc sulfate heptahydrate 0.05%, toast sawer 1.0%.
  • C shake culture at 220 rpm for 2 days to obtain a seed culture solution.
  • F1476 Platenum loop from slope culture of G81 strain, 30 ml liquid medium 6 (fructose 4.0%, kaditon 0.1%, sodium nitrate 0.3%, magnesium sulfate heptahydrate 0.05%, chloride In a 250 ml Erlenmeyer flask containing 0.5% potassium and 0.001% iron sulfate heptahydrate) Inoculated and cultured at 27 ° C for 5 days with shaking at 220 rpm to obtain a culture solution. The obtained culture broth was centrifuged at 30 OOrpm for 10 minutes, a spore solution was prepared from the supernatant, and the obtained spore solution was subjected to mutation treatment in the same manner as in Example 2.
  • liquid medium 6 fructose 4.0%, kaditon 0.1%, sodium nitrate 0.3%, magnesium sulfate heptahydrate 0.05%, chloride
  • the treatment solution was centrifuged at 14000 rpm for 10 minutes, the supernatant was discarded, the spores were washed with physiological saline, diluted, and 0.1 ml each was applied to a potato dextrose agar plate (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.). By culturing at room temperature for 5 to 6 days, a mutant candidate strain was obtained. The obtained strain was inoculated into a 250 ml Erlenmeyer flask containing 30 ml of liquid medium 4 and cultured with shaking at 220 rpm at 27 ° C. for 2 days to obtain a seed culture solution.
  • F1476-CH44 Inoculate one platinum loop from 9 strains of slant culture into a 25 Oml Erlenmeyer flask containing 30 ml of liquid medium 6 and incubate with shaking at 220 rpm at 27 ° C for 5 days to obtain a culture solution. It was. The obtained culture broth was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes to prepare a spore solution from the supernatant, and then the mutation treatment was performed in the same manner as in Example 2 using the obtained spore solution.
  • the treatment solution was centrifuged at 14000 rpm for 10 minutes, the supernatant was discarded, the spores were washed with physiological saline, diluted, and 0.1 ml each was applied to a potato dextrose agar plate (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.). By culturing at room temperature for 5 to 6 days, a mutant candidate strain was obtained. The obtained strain was inoculated into a 250-ml umbilical Erlenmeyer flask containing 30 ml of liquid medium 4 and cultured at 27 ° C for 2 days with shaking at 220 rpm to obtain a seed culture solution.
  • the seed culture solution (4 ml) was inoculated into a 250 ml umbilical Erlenmeyer flask containing 30 ml of liquid medium 5 and cultured with shaking at 27 ° C. and 220 rpm. After 72, 96, and 144 hours of culture, an aqueous solution of amino acid 5 prepared to 6 mgZml and sterilized by filtration was added in an amount of 1 ml each, and cultured with shaking at 27 ° C and 220 rpm for 168 hours.
  • N— (t-butoxycarbol) —L-tyrosine methyl ester (Tokyo Kasei: 150 g, 0.508 mol) in anhydrous N, N dimethylenolenolemamide solution (700 ml), coconut, potassium carbonate (87.7 g, 0.635 mol) and 1-bromo-2-butyne (74.3 g, 0.559 mol) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 19 hours. Ethyl acetate (2 L) was added to the reaction mixture, and the mixture was washed successively with saturated aqueous solution of ammonium chloride (1.5 L), saturated aqueous sodium bicarbonate (1.5 L), and saturated brine (1.0 L). .
  • the ethyl acetate layer was dehydrated and dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain a pale yellow oil.
  • the obtained oil was dissolved in ethyl acetate (500 ml) and cooled to 0 ° C to 5 ° C.
  • 4N hydrochloric acid Z ethyl acetate 1.0 L, 4. Omol was added dropwise, and the mixture was stirred at the same temperature for 2 hours and then at room temperature for 15 hours.
  • reaction mixture was diluted with ethyl acetate (500 ml), and the precipitated powder was collected by filtration and washed with hexane acetate ethyl acetate (2: 1) mixture (1.0 L). After drying under reduced pressure with a vacuum pump, colorless powder of (S) 2 amino-3- ⁇ 4 mono (2-petit-loxy) phenol ⁇ -propionic acid methyl ester hydrochloride (143 g, 99%) was obtained.
  • the organic layer was separated with 0.5N aqueous sodium hydroxide solution (1.5 L), water (1 L), IN hydrochloride (2 X 1. 5 L) and water (2 X 1.5 L) were sequentially washed.
  • the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated to a milky white solid (S) -2-toxybutalumino-3- (4-trifluoromethanesulfo-oxyphenyl) -propionic acid methyl ester (217 g, 100%) was obtained.
  • the oily substance obtained in b) was dissolved in ethyl acetate (100 ml) and cooled to 0 ° C to 5 ° C. Next, 4N hydrochloric acid Z ethyl acetate (83 ml, 0.332 mol) was added dropwise, and the mixture was stirred at the same temperature for 2 hours and then at room temperature for 15 hours. The reaction solution was diluted with hexane (100 ml), and the precipitated powder was collected by filtration and washed with a mixed solution (50 ml) of hexane-ethyl acetate (2: 1).
  • SNA synthetic nutrient agar
  • the conidia is formed from the phyllide that rises directly from the conidia or hyphae, or from the aerial hyphae in the late stage of culture, and is formed at the tip of the polyphialide, whose shape is 0-5 septum, length 40 m The following is a typical crescent shape and the tip does not extend long and narrow.
  • the base of the conidia has distinct foot cells or is scarred or blunt. From these morphological features under the microscope, F Usarium sp. F1476 strain ⁇ nj " ⁇ 'sex belonging to Section Eupionnotes was rejected, and F. incarnat belly was a candidate.
  • ITS Internal transcribed spacer
  • TEF 1—a translatio elongation factor 1 alpha
  • Gb intergenic spacer
  • the F1476 strain is closely related to Fusarium equiseti and F. incarna turn in molecular phylogeny, and is particularly contained in the F. incarnatum clade, F. incarnat um CBS The most closely related to 678.77.
  • F1476 strain belonging to F. equiseti was denied because F. equiseti has a characteristic that its conidia tip is elongated.
  • F1476 strain was identified as Fusarium incarnatum (Roberge) Saccardo. The validity of this identification was confirmed by the fact that F. incarnatum CBS 678.77 produced Compound 1 as well as F1476.
  • Fusarium sp. F1476 is a filamentous fungus that was isolated on 29th February 2000 by washing filtration from fallen leaves collected on the southern slope of Kamakura Mountain on 24th January 2000. As described later, spontaneous mutations and clones with different culture characteristics readily appear.
  • the clone that forms a heterologous colony is sometimes called org, the clone that produces the orange conidia on the entire surface of the colony is wet, and the clone that mainly contains only the mycelium is called fast.
  • the morphological observation method and the medium used were mainly according to Gerlach and Nirenberg (1982) and Aoki (1998, 2003). Ie from well-grown slants to conidia or mycelial fragments 3 inoculated on potato glucose agar medium (PDA) and synthetic nutrient agar medium (SNA) and exposed to dark or near ultraviolet light at 20 ° C or 25 ° C for 1 to 3 weeks (main and 10 days), the culture was observed with the naked eye under a microscope, and the color was described with Munsell and Metwen symbols. Medium such as malt extract agar medium (MA), oatmeal agar medium (OA), Miura medium (LCA) was also used.
  • MA malt extract agar medium
  • OA oatmeal agar medium
  • LCA Miura medium
  • PDA and SNA were mainly used for morphological observation, but sometimes carnation leaf agar (CLA) was also used.
  • Semi-automated measurements were performed for phialide and molecular measurements using Adobe Photoshop (ver 7.0, Adobe Systems Inc.) and general-purpose image analysis software Optimas (ver 6.5, Media Cybernetics Inc.).
  • the F1476 strain and F. equiseti and F. incarnatum sold by CBS were cultured on PDA, and DNA was extracted using QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Tokyo).
  • ITS4 (TCCTCCGCTTATTG ATATGC, SEQ ID No.l) primer and ITS5 (GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG, S EQ ID No.2) primer (White et al, 1990) were used to amplify the internal transcribed spacer (ITS) region.
  • TEF1 ATGGGTAAGGA (A / G) GACAAGAC, SEQ ID No.3 primer
  • TEF2 (GGA (G / A) GTACCAGT (G / C) ATCATGTT, SEQ ID No. 4) Primer (O 'Donnell et al, 1998), CN L12 (CTGAACGCCTCTAAGTCAG, SEQ ID No.
  • IGS intergenic spacer
  • SCN1 GACAA GCATATGACTACTG
  • SEQ ID No. 6 Primers (Kosiak et al, 2005) were used.
  • the amplified DNA was purified using the QIAamp Purification Kit (Qiagen, Tokyo). Ifr Sanfunore has Big Dye Terminator v3.1 Cycle sequencing Kit (Applied Biosystems Japan, Tokyo), the above 6 primers, and IGS1 (TCACCAATCACTAACTTCCTCTTCCG, SEQ ID No. 7 ) Primer and IGS2 (TGGGATCCTCAGCTTTTTCTGCAT, SEQ ID No.
  • the obtained sequence data was aligned with ClustalW, and the TiZTv ratio was determined and weighted using PAUP (ver 4.0 betalO; Swofford 2000). After that, analysis was performed by the neighbor-joining method and the maximum saving method, and a phylogeny was created and a bootstrap test was performed.
  • soba medium (contains 10g soba and 10ml SB solution per 250ml Erlenmeyer flask.
  • SB solution is Yeast extract (oriental yeast) 100mg, tartaric acid.
  • the culture was extracted with 20 ml of n-butanol, 300 ⁇ 1 was concentrated to dryness, dissolved in an equal volume of methanol to make a sample solution, and then used under the LCZMS analysis conditions shown in Analysis Condition 5 below. I prayed.
  • the detected compound 1 is the peak area of mass chromatography (positive ion (M + H): 660) obtained by analyzing the sample under the conditions of LCZMS shown in analysis condition 5 below. Quantification was performed by the absolute calibration curve method using the values.
  • Liquid B Acetonitrile (0.1% min.
  • Liquid A Water (0.01% trifluoroacetic acid)
  • Liquid B Acetonitrile (0.01% trifluoroacetic acid) min% Liquid B
  • Fusarium sp. F1476 strain on potato 'glucose agar medium is slow 25 ° C, reaching 10 to 15 mm in diameter in 10 days under near-ultraviolet irradiation, with a growth rate of 1.5 to 1.6 mm / Day.
  • the Fusarium sp. F1476 strain forms a dense and dense mycelium, its surface is ridged and swells, white to light pink (Munsell 5YR-10YR9 / 2), and the periphery is sometimes A remarkably fluffy mycelium was formed (called the fast part).
  • wet conidia gather in part, and the color is bright orange (apricot, light orange, Light Apricot or Apricot, Munsell 5YR7 / 6 to 7/10, Metwen 6A6 to 6B8) (called wet part) 7 hot.
  • 3 ⁇ 4 [3 ⁇ 4 is light orange; light orange ⁇ bright reddish orange ⁇ Tiger Lily, Mansell 5-10YR7 / 10, Metwen 6B8 to 8A6]
  • the front and back did not turn reddish purple. In the dark, the growth rate was a little worse from 0.9 to 1.1 mm / day.
  • the hue was paler pale (pale beige, Ivory, Munsell 10YR9 / 2, Metwen 4A3), and the back was light reddish yellow (Naples Yellow). However, the color of mycelia may become darker, and the color changes from ocher to gray-brown (gold, Golden Ocher, light grayish brown, Blond, Mansell 10YR5 / 4-8, Metwen 5E5-8). The color was dark brown (brown skin, dark y ellowish brown, Burnt Umber, Munsell 10YR3 / 6). In either case, the back side It did not become reddish purple.
  • Fusarium sp. F1476 strain grows rapidly on Miura medium (LCA) under near-ultraviolet irradiation 10 The diameter reached 25 mm per day and the growth rate was 3.4 mmZ.
  • the Fusarium sp. F1476 strain forms a flat and light colony, and the colony is granular or fluffy. The central part is dotted with wet conidia, and the color is beige (pale beige, Ivory, Munsell 10Y R9 / 2, Metwen 4A3), and the back side was the same color. Similar growth was observed in the dark. Morphological properties
  • the conidial pattern may rise and branch mainly vertically in the aerial mycelium.
  • Two to eight phialides were born directly on the branches or conidia.
  • Conidia-forming structures composed of conidia and phialides sometimes showed complex structures that form conidia.
  • the phialide was single or rotated directly on the aerial hyphae forming the conidial pattern.
  • conidia were formed from the hyphae that crazed on the surface of the agar.
  • conidia-forming cells expand or expand during the process of conidia formation, and become polyphyalides (or mesoconidia-forming cells) that produce multiple conidial gradients in one cell. .
  • the conidia pattern has a length of 10-30 / ⁇ ⁇ .
  • the flide has a cylindrical shape, a pen shaft shape, a sharp shape, and the like, and usually has a noticeable cup structure at the tip.
  • the polyphialide or mesoconidial cells) had 2-5 openings at the top, but the cup structure was notable.
  • the size of wet cells is (8.5) 10.5-24.5 (36.5) x 2.5-3.0 (3.5) m (average 17.5 x 3.0 ⁇ m) m), L / W (2.75) 3.10-9.70 (16.25) (average 6.4), fast part is (7.0) 9.5— 25.0 (28.0) x 2.5—3.0 (3.5) ⁇ m (average 17.0 x 3.0 ⁇ m), L / W (2.78) 3.31-8.77 (10.0) (average 6.04).
  • the size of the wet part is (6.0) 8.0-14.0 (19.0) x 2.5-3.5 m (average 11.0 X 3.0 ⁇ m), L / W (2.00) 2.38- 5.06 (7.56) (average 3.72), fast part is (8.5) 9.0-12.5 (14.0) x (2.5) 3.0-3.5 ⁇ m (average 11.0 x 3.0 ⁇ m), L / W ( 2.5) 2.85—4.33 (5.0) (average 3.59).
  • Conidia are formed in a mass of mucus at the tip of the phialide, typically crescent-shaped, sometimes oblong or cylindrical, and the tip does not extend significantly elongated.
  • the base of the conidia has distinct podocytes or is scarred or blunt.
  • conidia usually had no force bulkhead with 2-4 bulkheads or had 1 or 5 bulkheads.
  • the size of the conidia is (18.5) 23.5-29.0 (3 2.5) x (3.0) 4.0-5.5 (6.5) ⁇ m (26.5 x 5.0 m on average), L / W 4.19-8.39 (average 5.52), 27.0-30.0 (32.5) x (3.0) 3.5 for 4-wall conidia -5.5 (6.0) m (average 28.5 x 4.5 ⁇ m), L / W 4.65-8.88 (average 6.48), 16.0-19.0 x 2.5-3.0 m (average 17.5 X for fast bulkhead 2 conidia) 2.5 m), L / W 6.45-6.84 (average 6.64), (15.5) 22.0-28.0 (33.5) x (2.5) 3.0-5.0 (5.5) ⁇ m (average 25.0 x 4.0 ⁇ m) L / W 4.42-10.30 (average 6.55),
  • the formation of typical rough thick-spore spores on the mycelium was not observed, but hollow, thickened, almost smooth, subspherical cells linked to one or several cells at the tip or middle of the mycelium.
  • the size is (5.5) 8.5-15.0 (15.5) x (5.0) 6.0—13.5 (14.0) ⁇ m (average 11.5 x 9.5 m), L / W 1.04-1.45 (1.61) ( The average was 1.24) (see Figure 3 and Figure 4).
  • “(5.5) 8.5-15.0 (15.5)” means “usually in the range of 8.5-15.0, but may be expanded to 5.5-15.5”.
  • FIG. 11 shows the results of MSZMS analysis. Compared with the spectrum obtained for the standard strength of Compound 1, it was confirmed that the results were consistent.
  • the F1476 strain formed a vivid orange mouth-like mucus velvety orange on a PDA that grew very slowly (wet part) or a colony mainly composed of mycelial flora with a fast and irregular shape (fast part). ). When the passage was continued, the properties of both gradually separated and the growth tended to accelerate. These macroscopically distinct clones were isolated and examined for homology between the base sequences of the ITS region and the TEF 1- ⁇ region. Considered the same.
  • F1476 strain was at least Section Eupionnotes.
  • a phylogenetic analysis was performed using the TEF 1- ⁇ region (677b P).
  • the F1476 strain must be located outside of the F. equiseti clade together with F. inca rnatum. I understood. In particular, it was found to be closest to F. incarnatu m CBS678.77 (bootstrap value: 66).
  • the F 1476 strain is contained in the F. incarnatum clade, and the F. incarnatum CBS678. The most closely related to 77 was a force.
  • F. avena ceum is used for Fusarium, in which a part of conidia-forming cells stretches to form multiple conidia-forming sites, such as the F1476 strain.
  • Sacc., F. chenopodinum (Thum.) Sac F. chlamydosporum Wollenw. & Reinking, F. incarnatum ( F. Pallidoroseum (Cke) Sacc., F. semitectum Berk. & Rave nel), F. sporotrichioides Sherb, F subglutinans (Wollenw.
  • F. equiseti which is closely related to the base sequences of the TEF1- ⁇ region and the IGS region, does not form polyphialide, has a characteristic conical tip extension, and has a conidial length of 4 or more septa. It is clearly different from the F1476 strain in that it exceeds 40 ⁇ m.
  • F. incarnatum is according to Gerlach and Nirenberg (1982)! 7 , semitectum, and two variants are known, var. Semitectum and F. semitectum var. Majus Wollenw. The latter is characterized by a large number of conidia septa (0-9 septa) and the size increases accordingly. This is closer to the direction of i Fl4 standard ⁇ 3 ⁇ 4, F. semitectum var. Semitectum. Booth and Sutton (1984) used the name F. pallidoroseum to identify the two F. semitectum varieties, and Nirenberg (1990) assumed F. incarnatum force F. semitectum var. Majus. As mentioned earlier, historically F.
  • incarnatum standard strains are CBS 161.25 in Australia and CBS 145.44 are unknown but not considered Japan, so the F1476 strain is also very close to F. incarnatum CBS 678.77 from Japan. It is also the edge. This is supported by the production of Compound 1 as well as the F1476 strain CBS 678.77.

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Description

明 細 書
抗 HCV作用を有する化合物の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、 C型肝炎ウィルス (HCV)に対する高い複製阻害活性を有する、ウィル ス感染症、特に HCVの感染による肝臓疾患の予防および治療に有用な化合物の製 造方法に関する。
背景技術
[0002] HCVの感染者は世界で 1〜2億人、日本国内では 200万人以上と推測されている 。これらの患者の約 50%が慢性肝炎に移行しそのうち約 20%が感染後 30年以上た つて肝硬変、肝癌となる。肝癌の約 90%の原因が C型肝炎といわれている。 日本国 内では、毎年 2万人以上の患者が HCV感染に伴う肝癌により死亡している。
[0003] HCVは 1989年に輸血後の非 A非 B型肝炎の主要な原因ウィルスとして発見され た。 HCVはエンベロープを有する RNAウィルスであり、そのゲノムは 1本鎖（ + )RN Aからなり、フラビウィルス科のへパチウィルス（Hepacivirus)属に分類される。
[0004] HCVは、いまだ明らかでない原因により宿主の免疫機構を回避するため、免疫機 構の発達した大人に感染した場合でも持続感染が成立することが多ぐ慢性肝炎、 肝硬変、肝癌へと進行し、手術により摘出しても、非癌部で引き続き起こる炎症のた め肝癌が再発する患者が多 、ことも知られて 、る。
[0005] よって、 C型肝炎の有効な治療法の確立が望まれており、その中でも、抗炎症剤に より炎症を抑える対症療法とは別に、患部である肝臓において HCVを減らすあるい は根絶させる薬剤の開発が強く望まれている。
[0006] 現在、 HCV排除の唯一の有効な治療法としてインターフェロン療法が知られてい る。しかしインターフェロンが有効な患者は、全患者の 1Z3程度である。特に HCV ゲノタイプ lbに対するインターフェロンの奏効率は非常に低い。従って、インターフエ ロンに代わる、もしくはそれと併用し得る抗 HCV薬の開発が強く望まれている。
[0007] 近年、リバビリン（Ribavirin: 1— — D—リボフラノシル一 1Η— 1, 2, 4—トリァゾー ルー 3—カルボキシアミド）がインターフェロンとの併用による C型肝炎治療薬として巿 販されているが、有効率は依然低ぐ更なる新規な C型肝炎治療薬が望まれている。 また、インターフェロンァゴニスト、インターロイキン 12ァゴニストなど、唐、者の免疫 力を増強させることによってウィルスを排除する手段も試みられているが、いまだ有効 とされる薬剤は見出されていない。
[0008] HCV遺伝子がクローユングされて以来、ウィルス遺伝子の機構と機能、各ウィルス のタンパク質の機能などにっ 、ての分子生物学的解析は急速に進展したが、ホスト 細胞内でのウィルスの複製、持続感染、病原性などのメカニズムは十分に解明され ておらず、現在の所、信頼できる培養細胞を用いた HCV感染実験系は構築されて いない。従って従来、抗 HCV薬の評価をするにあたり他の近縁ウィルスを用いた代 替ウィルスアツセィ法を用いなければならな力つた。
[0009] しカゝし近年、 HCVの非構造領域部分を用いてインビト口での HCV複製を観測する ことが可能になったことにより、レブリコンアツセィ法によって抗 HCV薬を容易に評価 することができるようになった (非特許文献 1)。この系での HCV RNA複製のメカ- ズムは、肝細胞に感染した全長 HCV RNAゲノムの複製と同一であると考えられて いる。従って、この系は、 HCVの複製を阻害する化合物の同定に有用な細胞に基づ くアツセィ系ということができる。
[0010] 本願発明者らは、糸状菌類に属する、フザリウム'エスピー（Fusarium sp.) F1476 株 (以下「F1476株」と 、う）力も下記化合物を単離し、該化合物並びにその誘導体 が高い HCVの複製阻害活性を有することを見出した (特許文献 1)。なお、該化合物 は、国際公開公報 W098Z56755号 (特許文献 2)にも開示されており、抗真菌活 性および免疫反応阻害作用を有することが知られている。
Figure imgf000005_0001
[0012] 更に本願発明者らは、該化合物およびその誘導体を全合成する方法を開発し、そ の方法により得られた各種誘導体が同様に優れた HCV複製阻害活性を有すること を見出した (特許文献 3)。
特許文献 1：国際公開第 2004Z071503号パンフレット
特許文献 2：国際公開第 98Z56755号パンフレット
特許文献 3：国際公開第 2005Z005372号パンフレット
非特許文献 1 :ブイ'ローマンなど著、サイエンス（Science) , 1999年、第 285卷、第 1 10— 113頁
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0013] 本発明者は、鋭意研究を行った結果、上記化合物を産生する菌株（「F1476株」並 びにその変異株など）を用いて、培養液中に特定のアミノ酸誘導体の塩を添加するこ とにより、上記化合物の誘導体を直接該菌株に産生させる方法を見出した。さらに本 発明者らは、上記化合物の誘導体を直接該菌株に産生させるための最適な培養条 件、並びに添加するアミノ酸誘導体の最適な塩を見出し、本発明を完成するに至つ た。
[0014] 本発明は、高い HCVの複製阻害活性を有するため、ウィルス感染症、特に HCV 感染による肝臓疾患の予防および治療に有用な化合物の簡便で有用な製造方法を 提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0015] 本発明は、
式 (1) :
Figure imgf000006_0001
〔式中、 Aは、水素原子、炭素数 1〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖状 のアルキニル基、
Figure imgf000007_0001
置換されていてもよいァリール基、または置換されていても よいへテロアリール基を表し；
[0016] ここで R1は、水素原子、炭素数 1〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素 数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖 状のアルキ-ル基、炭素数 3〜8のシクロアルキル基、置換されていてもよいァリール 基、置換されていてもよいへテロアリール基、置換されていてもよいァラルキル基、ま たは置換されて 、てもよ 、ヘテロァリールアルキル基を表す。〕
で示される化合物または製薬上許容されうるそれらの塩を生物学的に製造する方法 であって、
[0017] 式（2) :
Figure imgf000007_0002
で表される化合物を産生できる能力を有する糸状菌株の菌体または培地 Z培養液 中に式（3) :
Figure imgf000007_0003
〔式中、 Aは、上記式（1)の化合物と同じ定義を意味し; Rは、水素原子、炭素数 1〜 8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のァ ルケニル基、または炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表す〕 で表されるアミノ酸誘導体またはその塩を添加して、該菌株に直接、上記式（1)の化 合物を産生させることを特徴とする方法に関する。
[0019] さらに本発明は、式（3)のアミノ酸誘導体またはその塩の尺が、炭素数 1〜4の直鎖 もしくは分岐鎖状のアルキル基、特にメチル基であることを特徴とする上記の製造方 法に関する。
[0020] さらに本発明は、式（3)のアミノ酸誘導体またはその塩力 式（3)の化合物の塩酸 塩であることを特徴とする上記の製造方法に関する。
[0021] さらに本発明は、 A力 置換されていてもよいフエニル基または炭素数 2〜8の直鎖 もしくは分岐鎖状のアルキ-ルォキシ基である、上記の製造方法に関する。
[0022] さらに本発明は、式（2)の化合物を産生する菌株が、 F1476株または当該菌株と 分類学的もしくは遺伝学的に同等な菌株、特に Fusarium sp. F1476株またはそれら の変異株である、上記の製造方法に関する。
さらに本発明は、式（2)の化合物を産生する菌株が、以下の a)および b)から選択さ れる、 1以上の特徴を有している菌株、またはそれらの変異株である、上記の製造方 法に関する。
a)菌株カ、 Fusarium incarnatumに J¾ ^"る;^、もしくは Fusarium incarnatumと同等 の形状を示す；
b)菌株の遺伝子の ITS領域の配列が、 Fusarium sp. F1476株のそれと、 99%以 上相同する。
また本発明は、式（3) :
Figure imgf000008_0001
〔式中、 Aは、上記式（1)の化合物と同じ定義を意味し; Rは、水素原子、炭素数 1〜 8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のァ ルケニル基、または炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表す〕 で表されるアミノ酸誘導体またはその塩の培地添加物としての使用に関する。
[0024] また本発明は、式（3' ) :
Figure imgf000008_0002
〔式中、 Aは、上記式（1)の化合物と同じ定義を意味する。〕
で表されるアミノ酸誘導体またはその塩に関する。 [0025] さらに本発明は、式（3) :
Figure imgf000009_0001
〔式中、 Aは、上記式（1)の化合物と同じ定義を意味し; Rは、水素原子、炭素数 1 8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数 2 8の直鎖もしくは分岐鎖状のァ ルケニル基、または炭素数 2 8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表す〕 で表されるアミノ酸誘導体またはその塩を含む培地添加物に関する。
発明の効果
[0026] 本発明は、 C型肝炎などの HCV感染症の治療および予防に有効である式（1)の 化合物もしく製薬上許容されうるそれらの塩を、簡便でかつ安価に製造することがで きる方法を提供する。
図面の簡単な説明
[0027] [図 1]化合物 1の UVスペクトラムを示した図である。
[図 2]化合物 1の標品の MSZMSスペクトルを示した図である。
[図 3]F1476株の、 SNA上での wet部分の形態的性状の例を示した図である。
[図 4]F1476株の、 SNA上での fast部分の形態的性状の例を示した図である。
[図 5]F1476株の、 Internal transcribed spacer (ITS領域/ 466bp)の近隣結合系統榭 を示した図である。
[図 6]F1476株の、 Internal transcribed spacer (ITS領域/ 466bp)の最大節約系統榭 を示した図である。
[図 7]F1476株の、 Translation elongation factor 1 alpha (TEF 1 - /677bp)領 域の近隣結合系統榭を示した図である。
[図 8]F1476株の、 Translation elongation factor 1 alpha (TEF 1 - /677bp)領 域の最大節約系統榭を示した図である。
[図 9]F1476株の、 Intergenic spacer (IGSZ2358bp)領域の近隣結合系統榭を示し た図である。
[図 10]F1476株の、 Intergenic spacer (IGSZ2358bp)領域の最大節約系統榭を示 した図である。
[図 11]F. incarnatum CBS 678.77を培養して得られた試料液の MS/MSスペクトルを示 した図である。
発明を実施するための最良の形態
[0028] 本明細書においては、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基とは、所定の炭素数を 有する飽和炭化水素基を意味する。炭素数 1〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキ ル基としては、例えばメチル、ェチル、 n—プロピル、 i—プロピル、 n—ブチル、 sec— ブチル、 tーブチノレ、 n ペンチル、 t ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、 n— へキシル、イソへキシル、ネオへキシル、 3—メチルペンチル、 n—へプチル、イソへ プチル、 3—メチルへキシル、 5—メチルへキシル、 1, 1 ジメチルペンチル、 2, 2— ジメチルペンチル、 4, 4 ジメチルペンチル、 3—ェチルペンチル、 n—ォクチル、ィ ソォクチル、 3 メチルヘプチル、 2, 2 ジメチルへキシルなどを挙げることができる
[0029] また直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基とは、所定の炭素数を有し、すくなくとも 1つの二重結合を有する炭化水素基を意味する。炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖 状のアルケニル基としては、ビュル、 1—プロべ-ル、ァリル、 1—ブテュル、 2—ブテ 二ノレ、 2—メチノレ一 1—プロぺニノレ、 1—メチノレ一 1—プロぺニノレ、 1—ペンテ二ノレ、 2 ペンテ-ノレ、プレニノレ、 1一へキセ-ノレ、 2 へキセ-ノレ、 5 へキセ-ノレ、 4ーメチ ノレ一 3 ペンテ二ノレ、 1一へプテニノレ、 6 へプテニノレ、 1ーォクテニノレ、 2—ォクテニ ル、 7—オタテュルなどを挙げることができる。
[0030] また、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキ-ル基とは、所定の炭素数を有し、少なくとも 1つの三重結合を有する炭化水素基を意味する。炭素数 2〜8のアルキニル基として は、ェチニル、 1 プロピニル、 2 プロピニル、 1ーブチニル、 2 ブチニル、 3 ブ チニノレ、 1 ペンチ二ノレ、 2 ペンチ二ノレ、 3 ペンチ二ノレ、 4 ペンチ二ノレ、 1一へ キシュノレ、 2 へキシュノレ、 3 へキシュノレ、 4一へキシュノレ、 5 へキシュノレ、 1一へ プチニル、 2 へプチニル、 3 へプチニル、 4一へプチニル、 5 へプチニル、 6— へプチニル、 1ーォクチ-ル、 2—ォクチ-ル、 4ーォクチ-ルなどを挙げることができ る。 [0031] またシクロアルキル基とは、所定の炭素数を有する環状飽和炭化水素基を意味す る。たとえば、炭素数 3〜8のシクロアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブ チル基、シクロペンチル基、シクロへキシル基、シクロへプチル基などが挙げられる。 本明細書にぉ 、て記載されるァリール基は、芳香族性を有する単環または多環の 炭化水素基を意味する。具体的には、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フルォレ ンなど力 誘導される基を挙げることができる。
[0032] 本明細書にぉ 、て記載されるへテロァリール基は、芳香族性を有し、窒素原子、硫 黄原子、および酸素原子から独立して選択されるへテロ原子 1〜4個 (好ましくは 1ま たは 2個）を環員として含む 4〜6員の単環または 7〜10員の二環の環状基 (好ましく は単環基)を意味する。具体的には、フラン、チォフェン、ピロール、ピラゾール、ピリ ジン、チアゾール、イミダゾール、ピリミジン、インドール、キノリン、ォキサゾール、イソ ォキサゾール、ピラジン、トリァゾール、チアジアゾール、テトラゾール、ピラゾールな ど力 誘導される基を挙げることができる。
[0033] 本明細書において記載されるァラルキル基は、上記のァリール基で置換されている 上記の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を意味し、具体的にはべンジル基、フエ ネチル基などを挙げることができる。
[0034] 本明細書において記載されるへテロァリールアルキル基は、上記のへテロアリール 基で置換されて!ヽる上記の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を意味する。
[0035] 本明細書にぉ 、てハロゲン原子とは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味する。
[0036] 本明細書において記載される製薬上許容されうるそれらの塩とは、薬理学的に許 容されるものであれば特に限定されない。例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水 素酸などの鉱酸との塩；酢酸、酒石酸、乳酸、クェン酸、フマル酸、マレイン酸、コハ ク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸 、ナフタレンスルホン酸、ショウノウスルホン酸などの有機酸との塩；ナトリウム、力リウ ム、カルシウムなどのアルカリ金属またはアルカリ土類金属などとの塩などを挙げるこ とがでさる。
[0037] 本明細書において記載される、式（3)のアミノ酸誘導体の塩とは、培地中の、菌株 の生育、もしくは菌株による式（1)の化合物の産生に実質的に悪影響を与えないも のであれば特に限定されない。例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸など の鉱酸との塩；酢酸、酒石酸、乳酸、クェン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、メタ ンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トリフルォロ酢酸、トルエンス ルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ショウノウスルホン酸などの有機酸との塩；ナトリウム 、カリウム、カルシウムなどのアルカリ金属またはアルカリ土類金属などとの塩；アンモ -ゥム塩などを挙げることができ、好ましくは塩酸、トリフルォロ酢酸、ナトリウム塩が挙 げられる。
[0038] 本発明の式 (2)で表される化合物を産生できる能力を有する菌類とは、式 (2)で表 される化合物を培地中でわずかでも産生できる菌類であればいかなるものでもよぐ 例えば、フザリウム 'エスピー（Fusarium sp.) F1476株（以下「F1476株」という）（WO 04/071503)もしくは当該菌株と分類学的もしくは遺伝学的に同等な菌株、およびそ れらの変異株、オーレォバシディウム ·エスピ一' TKR2449株（WO98/056755)もしく は当該菌株と分類学的もしくは遺伝学的に同等な菌株、およびそれらの変異株など が挙げられる。該菌類としては、好ましくは、 F1476株または当該菌株と分類学的も しくは遺伝学的に同等な菌株、およびそれらの変異株である。
[0039] 本発明において「分類学的に同等な菌株」とは、分類学的に同一の特徴を有する 菌株をいう。具体的には以下に示すような F1476株と同等の生理学的性質を有し、 かつ本発明の式 (2)で表される化合物を産生できる能力を有する菌株をいう。
[0040] 本発明において「遺伝学的に同等な菌株」とは、遺伝学的に同等な性質の特徴を 有する菌株をいい、具体的には菌株が有する 5S、 5. 8S、 18S 28S rDNAなどの リポゾ一マル DN Aの配列が同一もしくは相同性が 98 %以上、好ましくは 99 %以上 で、かつ本発明の式 (2)で表される化合物を産生できる能力を有する菌株をいう。
[0041] 菌株が、式 (2)で表される化合物を産生できる能力を有する力否かは、菌株を培養 し、化合物を培養物中から分離し、分離した化合物を必要に応じて更に精製し、化 合物あるいは精製物を分析することにより確認することができる。
[0042] 培養方法、分離方法および精製方法としては、後述する、本発明の式（1)の化合 物を製造する方法において述べられている、各種栄養源および許容される添加物を 含有する培地を用いる各種培養方法および培養条件；各種分離方法；ならびに各種 精製方法を採用することができる。
[0043] なお、菌株の培養時には、式（1)の化合物を製造する際に添加する式（3)で表さ れるアミノ酸誘導体は、原則として添加しないが、式（2)で表される化合物を産生でき る能力を有する力否かを判定する目的においては、必要に応じて、アミノ酸誘導体と して、式 (4) :
Figure imgf000013_0001
(式中、 RAは、水素原子または炭素数 1〜4の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、 好ましくはメチル基を示す)で表されるプレニルチロシン誘導体を添加してもよ ヽ。式 (4)で表されるプレニルチロシン誘導体は、フリー体のままでも、あるいは、塩酸塩、ト リフルォロ酢酸塩、ナトリウム塩として添加してもよいが、塩酸塩として添加するのが好 ましい。式 (4)で表されるプレニルチロシン誘導体としては、 RA力メチル基である化合 物の塩酸塩が好ましい。添加時の形態 (粉末、有機溶媒に溶解）、添加量および添 加後の培養条件は、式（1)の化合物を製造する際に添加する式 (3)で表されるァミノ 酸誘導体についてのそれらと同じである。
[0044] 式（2)で表される化合物を産生できる能力を確認するための分析方法としては、菌 株を培養 Z分離 Z精製して得られる化合物から得られる、例えば、融点、元素分析、 NMRスペクトル、 IR ^ベクトル、 UVスペクトル、 MSスペクトル、 HPLCにおける reten tion time,旋光度、 X線構造解析などの周知の測定方法によるデータを、標品である 式 (2)の化合物と比較し、一致する力否力判定する方法が挙げられる。
[0045] なお、これらの測定方法は、適宜組み合わせて判定に用いてもよぐ例えば LCZ MS、 LC— MSZMSおよび高分解能 MS分析（以下、 TOF— MSとも称する）など のように、もともと組み合わされて 、る測定方法を採用してもょ 、。
[0046] ここで、分析に用いる化合物は、単品であっても、 2以上の化合物の混合物であつ てもよく、どちらを用いるかは、分析方法に応じて、適宜選択できる。
[0047] 菌株を培養 Z分離 Z精製して得られる化合物を、標品である式 (2)の化合物と比 較し、一致する力否か判定するための具体的な基準としては、例えば以下のものを 挙げることができる：
1) MSスペクトルにおいて、分子イオンピーク： 660 (M+H)と、脱プレニル化に基づ くフラグメントピーク： 592とが観察される力否力。
2)元素分析または TOF— MSにおいて、分子式: C H NO が導き出される力否か
36 54 10
3) UVスペクトルが、図 1で示される形を示すか否か (化合物 1： 100mg/L；溶媒： Me OH )。
すなわち、 277および 228nmで極大吸収： λ maxを示すか否か。
[0048] 4) HPLCにおいて、以下の i)〜iii)のいずれかのピークが検出されるか否か：
i)後述する本願明細書実施例 2の分析条件 1で分析した場合の、 6. 1 ±0. 1分の リテンションタイム (RT)を有するピーク；
ii)本願明細書実施例 4の分析条件 3で分析した場合の、 2. 0±0. 1分のリテンショ ンタイム (RT)を有するピーク；
iii)本願明細書試験例 1の分析条件 5で分析した場合の、 22. 3±0. 1分のリテン シヨンタイム (RT)を有するピーク。
[0049] その他、文献公知となっている各種データを挙げることもできる。
[0050] 上述したように、本発明の製造方法においては、式（2)で表される化合物を産生で きる能力を有する糸状菌株としては、上述の Fusarium sp. F1476株を挙げることがで きるが、 F1476株は、後述する試験例 1に詳述するように、フザリウム インカナータ ム (Fusarium incarnatum)に属する菌株である。
[0051] 本発明において「Fusarium incarnatumと同等の形状を有する」とは、菌株が、以下 の a)〜c)のすベての特徴を有することを！、う：
a)ポリフィアライドを有する。ポリフィアライドとは分生子形成細胞の先端で、分生子 が生じた後、その一部が肥大もしくは成長して、その先端で次の分生子を生じる形状 をいう。
b)分生子が、フィアライドの先端に粘液質で塊状に集合して形成され、典型的には 三日月形 (lunate)でときに長楕円形ないし円筒形となり、その先端は顕著に細長く延 びることはない。分生子の基部は明瞭な足細胞を有するか、截断痕状または鈍頭で ある。截断痕とは、円錐体の上部を水平方向の割面で切り取ったときに残された下部 の形状のことをいう。
これらの分生子の形態の判定に当たっては、例えば Ainsworth, G. C, Kirk, P. M., Bisby, Guy Richard, Dictionary of the Fungi 9th Edition, CAB INTERNATIONAL 、 2001や、本願明細書の試験例 1において図示されている分生子の形態的性状（図 3および図 4)を参照することができる。
c)分生子が、 0〜5個、好ましくは 2〜4個の隔壁を有する。分生子の大きさは、 2隔 壁分生子で ίま、長さ 15. 5〜19. 5 /ζ πι、幅 2. 5〜3. 5 m、 3隔壁分生子で ίま、長 さ 15. 5〜37. 、幅 2. 5〜6. 5 m、 4隔壁分生子では、長さ 24. 0〜37. 05 μ m、幅 3. 0〜6. m、 5隔壁分生子では、長さ 27. 5〜41. 5 m、幅 3. 0〜6. 0 μ mである。
[0052] 本発明にお 、て、「ITS領域」とは、菌株が有するリボゾ一マル RNAをコードする D NA配列のうち、 ITS1、 5. 8Sおよび ITS2の 3つの部分を合わせた領域をいう。そし て 2つの菌株の ITS領域の配列が 99%以上相同すれば、それらの菌株は同種であ ると判断できることが、例えば以下の文献 1〜3により裏づけられている。
文献 1 : Journal of Clinical Microbiology, vol. 37, 1985-1993 (1999)
文献 2 :Mycoscience, vol. 40, 491-501 (1999)
文献 3 Journal of Clinical Microbiology, vol. 38, 1510-1515 (2000)
[0053] 特に、文献 3は、 F1476株 (Fusarium属)と同じ糸状菌（Aspergillus属）につ!/、ての裏 づけ事例として位置づけられる。
[0054] 上記より、本発明の製造方法において式 (2)で表される化合物を産生できる能力を 有する糸状菌株として用いることができる菌株としては、 Fusarium incarnatumに属す る力、または Fusarium incarnatumと同等の形状を示す；および Zまたはその遺伝子 の ITS領域の配列が F1476株のそれと 99%以上相同する菌株を挙げることができる
[0055] 本発明に使用することができる F1476株は、 2000年 1月 24日に鎌倉巿鎌倉山南 斜面にて採集された落葉より 2000年 2月 29日に洗浄濾過法により分離した糸状菌 である。
[0056] 上記 F1476株の生理学的性質は、下記に示すとおりである：
生育温度範囲は、 10〜30°Cであり、好ましくは、 20〜30°Cである。
生育可能 pH範囲は、 3〜11であり、好ましくは、 5〜7である。
F1476株は、 Fusarium sp. F1476と表示した上で、独立行政法人産業技術総合 研究所特許生物寄託センターに、 2003年 2月 4日付で、受託番号 FERM BP— 82 90として寄託されている。
[0057] F1476株の分類学的な特徴は以下の通りである。本発明の F1476株と分類学的 に同等な菌株とは、以下の分類学的な特徴を有し、かつ、本発明の式 (2)で表され る化合物を産生できる能力を有する菌株をいう。
[0058] 培養諸性状
バレイショ'ブドウ糖寒天培地 (PDA)上での生育は遅ぐ 25°C、近紫外光照射下 1 0日で直径 12mmに達し、生育率は 1. 5〜1. 6mmZ日である。密集した菌糸叢を形 成し、表面は皺状で盛り上がり、中央部分に湿った分生子座が集まり、周辺部はとき に顕著に綿毛状の菌糸塊をつくり、色調は明るい橙色 (杏色、 Light orange, Light A pricotないし Apricotゝマンセノレ 5YR7Z6力ら 7ZlO、メトウェン 6A6力ら 6B8)、裏面 ίま淡橙色; 9り橙色 (light orange ^ bright reddish orange ^ Tiger Lily、マンセノレ 5— 10 YR7/10,メトウェン 6B8から 8A6)を呈する。
[0059] 暗所では生育率は少し悪ぐ 0. 9〜1. ImmZ日で、色調はより薄ぐベージュ色 (p ale beige, Ivory,マンセル 10YR9Z2、メトウェン 4A3)で、裏面は明るい赤味黄色（1 ight reddish yellow, Naples Yellow)であり、しかし菌糸の色調が濃くなることもあり、黄 土色力ら灰褐色 (gold、 Golden Ocherゝ light grayish brown、 Blond、マンセノレ 10YR5 Z4— 8、メトウェン 5E5— 8)となり、その場合の裏面は暗黄褐色 (栗皮色、 dark yello wish brown, Burnt Umber,マンセル 10YR3/6)を呈する。
[0060] 麦芽エキス寒天培地 (MA)上での生育は遅ぐ近紫外光照射下 11日で直径 11m mに達し、生育率は 1. OmmZ日である。密集した菌糸叢を形成し、盛り上がり、羊毛 状ないしフェルト状、色調は明るい橙色（light orange, Light Apricot,マンセル 5YR8 Z6、メトウェン 6A6)、裏面は輝橙色（bright orangeゝ Nasturtium Orange,マンセノレ 5 YR7/12,メトウェン 6A7)を呈する。暗所では色調は淡色となる。
[0061] オートミール寒天培地 (OA)上での生育は早ぐ近紫外光照射下 10日で直径 21m mに達し、生育率は 3. 7mmZ日である。平坦だが中央部分に多数の分生子座が密 集した、粒状のコロニーを呈する。色調は明るい黄橙色（light yellowish orange, Maiz e、マンセル 5YR7Z8、メトウェン 6B6)であり、裏面も同色である。喑所での色調は 淡色となる。
[0062] 合成栄養寒天培地 (SNA)上での生育は遅ぐ近紫外光照射下 7日で直径 13mm に達し、生育率は 1. 6mmZ日である。平坦でうすいコロニーを形成し、該コロニーは 、フェルト状ないし羊毛状であり、中央部分には湿った分生子座が点在し、色調はべ 一ジュ色（pale beige, Ivory,マンセル 10YR9/2、メトウェン 4A3)であり、裏面も同 色である。暗所でも同様の生育を示す。
[0063] 三浦培地 (LCA)上での生育は早ぐ近紫外光照射下 10日で直径 25mmに達し、 生育率は 3. 4mmZ日である。平坦でうすいコロニーを形成し、該コロニーは、粒状な いし綿毛状であり、中央部分には湿った分生子座が点在し、色調はベージュ色 (pale beige, Ivory,マンセル 10YR9Z2、メトウェン 4A3)であり、裏面も同色である。喑所 でも同様の生育を示す。
[0064] 生育温度範囲は、 10〜30°Cであり、至適生育温度は 20〜30°Cである。
生育 pH範囲は、 pH3〜： L 1であり、至適 pHは、 pH5〜7である。
[0065] 形態的性状
SNA上では、分生子柄は、主に気中菌糸から垂直に立ち上がり、分岐し、その分 枝あるいは分生子柄に直接フィアライドを輪生し、複雑な分生子形成構造を形成す る。ときに気中菌糸に直接フィアライドを単生することもある。寒天表面上を這う菌糸 から分生子構造が形成することもある。分生子柄は、 10〜30 /ζ πιの長さとなる。フィ ァライドは、円筒形で、先端には通常顕著なカップ構造を有し、 4. 0〜20. 0 X 2. 5 〜3. 0 mの大きさである。分生子は、フィアライドの先端に粘液質で塊状に集合し て形成され、典型的には三日月形でときに長楕円形ないし円筒形となり、先端は顕 著に細長く延びることはない。分生子の基部は明瞭な足細胞を有するか、截断痕状 または鈍頭である。通常、分生子は 2— 4隔壁を有する力 隔壁がないあるいは 1また は 5隔壁を有することがあり、大きさは平均、 19. 3 X 3. 8 ^ m, L/W 5. 2である。 厚膜胞子は認められない。
[0066] 同定
明色の菌糸力 形成される複雑な房状の分生子構造は、ときに分生子座となり、分 生子は円筒形のフィアライド先端力 内生的に生ずるフィァ口型で、明色、特徴的な 舟形ないし三日月形の 2〜5細胞となる。以上の形態的特徴から、本菌 F1476株は 不完全菌 Fusarium属に属することがわかる。そこで本菌を Fusarium sp. F1476株と 同定した。
以下に、 Fusarium属に属する菌株の属と種に関する同定法について述べた参考文 献を記す。
[0067] 参考文献
uenach, W. and Nirenberg, H. 1982 The genus Fusarium - a pictorial atlas. Mitt. Biol. Bundesanst. Land- u. Forstwirtsch. Berlin— Dahlem 209:1—406.
Booth, C. 1971. The genus Fusarium. CMI, Kew, Surrey, 237pp.
Carmichael, J.W., Kendrich, B., Conners, I丄. and Sigler, L. 1980. Genera of Hyph omycetes. University of Alberta Press, Edmonton.
ams, W. 1971. Cephalosporium- artige Schimmelpilze (Hyphomycetes) ustav Fis cher Verlag, Stuttgart. 262pp.
[0068] なお、本発明においては、式 (2)で表される化合物を産生できる能力を有する菌株 力 、必要に応じて、 Fusarium incarnatum CBS678.77株を除外することが許される。
[0069] 本発明において「変異株」とは、上記 F1476株、 TKR2449株などの、式（2)で表 される化合物を産生できる能力を有する菌類の自然または人工的な突然変異株で、 かつ、式 (2)で表される化合物を産生できる能力を有する菌株を言う。
[0070] 一般に当業者であれば、公知の方法を用いて、上記 F1476株、 TKR2449株など の式 (2)で表される化合物を産生できる能力を有する菌類から、当該菌類よりも優れ た能力（例えば、本発明の式（1)または式 (2)で表される化合物の産生能など)を有 する変異株など種々の変異株を作製することは容易である。
[0071] 例えば、当該菌類の胞子もしくは菌糸を、 y線、 X線、紫外線照射などの物理的な 手段で、または亜硝酸、メタンスルホン酸ェチル、メタンスルホン酸メチル、 1 メチル — 3— -トロ一 トロソグァ二ジンのようなィ匕学物質で処理したのち、洗浄、希釈し 、ポテトデキストロース寒天プレートなどの寒天培地に塗布して培養、単離することに より、変異株が得られる。その後、得られた各菌株を固体培養もしくは液体培養し、培 養物を適切な溶媒などで抽出後、 HPLC、 LCZMSなどの分析機器を用いて分析 し、各菌株の化合物の生産性を評価することにより、高生産変異株など種々の変異 株を得ることができる。
[0072] 本発明の化合物の製造方法について以下に詳細に記載する。
本発明の式（1)の化合物は、上記に示す式で示されるものであり、この式（1)にお ける Aは、水素原子、炭素数 1〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数 2 〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖状 のアルキニル基、
Figure imgf000019_0001
置換されていてもよいァリール基、または置換されていても よいへテロアリール基を表し；
[0073] ここで R1は、水素原子、炭素数 1〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素 数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖 状のアルキ-ル基、炭素数 3〜8のシクロアルキル基、置換されていてもよいァリール 基、置換されていてもよいへテロアリール基、置換されていてもよいァラルキル基、ま たは置換されて 、てもよ 、ヘテロァリールアルキル基を表す。
[0074] R1としては、炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基が好ましぐ特に 2—ブチン 1ーィルなどのブチュル基が好まし!/、。
[0075] 上記の「置換されて!、てもよ!/、ァリール基または置換されて!、てもよ!/、ヘテロァリー ル基」の置換基としては、ハロゲン原子、 OR2、炭素数 1〜8の直鎖もしくは分岐鎖 状のアルキル基、炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、炭素数 2〜 8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、シァノ基、ニトロ基、トリフルォロメチル基 、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基でモノもしくはジ置換されて 、てもよ 、ァミノ基 、ァシル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキルスルホ-ル基、力ルバモイル基、直鎖 もしくは分岐鎖状のアルキルチオ基、カルボキシル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアル キルカルボ-ル基、ホルミル基、アミノスルホ -ル基などが挙げられ、それらによって モノ、ジもしくはトリ置換されていてもよい。ここで R2は、水素原子、炭素数 1〜4の直 鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、またはトリフルォロメチル基を表す。当該置換基と しては、フッ素、メトキシ基、メチル基およびジメチルァミノ基が好ましい。
置換されていてもよいァリール基の好ましいものとしては、例えば、炭素数 1〜8の 直鎖もしくは分岐鎖状のアルキルォキシ基で置換されて 、てもよ 、フエニル基、およ びノヽロゲン原子で置換されていてもよいフエ-ル基が挙げられ、更に好ましくはメトキ シフエ-ル基およびフルオロフェ-ル基が挙げられる。
置換されていてもよいへテロアリール基の好ましいものとしては、例えば、ピリジル基 が挙げられる。
[0076] 本発明の式（1)の化合物における Aとしては、—OR1 ;ハロゲン原子またはメトキシ 基で置換されているフエ-ル基；およびピリジル基が好ましぐ特に、 2—ブチン 1 ーィルォキシなどのブチュルォキシ基が好ましい。
[0077] 本発明の式（3)のアミノ酸誘導体は、上記に示す式で示されるものであり、この式（
3)における Aは、上記の式（1)の化合物の Aと同様の定義を表す。
なお、このような式（3)のアミノ酸誘導体としては、 Rが水素原子である遊離カルボン 酸、および Rカ チルまたは t ブチルであるカルボン酸メチルまたは t ブチルエス テルを挙げることができ、なかでも R力 Sメチルである上記式（3Ίで表されるアミノ酸誘 導体を挙げることができる。
[0078] なお、本発明の式（3)のアミノ酸誘導体は、例えば以下のようにして製造することが できる。
[0079] 製法 1
Figure imgf000020_0001
上記式中、 Pは、炭素数 1〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数 2〜8 の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のァ ルキニル基、またはカルボキシル基の保護基を示し、 P' は、ァミノ基の保護基を示 し、 R1' は、所望の、炭素数 1〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数 2 〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖状 のアルキ-ル基、炭素数 3〜8のシクロアルキル基、置換されていてもよいァリール基 、置換されていてもよいへテロアリール基、置換されていてもよいァラルキル基、また は置換されて 、てもよ 、ヘテロァリールアルキル基を示す。
[0080] 工程 1 1
化合物 1—1は市販されて 、る化合物 (Lーチロシン t ブチルエステル、 Lーチ 口シンメチルエステルなど）または市販されて ヽる化合物 (L チロシンなど)から容易 に合成することができる化合物であり、これをァセチル、トリフルォロアセチル、 t ブト キシカルボニル、ベンジルォキシカルボニル、 9 フルォレニルメチルカルボニルな どのようなァミノ基の保護基によって保護することによりィ匕合物 1—2を得ることができ る。この時の反 i条件 ίま、 rotective uroups in Organic synthesis, Theodora Green e (著)， 1999, Wiley-Interscience"に記載されているようなァミノ基の保護基の条件が 用いられる。
[0081] 工程 1—2
化合物 1—2を、ジェチルエーテル、トルエン、シクロへキサン、アセトン、ジメチルホ ルムアミド、ジォキサン、酢酸ェチル、ジメチルスルホキシドなどの溶媒中もしくはそれ らの混合溶媒中で、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム、水素化ナトリウムなどの塩基の 存在下、室温あるいは加熱下、好ましくは室温で、ハロゲン原子またはメシラートもし くはトシラートなどの脱離基と結合させた上記定義の R と反応させることにより、所 望の基 R の導入されたィ匕合物 1—3を得ることができる。あるいは化合物 1—2を光 延反応条件下、水酸基で置換された上記定義の R と反応させることによつてもィ匕 合物 1—3を得ることができる。
[0082] 工程 1—3
化合物 1—3のァミノ基の保護基^ を脱保護することによりィ匕合物 1—4を得ること 力 eさる。この時の反 、条件は、 Protective Groups in Organic synthesis, Theodora
Greene (著)， 1999, Wiley- Interscience"に記載されている様なアミノ基の保護基の 脱保護の条件が用いられる。
工程 1 4 化合物 1 4の力ルポキシル基の保護基 Pを脱保護することにより化合物 1 5を得 ることができる。この時の反応条件は、 "Protective Groups in Organic Synthesis, The odora Greene (著)， 1999, Wiley- Interscience"に記載されている様なカルボキシル基 の保護基の脱保護の条件が用いられる。
製法 2
Figure imgf000022_0001
2-3 2-4 上記式中、 Pは、炭素数 1〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数 2〜8 の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のァ ルキニル基、またはカルボキシル基の保護基を示し、 P' は、ァミノ基の保護基を示 し、 Tは、メシラート、トルエンスルホナート、トリフルォロメタンスルホナートなどの脱離 基を示し、 は、置換されて!、てもよ 、ァリール基または置換されて 、てもよ 、へテ ロアリール基、炭素数 1〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数 2〜8の直 鎖もしくは分岐鎖状のァルケ-ル基、または炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖状の アルキニル基を示す。
[0084] 工程 2—1
工程 1—1で得た化合物 1—2を、ジェチルエーテル、トルエン、シクロへキサン、ァ セトン、ジメチルホルムアミド、ジォキサン、酢酸ェチル、ジメチルスルホキサイドなど の各種溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、 N, N—ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルァミン、ピリジン、 4— N, N ジメチルァミノピリジンなどの塩基の存在下、 室温あるいは冷却下、好ましくは冷却下で、メタンスルホン酸クロリド、トルエンスルホ ン酸クロリド、無水トリフルォロメタンスルホン酸などの脱離基となりえる化合物と反応 させること〖こより、脱離基 Tを導入したィ匕合物 2— 1を得ることができる。
[0085] 工程 2— 2
化合物 2—1を、ジェチルエーテル、トルエン、ベンゼン、ジメチルホルムアミド、ジ ォキサン、酢酸ェチル、ァセトニトリル、水などの各種溶媒中もしくはそれらの混合溶 媒中で、パラジウムジアセテート、テトラキストリフエニルホスフィンパラジウムなどのパ ラジウム触媒の存在下、室温あるいは加熱下、好ましくは加熱下で、所望のァリール 基またはへテロアリール基である A を有する、ァリールまたはへテロアリールボロン 酸誘導体あるいはァリールまたはへテロアリールボロン酸エステル誘導体、あるいは 所望のアルキル基、アルケニル基、またはアルキ-ル基である を有するテトラァ ルキルすず誘導体、アルケニルまたはアルキ-ルトリー n—ブチルすず誘導体などと 反応させることによりィ匕合物 2— 2を得ることができる。
[0086] 工程 2— 3
化合物 2— 2のァミノ基の保護基^ を脱保護することによりィ匕合物 2— 3を得ること ができる。この時の反応条件は、 "Protective Groups in Organic Synthesis , Theodor a Greene (著)， 1999, Wiley- Interscience"に記載されているようなァミノ基の保護基の 脱保護の条件が用いられる。
[0087] 工程 2— 4
化合物 2— 3のカルボキシル基の保護基 Pを脱保護することにより化合物 2— 4を得 ることができる。この時の反応条件は、 "Protective Groups in Organic Synthesis, The odora Greene (著)， 1999, Wiley- Interscience"に記載されている様なカルボキシル基 の保護基の脱保護の条件が用いられる。
[0088] Aが上記以外の基である式（3)のアミノ酸誘導体またはその塩も、上記の方法に準 じて合成することができる。また、 Rが水素原子、炭素数 1〜8の直鎖もしくは分岐鎖 状のアルキル基、炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素 数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基である式（3)のアミノ酸誘導体また はその塩は、上記製法 1および 2で得られたィ匕合物を、必要に応じてカルボキシル基 の脱保護反応およびエステルイ匕などの反応に付すことにより合成することができる。
[0089] 本発明の好まし 、式 (I)の化合物としては、以下の化合物を挙げることができる。
[0090] 化合物 i
Figure imgf000023_0001
化合物 2
Figure imgf000024_0001
[0091] 本発明の式（1)の化合物を製造する方法は、前記の式 (2)の化合物を産生できる 能力を有する菌株を、式 (3)のアミノ酸誘導体またはその塩を該菌株の生育に好適 な培地 (好ましくは培養液）中に添加した培地中で培養して、所望の式（1)の化合物 を当該菌株に産生させるものである。
[0092] 本発明の、式（1)の化合物を製造するための培養に用いられる培地としては、式（2 )の化合物を産生できる能力を有する菌株 (例えば F1476株あるいはその変異株な ど）が利用できる栄養源を含有する培地であればよぐ各種の合成、半合成培地、天 然培地などいずれも利用可能である。
[0093] 上記栄養源のうち、炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、ラタトース、 サッカロース、マルトース、キシロース、シユークロース、澱粉、デキストリン、グリセリン
、糖蜜、水飴、油脂類、有機酸などを挙げることができる。式（1)の化合物を製造する 効率性の観点では、グルコース、フルクトース、ラタトースおよびデキストリンが好まし ぐなかでもラタトースが更に好ましい。
[0094] 上記栄養源のうち、窒素源としては、例えば、大豆粉、綿実粉、コーンスチープリカ 一、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、胚芽、ファーマメディア、尿素、ァミノ 酸などの有機窒素化合物、硝酸アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥムなどのアンモ-ゥム 塩などの無機窒素化合物などを挙げることができる。
[0095] 上記栄養源のうち、塩類としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、 マグネシウム塩、リン酸塩などの無機塩類などを挙げることができる。これらは、単独 で使用されてもよぐ適宜組み合わせて使用されてもよい。
[0096] 上記栄養源は、単独力または適宜組み合わせて使用することができる。
[0097] 上記栄養源含有培地には、必要に応じ、鉄塩、銅塩、亜鉛塩、コノ レト塩などの重 金属塩;ピオチン、ビタミン Bなどのビタミン類;その他、菌の生育を助け、本発明化
1
合物の産生を促進する有機物、無機物などを適宜添加することができる。
[0098] 上記栄養源含有培地には、上記栄養源の他に、更に必要に応じて、シリコーンオイ ル、ポリアルキレングリコールエーテルなどの消泡剤、界面活性剤などを添加すること ができる。
[0099] 培養条件は、該菌株が良好に生育しうる範囲内で適宜選択することができる。通常 、 pH3〜l l、温度 10〜30°Cで 5〜10日程度培養する。上述した各種の培養条件 は、使用する菌類の種類や特性、外部条件などに応じて適宜選択でき、最適条件を 選択できる。
[0100] このように調整した菌株を含有する培養液に式（3)のアミノ酸誘導体を添加し、所 望の式（1)の化合物を生産させる。すなわち培養中の微生物菌体を含む培養液に そのまま、あるいは培養終了後、遠心分離または濾過により培養液から分離した菌体 を別の培養液に懸濁させたものに、式（3)のアミノ酸誘導体またはその塩を添加し、 更に培養する。菌体の懸濁に使用できる培養液は、前記した培地、またはその組み 合わせであることが好まし!/、。 [0101] 培地に添加する式（3)のアミノ酸誘導体またはその塩は、塩酸塩、トリフルォロ酢酸 塩、ナトリウム塩などの塩であることが好ましい。当該アミノ酸誘導体は、粉末のままか 、あるいは水またはエタノールなどの水溶性有機溶媒などに溶解して培地に添加す ればよぐその添カ卩量は、培地 lml当たり 50〜2000mgが好ましい。
[0102] 当該アミノ酸誘導体添加後は、 25〜30°Cで 3〜14日間、好ましくは 5〜10日程度 、振とうあるいは通気攪拌条件下で培養を行うことにより、所望の式（1)の化合物を生 産させることができる。
[0103] 本発明化合物を産生する菌株を、上記栄養源含有培地で培養するに際しては、生 理活性物質の産生を微生物の培養によって行う際に一般的に使用される、固体培養 法、液体培養法などの培養方法を採用することができるが、好ましくは液体培養法を 用いることができる。液体培養法を採用する際、上記栄養源の 1つである上記炭素源 としては、グルコース、フルクトース、ラタトースおよびデキストリンを用いることが好まし く、なかでもラタトースを用いることが更に好ま 、。
また、液体培養法における好ましい液体培地としては、例えば、本願明細書の実施 例 5に示した液体培地 2、実施例 7に示した液体培地 3、および実施例 8に示した液 体培地 5などが挙げられる。
[0104] 上述の培養方法によって、本発明化合物は、培養物中に蓄積される。本発明にお いては、培養物中に蓄積された化合物を、公知の方法により、培養物中から分離し た後、必要に応じて更に精製することができる。
[0105] 上記分離は、培養物全体を、酢酸ェチル、酢酸ブチル、クロ口ホルム、ブタノール、 メチルイソプチルケトンなどの非親水性有機溶媒、あるいはメタノール、アセトンなど の親水性有機溶媒で抽出することにより行うことができる。また、培養物を濾過または 遠心分離によって培養液と菌体とに分離した後、培養液、菌体のそれぞれから分離 することちでさる。
[0106] 上記分離した培養液から本発明化合物を分離するには、上記非親水性有機溶媒 で抽出する方法を採用することもでき、また、培養液を吸着性の担体に接触させ、培 養液中の上記化合物を担体に吸着させた後、溶媒で溶出する方法を採用することも できる。 [0107] 上記担体としては、例えば、活性炭、粉末セルロース、吸着性榭脂などを挙げること ができる。上記溶媒としては、担体の種類、性質などによって適宜 1種または 2種以上 を組み合わせて使用することができ、例えば、含水アセトン、含水アルコール類など の水溶性有機溶媒の含水溶液などを適宜組み合わせたものなどを挙げることができ る。上記含水溶液における含水率は、担体や水溶性有機溶媒の種類などに応じて 適宜選択することができる力 例えば 10〜90% (V/V)、好ましくは、 40〜60% (V ZV)である。
[0108] 上記分離した菌体から本発明化合物出発を分離するには、アセトン、メタノールな どの親水性有機溶媒で抽出する方法を採用することができる。
[0109] 本発明においては、このようにして培養物中から分離された本発明化合物の粗抽 出物を、必要に応じて、更に精製する工程に付することができる。
[0110] 上記精製は、脂溶性生理活性物質の分離、精製に通常使用される方法によって行 うことができ、このような方法としては、例えば、シリカゲル、活性アルミナ、活性炭、吸 着性榭脂などの担体を用いるカラムクロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー 法などを挙げることができる。シリカゲルを担体として用いるカラムクロマトグラフィー 法を採用する場合は、溶出溶媒としては、例えば、クロ口ホルム、酢酸ェチル、メタノ ール、アセトン、水などを挙げることができ、これらは 2種以上を併用することができる 。また溶出溶媒にはトリフルォロ酢酸および酢酸を添加することができる。
[0111] 上記高速液体クロマトグラフィー法を採用する場合は、担体としては、例えば、オタ タデシル基、ォクチル基、フエ-ル基などが結合した化学結合型シリカゲル;ポリスチ レン系ポーラスポリマーゲルなどを挙げることができ、移動相としては、例えば、含水 メタノール、含水ァセトニトリルなどの水溶性有機溶媒の含水溶液などを使用すること ができる。また移動相にはトリフルォロ酢酸および酢酸を添加することができる。
[0112] 以上述べたとおり、本発明の式（1)の化合物の製造方法は、従来知られている製 法に比べ、煩雑な化学合成の工程を用いずに、菌体から直接所望の式（1)の化合 物を産生させるものであり、従来よりも簡便に大量の所望の化合物を製造できるもの である。
[0113] なお、 A力 プレニルォキシ基以外の基である本発明の式（1)の化合物を製造する 際には、菌株が元来その産生能力を有している式 (2)で表される化合物が、目的外 化合物として得られることがある。その場合は、前述した脂溶性生理活性物質の分離 、精製に通常使用される方法により精製を行い、式 (2)で表される化合物力ゝら式（1) の化合物を分離して得ることができる。また、式 (2)で表される化合物を産生できる菌 株の変異株を作製し、式 (4)で表されるプレニルチロシンを添加しなければ、式（2) の化合物を産生しないか、式（1)の化合物に対する式 (2)の化合物の産生割合が、 変異前よりも低い菌株を選抜して製造に用いることで、より効率的に式（1)の化合物 を得ることちでさる。
[0114] さらに、本発明の式（1)の化合物の製造方法においては、式（1)の化合物から、式
(2)の化合物を、必要に応じて除くことが許される。
[0115] このようにして得られる本発明の式（1)の化合物は、そのまま、もしくはそのプロドラ ッグとして、または製薬的に許容されうる塩として、医薬組成物、特に HCVに起因す る肝臓疾患の治療剤の有効成分として使用することができる。
実施例
[0116] 以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定され るものではない。なお、以下の各実施例で使用されるアミノ酸 1〜6および産生される 化合物 1〜5は、以降に記載する。
[0117] 実施例 1
化合物 2の固体培養法での生産
Fusarium sp. F1476株の斜面培養から一白金耳を、 100mlの液体培地 1 (ダルコ ース 2. 0%、グリセロール 1. 5%、ポテトスターチ 1. 0%、ポリペプトン 0. 25%、ィー ストエタストラクト 0. 35%、炭酸カルシウム 0. 5%、塩ィ匕ナトリウム 0. 3%、硫酸亜鉛 7 水和物 0. 005%、硫酸銅 5水和物 0. 0005%、塩ィ匕マンガン 4水和物 0. 0005%、 トーストソーャ 1. 0%)を入れた 500ml容臍つき三角フラスコに接種し、 27°C、 3日間 、 220rpmで振とう培養し、種培養液を得た。この種培養液 2mlを、玄米固体培地 (発 芽玄米 5g、脱塩水 2ml)を入れた 50ml容ポリプロピレン製チューブに接種した。 10m gZmlに調製後、ろ過滅菌したアミノ酸 1の水溶液を培養開始時に lml、培養開始後 48および 96時間後に、 0. 5mlずつ添カ卩し、 27°C、 168時間静置培養を行った。この ように培養した培養物にメタノール 10mlを加え、 180rpmで 20分間振とう攪拌後、 30 OOrpmで 10分間遠心し、メタノール抽出液を得た。得られたメタノール抽出液 500 1 を濃縮乾固後、 10 1ジメチルスルホキシドおよび 90 1メタノールで溶解し、下記分 析条件に示す分析条件 Aで分析した結果、化合物 2の生産が認められた。添加した アミノ酸の種類と生産された化合物の物理化学的性質を表 1に示す。生産された化 合物 2は、標品を分析条件 2に示した LC/MSの条件で分析し、得られたマススぺク トルの M+H値と RTがー致することを基に同定した。
[0118] 分析条件 A
装ま： LC— MS Agilent 1100 seriesし hemStations system LCQ Navigator system カラム： Develosil Combi RP— 5 (5 μ m、 4.6mm X 50mm) (NOMURA Chemical社製） 移動相：以下に示す溶媒勾配溶出
A液：水（0.01%トリフルォロ齚酸）
B液：ァセトニトリル（0.01%トリフルォロ酢酸） 分 % B液
0 15
0. 7 15
1 35
5 55
6 82
7. 2 98
7. 6 98
8. 2 15
8. 8 15
流速： 3ml/分、 温度：室温
1 ァミノ酸添加培養で生産された化合物の物理化学的性状
Figure imgf000029_0001
[0121] . m2 F1476— C193株の取得
MA斜面培地（マルトエタストラクト 1. 0%、イーストエタストラクト 0. 1%、バタトソイト ン 0. 1%、グルコース 1. 0%、寒天 2. 0%)に生育した Fusarium sp.F1476株（FER M BP— 8290)より 4mlの滅菌生理食塩水を用いて胞子懸濁液を作成した (胞子数 ：約 5 X 106/ml)。得られた胞子液 0. 3ml、 3mg/mlに調製した 1ーメチルー 3— -ト 口— 1— -トロソグァ二ジン 0. 3ml、生理食塩水 2. 4mlをまぜて 27°C、 127rpmで 1時 間振とうし、変異処理をした。処理液 2mlを 14000rpmで 10分間遠心し、上清を捨て 、 2mlの滅菌生理食塩水で胞子を洗浄後、希釈して 0. 1mlずつポテトデキストロース 寒天プレート (日本製薬社製）に塗布した。室温で 5— 6日間培養し、得られたコロ- 一をポテトデキストロース寒天斜面培地に広げ、 140株の変異候補株を得た。得られ た菌体を滅菌水にて懸濁し、玄米固体培地 (発芽玄米 5g、脱塩水 2ml)を入れた 50 ml容ポリプロピレン製チューブに接種し 27°C、 192時間静置培養を行った。このよう にして培養した培養物にメタノール 10mlをカ卩え、 180rpmで 20分間振とう攪拌後、 30 OOrpmで 10分間遠心し、メタノール抽出液を得た。得られたメタノール抽出液 500 1 を濃縮乾固後、 10 1のジメチルスルホキシドおよび 90 1のメタノールで溶解し、下 記に示す分析条件 1で分析することで、化合物 1の高生産株をスクリーニングした。そ の結果、化合物 1の高生産株 Fusarium sp. F1476— C193株を得ることができた。 （ 表 2) 表 2 F 1476 および F 1476- C 193株の化合物 1生産性
Figure imgf000030_0001
化合物 1の物理化学的性状
分子量 659
ESI (LCZMSポジティブモード) m/z=660(M+H)
分析条件 1におけるリテンションタイム (RT) 6. 1 ±0. 1分
分析条件 1
装ま： HPLし Agilent 丄丄 00 series (し nemStations system) カラム： Develosil Combi RP— 5(5 μ m、 4.6mm X 50mm) (NOMURA Chemical社製) 移動相：以下に示す溶媒勾配溶出
A液：水（0.01%トリフルォロ酢酸）
B液：ァセトニトリル（0.01%トリフルォロ酢酸）
% B液
0 15
0. 7 15
1 35
5 55
6 82
7. 2 98
7. 6 98
8. 2 15
8. 8 15
流速 ： 3ml/分、 ：室温
実施例 3
化合物 2、化合物 3およびィヒ合物 4の固体培養法での生産
F1476— C193株の斜面培養から一白金耳を、 100mlの液体培地 1 (グルコース 2 . 0%、グリセロール 1. 5%、ポテトスターチ 1. 0%、ポリペプトン 0. 25%、イーストェ タストラタト 0. 35%、炭酸カルシウム 0. 5%、塩ィ匕ナトリウム 0. 3%、硫酸亜鉛 7水和 物 0. 005%、硫酸銅 5水和物 0. 0005%、塩ィ匕マンガン 4水和物 0. 0005%、卜ース トソーャ 1. 0%)を入れた 500ml容臍つき三角フラスコに接種し、 27°C、 3日間、 220 rpmで振とう培養し、種培養液を得た。この種培養液 2mlを、玄米固体培地 (発芽玄 米 5g、脱塩水 2ml)を入れた 50ml容ポリプロピレン製チューブに接種し、培養 48、 72 、 96、 144時間後に、 lOmgZmlに調製後ろ過滅菌したアミノ酸 1の水溶液を 0. 5ml 添加し、 27°C、 192時間静置培養を行った。このように培養した培養物にメタノール 1 0mlを加え、 180rpmで 20分間振とう攪拌後、 3000rpmで 10分間遠心し、メタノール 抽出液を得た。得られたメタノール抽出液 500 1を濃縮乾固後、 10 1ジメチルスル ホキシドおよび 90 1メタノールで溶解し、下記分析条件 2に示す分析条件で分析し た結果、化合物 2の生産が認められた。同様の方法で、アミノ酸 2の添加によりィ匕合 物 2を、アミノ酸 3の添加でィ匕合物 3を、アミノ酸 4の添加でィ匕合物 4を得た。添加した アミノ酸の種類と生産された化合物の物理化学的性質を表 3に示す。生産されたィ匕 合物は、化合物 2、化合物 3およびィヒ合物 4の標品を分析条件 2に示した LCZMS の条件で分析し、得られたマススペクトルの M+H値と RTがー致することを基に同定 した。
[0125] 分析条件 2
装ま： LC— MS Agilent 1100 series Chembtations system LCQ Navigator system カラム： Develosil Combi RP— 5 (5 μ m, 4.6 mm X 50mm) (NOMURA Chemical社製） 移動相：以下に示す溶媒勾配溶出
A液：水（0.01%トリフルォロ酢酸）
B液：ァセトニトリル（0.01%トリフルォロ酢酸） 分 % B液
0 15
0. 7 15
1 35
5 55
6 82
7. 2 98
7. 6 98
8. 2 15
8. 8 15
流速： 3ml/分、 温度：室温 [0126] 表 3 アミノ酸添加培養で生産された化合物の物理化学的性状
添加した 生産された ESI ポジティブモード
RT (分） 分子量 アミノ酸 化合物 (M+H) アミノ酸 1 化合物 2 4. 3 ±0. 1 653 652 アミノ酸 2 化合物 2 4. 4± 0. 1 653 652 アミノ酸 3 化合物 3 6. 1 ±0. 1 670 669 ァミノ酸 4 化合物 4 5. 8±0, 1 644 643 [0127] 実施例 4
F1476— G81株の取得
実施例 2と同様に Fusarium sp. F1476— C193株の胞子懸濁液を作成し (胞子数 約 2 X 106Zml、得られた胞子液 0. 3mlを用いて変異処理をした。処理液 2mlを 140 OOrpmで 10分間遠心し、上清を捨て、 2mlの生理食塩水で胞子を洗浄後、希釈して 0. 1mlずつポテトデキストロース寒天プレート（日本製薬社製）に塗布した。室温で 5 〜6日間培養し、得られたコロニーをポテトデキストロース寒天斜面培地に広げ、 360 株の変異候補株を得た。得られた菌株を、 10mlの液体培地 1を入れた 30ml容ポリブ ロピレン製チューブに接種し、 27°C、 7日間、 160rpmで振とう培養した。このようにし て培養した培養物に n—ブタノール 10mlをカ卩え、 180rpmで 20分間振とう攪拌後、 3 OOOrpmで 10分間遠心し、 n—ブタノール抽出液を得た。得られた n—ブタノール抽 出液 lmlを濃縮乾固後、 10 μ 1のジメチルスルホキシドおよび 90 μ 1のメタノールで溶 解し、下記に示す分析条件 3で分析し、化合物 1の高生産株をスクリーニングした。そ の結果、化合物 1の高生産株 F1476— G81株を得ることができた。 F1476— G81 株の化合物 1の生産性を η—ブタノール抽出液の濃度で示す。生産量は、化合物 1 の標品を分析条件 3で分析し 225應の吸収力も得られるピークの面積値をもとに定 量した。（表 4)
「01 ?°1
表 4 F 1 4 7 6— C 1 9 3株おょぴ F 1 4 7 6— G 8 1の化合物 1生産性
Figure imgf000033_0001
分析条件 3における化合物 1の RT： 2. 0±0. 1分 分析条件 3
装]^： Waters Millennium system 996
カラム： Xterra MS C18 (5 μ m、 4.6mm X 250mm)(Waters社製)
移動相：以下に示す溶媒勾配溶出
A液：水（0.01%トリフルォロ酢酸）
B液：ァセトニトリル（0.01%トリフルォロ酢酸） 分 % B液
0 65
0. 7 65
1 75
2. 4 85
2. 5 98
3. 1 98
3. 2 65
5 65
流速： 1. 5ml/分、 温度：室温
[0130] 実飾 15
F1476— G81株による化合物 4の液体培養法での生産
実施例 2と同様に液体培地 1を用いて F 1476— G81株の種培養液を調製した。こ の種培養液 4mlを、液体培地 2ポテトスターチ 8. 0%、フラクトース 0. 14%、バタトソ ィ卜ン 0. 8%、米ぬ力 2. 0%、硫酸マグネシウム 7水和物 0. 1%) 36mlを入れた 300 ml容フラスコに接種し、 27°C、 220rpmで振とう培養した。培養 72、 96、 144時間後 に、 4mgZmlに調製後ろ過滅菌したアミノ酸 5の水溶液を 0. 5mlずつ添カ卩し、 27°C、 220rpmで 168時間振とう培養を行った。このようにして培養した培養物 lmlに 100% エタノール 4mlをカ卩え、 180rpmで 30分間振とう攪拌後、 3000rpmで 10分間遠心し、 エタノール抽出液を得た。得られたエタノール抽出液を下記に示す分析条件 4で分 祈した結果、化合物 4の生産が認められた。生産量を液体培養物中の濃度で示す。 生産量は、化合物 4の標品を分析条件 4で分析し、 225 の吸収力も得られるピーク の面積値をもとに定量した。（表 5)
[0131] 表 5 アミノ酸添加培養による 化合物 4の生産性
Figure imgf000034_0001
化合物 4の物理化学的性状 ESI (LCZMSポジティブモード) m/z=644(M+H)
分析条件 4における RT1.3±0.1分
[0132] 分析条件 4
装食： LC— M¾ Agilent 丄丄 00 series し nemStations system
カラム： Xterra MS CI 8(5 μ m、 4.6mm X 50mm) (Waters社製）
移動相：以下に示す溶媒勾配溶出
A液：水（0.01%トリフルォロ酢酸）
B液：ァセトニトリル（0.01%トリフルォロ酢酸） 分 % B液
0 65
0. 7 65
1 75
2. 4 85
2. 5 98
3. 1 98
3. 2 65
5 65
[0133] 実施例 6
F1476— H36株の取得
実施例 2と同様に Fusarium sp. F1476— G81株の胞子懸濁液を作成した（胞子数 約 6 X 107Zml)。得られた胞子液 0. 3mlを用い実施例 2同様に変異処理をした。処 理液 2mlを 14000rpmで 10分間遠心し、上清を捨て、 2mlの生理食塩水で胞子を洗 浄後、希釈して 0. 1mlずつポテトデキストロース寒天プレート（日本製薬社製）に塗布 した。室温で 5〜6日間培養し、得られたコロニーをポテトデキストロース寒天斜面培 地に広げ、 77株の変異候補株を得た。得られた菌株を、 10mlの液体培地 1を入れた 30ml容ポリプロピレン製チューブに接種し 27°C、 3日間、 160rpmで振とう培養し種 培養液を調製した。この種培養液 4mlを、 36mlの液体培地 2を入れた 300ml容フラス コに接種し、 27°C、 220rpm7日間振とう培養した。このようにして培養した培養物 lml に 100%エタノール 4mlを加え、 180rpmで 30分間振とう攪拌後、 3000rpmで 10分 間遠心し、エタノール抽出液を得た。得られたエタノール抽出液を上記に示した分析 条件 3で分析しィ匕合物 1の高生産株をスクリーニングした。その結果、化合物 1の高 生産株 Fusarium sp. F1476— H36株を得ることができた。生産量を液体培養物中 の濃度で示す。生産量は、化合物 1の標品を分析条件 3で分析し 225 の吸収から 得られるピークの面積値をもとに定量した。（表 6)
表 6 F 1 4 7 6 - G 8 1株おょぴ F 1 4 7 6— H 3 6の化合物 1の生産性
Figure imgf000036_0001
[0135] 施例 7
F1476—H36株による化合物 5の液体培養法での生産
実施例 2と同様に液体培地 1を用いて F 1476— H36株の種培養液を調製した。こ の種培養液 4mlを、液体培地 3 (ラタトース 14. 0%、グルコース 0. 1%、イーストエタ ストラクト 1. 0%、ファーマメディア（Traders社製） 2. 0%、硫酸マグネシウム 7水和物 0. 1%) 36mlを入れた 300ml容フラスコに接種し、 27°C 220rpmで振とう培養した。 培養 72 96 144時間後に、 4mgZmlに調製後ろ過滅菌したアミノ酸 6の水溶液を 0 . 5mlずつ添カ卩し、 27°C 220rpmで 168時間振とう培養を行った。このようにして培 養した培養物 lmlに 100%エタノール 4mlをカ卩え、 180rpmで 30分間振とう攪拌後、 3 OOOrpmで 10分間遠心し、エタノール抽出液を得た。得られたエタノール抽出液を上 記に示した分析条件 4で分析した結果、化合物 5の生産が認められた。生産量を液 体培養物中の濃度で示す。生産量は、化合物 5の標品を分析条件 4で分析し 255η mの吸収力も得られるピークの面積値をもとに定量した。（表 7)
136] 表 7 アミノ酸添加培養による化合物 5の生産性
Figure imgf000036_0002
化合物 5の物理化学的性状 ESI(LC/MSポジティブモード) m/z=682(M+H)
分析条件 4における RT : 1.8±0.1分
実施例 8
F1476—H36株による化合物 4の液体培養法での生産
F1476—H36株の斜面培養から一白金耳を、 100mlの液体培地 4 (グルコース 2. 0%、グリセロール 1. 5%、ポテトスターチ 1. 0%、ポリペプトン 0. 25%、イーストエタ ストラクト 0. 35%、炭酸カルシウム 0. 5%、塩ィ匕ナトリウム 0. 3%、硫酸亜鉛 7水和物 0. 05%、トーストソーャ 1. 0%)を入れた 500ml容臍つき三角フラスコに接種し、 27 。C、 2日間、 220rpmで振とう培養し、種培養液を得た。この種培養液 4mlを液体培地 5 (ラタトース 8. 0%、グルコース 0. 1%、イーストエタストラクト 1. 0%、ファーマメディ ァ（Traders社製） 1. 0%、硫酸マグネシウム 7水和物 0. 1%) 36mlを入れた 300ml容 フラスコに接種し、 27°C、 220rpmで振とう培養した。培養 72、 96、 144時間後に、 6 mgZmlに調製後ろ過滅菌したアミノ酸 5の水溶液を lmlずつ添カ卩し、 27°C、 220rpm で 168時間振とう培養を行った。このようにして培養した培養物 lmlに 100%エタノー ル 4mlを加え、 180rpmで 30分間振とう攪拌後、 3000rpmで 10分間遠心し、エタノー ル抽出液を得た。得られたエタノール抽出液を上記に示した分析条件 4で分析した 結果、化合物 4の生産が認められた。生産量を液体培養物中の濃度で示す。生産量 は、化合物 4の標品を分析条件 4で分析し 225應の吸収力も得られるピークの面積 値をもとに定量した。（表 8) 表 8 アミノ酸添加培養による化合物 4の生産性
Figure imgf000037_0001
例 9
F1476 -CH44. 9株の取得
F1476— G81株の斜面培養から一白金耳を、 30mlの液体培地 6 (フラクトース 4. 0%、カジトン 0. 1%、硝酸ナトリウム 0. 3%、硫酸マグネシウム 7水和物 0. 05%、 塩化カリウム 0. 05%、硫酸鉄 7水和物 0. 001%)を入れた 250ml容三角フラスコに 接種し、 27°C、 5日間、 220rpmで振とう培養し、培養液を得た。得られた培養液を 30 OOrpmで 10分間遠心し、上清より胞子液を作成後、得られた胞子液を用いて、実施 例 2同様に変異処理をした。処理液を 14000rpmで 10分間遠心し、上清を捨て、生 理食塩水で胞子を洗浄後、希釈して 0. 1mlずつポテトデキストロース寒天プレート（ 日本製薬社製)に塗布した。室温で 5〜6日間培養し、変異候補株を得た。得られた 菌株を、 30mlの液体培地 4を入れた 250ml容三角フラスコに接種し、 27°C、 2日間、 220rpmで振とう培養し、種培養液を得た。この種培養液 4mlを 30mlの液体培地 5を 入れた 250ml容臍つき三角フラスコに接種し、 27°C、 220rpmで 7日間振とう培養を 行った。このようにして培養した培養物 lmlに 100%エタノール 4mlをカ卩え、 180rpm で 30分間振とう攪拌後、 3000rpmで 10分間遠心し、エタノール抽出液を得た。得ら れたエタノール抽出液を上記に示した分析条件 3で分析し、化合物 1の非生産株を スクリーニングした。その結果、化合物 1の非生産株 Fusarium sp. F1476— CH44. 9株を得ることができた。
実施例 10
F1476-CH44. 9株による化合物 4の液体培養法での生産
F1476-CH44. 9株の斜面培養から一白金耳を、 100mlの液体培地 4 (ダルコ一 ス 2. 0%、グリセローノレ 1. 5%、ポテトスターチ 1. 0%、ポロースリペプトン 0. 25%、 イーストエタストラクト 0. 35%、炭酸カルシウム 0. 5%、塩ィ匕ナトリウム 0. 3%、硫酸 亜鉛 7水和物 0. 05%、トーストソーャ 1. 0%)を入れた 500ml容臍つき三角フラスコ に接種し、 27°C、 2日間、 220rpmで振とう培養し、種培養液を得た。この種培養液 4 mlを液体培地 5 (ラタトース 8. 0%、グルコース 0. 1%、イーストエタストラクト 1. 0%、 ファーマメディア（Traders社製） 1. 0%、硫酸マグネシウム 7水和物 0. 1%) 36mlを入 れた 300ml容フラスコに接種し、 27。C、 220rpmで振とう培養した。培養 72、 96、 144 時間後に、 6mgZmlに調製後ろ過滅菌したアミノ酸 5の水溶液を lmlずつ添加し、 27 。C、 220rpmで 168時間振とう培養を行った。このようにして培養した培養物 lmlに 10 0%エタノール 4mlをカ卩え、 180rpmで 30分間振とう攪拌後、 3000rpmで 10分間遠心 し、エタノール抽出液を得た。得られたエタノール抽出液を上記に示した分析条件 4 で分析した結果、化合物 4の生産が認められた。生産量を液体培養物中の濃度で示 す。生産量は、化合物 4の標品を分析条件 4で分析し 225應の吸収力も得られるピ ークの面積値をもとに定量した。（表 9)
表 9 アミノ酸添加培養による化合物 4の生産性
Figure imgf000039_0001
実施例 11
F1476-CH44. 28株の取得
F1476-CH44. 9株の斜面培養から一白金耳を、 30mlの液体培地 6を入れた 25 Oml容三角フラスコに接種し、 27°C、 5日間、 220rpmで振とう培養し、培養液を得た。 得られた培養液を 3000rpmで 10分間遠心し、上清より胞子液を作成後、得られた胞 子液を用いて実施例 2同様に変異処理をした。処理液を 14000rpmで 10分間遠心 し、上清を捨て、生理食塩水で胞子を洗浄後、希釈して 0. 1mlずつポテトデキストロ ース寒天プレート (日本製薬社製）に塗布した。室温で 5〜6日間培養し、変異候補 株を得た。得られた菌株を、 30mlの液体培地 4を入れた 250ml容臍つき三角フラスコ に接種し、 27°C、 2日間、 220rpmで振とう培養し、種培養液を得た。この種培養液 4 mlを 30mlの液体培地 5を入れた 250ml容臍つき三角フラスコに接種し、 27°C、 220r pmで振とう培養した。培養 72、 96、 144時間後に、 6mgZmlに調製後ろ過滅菌した アミノ酸 5の水溶液を lmlずつ添カ卩し、 27°C、 220rpmで 168時間振とう培養を行った 。このようにして培養した培養物 lmlに 100%エタノール 4mlをカ卩え、 180rpmで 30分 間振とう攪拌後、 3000rpmで 10分間遠心し、エタノール抽出液を得た。得られたエタ ノール抽出液を上記に示した分析条件 3で分析しィ匕合物 4の高生産株をスクリーニン グした。同様の変異処理を繰り返すことにより、化合物 4の高生産株 Fusarium sp. Fl 476-CH44. 28株を得ることができた。生産量を液体培養物中の濃度で示す。生 産量は、化合物 4の標品を分析条件 4で分析し、 225應の吸収力も得られるピークの 面積値をもとに定量した。（表 10) 表 1 0 ァミノ酸添加培養による化合物 4の生産性
Figure imgf000040_0003
ノ酸と化合物の構造式
アミノ酸 1
Figure imgf000040_0001
アミノ酸 5
HCI
Figure imgf000040_0002
アミノ酸 6
Figure imgf000041_0001
化合物
Figure imgf000041_0002
化合物 2
Figure imgf000041_0003
化合物 4
Figure imgf000041_0004
化合物 5
Figure imgf000042_0001
[0143] 以下に、上記実施例で使用したアミノ酸誘導体またはその塩の製造方法の例を記 載する。以下に記載されていないアミノ酸誘導体またはその塩も、市販されているか 、または以下の製造例の記載および当業者の技術常識に基づ 、て容易に合成する ことができる。
[0144] 製诰例 1
(S)—2 ァミノ 3— (4—ピリジン— 3—ィルフエ-ル）—プロピオン酸トリフルォロ 酢酸塩 (アミノ酸 1)の合成
Figure imgf000042_0002
(S)—2 アミノー 3— (4—ピリジン— 3—ィルフエ-ル）—プロピオン酸 t—ブチル エステル（210mg、 0. 704mmol)をトリフルォロ酢酸（lml)に溶解し、室温にて 3時間 撹拌した。溶媒を減圧留去後、得られた残渣にへキサンージクロロメタン一メタノール (10 : 3 : 1)混合液 (20ml)を加え析出した粉末を濾取した。真空ポンプで減圧乾燥 後、無色粉末の（S)—2 アミノー 3—（4 ピリジン 3—ィルフエ-ル） プロピオン 酸トリフルォロ酢酸塩（245mg、 98%)を得た。
(S)—2 ァミノ 3— (4—ピリジン— 3—ィルフエ-ル）—プロピオン酸トリフルォロ 酢酸塩の物理化学的性状
分子量 356
EI— MS (ポジティブモード） 242 (M+— C HF O )
2 3 2
ェ!！ NMR (重水中）の化学シフト値 δ： 3.16(1H、 dd、 J=14.5Hzゝ 6.5Hz)、 3.26(1H、 dd、 J=14.5Hzゝ 6.5Hz)、 4.18(1H、 t、 J=6.5 Hz)ゝ 7.38(2H、 d、 J=7.5Hz)、 7.63(2H、 d、 J=7.5Hz)、 7.99(1H、 dd、 J=8.0Hz、 6.5Hz)、 8 •60(1H、 d、 J=6.5Hz)、 8.71(1H、 d、 J=8.0Hz)、 8.91(1H、 s)
製造例 2
(S) 2 アミノー 3— {4一（2—プチ-ルォキシ）フエ-ル}—プロピオン酸メチルェ ステル塩酸塩 (アミノ酸 5)の合成
Figure imgf000043_0001
N— (t—ブトキシカルボ-ル）—Lーチロシンメチルエステル（東京化成： 150g、 0. 508mol)の無水 N, N ジメチノレホノレムアミド溶液（700ml)〖こ、炭酸カリウム（87. 7g 、 0. 635mol)、 1—ブロモ—2 ブチン（74. 3g、 0. 559mol)を加え、室温で 19時 間撹拌した。反応液に酢酸ェチル（2L)をカ卩え、飽和塩ィ匕アンモ-ゥム水溶液（1. 5 L)、飽和重曹水（1. 5L)、飽和食塩水（1. 0L)で順次洗浄した。酢酸ェチル層を無 水硫酸ナトリウムで脱水乾燥し、溶媒を減圧留去後、淡黄色油状物を得た。得られた 油状物を酢酸ェチル（500ml)に溶解し 0°C〜5°Cに冷却した。次に 4N塩酸 Z酢酸 ェチル（1. 0L、 4. Omol)を滴下し、同温度にて 2時間撹拌しその後室温にて 15時 間撹拌した。反応液を酢酸ェチル（500ml)で希釈後、析出した粉末を濾取し、へキ サン 酢酸ェチル（2 : 1)混合液（1. 0L)で洗浄した。真空ポンプで減圧乾燥後、無 色粉末の（S) 2 アミノー 3— {4一（2—プチ-ルォキシ）フエ-ル}—プロピオン酸 メチルエステル塩酸塩（143g、 99%)を得た。
(S) 2 アミノー 3—{4一（2—プチ-ルォキシ）フエ-ル}—プロピオン酸メチルェ ステル塩酸塩の物理ィ匕学的性状
分子量 283
ESI (LC/MSポジティブモード） 248 (M—HC1+H+)
1H—NMR (メタノール d—4中）の化学シフト値 δ：
1.81(3H、 t、 J=2.5Hz)、 3.11(1H、 dd、 J=14.5Hzゝ 7.0Hz), 3.21(1H、 dd、 J=14.5Hzゝ 6.0 Hz)ゝ 3.81(3H、 s)、 4.27(1H、 dd、 J=7.0Hzゝ 6.0Hz)ゝ 4.66(2H、 q、 J=2.5Hz)ゝ 6.96(2H、 d 、 J=8.5Hz)ゝ 7.17(2H、 d、 J=8.5Hz)
[0146] 製造例 3
(S)—2 アミノー 3— (3' —メトキシビフエ-ルー 4—ィル）—プロピオン酸メチルェ ステル塩酸塩 (アミノ酸 6)の合成
Figure imgf000044_0001
[0147] a) (S)— 2— t ブトキシカルボ-ルァミノ一 3— (4—トリフルォロメタンスルホ -ルォ キシフエ-ル） プロピオン酸メチルエステルの合成
Figure imgf000044_0002
N— (t ブトキシカルボ-ル） L チロシンメチルエステル（150g、 0. 508mol) の無水ジクロロメタン溶液（400ml)に無水ピリジン（257ml、 2. 54mol)を加え、 0°C〜 5°Cに冷却した。次にトリフルォロメタンスルホン酸無水物（143g、 0. 508mol)を滴 下し、同温度にて 2時間 30分間撹拌した。反応液に水（1. 5L)、ジクロロメタン（500 ml)を加え分液し、有機層を 0. 5N水酸ィ匕ナトリウム水溶液（1. 5L)、水（1L)、 IN塩 酸 (2 X 1. 5L)、水（2 X 1. 5L)で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムにて有機層を乾 燥し、濃縮して乳白色固体の（S)— 2— t—ブトキシカルボ-ルァミノ— 3— (4—トリフ ルォロメタンスルホ-ルォキシフエ-ル）—プロピオン酸メチルエステル（217g、 100 %)を得た。
(S)— 2— t—ブトキシカルボ-ルァミノ— 3— (4—トリフルォロメタンスルホ-ルォキ シフエ-ル） プロピオン酸メチルエステルの物理化学的性状
分子量 427
FAB - MS (ポジティブモード、マトリックス m— NBA) 428 (M +H+)
1H—NMR (重クロロフオルム中）の化学シフト値 δ：
1.41(9Ηゝ s)ゝ 3.04(1H、 dd、 J=14.0Hzゝ 6.5Hz)、 3.18(1H、 dd、 J=14.0Hzゝ 6.0Hz)ゝ 3.72( 3H、 s)、 4.57— 4.64(1Hゝ m)、 5.04(1H、 brd、 J=7.5Hz)、 7.16— 7.26(4H、 m) [0149] b) (S)— 2— t—ブトキシカルボ-ルァミノ 3— (3' —メトキシビフエ-ルー 4—ィル )一プロピオン酸メチルエステルの合成
Figure imgf000045_0001
(S) 2— t—ブトキシカルボ-ルァミノ 3— (4—トリフルォロメタンスルホ-ルォキ シフエ-ル）—プロピオン酸メチルエステル（31. Og、 0. 0725mol)、 3—メトキシフエ -ルボロン酸（19. 84g、 0. 131mol)、炭酸カリウム（14. 03g、 0. 102mol)を無水ト ルェン (400ml)に懸濁し、窒素雰囲気下にて、テトラキス（トリフエ-ルホスフィン）白 金（2. 51g、 0. 0022mol)を加えた。窒素気流下 90°Cで 2時間撹拌したのち、反応 混合物をセライトにて濾過し、残渣を酢酸ェチル（500ml)で洗浄した。濾液を、 0. 5 N水酸化ナトリウム水溶液 (2 X 500ml)、水（500ml)、 IN 塩酸（500mL)、水（500 ml)、飽和食塩水（300ml)で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し 濃縮後、粗化合物（S)— 2— t—ブトキシカルボ-ルァミノ 3— (3' —メトキシビフエ 二ルー 4 ィル） プロピオン酸メチルエステルを黄色油状物質として得た。
(S)— 2— t—ブトキシカルボ-ルァミノ 3— (3' —メトキシビフエ-ルー 4—ィル） プロピオン酸メチルエステルの物理化学的性状
分子量 385
ESI (LC/MSポジティブモード） 386 (M + H+)
1H—NMR (重クロロフオルム中）の化学シフト値 δ：
1.42(9H、 s)ゝ 3.00— 3.20(2H、 m)、 3.74(3H、 s)ゝ 3.86(3H、 s)ゝ 4.59— 4.67(1H、 m)、 5.02(1 H、 brd、 J=8.0Hz)ゝ 6.87— 6.92(1H、 m)、 7.10— 7.32(4H、 m)、 7.38(1H、 t、 J=8.0Hz)ゝ 7.52 (2H、 d、 J=8.5Hz)。
[0150] c) (S)— 2 アミノー 3— (3' —メトキシビフエ-ルー 4—ィル）一プロピオン酸メチル エステル塩酸塩 (アミノ酸 6)の合成
Figure imgf000045_0002
b)で得られた油状物を酢酸ェチル（100ml)に溶解し 0°C〜5°Cに冷却した。次に 4 N塩酸 Z酢酸ェチル（83ml、 0. 332mol)を滴下し、同温度にて 2時間撹拌しその後 室温にて 15時間撹拌した。反応液をへキサン（100ml)で希釈後、析出した粉末を濾 取し、へキサン 酢酸ェチル（2 : 1)混合液（50ml)で洗浄した。真空ポンプで減圧乾 燥後、無色粉末の（S)—2—アミノー 3— (3' ーメトキシビフエ-ルー 4 ィル） プロ ピオン酸メチルエステル塩酸塩（20. 63g、 88%)を得た。
(S)—2 アミノー 3— (3' —メトキシビフエ-ルー 4—ィル）—プロピオン酸メチルェ ステル 塩酸塩の物理化学的性状
分子量 321
ESI (LC/MSポジティブモード） 286 (M—HC1+H+)
1H—NMR (メタノール d—4中）の化学シフト値 δ：
3.21(1H、 dd、 J=14.0Hzゝ 7.5Hz)、 3.32(1H、 dd、 J=14.0Hzゝ 6.5Hz)、 3.84(6H、 s)ゝ 4.37( 1H、 dd、 J=7.5Hzゝ 6.5Hz)、 6.92(1H、 ddd、 J=8.0Hz、 2.5Hzゝ 1.0Hz)ゝ 7.13(1H、 dd、 J=2 • 5Hz、 2.0Hz)ゝ 7.18(1H、 ddd、 J=7.5Hzゝ 2.0Hzゝ 1.0Hz)ゝ 7.33(2H、 d、 J=8.5Hz)ゝ 7.35( 1H、 dd、 J=8.0Hz、 7.5Hz)、 7.63(2H、 d、 J=8.5Hz)
試験例 1
Fusarium sp. F1476株の同定
概要
Fusarium sp. F1476株のコロニーの生育は、きわめて遅ぐバレイショ 'ブドウ糖寒 天培地 (PDA)上では明るい橙色で湿潤な分生子座を形成したり、堅く皺状で盛り上 力 Sり表面が綿毛状の菌叢を形成するなど多形であるが、表裏とも決して赤紫にはなら ない。このこと； 0らは、 Fusarium sp. F丄 476株力、 Fusarium merismoidesま 7こは F. aqu aeductuumなどであることが示唆された。 Fusarium sp. F1476株は、合成栄養寒天培 地（SNA)上では平坦でほぼ無色のコロニーを形成した。分生子は、分生子座上ま たは菌糸から直接立ち上がるフィアライド、あるいは培養後期に気中菌糸から立ち上 力 ¾ポリフィアライドの先端で形成され、その形状は、 0〜5隔壁、長さ 40 m以下、典 型的には三日月形で、先端が細長く延びることはない。分生子の基部は明瞭な足細 胞を有するか、截断痕状または鈍頭である。これらの顕微鏡下の形態的特徴から、 F usarium sp. F1476株力 ^Section Eupionnotesに属す nj"會 '性 ίま否疋 れ、 F. incarna t腹が候補となった。
[0152] 分子系統解析を行うために internal transcribed spacer (ITS) (図 5、 6)、 translatio n elongation factor 1 alpha (TEF 1— a ) (図 7、 8)、 intergenic spacer (1Gb) (図 9 、 10)の 3領域の塩基配列を調べたところ、 F1476株は Fusarium equiseti、 F. incarna turnと分子系統学的に近縁であり、特に、 F. incarnatumクレードに含まれ、 F. incarnat um CBS 678.77と最も近縁であることが分力つた。一方、 F. equisetiは分生子先端が 細長く伸びる特徴を有することなどから、 F1476株が F. equisetiに属する可能性は否 定された。
[0153] 以上の結果を総合して、 F1476株を Fusarium incarnatum (Roberge) Saccardoと同 定した。なお、 F. incarnatum CBS 678.77が、 F1476株と同じく化合物 1を産生したこ とによっても、この同定の妥当性が裏付けられた。
[0154] 材料および方法
使用した菌株
Fusarium sp. F1476株は 2000年 1月 24日に鎌倉巿鎌倉山南斜面にて採集され た落葉より 2000年 2月 29日に洗浄濾過法により分離した糸状菌である。後述するよ うに自然変異しやすぐ培養性状の異なるクローンが容易に出現する。ヘテロなコロ ニーを形成するクローンを org、橙色の分生子座をコロニー表面全体に作るクローン を wet、主として菌糸叢のみのクローンを fastと、場合によって称することとした。
[0155] 比較に用いた菌株は以下の通りで、いずれもオランダ中央菌類研究所 (Centraalbu reau voor Schimmelcultures, Utrecht (以下、「CBS」とも称する)）より分譲された菌株 である。 Fusarium equiseti (Corda) Sacc. CBS 107.07、 CBS 193.60、 CBS 307.94、 Fu sarium incarnatum (Rob.) Sacc. CBS 161.25、 CBS 145.44、 CBS 678.77。 CBS力ら分 譲された菌株の培養実験は、すべて、玉川大学において、奥田徹教授によってとり 行われた。
[0156] 形態的性状の観察
形態観察の方法と使用した培地は、主として Gerlach and Nirenberg (1982)および A oki (1998、 2003)に従った。すなわちよく生育したスラントから分生子もしくは菌糸断片 をバレイショ ·ブドウ糖寒天培地 (PDA)および合成栄養寒天培地（SNA)上に 3点植 菌し、暗黒下もしくは近紫外光照射下で 20°Cもしくは 25°Cで 1週間から 3週間（主と して 10日）培養し、培養性状を肉眼、実態顕微鏡下で観察し、色調はマンセルおよ びメトウェン記号で記載した。なお麦芽エキス寒天培地 (MA)、オートミール寒天培 地 (OA)、三浦培地 (LCA)などの培地も用いた。形態観察には主として PDAと SN Aを用いたが、ときにカーネーション葉寒天培地 (CLA)も用いた。フィアライドや分生 子の計測には Adobe Photoshop (ver 7.0、 Adobe Systems Inc.,)と汎用画像解析ソフ ト Optimas (ver 6.5、 Media Cybernetics Inc.,)を用いて、半自動測定を行った。
[0157] DNAの抽出
F1476株および CBSより分譲された F. equiseti、 F. incarnatumは PDA上で培養し 、 QIAamp DNA Mini Kit (株式会社キアゲン、東京)を用いて DNAを抽出した。
[0158] Internal transcribed spacer (ITS)領域の増幅には、 ITS4(TCCTCCGCTTATTG ATATGC、 SEQ ID No.l)プライマー、 ITS5(GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG, S EQ ID No.2)プライマー (White et al, 1990)を、 translation elongation factor 1 alpha ( TEF 1— a )領域の増幅には TEF1(ATGGGTAAGGA(A/G)GACAAGAC、 SEQ I D No.3)プライマー、 TEF2(GGA(G/A)GTACCAGT(G/C)ATCATGTT、 SEQ ID No. 4)プライマー (O' Donnell et al, 1998)を、 intergenic spacer (IGS)領域の増幅には CN L12(CTGAACGCCTCTAAGTCAG、 SEQ ID No.5)プライマー、 SCN1(GAGACAA GCATATGACTACTG、 SEQ ID No.6)プライマー (Kosiak et al, 2005)を用いた。増幅 した DNAは、 QIAamp Purification Kit (株式会社キアゲン、東京)を用いて精製した 。 Ifr製サンフノレは、 Big Dye Terminator v3.1 Cycle sequencing Kit (Applied Biosyste ms Japan,東京)と、上記各 6種のプライマーと、 IGS領域については新たに設計した I GS1(TCACCAATCACTAACTTCCTCTTCCG、 SEQ ID No.7)プライマー、 IGS2(T GGGATCCTCAGCTTTTTCTGCAT、 SEQ ID No.8)プライマーの合計 8種のプライ マーを用いてサイクルシークェンスを行い、精製した後、 Genetic Analyzer (ABI 310, Applied Biosystems Japan,東京)で DNA配列のシークェンスを行った。得られた F1 476株の ITS領域、 TEF 1— α領域、および IGS領域の配列を、それぞれ以下に 示した。 F1476株の IGS領城の配列（SEQ ID No.9)
GAGCTCTCCGGCGCCTT
F1476 の TEF 1 α領城の配列（SEQ ID No.10)
Figure imgf000050_0001
AGACGCTCCCGGTCCACCGTA
F1476株の ITS領城の配列（SEQ ID No.11)
[0162] 系統解析
得られたシークェンスデータは ClustalWでァライメントし、 PAUP (ver 4.0 betalO; S wofford 2000)を用いて、 TiZTv比を求め、重み付けを行った。その後、近隣結合法 および最大節約法で解析し、系統榭を作成して、ブートストラップ検定を行った。
[0163] F 1476株および CBS標準株の化合物 1の牛.産確認
F1476株と F. equiseti、 F. incarnatumの標準株合計 7株を、そば培地（250ml三角 フラスコ 1本につき、そば 10g、 SB溶液 10mlを含む。 SB溶液は Yeast extract (オリエ ンタル酵母) 100mg、酒石酸ナトリウム 50mg、 KH PO 50mg、 MgSO · 7Η O50mg
2 4 4 2
、 FeSO - 7H 05. Omg、 ZnSO · 7Η 05. 0 mg、脱塩水 1, 000ml力もなる）中、
4 2 4 2
各 2本ずつ 25°Cで 12日間静置培養した。
[0164] 培養物を n—ブタノール 20mlで抽出し、 300 μ 1を濃縮乾固し、等量のメタノールに 溶解して試料液とした後、下記分析条件 5に示した LCZMSの分析条件で用いて分 祈した。
[0165] 検出されたィ匕合物 1は、標品を下記分析条件 5に示した LCZMSの条件で分析し て得られたマスクロマトグラフィー（positive ion (M+H) : 660)のピーク面積値を用い た絶対検量線法にて定量した。
[0166] 分析条件 5
装置：島津高速液体クロマトグラフ質量分析計 LCMS-2010A
カラム： Shiseido C18 MGII, 2 mm X 75 mm, 3 m (資生堂社製）
移動相：以下に示した溶媒勾配溶出 A液:水（0. 1%蟻酸）
B液：ァセトニトリル（0. l%g 分 % B液
0 20
1 .0 20
20.0 80
26.0 80
27.0 20 流速： 0. 2mlZ分、温度： 40°C
恢出： Ionization; electrospray (ESI)
bean mode： selective ion method (SIM) (Positive, m/z =り (30.3, 592.1)
[0167] 次に F. incarnatum CBS 678.77を培養して得られた試料液を、下記分析条件 6に示 した TOF— MSの分析条件で用いて分析した。
[0168] 分析条件 6
装食： LC— MS Agilent 1100 series し hemStations system
LCQ Navigator system
カラム： Develosil Combi-RP, 3.0 x 50 mm, 5 ^ m (野村化学社製）
移動相：以下に示した溶媒勾配溶出
A液：水（0. 01%トリフルォロ酢酸）
B液：ァセトニトリル（0. 01%トリフルォロ酢酸） 分 % B液
0 15
0.7 15
1.3 35
2.6 35
4.5 55
6 82
6.8 82
7.2 98
8 98
8.1 15
10 15 流速： 1. 276mlZ分、温度 60°C
[0169] さらに同じく F. incarnatum CBS 678.7を培養して得られた試料液を、下記分析条件
7に示す分析条件で用 、て MS/MS分析し、化合物 1の標品から得られるスペクトル（ 図 2)と比較した。
[0170] 分析条件 7
装置、カラム、移動相、流速、温度:分析条件 6に同じ
MS/MS条件
イオンモード： ESI ポジティブ
ィオンスプレイ電圧： 5500 V
温度： 450°C
コリジョンエネノレギー： 25V
[0171] 結果
培養諸性状
Fusarium sp. F1476株のバレイショ 'ブドウ糖寒天培地（PDA)上での生育は遅ぐ 25°C、近紫外光照射下 10日で直径 10〜15mmに達し、生育率は 1. 5〜1. 6mm/ 日であった。 Fusarium sp. F1476株は、部分的に密集した堅い菌糸叢を形成し、そ の表面は皺状で盛り上がり、白色ないし薄いピンク色（マンセル 5YR-10YR9/2)を呈 し、周辺部はときに顕著に綿毛状の菌糸塊を形成した (fast部分と呼ぶ)。また一部に 湿った分生子座が集まり、色調は明るい橙色（杏色、 light orange, Light Apricotない し Apricot、マンセル 5YR7/6から 7/10、メトウェン 6A6から 6B8) (wet部分と呼ぶ)であつ 7こ。袅 [¾は、淡橙色； 9り橙色 (light orange ^ bright reddish orange ^ Tiger Lily、マンセ ル 5-10YR7/10、メトウェン 6B8から 8A6)を呈した力 表裏とも赤紫色にはならなかった 。暗所では、生育率は少し悪ぐ 0. 9〜1. 1mm/日であった。色調はより薄ぐページ ュ（pale beige, Ivory,マンセル 10YR9/2、メトウェン 4A3)色で、裏面は明るい赤味黄 色（light reddish yellow, Naples Yellow)であった。し力し、菌糸の色調が濃くなること もあり、黄土色から灰褐色（gold、 Golden Ocher、 light grayish brown, Blond,マンセ ル 10YR5/4-8、メトウェン 5E5-8)となり、その場合の裏面は喑黄褐色（栗皮色、 dark y ellowish brown, Burnt Umber,マンセル 10YR3/6)であった。いずれの場合も裏面も 赤紫色にはならなかった。
[0172] 上記の湿った分生子座を豊富に形成する部分 (WET部分)を継代すると、生育が 早くなり、 10日で直径 22〜27mmに達し、均質で平坦、ビロード状、粘液質の橙色の コロニーを形成するようになり、ときに黄色色素を培地中に作ることもあった。また FAS T部分を継代すると肉眼的に分生子座の橙色が認められなくなり、主として菌糸叢か らなる綿毛状あるいは粒状、粉状コロニーが形成され、コロニーは、 10日で 10〜16 mmに達しに。
Fusarium sp. F1476株の合成栄養寒天培地（SNA)上での生育は遅ぐ近紫外光 照射下 7日で直径 13mmに達し、生育率は 1. 6mmZ日であった。 Fusarium sp. F14 76株は、平坦で薄いコロニーを形成した。該コロニーは、フェルト状ないし羊毛状で あり、中央部分は湿った分生子座が点在しており、色調はベージュ色を呈した (pale beige, Ivory,マンセル 10YR9/2、メトウェン 4A3)。裏面も同色であった。喑所でも同 様の生育を示した。
[0173] WET部分を継代して SNA上で生育させたところ、コロニーは 10日で 14〜19mmに 達したが、ほかの培養性状にあまり変化はな力つた。 FAST部分は、 10日で 19〜20 mmと早い生育を示した。
[0174] Fusarium sp. F1476株の麦芽エキス寒天培地（MA)上での生育は遅ぐ近紫外 光照射下 11日で直径 11mmに達し、生育率は 1. OmmZ日であった。 Fusarium sp. F1476株は、密集した菌糸叢を形成し、菌糸叢は、盛り上がり、羊毛状ないしフェル ト状であった。色調は明るい橙色（light orange, Light Apricot,マンセル 5YR8/6、メト ゥェン 6A6)であり、裏面は輝橙色（bright orange, Nasturtium Orange,マンセル 5YR7 /12、メトウェン 6A7)であった。暗所では色調は淡色となった。
[0175] Fusarium sp. F1476株のオートミール寒天培地（OA)上での生育は早ぐ近紫外 光照射下 10日で直径 21mmに達し、生育率は 3. 7mmZ日であった。 Fusarium sp. F1476株は、平坦だが中央部分に多数の分生子座が密集した、粒状コロニーを呈 した。色調は明るい黄橙色（light yellowish orange, Maize,マンセル 5YR7/8、メトウェ ン 6B6)であり、裏面も同色であった。暗所での色調は淡色となった。
[0176] Fusarium sp. F1476株の三浦培地（LCA)上での生育は早ぐ近紫外光照射下 10 日で直径 25mmに達し、生育率は 3. 4mmZ日であった。 Fusarium sp. F1476株は、 平坦でうすいコロニーを形成し、コロニーは、粒状ないし綿毛状であり、中央部分は 湿った分生子座が点在しており、色調はベージュ色（pale beige, Ivory,マンセル 10Y R9/2、メトウェン 4A3)であり、裏面も同色であった。暗所でも同様の生育を示した。 形態的性状
SNA上では、分生子柄は主に気中菌糸力 垂直に立ち上がり、分岐することがあ る。その分枝あるいは分生子柄に直接フィアライドが 2から 8個輪生した。分生子柄や フィアライドからなる分生子形成構造は、ときに分生子座を形成する複雑な構造を示 した。またコロニーの周辺部分では、分生子柄を形成することなぐ気菌糸上に直接 フィアライドが単生もしくは輪生した。寒天表面上を這う菌糸から分生子が形成される こともあった。とくに 2週間以上培養すると、分生子形成細胞は、分生子の形成過程 で伸長あるいは膨張し、 1細胞で複数個の分生子傾性部分を生ずるポリフィアライド（ もしくはメソ分生子形成細胞）となった。分生子柄は、 10〜30 /ζ πιの長さとなった。フ ィァライドは、円筒形、ペン軸形、とっくり形などであり、その先端には通常顕著なカツ プ構造を有していた。ポリフィアライド (もしくはメソ分生子形成細胞）は上部に 2〜5個 の開口部を生じていたが、カップ構造は顕著ではな力つた。分生子形成細胞 (フィァ ライド、ポリフィアライド）では、そのサイズは、単生のものでは wet部分が (8.5)10.5-24. 5(36.5) X 2.5-3.0(3.5) m (平均 17.5 x 3.0 μ m)、 L/W (2.75)3.10-9.70(16.25) (平均 6.4)、 fast部分は (7.0)9.5— 25.0(28.0) x 2.5—3.0(3.5) μ m (平均 17.0 x 3.0 μ m)、 L/W ( 2.78)3.31-8.77(10.0)(平均 6.04)であった。特に分生子座を形成する密に輪生した分 生子形成細胞では、そのサイズは、 wet部分が (6.0)8.0- 14.0(19.0) x 2.5-3.5 m (平 均 11.0 X 3.0 μ m) , L/W (2.00)2.38- 5.06(7.56) (平均 3.72)、 fast部分は (8.5)9.0- 12.5 (14.0) x (2.5)3.0-3.5 μ m (平均 11.0 x 3.0 μ m)、 L/W (2.5)2.85— 4.33(5.0) (平均 3.59) であった。分生子は、フィアライドの先端に粘液質で塊状に集合して形成され、典型 的には三日月形でときに長楕円形ないし円筒形となり、先端は顕著に細長く延びるこ とはない。分生子の基部は明瞭な足細胞を有するか、截断痕状または鈍頭である。 また、通常分生子は 2— 4隔壁を有する力 隔壁がないあるいは 1または 5隔壁を有 することがあった。分生子のサイズは、 wet部分の 3隔壁分生子では (18.5)23.5- 29.0(3 2.5) x (3.0)4.0-5.5(6.5) μ m (平均 26.5 x 5.0 m)、 L/W 4.19- 8.39 (平均 5.52)、 4隔 壁分生子では 27.0- 30.0(32.5) x (3.0)3.5-5.5(6.0) m (平均 28.5 x 4.5 μ m)、 L/W 4. 65-8.88 (平均 6.48)、 fast部分の 2隔壁分生子では 16.0-19.0 x 2.5-3.0 m (平均 17. 5 X 2.5 m)、 L/W 6.45- 6.84(平均 6.64)、 3隔壁分生子では (15.5)22.0- 28.0(33.5) x (2.5)3.0-5.0(5.5) μ m (平均 25.0 x 4.0 μ m)、 L/W 4.42-10.30 (平均 6.55)、 4隔壁分 生子では (25.0)26.0- 31.5(37.0) x (3.0)4.0-5.5(7.0) μ m (平均 29.0 x 4.5 μ m)、 L/W 4 .45-9.41 (平均 6.4)、 5隔壁分生子では 27.5- 33.0(35.5) x (3.0)4.0-5.5(6.0) m (平均 30.5 X 5.0 μ m)、 L/W 4.87-8.81 (平均 6.54)であった。菌糸上には典型的な粗面の 厚膜胞子の形成は認められな力つたが、空洞化肥厚したほとんど平滑で亜球形の細 胞が、菌糸の先端もしくは中間に 1細胞または数細胞が連鎖した形状で形成され、そ のサイズは、 (5.5)8.5-15.0(15.5) x (5.0)6.0—13.5(14.0) μ m (平均 11.5 x 9.5 m)、 L/ W 1.04-1.45(1.61) (平均 1.24)であった（図 3および図 4参照）。なお、例えば、「(5.5)8 .5-15.0(15.5)」は、「通常は 8.5-15.0の範囲であるが、 5.5—15.5まで拡大されることもあ る」を意味する。
[0178] DNA塩基配列による系統解析
得られた ITS領域の塩基配列 (466bp)を BLAST検索した結果、 F1476株は F. equ iseti、 F. incarnatumと相同性が高いことが分かった。そこで系統解析には、 F1476 株と CBSの標準株、 F. equiseti 3株と F. incarnatum 3株の他、 BLAST検索で相同 性が高力つた 14株の登録データを用いた。近隣結合法 ·最大節約法で系統解析し た結果 (図 5、 6)、 F1476株は F. equiseti, F. incarnatumとクレードを形成した（ブート ストラップ値： 100)。
[0179] TEF 1 α領域（677bp)の系統解析は、 CBSの標準株の他、 BLAST検索で相 同性が高力つた 15株の登録データを用いた。近隣結合法での解析の結果（図 7)、 F 1476株は F. incarnatumとともに F. equisetiクレードの外に位置することが分かった。 最大節約法での解析の結果でも（図 8)、 F1476株は F. incarnatumクレードに含まれ た。
[0180] Intergenic spacer (IGS)領域 (2358bp)の系統解析は、 CBSの標準株の他、 BLAS T検索で相同性が高力つた 6株の登録データを用いた。近隣結合法での解析の結果 (図 9)、 F1476株は F. incarnatumとともに F. equisetiクレードの外に位置することが 分かった。最大節約法での解析の結果でも（図 10)、 F1476株は F. incarnatumタレ ードに含まれた。
F 1476株および CBS標準株の化合物 1の生産確認
LCZMSでの分析の結果、 F1476株と F. incarnatum CBS 678.77を培養して得ら れた試料液中には、化合物 1の標品と比較して、 M+H値と RTがー致するマスク口マト グラフィ一のピークが観察された。しかし!7, incarnatum CBS 678.77を除く CBS標準 株 5株の培養抽出物中には化合物 1は検出されなかった（ND)。なお、 F. incarnatu m CBS 678.77の化合物 1の生産量は定量限界以下 (tr)であった。結果を表 11とし てまとめた。
表 1 1 化合物 1の生産性
Figure imgf000057_0001
化合物 1の物理化学的性状
分子量 659
ESI (LCZMSポジティブモード） m/z = 660 (M+H)
分析条件 5における化合物 1の RT 22. 3±0. 1分
TOF— MSでの分析の結果、表 12に示した分子式を得た。この分子式は、化合物 1のものと一致した。
表 1 2 試料液中の化合物の分子式
Formu la Calculated m/z (amu) PMM Error
660.3742 0.7208 [0183] MSZMSでの分析結果を図 11に示した。化合物 1の標品力 得られたスペクトル と比較し一致することを確認した。
[0184] 以上より、 F. incarnatum CBS 678.77は、化合物 1を生産することが示された。
[0185] 考察と同定
F1476株は生育がきわめて遅ぐ PDA上で粘液質ビロード状の鮮やかな橙色のコ 口-一を形成したり (wet部分)、堅く不規則な外形の主として菌糸叢力 なるコロニー を形成した (fast部分)。継代を続けると次第に両者の性質が分離し、生育が早まる傾 向があった。これらの肉眼的に差異のあるクローンを単離して ITS領域と TEF 1— α領域の塩基配列の相同性を調べたところ、完全に一致していたことから、これらの クローンは分子系統分類学上は同一と考えた。
[0186] F1476株の生育が遅く橙色の平坦なコロニーを形成することからは、 F. merismoid esや Fusanum aquaeductuum (Rabenn. & Radk.) ¾acc.などの section Eupionnotes力 21 候補にあげられた。し力 顕微鏡下ではポリフィアライドを形成する点、 ITS領域の塩 基配列の相同性力 BLAST検索し、近隣結合法 ·最大節約法で系統解析して得ら れた結果 (図 5、 6)、そして F1476株が、 F. merismoidesなどからは遠ぐ F. equiseti、 F. incarnatumとクレードを形成（ブートストラップ値： 100)することから、 F1476株が、 少なくとも Section Eupionnotesであることは否定された。次に TEF 1— α領域（677b P)を用いて系統解析を行い、近隣結合法での解析の結果 (図 7)、 F1476株は F. inca rnatumとともに F. equisetiクレードの外に位置することが分かった。特に、 F. incarnatu m CBS678.77と最も近縁であることが分かった（ブートストラップ値: 66)。さらに、 IGS 領域 (2358bp)の塩基配列を用 、た最大節約法での解析の結果 (図 10)においても、 F 1476株は F. incarnatumクレードに含まれており、かつ、 F. incarnatum CBS678.77と 最も近縁であることが分力つた。
[0187] 一方、 F1476株のように分生子形成細胞の一部が伸張し分生子形成部位を複数 つくるポリフィアライドもしくはメソ分生子形成細胞を形成する Fusariumには、 F. avena ceum (Fr.) Sacc.、 F. chenopodinum (Thum.) Sac F. chlamydosporum Wollenw. & R einking、 F. incarnatum (=F. pallidoroseum (Cke) Sacc.、 F. semitectum Berk. & Rave nel)、 F. sporotrichioides Sherb、 F. subglutinans (Wollenw. & Reinking) P.E. Nelson, Toussoun & Marasasなどがあるが（Pascoe 1990)、分生子が著しく小さいか、分生子 先端が細長く延びるか、菌糸または裏面色素が赤紫となることを特徴とすることなど から、 F1476株が F. incarnatum以外であることは否定され、これは、分子系統学的 データとは矛盾しな力つた。また TEF 1— α領域と IGS領域の塩基配列から近縁と される F. equisetiは、ポリフィアライドを形成せず、分生子先端が特徴的に伸張し、 4 隔壁以上の分生子の長さが 40 μ mを超える点で明らかに F1476株とは異なる。以上 の培養性状、形態的特徴、分子系統分類学的結果、さらに化合物 1の生産性から、 生育が著しく遅い点が異なる力 本菌 F1476株を、 Fusarium incarnatum (Roberge) ¾accardoと I £し 7こ。
[0188] F. incarnatumは、 Gerlach and Nirenberg (1982)によれば!7, semitectumとされ、 2 つの変種、 var. semitectumと F. semitectum var. majus Wollenw.力 S知られている。後 者は分生子の隔壁が多く（0〜9隔壁)、大きさもそれにつれて大きくなる特徴がある。 この 、で i Fl4 标 ί¾、 F. semitectum var. semitectumの方力より近い。 Booth and Sutton (1984)は F. semitectumの 2変種を同一として F. pallidoroseumの名称を用いた 、 Nirenberg (1990)は F. incarnatum力 F. semitectum var. majusに对 J iす とした。 また先に述べたとおり歴史的には F. semitectumには 2変種があった力 Pascoe (1990 )は 2変種を一つに統合して F. pallidoroseumとした。続いて Nirenberg (1990)は統合 は認めたが、命名法上 F. incarnatumがより早く優先権があるので F. pallidoroseumを 異名とした。 2つの変種を認めるか認めないかにより命名法上の問題力も F. incarnat umをとるか F. pallidoroseumをとるかはまだ議論の余地がある（Khoa et al 2004) 0今 回比較に用いた CBSの標準菌株の中でもっとも系統的に近縁だったものは CBS 678 .77である。この ¾株 ίま Matsushima (1975)により Pseudofusanum semitectum (Berk. & Ravenel) Matsush.として三重県津巿の土壌から分離記載された株である。その他の F . incarnatumの標準株は、 CBS 161.25がオーストラリア、 CBS 145.44は出所不明だが 日本とは考えられないので、 F1476株が同じくわが国由来の F. incarnatum CBS 678 .77と系統的に非常に近縁であるのはもつともである。このことは、 F1476株力 CBS 678.77株と同じく化合物 1を産生したことによつてもサポートされる。
[0189] なお、本同定に当たっては、以下の文献を引用した： Aoki T and O'Donnell K. 1998. Fusarium kyushuense sp. nov. from Japan. Mycos cience 39: 1一 6.
Aoki T， O'Donnell K， Homma Y， and Lattanzi AR. 2003. Sudden-death syndrome of soybean is caused by two morphologically and phylogenetically distinct species wi thin the Fusarium solani species complex― F. virguliforme in North America and F. tucumanae in South America. Mycologia 95: 660—684.
Booth C and Sutton BC. 1984. Fusarium pallidoroseum, the correct name for F. se mitectum auct. Trans. Br. My col. Soc. 83: 702-704.
Gerlach W and Nirenberg H. 1982. The genus Fusarium - a pictorial atlas. Mitt. Biol. Bundesanst. Land- u. Forstwirtsch. Berlin— Danlem 209:1—406.
Khoa LV, Hatai K and Aoki T. 2004. Fusarium incarnatum isolated from black tige r shrimp, Penaeus monodon Fabricius, with black gill disease cultured in Vietnam. J Fish Diseases 27: 507-515.
Kosiaka EB, Hoist— Jensena A, Rundbergeta T， Jaenb MTG and Torpa M. 2005. M orphological, chemical and molecular differentiation of Fusarium equiseti isolated fro m Norwegians. International Journal of Food Microbiology. 195—206.
Matsushima K. 1975. Icones Microfungorum A Matsushima Lectorum. Pub by the a uthor, Kobe.
Nirenberg HI. 1990. Recent advances in the taxonomy of Fusarium. Studies in My cology. 32: 91-101.
O'Donnell K， Kistler HC， Cigelni E and Ploetz RC. 1998. Multiple evolutionary or igins of the fungus causing Panamadisease of banana: concordant evidence from nucl ear and mitochondrial gene genealogies. Proceedings of the National Academy of Sci ence, USA 95: 2044-2049.
Pascoe Iu. 1990. Fusarium morphology I: identification and characterization of a t hird conidial type, the mesoconidium. Mycotaxon 37: 121—160.
SwoiFord DI. 2000. PAUP, phylogenetic analysis using parsimony, ver 4.0 betal0、 S inauer Associates Inc. Publishers, Sutherland, MA. White TJ， Bruns T， Lee S and Taylor JW. 1990. Amplification and direct sequenci ng of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In PCR Protocols: A guide to m ethods and application, Academic Press, New York, 315—322.

Claims

請求の範囲
[1] 式 (1)
Figure imgf000062_0001
〔式中、 Aは、水素原子、炭素数 1〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖状 のアルキニル基、
Figure imgf000062_0002
置換されていてもよいァリール基、または置換されていても よいへテロアリール基を表し；
ここで R1は、水素原子、炭素数 1〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素 数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖 状のアルキ-ル基、炭素数 3〜8のシクロアルキル基、置換されていてもよいァリール 基、置換されていてもよいへテロアリール基、置換されていてもよいァラルキル基、ま たは置換されて 、てもよ 、ヘテロァリールアルキル基を表す。〕
で示される化合物または製薬上許容されうるそれらの塩を生物学的に製造する方法 であって、
式 (2) :
Figure imgf000062_0003
で表される化合物を産生できる能力を有する糸状菌株の菌体または培地 Z培養液 中に式（3) :
Figure imgf000063_0001
〔式中、 Aは、上記式（1)の化合物と同じ定義を意味し; Rは、水素原子、炭素数 1〜 8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のァ ルケニル基、または炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表す〕 で表されるアミノ酸誘導体またはその塩を添加して、該菌株に直接、上記式（1)の化 合物を産生させることを特徴とする方法。
[2] 式（3)のアミノ酸誘導体またはその塩の R力 メチル基である、請求項 1記載の製造 方法。
[3] 式（3)のアミノ酸誘導体またはその塩が、式（3)の化合物の塩酸塩である、請求項 1 または 2記載の製造方法。
[4] Aが、置換されて!、てもよ 、フエニル基または炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖状 のアルキニルォキシ基である、請求項 1〜3の 、ずれか 1項記載の製造方法。
[5] 式 (2)の化合物を産生する菌株が、 F1476株または当該菌株と分類学的もしくは 遺伝学的に同等な菌株、またはそれらの変異株である、請求項 1〜4のいずれか 1項 記載の製造方法。
[6] 式（2)の化合物を産生する菌株が、以下の a)および b)から選択される、 1以上の特 徴を有している菌株、またはそれらの変異株である、請求項 1〜4のいずれか 1項記 載の製造方法。
a)歯株力、 Fusarium incarnatumに J¾する »、もしくは Fusanum incarnatumと同等 の形状を示す；
b)菌株の遺伝子の ITS領域の配列が、 Fusarium sp. F1476株のそれと、 99%以 上相同する。
[7] 式（2)の化合物を産生する菌株力 Fusarium sp. F1476株、またはその変異株で ある、請求項 1〜4のいずれか 1項記載の製造方法。
[8] 式 (3) :
Figure imgf000063_0002
〔式中、 Aは、請求項 1の式（1)の化合物と同じ定義を意味し; Rは、水素原子、炭素 数 1〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖 状のアルケニル基、または炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表 す〕
で表されるアミノ酸誘導体またはその塩の培地添加物としての使用。
式 (3' ) :
Figure imgf000064_0001
〔式中、 Aは、請求項 1の式（1)の化合物と同じ定義を意味する。〕
で表されるアミノ酸誘導体またはその塩。
式 (3) :
Figure imgf000064_0002
〔式中、 Aは、請求項 1の式（1)の化合物と同じ定義を意味し; Rは、水素原子、炭素 数 1〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖 状のアルケニル基、または炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表 す〕
で表されるアミノ酸誘導体またはその塩を含む培地添加物。
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