JPH01157396A - Ｄ−リボースの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、発酵法によるＤ−リボースの製造法に関する
。

従来の技術 Ｄ−リボースは、リポ核酸の構成成分としてすべての生
体に含まれ、又その還元型誘導体であるリビトールは、
ビタミンＢ２や細胞壁構成体であるリビトールタイコン
酸の構成成分として含まれ、生理的にもきわめて重要な
物質である。

一方、Ｄ−リボースは、従来からビタミンＢ２の合成原
料として使用され、近年では核酸系調味料などの合成原
料としても使用され脚光をあび、これを安価にかつ大量
に製造することは工業上きわめて意義深いことである。

これまでＤ−リボースの製造法としては、天然物中から
抽出単離する方法、フランやグルコースなどを原料とし
て合成する方法、あるいは微生物による発酵法などが知
られている。（特公昭４７−７９４８号公報、特開昭４
９−２０３８８号公報参照） 発明が解決しようとする問題点 前記したいずれの方法も製造工程が煩雑であったり、原
料が高価であったり、あるいはグルコン酸を副生じて収
率が低かったりなどの欠点を有し、工業的に安価にＤ−
リボースを製造する方法としては必ずしも満足できるも
のではない。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、バチルス属細菌を用いた発酵法による収
率の高いＤ−リボース製造法を確立するために種々検討
を重ねた結果、Ｄ−リボース生産能を有するバチルス属
菌を培養するに際し、培養培地中の芳香族アミノ酸量を
制禦することにより、著量のＤ−リボースを生成するこ
とを見い出し、この知見に基づいてさらに研究した結果
本発明を完成した。

すなわち本発明は、バチルス属に属し、Ｄ−リボース生
産能を有する微生物を、その生育に必要な栄養源を含む
培地に培養し培養物中にＤ−リボースを生成蓄積させる
に際し、培地中のし一トリプトファンおよびＬ−チロシ
ンの濃度をそれぞれ３γ／ｍｌ以下および１０γ／ｍｌ
以下に制禦することを特徴とするＤ−リボースの製造法
に関する。　本発明方法において用いられるバチルス（
Ｂａｃ　ｉ　ｌ　１ｕｓ）属に属し、Ｄ−リボース生産
能を有する微生物としては、例えばバチルス・プミルス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｕｍｉｌｕｓ）またはバチルス
・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）
に属する微生物が挙げられ、更に具体的にはバチルス・
プミルスＮｏ、　５０３（ＩＦＯ１２６００，ＡＴＣＣ
２１３５６）、Ｎｏ、５．３７（ＩＦＯ１２６０１，Ａ
ＴＣＣ２１３５７）、Ｎｏ、５５８（ＩＦＯ１２６０２
，ＡＴＣＣ２１３５８）、Ｎｏ、７１６（ＩＦＯ１３３
２２、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−８１２，ＡＴＣＣ２１９５１
）、Ｎｏ、９１１（ＩＦＯ１３５６６、ＦＥＲＭＰ−２
２６０，ＡＴＣＣ３１０９５）、Ｎｏ、１０２７（ＩＦ
Ｏ１３５８５，ＦＥＲＭ　　Ｐ−２４６６、ＡＴＣＣ３
１０９８）、Ｎｏ、１０８３（ＩＦＯ１３６２０，ＦＥ
ＲＭ　　Ｐ−２８３２，ＡＴＣＣ３１０９３）、バチル
ス・ズブチリスＮｏ。

４２９（ＩＦＯＬ２６０３．ＡＴｃｃ　　２１３５９）
、Ｎｏ、４８３（ＩＦＯ１２６０４，ＡＴＣＣ２１３６
０）、Ｎｏ−６０８（ＩＦＯｌ　３３２３．ＦＥＲＭ　
　Ｐ−１４９０，ＡＴｃｃ　　２１９５２）、Ｎｏ、９
５７（ＩＦＯ１３５６５，ＦＥＲＭ　　Ｐ−２２５９、
ＡＴＣＣ３１０９６）、Ｎｏ、９４１（１ＦＯ１３５７
３，ＦＥＲＭ　　Ｐ−２３６０，ＡＴＣｃ　　　３１０
９７）、　Ｎｏ、１０５４（ＩＦＯ１３５８６、ＦＥＲ
Ｍ　　Ｐ−２４６７、ＡＴＣＣ３１０９１）、Ｎｏ、１
０６７（ＩＦＯ１３５８８，ＦＥＲＭ　　Ｐ−２４６８
，ＡＴＣＣ３１０９２）、Ｎｏ。

１０９７（ＩＦＯ１３６２１，ＦＥＲＭ　　Ｐ−２８３
３、ＡＴＣＣ３１０９４）などが挙げられる。

上記ＩＦＯ番号は、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）の受
託番号を、ＦＥＲＭ番号は、通商産業省工業技術院微生
物工業技術研究所（ＦＲＩ）の受託番号を、ＡＴＣＣ番
号はジ・アメリカン・タイプ・カルチャー　−：ｌ　Ｌ
／クション（Ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕ
ｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ａ　Ｔ　ＣＣ、
米国）の受託番号をそれぞれ示す。

上記微生物において、バチルス・プミルス及びバチルス
・ズブチリスの菌学的性質は、バージズ・マニュアル・
オブ・デターミナテイブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇ
ｅｙ’ｓ　　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）第８版第５２９
頁〜第５３４頁に記載のそれらと同じである。但し、胞
子形成能に関しては、変異処理により欠失させたものも
含まれている。

本発明方法において用いられる微生物は、生育に芳香族
アミノ酸（Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン及びＬ−
フェニルアラニン）を要求するバチルス属細菌、及びト
ランスケトラーゼ及びＤ−リブロース−５−ホス７エー
トー３−エピメラーゼの少なくとも一方を欠損したバチ
ルス属細菌、更に前記バチルス属細菌の胞子形成能欠損
株、更に前記バチルス属細菌の２−デオキシ−Ｄ−グル
コースの酸化活性の高い株である。該微生物は、その生
育に上記芳香族アミノ酸を必要とするが、その量が多す
ぎると十分に生育した後、Ｄ−リボースを生成蓄積する
と同時にグルコン酸の副生成が増大する。本発明におい
ては培養時における培地中の芳香族アミノ酸のうち■、
−トリプトファン濃度を３γ／ｍｌ以下、とりわけ１γ
／ｍｌ以下、Ｌ−チロシン濃度を１０γ／ｍｌ以下、と
りわけ５γ／ｍα以下に制禦し、さらにＬ−７ェニルア
ラニン濃度を５０〜４００γ／　ｍ　Ｑ＋とりわけ１０
０〜２００γ／ｍＯ，に制禦することにより副生物の生
成を減少させることができる。

すなわち本発明においては、前記微生物をその生育に必
要な栄養源を含む培地で十分に生育させた後、培地中の
Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファンおよびＬ−フェニル
アラニン濃度を前記濃度範囲になるように制禦すればよ
い。

一般に、Ｄ−リボースを大量に培養法で発酵生産する場
合には種培養および主培養からなる二段階培養が行われ
るが、本発明においては種培養により菌を十分生育させ
る際には必ずしも前記芳香族アミノ酸量を制禦する必要
はなく、主培養において培地中の該芳香族アミノ酸濃度
が前記範囲に制禦されておればさしつかえない。

該制禦法としては、あらかじめ該芳香族アミノ酸を前記
濃度範囲内で含む培地を用いるか、もしくは、含まない
培地に前記濃度範囲内になるように該芳香族アミノ酸を
添加してやればよい。

培地としては、各種栄養原理ち炭素源、窒素源などが使
用され、該炭素源としては、例えばＤ−グルコース、Ｄ
−フラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ソルビトール、
Ｄ−マンニトール、シュークロース、糖蜜、澱粉加水分
解物、澱粉、酢酸、エタノ゛−ルなどが挙げられる。

該窒素源としては、コーンステイープリカー、綿実粕、
酵母エキス、乾燥酵母、フィツシュミール、肉エキス、
ペプトン、カザミノ酸、その他の含窒素有機資源、アン
モニア水、アンモニアガス、硫酸アンモニウム、硝酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウム、炭酸アンモニウム、リ
ン酸アンモニウム、硝酸ナトリウムなどの無機窒素化合
物のほか、尿素、アミノ酸などの有機窒素化合物が使用
されるが、なかでもコーンステイープリカーが有利に使
用される。

さらに詳述すると、その水分含量が５０％である場合、
Ｌ−トリプトファンを含まず、Ｌ−チロシンおよびＬ−
７エニルアラニンをそれぞれ約０゜０４％（Ｗ／Ｗ）以
下、約０．５〜０．７％（Ｗ／Ｗ）含むコーンステイー
プリカーを窒素源として培地に対して約２〜２．５％（
Ｗ／Ｗ）添加する方法が効果的である。

該コーンステイープリカーは、たとえば後述する参考例
の方法に準じて得られる。

又培地には、これらの炭素源や窒素源のほか、用いられ
る微生物の生育に必要な種々の金属、ビタミン、アミノ
酸類などが適宜添加される。

培養条件、即ち培養温度、培地のｐＨ，培養時間などは
特に限定されないが、培養温度は一般的には約１８ない
し４５℃、更に好ましくは約２５ないし４０°Ｃである
。また、本発明の芳香族アミノ酸濃度において、Ｌ−チ
ロシンが約８γ／ｍα以上、Ｌ　７ｘニルアラニンが約
３００γ／ｍｌ以上である場合には約３５°Ｃ以上で培
養するのが好ましい。培地のｐＨは一般的には約４．５
ないし９であり、更に好ましくは約５．５ないし８であ
り、培養時間は一般的には約１８ないし１８０時間であ
り、更に好ましくは約３６ないし１２０時間である。生
成蓄積されたＤ−リボースを培養液中から採取するには
、従来公知のＤ−リボースの分離、採取法が採用される
。例えば、培養液をろ過又は遠心分離することにより、
菌体を除去した後、菌体除去液を活性炭処理、イオン交
換樹脂処理等により脱色、脱塩後濃縮し、濃縮液にエチ
ルアルコールなどの有機溶媒を添加して結晶化するのが
良い。この場合、培養成績中に目的とするＤ−リボース
以外の炭水化物が含有される場合は、グルコースオキシ
ダーゼで処理するか、酵母あるいはＤ−リボースを資化
せず該炭水化物を資化する菌株で処理することにより、
これを培養成績体から除く方法が採用される。

犬Ａ男 以下に実験例、実施例および参考例を挙げて本発明を具
体的に説明するが、これらにより本発明の内容が限定さ
れるものではない。

なお、培地中の「パーセント（％）」は特にことわりの
ない限り「重量／容量パーセント（Ｗ／Ｖ％）」を示す
ものとする。

実験例 後述する実施例１の方法において、主培養で用いるコー
ンステイープリカー（以下Ｃ５Ｌと略称することもある
）を第１表に示すアミノ酸組成のもの（Ｌｏｔ　Ｎｏ、
　１〜４）におきかえて、芳香族アミノ酸を培地にさら
に添加した場合もしくは無添加の場合のＤ−リボース及
びグルコン酸の生成量を第２表に示す。

なお、Ｄ−リボースの生成量はメソッズ・イン・カーボ
ハイドレート・ケミストリー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　１ｎ
Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第１
巻、第４８４頁（１９６２）に記載されているオルシノ
ール法に準じて測定した。

（以　下　余　白） 第１表 ＊水分含量約５０％（ｗ／ｗ）のＣ３Ｌ中のアミノ酸含
量このように、培地中の芳香族アミノ酸濃度を制禦する
ことにより、通常芳香族アミノ酸を制禦しない場合には
約３０〜５０ｍｇ／ｒｒｌ蓄積するグルコン酸の生成量
を約５〜２０ｍｇ／ｍ（２に制禦し、Ｄ−リボースの生
産量を増大させることが出来る。

実施例１ バチルス・プミルスＮｏ、７１６（ＩＦＯ１３３２２、
ＦＥＲＭ　　ＢＰ−８１２，ＡＴＣＣ２１９５１）４１
ソルビト一ル２％、コーンステイープリカー（第１表に
示すＬｏｔ、Ｎｏ、　４　）２％、リン酸二カリウム０
．３％、リン酸−カリウム０．１％からなる培地ｌＯＱ
に接種し、３６°Ｃ９２４時間９通気撹拌培養し、これ
を種としてＤ−グルコース２０％、コーンステイープリ
カー（第１表に示すＬｏｔ、Ｎｏ、　４　）２．６％、
硫酸アンモニウム０．７％、炭酸カルシウム２，０％、
硫酸マンガン０．００５％からなる培地１００Ｑに接種
した。これを３８°Ｃ！、５５時間通気撹拌培養（通気
量：　ｌ　ＯＯ１２／ｍｉｎ、。

撹拌数：　２１　Ｏｒｐｍ）したところ、Ｄ−リボース
が９２．１ｍｇ／ｍＱの割合で蓄積した。このＤ−リボ
ース発酵液からろ過により菌体を除去した後、約半量に
まで濃縮し約１／４量のエタノールを加え沈澱物を除去
した後、カチオン及びアニオン交換樹脂で脱塩後、活性
炭カラムを通過させて脱色した。この脱色液を濃縮して
、これに約４倍量のエタノールを加えＤ−リボース結晶
８　、４　ｋｇを得た。

これに対しＣＳ　Ｌ　ｌｏｔ、Ｎｏ、　ｌを用いて同様
に培養した場合は、Ｄ−リボースの蓄積は５５時間で６
ｋｇに過ぎなかった。

実施例２ バチルス・プミルスＮｏ、７１６株（ＩＦＯ１３３２２
、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−８１２，ＡＴＣＣ２１９５１）ｔ
−ソルビトール２％、コーンステイープリカー（第１表
に示すＬｏｔ　Ｎｏ、４）２％、リン酸二カリウム０．
３％、リン酸−カリウム０．１％からなる培地１０ｆｆ
に接種し、３７°Ｃ１２４時間通気撹拌培養し、これを
種としてＤ−グルコース２２％、コーンステイープリカ
ー（第１表に示すＬｏｔＮｏ、４）２．６％、硫酸アン
モニウム０．５％、炭酸カルシウム２．０％、硫酸マン
ガン０．００５％からなる培地１００αに接種し、４０
°Ｃ１７２時間通気撹拌培養（通気量：　ｌ　ＯＯＱ／
　ｍｉｎ、、撹拌数：２１０　ｒｐｍ）した。培養終了
液にＤ−リボースが９０．６ｍｇ／ｍ１２の割合で蓄積
した。この培養液を実施例１と同様に処理してＤ−リボ
ース結晶８　、３　ｋｇを得た。これに対しコーンステ
イープリカー（第１表に示すＬｏｔ、Ｎｏ、４）を２．
６％用いて、サラにＬ−チロシンをｏ、ｏｏｉ％添加し
、同様に培養した場合、Ｄ−リボースの蓄積量は５７時
間で５．６ｋｇにとどまった。

実施例３ バチルス・プミルスＮｏ、７１６株（ＩＦＯ１３３２２
、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−８１２，ＡＴＣＣ２１９５１）を
ソルビトール２％、コーンステイープリカー（第１表に
示すｔｏｔ、　Ｎｏ、４）２％、リン酸二カリウム０．
３％、リン酸−カリウム０．１％からなる培地１０１２
に接種し、３７°Ｃ１２４時間通気撹拌培養し、これを
種としてＤ−グルコース２０％、コーンステイープリカ
ー（第１表に示す１、ｏｔ、　Ｎｏ、４）２．６％、硫
酸アンモニウム０．５％、炭酸カルシウム２．０％、硫
酸マンガン０．００５％からなる培地１００１２に接種
し、３７°Ｃ２７２時間通気撹拌培養（通気量：　ｌ　
ＯＯＬ’ｍｉｎ、、撹拌数：２１０　ｒｐｍ）Ｌ、た。

培養終了液にＤ−リボース９５．２ｍｇ／ｍ４の割合で
蓄積していた。この培養液を実施例１と同様に処理して
Ｄ−リボース結晶８．５ｋｇを得た。又コーンステイー
プリカーＬｏｔ。

Ｎｏ、４を２．６％もちいて、さらにフェニルアラニン
を０．０１％添加し、上記と同様に培養した場合、Ｄ−
リボース８フｍｇ／ｍＱ蓄積しＤ−リボース結晶８　、
３　ｋｇを得た。これに対しコーンステイープリカーＬ
ｏｔ、　Ｎｏ、４を２．６％用いて、さらにＬ−チロシ
ンを０．００１％添加し、同様に培養した場合、Ｄ−！
Ｊポースの蓄積量は５７時間で５．６ｋｇに止まった。

参考例 アメリカ産イエローコーンを１トンあたり１゜２倍量（
ｖ／ｗ）の０．１５％二酸化イオウ水溶液に５３°Ｃ９
４８時間浸漬し、常法により分離して下記組成のＣＳＷ
を得た。

全窒素（ＴＮ）　　：０．９４％ ＮＨ，−Ｎ／ＴＮ　　：２．７％ ｐＨ：　　　４．１ 還元Ｉ！（Ｒ５）：　　　２．Ｏ％ 固形分（ＤＳ）：　　１０．０％ 得られたＣ３Ｗ３０１２を４５℃に保ちながら２４時間
エイジングした結果、ＮＨ，−Ｎ／ＴＮ　：：４．６％
、Ｒ５：０．８％、ｐＨ：３．８となった。

該Ｃ８Ｗに２８％水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐ
Ｈ４，４に調整後、４５°Ｃに保ちながらゆるやかに２
５時間撹拌してＮＨ，−Ｎ／ＴＮが７．５％となるまで
消化させた後、３５％塩酸を加えてｐＨを４．２に調整
後、４５℃でゆるやかに４７時間撹拌しなからＮＨ，−
Ｎ／ＴＮが約１２．２％になるまで消化させ、ついで３
５％塩酸を加えてｐＨ４，０に調整し消化を停止させた
。

得られたＣ８Ｗを水分含量が約５０％になるまで常法に
より減圧濃縮して下記組成のＣ３Ｌ７．ＯＱを得た。

ＴＮ：４．Ｑ％ ＮＨ，−Ｎ／ＴＮ　：　　１　１．９％Ｒ３：Ｑ、７％ ＤＳ：４９．４％ また、該Ｃ３Ｌのチロシン含量（１００ｇあたりのｍｇ
）は１以下であった。

発明の効果 バチルス属に属しＤ−リボース生産能を有する微生物を
、芳香族アミノ酸の量を制禦することによって菌の生育
をＤ−リボースの生成蓄積に適した状態で培養すること
により、グルコン酸の副生を抑制し、Ｄ−リボースの生
産量を増大させることが出来る。又副生ずるグルコン酸
の量が少ないので、グルコン酸の分離除去操作が容易で
ある。

代理人　　弁理士　岩　１）　　弘

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）バチルス属に属し、Ｄ−リボース生産能を有する
   微生物を、その生育に必要な栄養源を含む培地に培養し
   培養物中にＤ−リボースを生成蓄積させるに際し、培地
   中のＬ−トリプトファンおよびＬ−チロシンの濃度をそ
   れぞれ３γ／ｍｌ以下および１０γ／ｍｌ以下に制禦す
   ることを特徴とするＤ−リボースの製造法。
2. （２）培地中のＬ−フェニルアラニンの濃度を５０〜４
   ００γ／ｍｌに制禦することを特徴とする特許請求の範
   囲第１項記載の製造法。