CN114854613A - 一种雪白链霉菌菌株及其用途和生产新生霉素的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开属于微生物和生物工程领域，具体涉及一种雪白链霉菌菌株及其用途和生产新生霉素的方法。更具体来说，本公开涉及一种雪白链霉菌菌株1‑4、包含雪白链霉菌菌株1‑4的组合物及用途，和生产新生霉素的方法。雪白链霉菌1‑4是通过多轮的自然选育手段，筛选得到的新型的雪白链霉菌菌株，其发酵生产新生霉素的产率高，可显著提高发酵液中新生霉素的效价，并且有效降低了目标产物外的无活性杂质含量。

Description

一种雪白链霉菌菌株及其用途和生产新生霉素的方法
技术领域
本公开属于微生物和生物工程领域，具体涉及一种雪白链霉菌菌株及其用途和生产新生霉素的方法。更具体来说，本公开涉及一种雪白链霉菌菌株1-4、包含雪白链霉菌菌株1-4的组合物及用途，和生产新生霉素的方法。
背景技术
新生霉素(novobiocin，Nov)是香豆素类抗生素的代表药物，具有独特的结构特征，是一种具有抗G+菌作用的抗生素。新生霉素的抗菌谱与青霉素相似，通过抑制细菌DNA回旋酶和真核DNA拓扑异构酶II来抑制DNA的合成，发挥抗菌作用。新生霉素可以治疗由耐药性金葡萄球菌、肺炎双球菌等多种革兰氏阳性菌所引起的感染，作用机制为特异性靶向参与能量转移的GyrB亚基活性，进而干扰细菌DNA合成并最终影响细菌生长。
其后，国内外多项研究表明新生霉素对多种癌细胞具有抑制作用，并能与抗癌药联合应用，逆转抗癌药的抗药性；新生霉素也被不断研究证实对热休克蛋白90(Hsp90)具有抑制作用，具备成为一类新的具有抑制肿瘤细胞增殖活性的化学治疗药物的潜力。
新生霉素最早于19世纪50年代被发现，由默克公司科学家在Streptomyces sp.的代谢产物中成功分离得到新生霉素并将其上市[1-2]。新生霉素可由雪白链霉菌(Streptomyces niveus)或者类球形链霉菌(Streptomyces spheroides)产生，目前报道的由雪白链霉菌(Streptomyces niveus BC-345)产生的新生霉素总产物(采用UV检测)的最高效价是0.92g/l[3]。然而，该报道中采用纸层析方法对雪白链霉菌生产的新生霉素总产物进行检测，在新生霉素总产物中包含了大量无活性的新生霉素结构类似物，无活性的新生霉素结构类似物杂质占比达到了37％，而新生霉素的实际含量只有0.58g/l。
因此，开发新生霉素的产率提高、无活性杂质含量降低的新型雪白链霉菌菌株，以提高发酵产物中新生霉素的效价，是当前亟待解决的重要问题。
引用文献：
[1]Smith,C.G.,Dietz,A.,Sokolski,W.T.,Savage,G.M.Streptonivicin,a newantibiotic.Antibiot.Chemother.1956；6:135-142.
[2]Smith,C.G,Hoeksema,H.Novobiocin.Prog Ind Microbiol.1961；3:91-139.
[3]Kominek,L.A.(1972)Biosynthesis of novobiocin by Streptomycesniceus.Antimicrob.Agents Chemother.1,123-134.
发明内容
发明要解决的问题
鉴于现有技术中存在的问题，例如，生产新生霉素的雪白链霉菌存在产物中新生霉素的含量低，而无活性杂质含量高的缺陷。为此，本公开提供了一种菌株，所述菌株为雪白链霉菌(Streptomyces niveus)1-4，其保藏编号为CCTCC NO：M 2020480。雪白链霉菌1-4发酵生产新生霉素的产率高，可显著提高发酵液中新生霉素的效价，并且有效降低了目标产物外的无活性杂质含量。
用于解决问题的方案
(1)一种菌株，所述菌株为雪白链霉菌(Streptomyces niveus)1-4，所述菌株的保藏编号为CCTCC NO：M 2020480。
(2)一种组合物，其中，所述组合物包含根据(1)所述的菌株。
(3)根据(1)所述的菌株，或根据(2)所述的组合物在生产新生霉素中的用途。
(4)一种生产新生霉素的方法，其中，包括培养根据(1)所述的菌株或根据(2)所述的组合物，以培养后的所述菌株或组合物生产新生霉素的步骤。
(5)根据(4)所述的生产新生霉素的方法，其中，所述菌株或组合物在氧气环境下进行发酵培养，产生所述新生霉素。
(6)根据(5)所述的生产新生霉素的方法，其中，所述发酵培养的温度为27℃-29℃，培养基pH为5.5-7.5，培养时间为5-9天。
(7)根据(4)-(6)任一项所述的生产新生霉素的方法，其中，包括如下步骤：
将所述菌株或组合物接种于种子培养基中，扩大培养后得到种子培养液；
将所述种子培养液接种于发酵培养基中，发酵培养后得到发酵培养液；
可选地，还包括：
鉴定或分离所述发酵培养液中的新生霉素。
(8)根据(7)所述的生产新生霉素的方法，其中，所述种子培养基包括碳源、氮源和任选存在的无机盐，所述种子培养基中碳源和氮源的质量比为(1-5)：(1-10)；
可选地，所述发酵培养基包括碳源、氮源和无机盐，所述发酵培养基中碳源和氮源的质量比为1：(0.1-0.5)；
优选地，所述碳源包含可同化的碳源，所述氮源包含可同化的氮源。
(9)根据(7)或(8)所述的生产新生霉素的方法，其中，所述种子培养基包含如下组分：
碳源3-15g/L，氮源3-30g/L，无机盐0-10g/L；所述种子培养基的pH为6.0～7.5；
可选地，所述发酵培养基包含如下组分：
碳源30-40g/L，氮源5-15g/L，无机盐5-15.5g/L；所述发酵培养基的pH为6.0～7.5。
(10)根据(8)或(9)所述的生产新生霉素的方法，其中，所述可同化的碳源选自葡萄糖、棉子糖、甘油、蔗糖、甘露醇、肌醇、甘氨酸、柠檬酸钠、淀粉中的一种或两种以上的组合；
可选地，所述可同化的氮源选自酵母抽提物、酵母粉、牛肉浸膏、脱脂奶粉、全脂奶粉、黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆干粉、铵盐、脯氨酸中的一种或两种以上的组合；
可选地，所述无机盐选自磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁、硫酸锌中的一种或两种以上的组合。
发明的效果
在一些实施方式中，本公开通过多轮的自然选育手段，筛选得到了一种新型的雪白链霉菌菌株，为雪白链霉菌1-4。雪白链霉菌1-4发酵9天后发酵液中新生霉素的发酵单位可达1g/L，而新生霉素结构类似物杂质占比只有28％，较现有已报道文献中新生霉素的发酵含量相比提高至少0.4g/L，新生霉素的效价提高至少60％。雪白链霉菌1-4发酵生产新生霉素的产率高且产物中杂质含量低，适于满足工业化生产的需求。
在一些实施方案中，本公开提供的生产新生霉素的方法，在包含可同化的碳源、氮源的培养基中，通过有氧发酵产生新生霉素。本发明提供的生产方法通过优化培养基成分和发酵条件，可促进雪白链霉菌1-4生长、代谢，提高雪白链霉菌1-4生产新生霉素的产量。
附图说明
图1示出了实施例1中雪白链霉菌1-4(图1A)与野生型链霉菌菌种原种-1(图1B)的形态比对结果。
图2示出了雪白链霉菌1-4在实施例6条件下产生的新生霉素的HPLC图谱，新生霉素含量为903mg/L。
图3示出了雪白链霉菌1-4在实施例7条件下产生的新生霉素的HPLC图谱，新生霉素含量为1064mg/L。
图4示出了雪白链霉菌1-4在实施例8的50L发酵罐中放罐时产生的新生霉素的HPLC图谱(发酵液处理：发酵液10ml，加入30ml无水甲醇，震荡反应1小时，8000rpm、10分钟离心，取上层液进样)，新生霉素含量为716mg/L。
图5示出了雪白链霉菌1-4在实施例8的50L发酵罐中生产新生霉素的发酵曲线。
具体实施方式
以下，针对本公开的内容进行详细说明。以下所记载的技术特征的说明基于本公开的代表性的实施方案、具体例子而进行，但本公开不限定于这些实施方案、具体例子。需要说明的是：
本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。
本说明书中，如没有特别说明，则“％”均表示质量百分含量。
另外，本说明书中，所述“水”包含去离子水、蒸馏水、离子交换水、双蒸水、高纯水、纯净水等微生物发酵领域能够使用的任何可行的水。
本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
第一方面
本公开的第一方面提供了一种菌株，所述菌株为雪白链霉菌(Streptomycesniveus)1-4，雪白链霉菌1-4的微生物菌株于2020年09月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学保藏中心)，保藏号为CCTCC NO：M2020480，分类命名为雪白链霉菌，并登记入册，证明存活。
雪白链霉菌1-4的主要生物学特征为：ISP2培养基中菌落颜色白色，圆形，菌落初始表面光滑、边缘整齐、不易挑起，继而发展成绒毛状、表面起粉、色泽丰富，正反面颜色不同，中间稍凸起，多皱，直径大小为中型(约6mm左右)，能产大量孢子，培养基内菌丝发达，菌丝与培养基结合紧密，不易挑起。
雪白链霉菌1-4的遗传学特征为：与雪白链霉菌Streptomyces niveus(NRRL2466)16s rRNA同源性99.89％，与Streptomyces clavuligerus(NRRL 3585)同源性99.02％。结合菌株1-4的形态学和分子水平上的特征，经过和已知新生霉素生产菌进行形态学和分子水平的比较，可以认定菌株1-4属雪白链霉菌。
本公开中的雪白链霉菌1-4发酵生产新生霉素的产率高、产物中杂质含量低，与已知新生霉素生产菌株相比，雪白链霉菌1-4发酵液中新生霉素的效价可提高约60％，具有良好的工业生产前景。
第二方面
本公开的第二方面提供了一种组合物，包括根据第一方面所述的菌株。该组合物由于包含雪白链霉菌1-4，可有效提高发酵液中新生霉素的含量，解决目前新生霉素的生产菌株存在的产量低、无活性杂质含量高的问题。
在一些实施方案中，组合物中可以包含培养基。培养基可以为液体培养基或固体培养基，培养基可以包含本领域中用于微生物培养的通用成分。例如，糖类、淀粉等碳源，酵母粉、大豆饼粉、玉米粉、大米粉和蛋白胨等氮源。进一步的，组合物可以被制作为固态或液态的菌剂。
在一些实施方案中，通过对组合物进行培养，得到新生霉素的效价提高的发酵培养物。进一步的，发酵培养物可通过分离纯化步骤，去除其中的菌体等物质。
第三方面
本公开的第三方面提供了一种生产新生霉素的方法，其中，包括培养根据第一方面所述的菌株或根据第二方面所述的组合物，以所述菌株或组合物生产新生霉素的步骤。本公开的生产方法利用雪白链霉菌1-4，可有效提高产物中新生霉素的效价，降低无活性杂质含量。
进一步的，为提供适合雪白链霉菌1-4发酵的环境条件，所述菌株或组合物在氧气环境下进行发酵培养产生所述新生霉素。作为优选，所述发酵培养的温度为27℃-29℃，培养基pH为5.5-7.5，培养时间为5-9天。
在一些实施方案中，生产新生霉素的方法包括如下步骤：
将所述菌株或组合物接种于种子培养基中，扩大培养后得到种子培养液；
将所述种子培养液接种于发酵培养基中，发酵培养后得到发酵培养液。
对于种子培养基，可以是本领域中常用的能够实现链霉菌扩大培养的培养基。进一步的，种子培养基又可分为一级种子培养基和二级种子培养基。其中，一级种子培养基内接种平板培养基上雪白链霉菌1-4的菌丝体，菌丝体在一级种子培养基内培养后，将一级种子培养液接种于二级种子培养基中，进一步对雪白链霉菌1-4进行扩大培养。
在一些实施方案中，种子培养基中包含碳源和氮源。例如，将所需的碳源和氮源溶解于水中，得到一级种子培养基或二级种子培养基。在另外一些实施方案中，种子培养基中包含碳源、氮源和无机盐。例如，将碳源、氮源和无机盐溶解于水中，得到二级种子培养基。
具体的，种子培养基的碳源和氮源的质量比为(1-5)：(1-10)。例如，碳源和氮源的质量比为1:1.3，3.5:1，1:5.4，3:8，5:2，4:7等等。当种子培养基中碳源和氮源的质量比为(1-5)：(1-10)时，可为雪白链霉菌1-4的生长、繁殖提供所需的营养环境。
在一些具体的实施方案中，种子培养基中碳源的浓度为3-15g/L，例如，碳源为4g/L、5g/L、6g/L、8g/L、10g/L、12g/L、14g/L等等。氮源的浓度为3-30g/L，例如氮源为4g/L、5g/L、7g/L、9g/L、10g/L、13g/L、15g/L、17g/L、20g/L、25g/L、27g/L等等。无机盐的浓度为0-10g/L，例如，无机盐为2g/L、3g/L、5g/L、6g/L、7g/L、9g/L等等。当种子培养基中碳源的浓度为3-15g/L，氮源的浓度为3-30g/L，无机盐的浓度为0-10g/L时，可促进雪白链霉菌1-4的生产、繁殖，提高对雪白链霉菌1-4扩大培养的效率，获得菌丝浓度高的种子培养基。
进一步的，种子培养基的pH为6.0～7.5，例如，pH为6.5，6.2±0.1，7.2±0.2，pH7.3±0.1等。
在一些优选的实施方案中，种子培养基中的碳源为可同化的碳源。本公开中的可同化的碳源是指能够被细菌自身吸收，用于细菌生长、代谢的碳源。进一步的，可同化的碳源选自葡萄糖、棉子糖、甘油、蔗糖、甘露醇、肌醇、甘氨酸、淀粉、柠檬酸钠中的一种或两种以上的组合。
在一些优选的实施方案中，种子培养基中的氮源为可同化的氮源。本公开中的可同化的氮源是指能够被细菌自身吸收，用于细菌生长、代谢的氮源。进一步的，可同化的氮源选自酵母抽提物、酵母粉、牛肉浸膏、脱脂奶粉、全脂奶粉、黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆干粉、铵盐、脯氨酸中的一种或两种以上的组合。
在一些具体的实施方案中，种子培养基中无机盐选自磷酸二氢钾和氯化钠中的一种或两种的组合。此外，无机盐也可以是本领域中其他常用的链霉菌培养的无机盐成分。
进一步的，在种子培养基中进行扩大培养的条件为：将雪白链霉菌1-4的菌丝体接种于一级种子培养基中，置于27-29℃，200-250rpm，摇床振荡培养72hr，得到一级种子培养液。进一步的，将一级种子培养液接种于二级种子培养基中，置于27-29℃，200-250rpm，摇床振荡培养28-55hr，得到扩大培养后的二级种子培养液。
对于发酵培养基，可以是本领域中常用的能够实现链霉菌发酵培养的培养基。发酵培养基提供菌株生长、代谢所需营养，以得到菌株目标的代谢产物。
在一些实施方案中，发酵培养基中包含碳源、氮源和无机盐。具体的，发酵培养基的碳源和氮源的质量比为1：(0.1-0.5)。例如，碳源和氮源的质量比为1:0.15，1:0.2，1:0.25，1:0.3，1:0.375，1:0.4，1：0.45等等。当发酵培养基中碳源和氮源的质量比为1：(0.1-0.5)时，可为雪白链霉菌1-4的生长、代谢提供所需的营养环境，促进新生霉素的产生，并减少新生霉素之外的代谢副产物。
在一些具体的实施方案中，发酵培养基中碳源的浓度为30-40/L，例如，碳源为30g/L、32g/L、34g/L、36g/L、38g/L等等。氮源的浓度为5-15g/L，例如氮源为6g/L、7g/L、7.5g/L、9g/L、10g/L、12g/L、12.5g/L、13g/L、13.5g/L、14g/L、14.5g/L等等。无机盐的浓度为5-15.5g/L，例如，无机盐为6g/L、6.7g/L、7g/L、8g/L、10g/L、12g/L、14g/L、14.7g/L等等。当发酵培养基中碳源的浓度为30-40g/L，氮源的浓度为5-15g/L，无机盐的浓度为5-15.5g/L时，可有效提高雪白链霉菌1-4生产新生霉素的产率，进而提高发酵产物中新生霉素的效价，降低杂质含量。
进一步的，发酵培养基的pH为6.0～7.5。作为优选，发酵培养基的pH为7.2±0.1。
在一些优选的实施方案中，发酵培养基中的碳源为可同化的碳源。本公开中的可同化的碳源是指能够被细菌自身吸收，用于细菌生长、代谢的碳源。进一步的，可同化的碳源选自葡萄糖、棉子糖、甘油、蔗糖、甘露醇、肌醇、甘氨酸、淀粉、柠檬酸钠中的一种或两种以上的组合。
在一些优选的实施方案中，发酵培养基中的氮源为可同化的氮源。本公开中的可同化的氮源是指能够被细菌自身吸收，用于细菌生长、代谢的氮源。进一步的，可同化的氮源选自酵母抽提物、酵母粉、牛肉浸膏、脱脂奶粉、全脂奶粉、黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆干粉、铵盐、脯氨酸中的一种或两种以上的组合。
在一些具体的实施方案中，发酵培养基中无机盐选自柠檬酸钠、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁、硫酸锌和碳酸钠中的一种或两种的组合。此外，无机盐也可以是本领域中其他常用的链霉菌培养的无机盐成分。
进一步的，生产新生霉素的方法还包括：
(3)鉴定或分离所述发酵培养液中的新生霉素。
对于鉴定发酵培养液中的新生霉素，可以通过以下方法进行检测：
取发酵液2ml，加入4ml无水甲醇，震荡反应1小时，8000rpm、10分钟离心，取上层液进样。
HPLC柱：SunFireTM C18；250mm*4.6mm；5μm
紫外吸收波长：305nm
温度控制：40℃
HPLC流动相条件：A甲醇：B水(0.1％磷酸)
流动相 0min 30min 35min 35.01min 40min
A 60 100 100 60 60
B 40 0 0 40 40
进样量：10μl。
第四方面
本公开的第四方面提供了根据第一方面所述的菌株或根据第二方面所述的组合物在生产新生霉素中的用途，可以解决目前新生霉素的生产菌株存在的新生霉素生产效价低、杂质含量高的问题。
实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：菌株来源
本发明雪白链霉菌1-4(CCTCC NO：M 2020480)是在从东北林区土壤中分离出来的野生型链霉菌菌种原种-1的基础上，通过多轮的自然选育手段筛选不同状态的单克隆不少于80株，进行摇瓶发酵，HPLC检测新生霉素的产量。经过多轮单克隆分离，筛选出新生霉素的高产菌株雪白链霉菌1-4。对雪白链霉菌1-4进行发酵培养，以期达到提高新生霉素产量的目的。
图1示出了雪白链霉菌1-4(图1A)与野生型链霉菌菌种原种-1(图1B)的形态比对结果，两种菌株在形态学特征上区别明显，说明本公开经自然选育手段筛选得到了新型的雪白链霉菌菌株。
实施例2：雪白链霉菌1-4生理生化试验
参照《链霉菌鉴定手册》、《放线菌的分类与鉴定》、《常见细菌系统鉴定手册》中的有关内容进行实验。除温度实验外，均为28℃培养7-10天。
(1)碳源的利用：各种碳源的终浓度均为1.0％。(结果见表1)
(2)无机氮源的利用：硝酸钾和硫酸铵的浓度均为0.5％。(结果见表1)
(3)降解试验(结果见表2)和NaCl耐受实验(结果见表5)采用基础培养基为GYEA(pH6.8)，各种降解物的浓度见表2。
(4)氧化酶和过氧化氢酶试验(结果见表3)、pH试验(结果见表4)均采用YMS培养基。
表1雪白链霉菌1-4菌株的碳源和氮源的利用情况
碳源 生长情况 碳源 生长情况 无机氮源 生长情况
D-葡萄糖 4 D-蔗糖 4 硫酸铵 +
D-棉子糖 4 D-乳糖 0 硝酸钾 -
D-木糖 0 肌醇 3
L-阿拉伯糖 0 甘露醇 4
甘油 4 甘氨酸 1
麦芽糖 0 鼠李糖 0
D-果糖 0
表2雪白链霉菌1-4菌株的降解试验结果
降解物 降解物浓度 结果 降解物 降解物浓度 结果
酪氨酸 0.1％ 4，- Tween-80 1.0％ 2，+
表3雪白链霉菌1-4菌株主要的生理生化特征
试验项目 结果 试验项目 结果 试验项目 结果
明胶液化 + 牛奶凝固 + 纤维素利用 -
淀粉水解 + 牛奶胨化 + M.R实验 -
表4雪白链霉菌1-4菌株生长的pH试验
pH 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5
生长情况 0 0 0 4 4 4 4 4 4
表5雪白链霉菌1-4菌株对NaCl的耐受性
NaCl浓度 0.5％ 1％ 1.5％ 2％
菌株生长情况 4 3 2 0
备注：表1-5中：0：无生长；1：生长很弱；2：能生长，有少量孢子；3：生长良好，有大量孢子；4：生长最好，有丰富孢子；+：阳性；-：阴性。
实施例3：制备新生霉素
(1)平板菌丝体的制备与培养
平板孢子培养基配方(g/L)：酵母提取物4，麦芽提取物10，葡萄糖4，琼脂20，消前pH 7.0-7.4，培养皿90mm，装量25-30mL，经121℃灭菌30分钟后，冷却到50-60℃倒平板，接入实施例1中分离的雪白链霉菌1-4的一环菌丝体经28℃培养9天后，菌丝成熟。
(2)一级种子液的制备与培养
种子培养基(g/L)：牛肉浸膏3，
Figure BDA0002934208380000121
A(sigma，C0626-500G)10，葡萄糖10，pH 6.5，摇瓶装液量为20mL/250mL三角瓶，经121℃灭菌30分钟。从实施例3的平板中取2x2cm。
菌丝体接入种子培养基，置于28℃，250rpm，振幅5cm，湿度65％摇床振荡培养72hr。这时培养液pH 8.5-8.7，菌丝浓度为10-15％(重量百分比)。
(3)二级种子液的制备与培养
种子培养基(g/L)：酵母提取物4，麦芽提取物10，葡萄糖4，pH7.2±0.2，摇瓶装液量为20mL/250mL三角瓶，经121℃灭菌30分钟。菌体接种量为1.5mL，置于28℃，250rpm，振幅5cm，湿度65％摇床振荡培养48hr。这时培养液pH 6.17，菌丝浓度为11％(重量百分比)。
(4)新生霉素发酵培养基的制备与培养
发酵培养基配方(g/L)：葡萄糖30，柠檬酸钠6，L-脯氨酸6，磷酸氢二钾2，硫酸铵1.5，氯化钠5，硫酸镁1，氯化钙0.4，硫酸亚铁0.2，硫酸锌0.1，消前pH 7.2±0.1，摇瓶装液量为250mL三角瓶装25mL，经121℃灭菌30分钟。将种子液以1.5mL的接种量接入，在28℃，250rpm，振幅5cm，湿度65％摇床振荡培养5天，发酵结束后HPLC测新生霉素单位，测得单位为259mg/L。
实施例4：制备新生霉素
(1)种子液的制备与培养
一级种子培养液的制备按照实施例3进行。以1.5mL的接种量接入二级种子培养基(g/L)：牛肉浸膏3，
Figure BDA0002934208380000131
A 10，葡萄糖10，pH 6.2±0.1，摇瓶装液量为20mL/250mL三角瓶，经121℃灭菌30分钟。置于28℃，250rpm，振幅5cm，湿度65％摇床振荡培养48hr。这时培养液pH 8.44，菌丝浓度为15.9％(重量百分比)。
(2)新生霉素发酵培养基的制备与培养
发酵培养基配方(g/L)：葡萄糖30，柠檬酸钠6，L-脯氨酸6，磷酸氢二钾2，硫酸铵1.5，氯化钠5，硫酸镁1，氯化钙0.4，硫酸亚铁0.2，硫酸锌0.1，消前pH 7.2±0.1，摇瓶装液量为250mL三角瓶装25mL，经121℃灭菌30分钟。将种子液以1.5mL的接种量接入，在28℃，250rpm，振幅5cm，湿度65％摇床振荡培养5天，发酵结束后HPLC测新生霉素单位，测得单位为332mg/L。
实施例5：制备新生霉素
(1)种子液的制备与培养
一级种子培养液的制备按照实施例3进行。以1.5mL的接种量接入二级种子培养基(g/L)：黄豆饼粉15，玉米淀粉10，葡萄糖5，酵母粉1，玉米浆干粉1，磷酸二氢钾2，氯化钠5，pH 7.3±0.1，摇瓶装液量为20mL/250mL三角瓶，经121℃灭菌30分钟。置于28℃，250rpm，振幅5cm，湿度65％摇床振荡培养48hr。这时培养液pH 7.32，菌丝浓度为26.4％(重量百分比)。
(2)新生霉素发酵培养基的制备与培养
发酵培养基配方(g/L)：葡萄糖30，柠檬酸钠6，L-脯氨酸6，磷酸氢二钾2，硫酸铵1.5，氯化钠5，硫酸镁1，氯化钙0.4，硫酸亚铁0.2，硫酸锌0.1，消前pH 7.2±0.1，摇瓶装液量为250mL三角瓶装25mL，经121℃灭菌30分钟。将种子液以1.5mL的接种量接入，在28℃，250rpm，振幅5cm，湿度65％摇床振荡培养5天，发酵结束后HPLC测新生霉素单位，测得单位为463mg/L。
实施例6：制备新生霉素
(1)种子液的制备与培养
种子培养基配方(g/L)：黄豆饼粉15，玉米淀粉10，葡萄糖5，酵母粉1，玉米浆干粉1，磷酸二氢钾2，氯化钠5，消前pH 7.3±0.1，摇瓶装液量为250mL三角瓶装20mL，经121℃灭菌30分钟。菌体接种量为2x2 cm，培养温度28℃，250rpm，振幅5cm，湿度65％摇床振荡培养55hr，这时培养液pH 7.0-7.3，菌丝浓度为20-25％(重量百分比)。
(2)新生霉素发酵培养基的制备与培养
发酵培养基配方(g/L)：葡萄糖30，柠檬酸钠6，L-脯氨酸6，棉籽粉6，磷酸氢二钾2，硫酸铵1.5，氯化钠5，硫酸镁1，氯化钙0.4，硫酸亚铁0.2，硫酸锌0.1，消前pH 7.2±0.1，摇瓶装液量为250mL三角瓶装25mL，经121℃灭菌30分钟。将种子液以5-10％(体积百分比)的接种量接入，在28℃，250rpm，振幅5cm，湿度65％摇床振荡培养9天，发酵结束后HPLC测新生霉素单位，测得单位为903mg/L。
实施例7：制备新生霉素
种子培养基的制备按照实施例6进行。以1.5mL的接种量接入发酵培养基(g/L)：葡萄糖30，柠檬酸钠6，L-脯氨酸6，棉籽粉6，碳酸钠0.8，磷酸氢二钾2，硫酸铵1.5，氯化钠5，硫酸镁1，氯化钙0.4，硫酸亚铁0.2，硫酸锌0.1，消前pH为自然pH，摇瓶装液量为250mL三角瓶装25mL，经121℃灭菌30分钟。置于28℃，250rpm，振幅5cm，湿度65％摇床振荡培养9天，发酵结束后HPLC测新生霉素单位，测得单位为1064mg/L。
实施例8：制备新生霉素
(1)种子罐种子液的制备
在15L种子罐中投入10L的种子培养基(种子培养基的配比见实施例6)，灭菌采用蒸汽灭菌，121℃条件下30分钟，待冷却后，接入800ml摇瓶种子液，培养温度28±1℃，搅拌转速200rpm，通气量1vvm，培养28hr。
(2)发酵罐培养基的配制与培养
发酵培养基配方(g/L)：葡萄糖30，柠檬酸钠6，L-脯氨酸6，棉籽粉6，磷酸氢二钾2，硫酸铵1.5，氯化钠5，硫酸镁0.5，氯化钙0.6，硫酸亚铁0.3，硫酸锌0.15。发酵罐50L，投料体积为36L，消前pH 7.2±0.05，于121℃下蒸汽灭菌30分钟，冷却后，接入约4.3L种子罐培养液，发酵温度28±1℃，搅拌桨转速底限200rpm，与溶氧关联，溶氧控制在30％-50％，通气量为2vvm。发酵培养134hr，放罐，发酵液经HPLC测定，测得新生霉素含量为716mg/L。
产业上的可利用性
本发明的提供的雪白链霉菌1-4及新生霉素的生产方法，可以在工业上应用。
本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方案的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方案予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种菌株，所述菌株为雪白链霉菌(Streptomyces niveus)1-4，所述菌株的保藏编号为CCTCC NO：M 2020480。
2.一种组合物，其中，所述组合物包含根据权利要求1所述的菌株。
3.根据权利要求1所述的菌株，或根据权利要求2所述的组合物在生产新生霉素中的用途。
4.一种生产新生霉素的方法，其中，包括培养根据权利要求1所述的菌株或根据权利要求2所述的组合物，以培养后的所述菌株或组合物生产新生霉素的步骤。
5.根据权利要求4所述的生产新生霉素的方法，其中，所述菌株或组合物在氧气环境下进行发酵培养，产生所述新生霉素。
6.根据权利要求5所述的生产新生霉素的方法，其中，所述发酵培养的温度为27℃-29℃，培养基pH为5.5-7.5，培养时间为5-9天。
7.根据权利要求4-6任一项所述的生产新生霉素的方法，其中，包括如下步骤：
将所述菌株或组合物接种于种子培养基中，扩大培养后得到种子培养液；
将所述种子培养液接种于发酵培养基中，发酵培养后得到发酵培养液；
可选地，还包括：
鉴定或分离所述发酵培养液中的新生霉素。
8.根据权利要求7所述的生产新生霉素的方法，其中，所述种子培养基包括碳源、氮源和任选存在的无机盐，所述种子培养基中碳源和氮源的质量比为(1-5)：(1-10)；
可选地，所述发酵培养基包括碳源、氮源和无机盐，所述发酵培养基中碳源和氮源的质量比为1：(0.1-0.5)；
优选地，所述碳源包含可同化的碳源，所述氮源包含可同化的氮源。
9.根据权利要求7或8所述的生产新生霉素的方法，其中，所述种子培养基包含如下组分：
碳源3-15g/L，氮源3-30g/L，无机盐0-10g/L；所述种子培养基的pH为6.0～7.5；
可选地，所述发酵培养基包含如下组分：
碳源30-40g/L，氮源5-15g/L，无机盐5-15.5g/L；所述发酵培养基的pH为6.0～7.5。
10.根据权利要求8或9所述的生产新生霉素的方法，其中，所述可同化的碳源选自葡萄糖、棉子糖、甘油、蔗糖、甘露醇、肌醇、甘氨酸、柠檬酸钠、淀粉中的一种或两种以上的组合；
可选地，所述可同化的氮源选自酵母抽提物、酵母粉、牛肉浸膏、脱脂奶粉、全脂奶粉、黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆干粉、铵盐、脯氨酸中的一种或两种以上的组合；
可选地，所述无机盐选自磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁、硫酸锌中的一种或两种以上的组合。
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