NL8004151A

NL8004151A - Werkwijze voor het bereiden van een cefalosporine door fermentatie.

Info

Publication number: NL8004151A
Application number: NL8004151A
Authority: NL
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1979-07-19
Filing date: 1980-07-18
Publication date: 1981-01-21
Also published as: GB2060610B; JPH0154998B2; AT378003B; FR2461753B1; US4533632A; IT8049269A0; SE8005266L; DE3027380C2; ATA374780A; CH651589A5; DE3027380A1; GB2060610A; ES493506A0; IT1146184B; DK310880A; ES8106760A1; ZA804357B; AU6065080A; JPS5642596A; AU541351B2

Description

Werkwijze voor het bereiden van een cefalosporine door fermentatie .

Een groot aantal semi-cefalosporinen wordt bereid uit cefalosporine C verkregen door fermentatie. Het is gebleken, dat tijdens de fermemtatie die in water wordt uitgevoerd en gewoorlijk enkele dagen duurt, die |S- lactamring van cefalo-5 sporine C niet-enzymatisch door hydrolyse wordt aangetast. Bij een fermentatieproces op technische schaal leidt deze aantasting tot een verlies van ongeveer 25%.

Verder is gebleken, dat tijdens de fermentatie ongeveer 15% cefalosporine C in de vorm verkeert van desacetyl-10 cefalosporine C. Hoewel desacetylcefalosporine C. ook kan worden gebruikt voor het bereiden van andere cefalosporinen, wordt het ais ondoelmatig en weinig doeltreffend beschouwd om het desacetylcefalosporine C te isoleren omdat daarvoor andere methoden nodig zijn en de schaal van de uitvoering gewijzingd moet worden. Der-15 halve gaat de 15% desacetylcefalosporine C ook verloren zodat de totale hoeveelheid niet-extraheerbaar cefalosporine C op ongeveer 40% komt.

Gevonden is, dat desacetylcefalosporine C aanzienlijk bestendiger is tegen niet-enzymatische β-lactamdegrada-20 tie dan cefalosporine C zelf in de cultuurvloeistof. Bij een onderzoek waarbij desacetylcefalosporine C in waterige oplossing en cultuurvloeistof onder fermentatieomstandigheden werd behandeld, kon zelfs met de meest gevoelige bepalingsmethode geen ontleding worden aangetoond. Dit is verrassend omdat andere on-25 derzoekingen het tegendeel doen vermoeden, (zie J. Antib., Vol. XXVI, no. 3, blz. 140).

De uitvinding heeft geleid tot een werkwijze voor de omzetting van cefalosporinen C tot desacetylcefalosporine C tijdens fermentatie zodra het cefalosporine C is gevormd.

800 4151 2

Omdat bij de werkwijze volgens de uitvinding praktisch geen verlies optreedt aan cefalosporineprodukt door ontleding vanwege de onverwachte stabiliteit van desacetylcefalo-sporine C, en het bij gebruikelijke fermentatieprocessen gevorm-f5 de desacetylcefalosporine C eveneens kan worden gewonnen, wordt een aanmerkelijke verbetering van de opbrengst aan cefalosporineprodukt bereikt. Deze opbrengstverhoging ligt in de orde van ongeveer Uo % maar kan variëren afhankelijk van de hoeveelheid desacetylcefalosporine C die tijdens de bereüing van cefalospo-10 rine C door gebruikelijke fermentatie wordt gevormd, en van de kinetica van de cefalosporine C vorming.

Verder is gevonden, dat de vorming van desacetylcefalosporine C doorgaat wanneer de fermentatie langer dan normaal voor de vorming van cefasporine C wordt voortgezet.

15 Normaal begint de vorming van cefalosporine C na de gebruikelijke 6 dagen fermenteren af te nemen. Gebleken is echter, dat wanneer het fermenteren bij aanwezigheid van acetylesterase bijvoorbeeld 2 dagen dus met een derde van de normale tijd, wordt voortgezet nog 50 % meer bruikbaar cefalosporineprodukt wordt verkregen, 20 Dit betekent, dat door vorming van desacetylcefalosporine C tijdens de bereiding van cefalosporine C door fermentatie en verlenging van de fermentatietijd, ongeveer 9& % meer bruikbaar cefalosporineprodukt wordt verkregen dan bij normale cefalospo-rine C fermentatie. · 25 Het behoeft geen betoog dat deze aanmerkelijke opbrengstverbetering uit economisch oogpunt van grote betekenis is. Verder worden de beperkingen aan de fermentatie bij de bereiding van cefalosporine C vanwege de instabiliteit daarvan, in aanmerkelijke mate opgeheven.

30 Desacetylcefalosporine C kan gemakkelijk in andere vaardevolle antibiotica zoals cefalothine en cefalori-dine, worden omgezet.

De uitvinding heeft derhalve betrekking op een werkwijze voor het bereiden van desacetylcefalosporine C door 35 fermentatie van een cefalosporine C vormend microorganisme bij 800 4 1 51 -- 't 3 aanwezigheid van een acetylesterase in een voldoende hoeveelheid om al of nagenoeg al het gevormd cefalosporine C voordat het niet-enzymatisch wordt ontleed, om te zetten in desacetylcefalo-sporine C.

5 Bij uitvoering van de werkwijze volgens de uit vinding kan het acetylesterase meteen bij het begin van de fermentatie worden toegevoegd of aan het t gin van de cefalosporine C groeifase. Ook kan het enzym met tussenpozen tijdens de fermentatie worden toegevoegd. Daarnaast kan het enzym tijdens 10 de fermentatie in situ worden gevormd.

Het esterase-enzym kan uit een groot aantal bronnen afkomstig zijn. Bijvoorbeeld uit hoger ontwikkelde planten, bacteriën, gisten en fungi. Geschikte hoger ontwikkelde plantebronnen omvatten de schil van citrusvruchten zoals be-15 schreven in het Britse octrooischrift 966.222, en tarwekiemen zoals beschreven in het Britse octrooischrift 111.121.308. In laatstgenoemd octrooischrift wordt tevens melding gemaakt van de geschikte acetylesterase aktiviteit van het bacteriegenus Rhizobium. Geschikte gistbronnen omvatten gisten van het genus 20 Rhodotorula zoals beschreven in het Britse octrooischrift 1ΛΤ^.519. Ook zijn geschikt microorganismen uit de klasse der Basidiomycetes zoals beschreven in het Britse octrooischrift 1.531.212, en bacteriën van het species B. subtilis zoals beschreven in App. Microbiol. Vol. 30, no.3, blz. 1*13. Een bij 25 uitstek geschikte enzymbron is het microbiele genus Rhodospori-dium, in het bijzonder het species Rhodosporidium toruloides. Bijvoorbeeld de stam CBS 3^9 zoals beschreven in voornoemd Brits octrooischrift 1.531.212.

Een bruikbare selectiemethode voor esterase-30 bronnen is beschreven in meer genoemd Brits octrooischrift 1.531.121, Hoewel de daarin beschreven selectiemethode betrekking heeft op microorganismen uit de klasse der Basidiomycetes, kan deze methode eenvoudig worden aangepast voor het selecteren van esterases afkomstig uit andere bronnen.

35 800 41 51 1*

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding wordt een bekende cefalosporine C vormende stam gekweekt bij aanwezigheid van een acetylesterase onder aerobe omstandigheden, bij voorke-ur in een submerse cultuur, 5 onder schudden of roeren. Als zuurstofbron kan zuivere zuurstof of lucht worden gebruikt. Het fermentatiemedium bevat een assimileerbare koolstofbron, een verteerbare stikstofbron, en desgewenst groeibevorderende agentia alsmede anorganische zouten.

Geschikte koolstofbronnen omvatten glucose, 10 sucrose, zetmeel, oplosbaar gemaakt zetmeel, n-alkanen, plantaardige en dierlijke oliën, methanol, ethanol, glycerol, sorbitol en azijnzuur.

Geschikte stikstofbronnen omvatten natuurlijke stikstof houdende stoffen of produkten waaruit deze stoffen ont-15 staan, bijvoorbeeld vleesextract, pepton, caseïne, maisweekvloei-stof, gistextract, sojaboonmeel, trypton, katoenzaadmeel en tarwezemelen. Ook kunnen stikstof houdende organische en anorganische verbindingen worden gebruikt, bijvoorbeel ureum, nitraten, en ammoniumzouten, zoals ammoniumacetaat, ammoniumchloride, ammonium-20 sulfaat en ammoniumfosfaat.

Als anorganische zouten kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt sulfaten, nitraten, chloriden, carbonaten en fosfaten van kalium, magnesium en calcium.

Geschikte groei-bevorderende agentia zijn bij-25 voorbeeld cysteine, cystine, thiosulfaat, methyloleaat en in het bijzonder methionine als ook sporenelement en zoals ijzer, zink, koper en mangaan. De fermentatieomstandigheden ten aanzien van de temperatuur, pH en tijd, worden zo gekozen dat de gebruikte stam een maximale hoeveelheid aan het gewenste cefalosporine produceert. 30 De fermentatie wordt gewoonlijk uitgevoerd bij een temperatuur van 15-45°C en bij voorkeur ongeveer 25°C, en bij een pH van 4-9, bij voorkeur 5-8 en in het bijzonder ongeveer 6, en gedurende 1-20 dagen en bij voorkeur 4-10 dagen.

Als cefalosporine C producerende stam wordt 35 bij voorkeur gebruikt een stam van Acremonium chrysogenum (vroeger 800 4 1 51 « 5 bekend als Cefalosporium acremonium) Sommige mutanten van Acremo-nium chrysogenum zijn ook in staat cm tijdens de fermentatie grote hoeveelheid acetylesterase in situ te vormen. Daarnaast komen voor de vorming van cefalosporine C in aanmerking microorganismen van 5 het genus Cefalosporium C bijvoorbeeld de Stam Cefalosporium polyaleurum, en sommige microorganismen van het gems Emericellopsis en Streptomyces, bijvoorbeeld de stammen Emericellopsis glabra, Emericellopsis microspora en Streptomyces lactamdurans

De hoeveelheid esterase of esterase bevattend 10 produkt nodig om tijdens de fermentatie gevormd cefalosporine C

om te zetten in desacetylcefalosporine G kan eenvoudig worden vastgesteld door tevoren de enzymaktiviteit te bepalen of met proefnemingen op kleine schaal. De benodigde hoeveelheid esterase is afhankelijk van de aard van het enzym en de toegepaste fermentatie-15 omstandigheden. Het verloop van de fermentatie kan geschikt worden gevolgd door hogedrukvloeistof-chromatografie (HPLC) of met dunne-laag- of papierchromatografie onder gebruikmaking van een geschikte drager en een geschikt loopmiddel waarbij de bepaling densitometrisch wordt uitgevoerd. Voor een geschikte methode wordt verwezen naar 20 meer genoemd Brits octrooischrift 1.531.212.

Het verdient aanbeveling om een aanmerkelijke overmaat esterase te gebruiken.

Het gevormde desacetylcefalosporine C kan op gebruikelijke wijze worden geïsoleerd , bijvoorbeeld zoals beschre-25 ven in het Britse octrooischrift 1Λ33.528. Na centrifugeren of filtreren van de cultuurvloeistof, bijvoorbeeld door een kiezelgper-bed, kan het isoleren bijvoorbeeld worden uitgevoerd door de oplossing te ontzouten waarbij de oplossing wordt geadsorbeerd aan kool waarna met aceton en water wordt geelueerd. Het eluaat kan dan ver-30 der worden gezuiverd door adsorptie aan een anionenuitwisselaar-hars (bijvoorbeeld Amberlite IRA-68 in de acetaatvorm) en elueren van het desacetylcefalosporine met een kaliumacetaatoplossing gevolgd door precipitatie met aceton,

Het esterase verkeert gewoonlijk in een vorm 35 waarin het gemakkelijk in de fermentatievloeistof wordt verdeeld.

800 4151 6

Wanneer het esterase afkomstig is uit een ander microorganisme dan voor de vorming van cefalosporine C wordt gebruikt, kan een monster van de cultuur of van de afgescheiden cellen worden genomen, bij voorkeur na een behandeling om de levensvatbaarheid van de cel-5 len teniet te doen, en desgewenst na destructie van de cellen bijvoorbeeld door ultrasone behandeling, behandeling met lytische enzymen of behandeling met detergentia. Andere manieren om cellen te prepareren waardoor zijhoudbaar blijven zonder dat de esterase-aktiviteit vermindert komen eveneens in aanmerking, zoals aceton 10 gedroogde poeders of aceton behandelde cellen.

Verder kan het esterase in celvrije vorm worden toegepast. Dan wordt een filtraat of de uit de gebruikte kweek afkomstige bovenstaande vloeistof gebruikt. De cellen kunnen desgewenst worden gedestrueerd bijvoorbeeld zoals boven aangegeven, 15 alvorens te filtreren of centrifugeren. In plaats daarvan kan het celvrije esterase verder worden gezuiverd op gebruikelijke wijze bijvoorbeeld enzymprecipitatie met bijvoorbeeld een zout of een organisch oplosmiddel zoals aceton, chromatografie over bijvoorbeeld een ionenuitwisselaarhars of een drager met een specifieke affini-20 teit voor het enzym, of ontzouten bijvoorbeeld door gelfiltratie of dialyse. Het celvrije esterase kan worden gebruikt als een oplossing of precipitaat, of in geïmmobiliseerde toestand.

Wanneer het esterase afkomstig is uit een hoger ontwikkelde plantenbron, verdient het aanbeveling om een 25 enzym bevattend extract uit deze bron te gebruiken. Dergelijke extracten kunnen op gebruikelijke wijze worden verkregen bijvoorbeeld door malen of persen zoals beschreven in het Britse octrooischrift 966.222, of chemisch bijvoorbeeld door de plantenbron te behandelen met een vloeibare koolwaterstof bijvoorbeeld petroleumether zoals 30 beschreven in het Britse octrooischrift 1.121.308. Het verkregen preparaat kan al dan niet na verwijderen van celresten rechtstreeks aan de hydrolyseoplossing worden toegevoegd. Desgewenst kan het preparaat ook nog verder worden behandeld onder gebruikmaking van de boven aangegeven methode om een celvrij esterase te verkrijgen.

800 41 51 7

Het is duidelijk dat wanneer bovenbeschreven vormen van het acetylesterase worden toegepast, het enzym aan de fermentatievloeistof moet worden toegevoegd. Maar het is ook mogelijk om het enzym in situ in de fermentatievloeistof te vormen door 5 gebruik te maken van een gemengde cultuur van het cefalosporine-producerende organisme en één van bovengenoemde esterase-protuce-rende organismen. In plaats van een mengcultuur kunnen ook nrcro-organismen worden gebruikt die zowel cefalosporine C als esterase produceren tijdens de fermentatie. Voorbeelden van dergelijke micro-10 organismen zijn mutanten van Acremonium chrysogenum. Dergelijke mier oor ganismen zijn niet eerder bes direven en maken deel uit van de uitvinding.

Mutanten van Acremonium chrysogenum die zowel cefalosporine C als esterase vormen, kunnen op verschillende manie-15 ren worden verkregen zoals die beschreven in Techniques For the Development of Micro-Organisms door H.I. Adler in "Radiation and Radioisotopes for Industrial Microorganisms", Proceedings of the Symposium, Vienna, 1973, biz. 2^1, International Atomic Energy Authority". Deze methoden omvatten: 20 1) bestraling met ioniserende stralen bijvoor beeld X- en γ-stralen, bestraling met UV al dan niet bij aanwezigheid van een fotosensibilisator bijvoorbeeld 8-methoxypsoralen; behandelen met stikstofoxyde, hydroxylamine, pyrimidinebasen bijvoorbeeld 5-broomuracil, acridines, alkyleringsmiddelen bijvoorbeeld 25 ethylmethaansulfonaat of mosterdgas, waterstofperoxyde, fenolen of formaldehyde, of een warmtebehandeling, en 2) genetische manipulatietechnieken zoals recombinatie, transductie, transformatie, lysogenisatie, lysogene conversie en spontane mutatie.

30 Bestralen met UV licht komt het meest in aan merking.

Geschikte mutanten zijn die welke tijdens de fermentatie weinig cefalosporine C en veel desacetylcefalosporine C produceren en daarnaast in staat zijn toegevoegd cefalosporine C 35 te desacetyleren. Beide bepalingen kunnen volgens standaardmethoden 800 41 51 8 worden uitgevoerd.

De in de hierna volgende voorbeelden gebruikte stam IMI 237183 is gedeponeerd in het Commonwealth Mycological Institute, Kew, Engeland op 9 april 1979. Stammen van deze soort 5 zijn onder andere beschreven in "Cephalosporium-artige Schimmelpilze (Hyphomycetes)" door Walter Gams (Verlag, W. Germany) 1971» blz. 109-111.

Voorbeeld I

(a) Bereiding van acetylesterase 10 Rhodosporidium toruloides CBS 31*9 werd 72 uren gekweekt in kolven met een inhoud van 2 1, die elk een medium bevatten bestaande uit glucose (2 gew.$) gistextract (1 gew.#), * pepton (1 gew.%), kaliumdiwaterstoffosfaat (0,5 gew.%) en polypro-pyleenglycol (0,1 gew.#). Hierna werd 100 ml van de gistsuspensie 15 overgebracht in een gesteriliseerde kolf en gekoeld op 1*°C. Gekoelde aceton (30 ml, -10°C) werd toegevoegd. Na korte tijd roeren werd nog meer koude aceton portie-gewijs toegevoegd tot een acetoncon-centratie van 75 vol.#. Hierna liet men de gistcellen bezinken waarna de bovenstaande vloeistof werd afgeschonken en verse zuivere 20 aceton werd toegevoegd. Na goed mengen werd overmaat aceton door decanteren verwijderd waarna de behandelde cellen twee keer werden gecentrifugeerd in gesteriliseerd water. De gewassen cellen werden opnieuw gesuspendeerd in gesteriliseerd water om een suspensie te verkrijgen met een esteraseaktiviteit van 3,5 I.E./ml.

25 (b) Fermentatie van desacetylcefalosporine C (DAC)

Het fermenteren werd uitgevoerd in schudkol-ven die elk 9 »5 ml van een medium met de hierna aangegeven samenstelling bevatte waaraan 0,1* ml van de boven onder (a) bereide ase ester^uspensie na behandelen in een autoclaaf, was toegevoegd.

30 maisweekvloeistof 0,5 % als stikstof lactose 1*6 g/1 glucose 2 g/1 methionine 2,3 g/1 fenylacetylethanolamine 1,5 g/1 35 calc iumcarbonaat 16 g/1 800 4 1 51 9 ureum 0,6 g/1 ammoniumsulfaat 3,^ g/1 maïsolie 6 druppels per kolf pH met ïïaOH ingesteld op 6,6 5

De inhoud van de kolven werd geent met Acremonium chrysogenum stam IMI 237183 (0,5 mol). Deze stam was tevoren ^8 uren gekweekt in een medium dat maisweekvloeistof (0,1 gev.% als stikstof), ammoniumacetaat (5,5 g/l)> sucrose (25 g/1) en IQ calciumcarbonaat (10 g/l) bevatte. De kolven werden 5 dagen gein-cubeerd bij 25°C onder schudden. Na 3, ^ en 5 dagen werd de concentratie desacetylcefalosporine C (DAC) bepaald door hogedrukvloeistof-chromatografie (HPLC). Deze concentraties zijn in onderstaande tabel A vermeld, samen met die voor een uitvoering onder dezelfde omstandigheden maar zonder esterase.

TABEL A

Tijd, Concentratie DAC Concentratie DAC

dagen /ug/mlx »ug/ml* 20 met esterase zonder esterase 3 352 89 1* 1732 137 5 2615 U78 i ' : I ! 25 * . .

gemiddelde uit drie bepalingen

Voorbeeld II Enting

Een gevriesdroogde ampul met Acremonium on chrysogenum IMI 237183 werd gereconstitueerd met vloeibaar Sabouraud’s medium (2 ml). Met de verkregen celsuspensie werd in een 250 ml Blake-kolf (een kolf met vlakke zijkanten) gestold Sabouraud's medium geent. De cultuur werd 1^ dagen bij 25°C geincubeerd.

800 4 1 51 10

Samenstelling Sabouraud's medium maltose Π,0 gev./vol.# mout extract 2,H gev. # pepton 1,0 gev.# 5 agar 2,5 gev.# water tot 100 gev.# pH 7,5 (ingesteld voor sterili satie)

Na afloop van het incuberen verden ongeveer 50 ml gesteriliseerd water en glaskralen toegevoegd om de opper-vlaktecultuur weg te wassen. Met de celsuspensie (k ml) werd in een 500 ml Roux-kolf (een kolf met vlakke zijkanten) gestold Sabouraud's medium geent. De kolven werden 12 dagen bij 25°C ge-incubeerd.

^ Na afloop werden Ho ml gesteriliseerd water en glaskralen toegevoegd om de oppervlaktecultuur weg te wassen.

Met deze celsusp-ensie (6 ml) werd 600 ml pepton-moutextractmedium geent in 2 1 kolven met vlakke bodem en voorzien van keerplaten.

Samenst elling pepton-moutextractmedium 2q pepton 1,0 gev./vol.# mout extract 2, H gev. #

Yeatex korrels 2,68 gev.# calciumcarbonaat 0,5 gev.# sojaboonolie 1,96 gev.# 2^ water tot 100 # pH 7,5 (ingesteld voér sterili satie ).

De kolven verden 72 uren geincubeerd bij 25°C

in een schudinrichting bij 110 slagen per min. en een uitslag van k ,9 cm. Na afloop werd de cultuur in twee porties verdeeld.

30

Er werden twee fermentaties uitgevoerd in een 7 1. fermentatieinrichting bij 25°C onder roeren. Het gebruikte fermentatiemedium had dezelfde samenstelling als dat in voorbeeld I

(b) echter met dit verschil dat de hoeveelheid maisolie 3,0 vol.# bedroeg. De pH werd met 1 M zwavelzuur en 8 M ammoniumhydroxyde op 800 4 1 51 11 6,0 + 0,1 gehouden. Zuurstof werd door het medium geleid waarbij de spanning van de opgeloste zuurstof tijdens de fermentatie op meer dan 30 % werd gehandhaafd. Om de concentratie vrije ammoniak op meer dan 500 ppm te houden, werd tijdens de fermentatie met tussen-5 pozen 2h gew.^-ige ammoniumsulfaatoplossing toegevoegd. Toen na ongeveer 72 uren de koolstofbronnen waren uitgeput, werd een 55-gew.^-ige cereloseoplossing (glucosemonohydraat) toegevoegd tot een totale hoeveelheid van 15 ml/uur.

Tijdens één van de fermentaties werd aan het 10 begin van de cefalosporine groeifase (na 1+8 uren) acetylesterase afkomstig uit Rhodosporidium toruloides CBS 3*+9 (bereid zoals in voorbeeld I a) toegevoegd in een hoeveelheid equivalent met 1+00 ml gistcultuur.

De fermentaties werden 8 dagen uitgevoerd 15 waarbij eerst na 1+5 uren en daarna om de 2l+ uren de concentraties cefalosporine C en desacetylcefalosporine C (DAC) werden bepaald door hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC). De concentraties zijn in onderstaande tabel B vermeld.

TABEL B

20 ΓΤ. ^

Tijd, Zonder esterase met esterase | uren con.Cef,C,^ug/g conc.DACyUg/g j conc.Cef.C^ug/g conc.DAC^ug/g 1+5 1+00 50 ! 500 i 0 ! j 69 1800 120 j 200 1500 ; 25 93 1800 160 0 2200 117 2700 320 0 3000 11+1 2500 1+30 0 3300 165 2600 610 0 3500 189 2300 720 l 0 3900 30 _|_

Om de opbrengstverhoging met esterase aan te tonen, zijn in onderstaande tabel C de concentraties desacetylcefalosporine C (DAC) na 11+1 en 189 uren aangegeven in concentratie-equivalent cefalosporine C.

800 4 1 51 12

TABEL C

Tijd, Zonder esterase met esterase % opbrenstverhoging

uren conc.cef.C, ,ug/g conc.DAC in CefC voor DAC

' equiv.

5 1U1 2500 3663 U7 189 2300 h329 88 ! _f___ 800 4151

Claims

1. Werkwijze voor het bereiden van desacetyl-cefalosporine C, met het kenmerk dat, een cefalosporine C vormend microorganisme wordt gekweekt bij aanwezigheid van een acetyleste- 5 rase in een voldoende hoeveelheid om al of nagenoeg al het gevormde cefalosporine C voordat het niet-enzymatisch wordt ontleed, om te zetten in desacetylcefalosporine C.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de fermentatie 1-20 dagen wordt uitgevoerd 10 bij een temperatuur van 15-U5°C en een pH van ^-9.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de fermentatie U-10 dagen wordt uitgevoerd bij een temperatuur van ongeveer 25°C en een pH 5-8. U. Werkwijze volgens één der conclusies 1-3, 15 met het kenmerk, dat het cefalosporine C vormend microorganisme een stam is van het species Acremonium chrysogenum.

5. Werkwijze volgens één der conclusies 1-3, met het kenmerk, dat het cefalosporine C vormend microorganisme een stam is van het genus Cefalosporium, Emericellopsis of

20 Streptomyces.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat het cefalosporine C vormend microorganisme een stam is van het species Cephalosporium polyaleurum, Emericellopsis glabra, Emericellopsis microspora of Streptomyces lactamdurans

7. Werkwijze volgens één der conclusies 1-6, met het kenmerk, dat voor groeifase van het cefalosporine C een acetylesterase wordt toegevoegd in overmaat.

8. Werkwijze volgens één der conclusies 1-7, met het kenmerk ,dat het acetylesterase afkomstig is uit een hoger 30 ontwikkelde jdant, een bacterie, een gist of een fungus.

9. Werkwijze volgens één der conclusies, 1-8, met het kenmerk, dat het acetylesterase afkomstig is uit het bacterièle genus Rhizobium, het gist genus Rhodotorula, een microorganisme uit de klasse der Basidiomycetes, of een micro-

800 A 1 51 11* organisme van het species B. subtilis.

10. Werkwijze volgens êén der conclusies 1-9» met het kenmerk» dat het acetylesterase afkomstig is uit een micro-organisme van het species Rhodosporidium toruloides.

11. Werkwijze volgens êén der conclusies 1-10, met het kenmerk, dat het acetylesterase afkomstig is uit de stam Rhodosporidium toruloides CBS 3^+9.

12. Werkwijze volgens êén der conclusies 1-11, met het kenmerk, dat het acetylesterase wordt gebruikt in de 10 vorm van een celvrij preparaat.

13. Werkwijze volgens één der conclusies 1-7, met het kenmerk, dat het acetylesterase in situ wordt gevormd door fermentatie van een acetylesterase producerend microorganisme. 11*. Werkwijze volgens één der conclusies 1-7, 15 of 13, met het kenmerk, dat het acetylesterase in situ wordt gevormd door het cefalosporine C producerend microorganisme tijdens het fermenteren.

15· Cefalosporine C vormend microorganisme, met het kenmerk, dat het microorganisme tijdens fermentatie een 20 voldoende hoeveelheid acetylesterase produceert om al of nagenoeg al het gevormde cefalosporine C voordat het niet enzymatisch wordt ontleed, om te zetten in desacetylcefalosporine C.

16. Microorganisme volgens conclusie 15, met het kenmerk, dat het microorganisme een mutant van Acremonium 25 chrysogenum is.

17. Werkwijze en daarbij toegepaste produkten en microorganismen alsmede daarbij verkregen of verkrijgbare produkten zoals beschreven in de beschrijving en voorbeelden. 800 4151