KR830002916B1 - 발효에 의한 세팔로스포린 제법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 발명]

발효에 의한 세팔로스포린 제법

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 발효에 의해 세팔로스포린을 제조하는 방법에 관한 것이다.

세팔로스포린C 발효는 여러가지의 반합성 세팔로스포린 항생물질 제조시 다량 사용되는 세팔로스포린핵의 1차적 원천이다. 이 발효는 일반적으로 수일에 걸쳐 일어나며 세팔로스포린C 자체가 수용액중에서 β-락탐 가수분해에 의해 비효소적으로 분해되기 때문에 통상의 공업적 발효시 비 효소적 분해로 인해 세팔로스포린C 역가가 대략 25% 소실됨이 관찰되었다.

또한 일반적으로 발효시 생성된 세팔로스포린 핵의 약 15%는 데스아세틸 세팔로스포린C로써 존재하고 있음이 관찰되었다. 이 화합물 도한 세팔로스포린 핵의 공급원으로 유용하지만 일반적으로 필요한 기술과 작업 규모의 차이로 생성이된 데스 아세틸 세팔로스포린C의 분리가 불편하고 비경제적이다. 따라서 세팔로스포린 핵의 15%를 차지하는 데스아세틸 세팔로스포린C도 손실분으로 보아 생성된 세팔로스포린 핵의 총40%가 세팔로스포린C 추출에 이용되지 못한다.

우리는 본 발명에 의해 놀랍게도 초기의 연구자들(Konecny et al., J. Antib., Vol, XXVI, No. 3, P140)에 의해 이미 제안된 것과는 반대로 데스아세틸 세팔로스포린C가 세팔로스포린C에 비해 배양 육즙중에서는 비효소적 β-락탐 분해에 더욱 안정하다는 것을 발견하게 되었다. 우리는 예상밖으로 발효 조건하의 수용액 및 배양육즙중에서 감수성 분석법으로도 데스아세틸 세팔로스포린C의 분해를 확인할 수 없었다. 우리는 이러한 발견을 이용하여 발효중엥 세팔로스포린C가 생성이되자마자 데스아세틸세팔로스포린C로 변환시키는 공정을 개발하였다. 이러한 공정으로 두가지가 얻어진다. 첫째는 데스아세틸 세팔로스포린C의 놀라운 안정성으로 분해에 의한 세팔로스포린 생성물의 손실이 실제적으로 없고 두째는 통상의 발효중 생성되는 데스아세틸 세팔로스포린C가 회수될 수 있는 것이다. 따라서 우리는 세팔로스포린 생성물의 희수가 다량 증가될 수 있다는 것을 발견하였다. 증가율은 통상 약 40%이나 이는 통상의 세팔로스포린C 발효중 데스아세틸 세팔로스포린C의 함량과 세팔로스포린C 포집 역학에 따라 차이가 있다.

또한 우리는 발효가 통상의 세팔로스포린C 제조기간보다 오래 계속될 때에는 데스아세틸 세팔로스포린C가 계속 축적된다는 것을 발견하였다. 일반적으로 세팔로스포린C의 축적은 표준 기간인 약 6일간의 발효후에는 저하되나 아세틸 에스터레이즈 존재하에 발효기간이 2일 또는 그 기간의 1/3 정도가 연장된다면 이용될 수 있는 세팔로스포린 핵의 50%까지가 더욱 얻어질 수 있다는 것이 발견되었다. 따라서 발효기간이 연장되면 이러한 방법으로 생성된 데스아세틸 세팔로스포린C에 의해 얻어진 유용한 세팔로스포린 핵의 총량은 통상의 세팔로스포린C 발효시 보다 90%가 더욱 많다.

그러므로 유용될 수 있는 핵의 수득율이 현저히 증가되어 상당한 경제적인 가치를 지니게 된다. 또한 세팔로스포린C의 불안정성으로 인한 제한과 발효에 의해생성이된 세팔로스포린 핵의 수득율이 제한이 현저히 감소될 수 있다.

데스아세틸 세팔로스포린C는 세팔로틴 및 세팔로리딘과 같은 약물학적으로 가치있는 유도체로 쉽게 변환될 수 있다. 그러므로 본 발명에서는 아세틸 에스터레이즈 효소존재하에서 세팔로스포린C 생성 미생물을 발효시켜 생성된 모든 세팔로스포린C를 비효소적으로 분해되기 전에 데스아세틸 세팔로스포린C로 변환시킴을 특징으로하여 데스아세틸 세팔로스포린C를 제조하는 방법을 규정한다.

아세틸 에스테레이즈는 발효처에 가하거나 발효중 세팔로스포린C 증가기 초에 임의의 간격을 두고 가한다. 그렇지 않으면 발효 공정내에서 생성시킬 수도 있다.

에스테레이즈 효소는 극히 광범위한 원천으로부터 유도될 수 있다. 에스터레이즈는 고등식물, 세균 효모 및 곰팡이로부터 유도될 수 있다. 적합한 고등 식물원에는 영국 특허공보 제966,222호에 기술된 바와 같은 감귤 껍질 및 영국특허공보 제1,121,308호에 기술된 밀 배아가 있다. 후자의 명세서에서는 또한 리쪼비움 균속에서의 아세틸 에스터레이즈 활성도를 기술하고 있다. 적합한 효모원으로는 영국 특허공보 제 1,474,519호에 기술된 바와 같이 로도토룹라 속의 효모가 포함된다. 영국특허 공보 제1,531,212호에 기술된 담자균류 미생물과 App.Microbiol Vol. 30, P413에 기술된 B. 섭틸리스종의 세균도 적합한 생성원이 된다. 특히 적합한 것으로 밝혀진 효소원은 로도스포리디움 속 미생물, 특히 상기 언급된 영국 특허공보 제1,531,212호에 기술된 CBS 349균주와 같은 로도스포리디움토룹로이드 종이다.

유용한 에스터레이즈원을 선별하는 적합한 방법은 영국 특허공보 제1,531,121호에 기술되어 있다. 여기에는 담자균류 미생물에 의해 생성이된 에스터레이즈 농도를 측정하는 방법이 일반적으로 기술되어 있으나, 다른 생형원으로부터 적절히 선택된 조건하에서 생성된 에스터레이즈 감별법도 쉽게 적용시킬 수 있다.

본 발명의 방법은 공지의 세팔로스포린C 생성균주를 아세틸에스터레이즈 효소존재하 호기성 조건, 바람직하게는 액침 배양으로 공기 또는 산소와 함께 진탕 또는 교반시켜 배양함으로써 바람직하게 시행될 수 있다. 사용된 발효 매질에는 탄소동화원, 질소 소화원, 원한다면 무기염과 같은 성장촉진 물질이 함유되어야 한다.

적합한 탄소원으로는 글루코즈, 슈크로즈, 전분, 용성전분, n-파라핀, 식물 및 동물유, 아세트산, 메탄올, 글리세롤, 소르비톨 및 에탄올이 있다.

적합한 질소원으로는 천연 질소 함유물질 또는 수육 추출물, 펩톤, 카제인, 콘스팁리쿼(corn steep liquor) 효모추출물, 대두분, 트립톤, 면실분 및 밀겨와 같은 천연질소함유 물질로부터 생성된 물질이 있다. 질소함유 유기 또는 무기 화합물로는 우레아, 나이트레이트 및 암모늄아세테이트,암모늄 클로라이드 암모늄설페이트 및 암모늄포스페이트와 같은 암모늄염이 사용될 수 있다.

발효 매질로 사용될 수 있는 무기염으로는 칼륨, 마그네슘 및 칼슘의 설페이트, 나이트레이트, 클로라이드, 카보네이트 및 포스페이트가 있다.

사용될 수 있는 발육촉진 물질로는 시스테인, 시스틴, 티오설페이트, 메틸 올레이ㅌ 및 특히 메티오닐이 있고 또한 철, 아연동 및 망간과 같은 미량원소가 있다. 온도 및 발효시간등과 같응 배양조건은 사용된 균주가 원하는 세팔로스포린을 최대량 축적시킬 수 있도록 선택한다. 예를 들면 발효를 15 내지 45℃, 바람직하게는 약 25℃ 온도, pH 4내지 9 예를들면 5-8, 바람직하게는 약 6에서, 1-20일, 바람직하게는 4-10일간 시행하는 것이 유리하다.

가장 바람직한 세팔로스포린C생성 균주는 아크테모니움 크리조제눔(세팔로스포리움 아크레모니움으로써 알려진) 균주이다. 아크레모니움 크리조제눔의 몇몇 변이주도 발효시 동일반응계 내에서 아세틸에스터레이즈를 대량 생성시킬 수 있음이 발견됐다. 기타의 세팔로스포리움속 미생물, 예를들면 세팔로스포리움 폴리알로이눔, 및 에메리셀롭시스 글라브라, 에메리셀롭시스 마이크로스포라 및 스트렙토마이세스 락탐듀란스 균주와 같은 에메리셀롭시스와 스트렙토마이세스속 미생물도 세팔로스포린C를 생성할 수 있다.

발효시 생성된 세팔로스포린C를 데스아세틸 세팔로스포린C로 변환시킨는데 요구되는 에스터레이즈 또는 에스터레이즈 함유물질의 양은 효소 활성도 예비 분석법 또는 소형 시험법에 의해 간단히 측정될 수 있으며 이는 에스터 레이즈와 사용된 반응 조건에 따른다. 이 반응에 계속하여 HPLC 하거나 적적한 지지/용매계 화합물을 사용하여 박층 또는 종이크로마토그라피함으로써 분리하고 농도계로 분석한다. 적합한 방법은 상기에 언급된 영국특허 공보 제1,531,212호에 기술되어 있다. 일반적으로 에스터레이즈를 실질적으로 초과량 사용하는것이 편리하다.

데스아세틸 세팔로스포린C 생성물 준리에 사용되는 방법으로는 일반적으로 영국 특허공보 제1,433,528호에 기술된 바와 같은 종래의 기술을 이용한다. 규조토 배드에 발효 육즙을 통과시켜 원심분리 또능 여과한 후, 이 용액을 탄소에 흡착시켜 제염시키고 아세톤과 물로 용출시킴으로써 분리한다. 용출물은 또한 음이온 교환수지(예를 들면 앰버라이트 IRA-68에 아세테이트 상태로)에 흡착시킨후 칼륨 아세테이트 용액으로 수지로부터 데스아세틸 세팔로스포린을 용출시키고 생성물을 아세톤으로 침전시켜 더욱 정제한다.

일반적으로 에스터레이즈는 발효 육즙중에 쉽게 분포되어 세팔로스포린C를 가수분해할 수 있는 상태로 되어있다. 따라서 에스터레이즈가 타미생물로부터 생성될 경우 바람직하게 세포를 생존할 수 없도록 처리하여, 원한다면 초음파처리, 분해 효소로 처리 또는 세척제로 처리하는 종래의 방법에 의해 세포를 파열시킨 후 전배양 표본을 사용하거나 분리된 세포를 사용한다. 저장지 에스터레이즈활성도를 보유하는 기타의 세포제제가 사용될 수 있으며 예를 들면 아세톤 건조 문말 또는 아세톤 처리 세포가 있다.

미생물적 에스터레이즈는 또한 무세포형으로 사용될 수 있다. 따라서 배양시 얻어진 여액이나 상등액이 사용될 수도 있다. 원한다면 세포를 여과나 원심분리전에 상기에 기술된 바와 같이 파열시킨다. 그외에 무세포 에스터레이즈는 종래의 방법에 의해 정제시킬 수 있다. 사용되는 기술에는 염이나 아세톤과 같은 유기용매로 효소를 침전시키는 방법, 이온 교환수지나 효소에 특정한 친화력을 지닌 지지체상에서 크로마토그라피하는 방법 및 겔 여과나 투석과 같은 제염법이 있다. 무세포 에스터레이즈는 용액, 침전물 또는 적절히 고정시킨 제제로써 사용될 수 있다.

에스터레이즈가 고등 식물로부터 생성될 경우에는 식물의 효소함유 추출물을 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 추출물은 영국 특허공보 제966,222호에 기술된 바와 같이 분쇄 또는 압착시키는 물리적 기술이나 영국 특허공보 제1,121,308호에 기술된 바와 같이 석유 에트르와 같은 탄화수소 용매로 식물을 처리하는 화학적 기술에 의해 식물로부터 효소를 초기에 유리시키는 종래의 방법에 의해 제조될 수 있다. 생성된 제제를 세포편을 제거 또는 제거시키지 않고 가수분해 용액에 직접 가한다. 그렇지 않고 원한다면 제제를 미생물적 효소에서 상기 기술된 기술을 사용하여 더욱 처리함으로써 무쇄포 에스터레이즈를 얻는 것이다.

상기 기술된 상태의 아세틸 아세터레이즈를 사용할 경우 효소를 실제 발효 육즙에 가해야 한다. 그러나 다른 방법으로 세팔로스포린 생성균과 처음에 언급된 에스터레이즈 생성 균중의 하나를 혼합한 배지를 사용하여 반응계내에서 효소를 생성시킬 수도 있다. 발효시 세팔로스포린C 외에 에스터레이즈를 다량 생성시키는 아크레모니움 크리조제눔의 변이주와 같은 기타의 미생물이 사용될 수도 있다. 이들 미생물은 전에는 보고된 바 없으며 따라서 ㄹ발명의 특성이 되고 있다.

이들 아크레모니움 크리조제늄 변이주는 H.I. Adler in "Radiation and Radioisotopes for Industrial Microorganisus", Proceedings of the Symposium, Vienna, 1973, P, 241, Intermational Atomic Energy Authority에 미생물 생성 기술로 기술된 방법을 포함한 여러가지 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들 방법에는 다음이 포함된다 :

i) 이온화 방사선, 예를들면 X-및 γ-선, 자외선, 8-메톡시프소라겐과 같은 감광체 존재하의 자외선; 아산화질소; 하이드록실아민; 5-브로모우라실과 같은 피리미딘 염기 동족체; 아크리딘; 에틸 메탄설포네이트 또는 머스타드가스; 과산화수소; 페놀; 포름알데히드; 열; 및 ii) 유전적 기술, 예를 들면 재결합 형질도입, 형질전환, 용원화, 용원화 변환 및 자연 변이시키는 선택적 기술

우리는 자외선 이용이 적합하다는 것을 발견하였다.

이러한 과정에서 본 발명에 따라 존재하는 변이체는 적절한 감별 방법에 의해 확인될 수 있다. 따라서 첫 방법으로는 발효 전과정을 통해 DAC 상당량과 세팔로스포린C 소량을 생성하는 변이체는 표준 분석법에 의해 확인된다. 두번째 방법에서는 세팔로스포린C를 탈아세틸화시키는 변이체를 또한 표준 분석법에 의해 확인한다. 이러한 관점에서 본 발명에 따르는 변이체는 두가지 감별법 모두를 만족시킨다.

본 발명의 다음의 실시예에서 제한적인 의미없이 더욱 특별히 기술되고 있다. 모든 온도는 0℃이다.

IMI 237183균주는 Commonwealth Mycological Institute, Kew, England에 1979년 4월 9일 기탁되었다.

이러한종류의균주는Cephalosporium-artige Schimmelpilze(Hyphomycetes by Walter Gams(Verlag, W. Germany) 1971, pp 109-1111에 기술되어 있다.

[실시예 1]

(a) 아세틸 에스터레이즈의 제조

로도스포리디움 토루로이드 CBS 349를 2ℓ 플라스크 내에서 글루코즈(2%), 효모 추출물(1%), 펩톤(%)칼슘 디하이드로젠 포스페이트(0.5%) 및 폴리프로필렌 글리콜(0.1%)을 함유하는 액체 배지에서 72시간동안 발육시킨다. 효모 현탁액 100ml를 무균 플라스크에 넣고 4°로 냉각시킨다. 여기에 미리 -10℃로 냉각시킨 아세톤(30ml)을 가한다. 단시간동안 교반한후 냉각시킨 아세톤을 계속적으로 가하여 아세톤 농도를 단계적으로 75% V/V으로 높인다. 효모세포를 침전시키고 상등액을 경사한후 신선한 순수 아세톤을 가한다. 충분히 혼합한 후 과량의 아세톤을 경사시키고 처리된 세포를 무균수중에서 원심분리하여 2회 세척한다. 세척된 세포를 무균수에 재현탁시켜 3.5iu/ml의 에세터레이즈 활성을 지닌 현택액을 수득한다.

(b) 데스아세틸 세팔로스포린 C (DAC)의 발효

하기의 조성물 매질(9.5ml)을 함유하는 진탕 플라스크 내에서 발효를 시행하며 여기에 고압 멸균후(a)에 제조된 에스터레이즈 현탁액 0.4ml를 가한다 :

콘 스팁리쿼 0.5% 질소로써 칼슘 카보네이트 16g/ℓ

락토즈 46g/ℓ 우레아 0.8g/ℓ

글루코즈 2g/ℓ 암모늄 설페이트 3.4g/ℓ

메티오닌 2.3g/ℓ 옥수수유 플라스크당 6적

페닐아세틸에탄올아민 1.5g/ℓ pH(고압멸균전 NaOH로 조절) 6.6

콘 스팁 리쿼(0.1% 질소로써), 암모늄 아세테이트(5.5g/1), 슈크로즈(25g/1)및 칼슘 카보네이트(10g/1)를 함유하는 매질에서 48시간동안 전 발육시킨 A. 크리조제눔 균주 IMI 237183(0.5ml)를 플라스크에 접종시킨다. 플라스크를 25°진탕기상에서 5일간 배양하여 DAC 역가를 HPLC로 측정한다. 표 1은 3,4 및 5일후의 DAC 역가를 나타낸다; 각 숫자는 개별적으로 3개의 플라스크로 분석된 평균치를 나타낸다. 매질 및 미생물을 함유하나 에스터레이즈는 함유하지 않는 대조 플라스크에도 동시에 반응을 진행시켰다.

[표 1]

[실시예 2]

[접종물의 성장]

A. 크리조제눔 IMI 237183을 동결 건조시킨 앰풀에 Sabouraud's 매질액(2ml)을 가하여 재조제한다.

생성된 세포 현탁액을 고체화시킨 Sabouraud's 매질을 함유하는 250ml 편평면 병(블레이크 병)에 접종시킨다. 배양물을 25°에서 14일간 배양시킨다.

무균수 약 50ml와 유리구슬을 배양 완결후에 가하여 표면 배양물을 세척한다. 현탁시킨 세포는 고체화한 Sabouraud's 매질을 함유하는 500ml 편평면 병(Roux병)에 접종한다. 매 Roux 병 마다 현탁액을 약 4ml 사용한후 25°에서 12일간 배양한다.

무균수 40ml와 유리 구슬로 표면 배양을 세척하면 세포 현탁액이 제조된다. 이 현탁액을 펩톤/맥아 추출물 600ml를 함유하는 2ℓ 편평바닥 플라스크내의 액체 채종기 배양물에 접종시킨다.

액체 채종기 배양물에 Roux 병으로부터 6ml 세포 현탁액을 접종시킨 후 25°의 진탕기상에서 110회전/분 4.9cm 낙차로 진탕시키면서 72시간 동안 배양한다. 두 액체채종기 배양물을 적하시켜 접종물이 주 발효기에 이르도록 한다.

두가지 발효를 각기 7ℓ 발효조에서 옥수수유가 3.0% V/V 존재하는 것을 제외하고는 실시예1(b)과 같은 발효 매질을 사용하여 25°에서 교반하면서 시행한다.

pH는 1M황산과 8M 수산화 암모늄을 사용하여 6.0±0.1으로 조절한다. 발효중 용해된 산소가 30%이상으로 포화되도록 유지한다. 24% 암모늄 설페이트 용액을 일부 발효물에 보조 공급하여 유리 암모니아 농도를 500ppm 이상 유지시킨다. 1회1분의 탄소공급이 약 72시간에 소모되면 나머지 발효물에 글루코즈를 공급하여 호흡율을 유지시킨다. 이량은 대략 55% 세레로즈(글루코즈 모노하이드레이트) 15ml/hr이다.

데스아세틸 세팔로스포린C를 생성하는 발효의 잇점을 증명하기 위하여 세팔로스포린 증가기 초(48hr)에 발효물중의 하나에 로도스포리디운 토루로이드 CBS 349(실시예 1a에서와 같이 제조된)로 부터의 아세틸 에스테레이즈를 가한다. 효모육즙 400ml에 상당한 량을 가한다.

8일간 발효시키고 세팔로스포린 C 및 DAC에 대해 매일 HPLC분석한다.

세팔로스포린C를 생성하는 대조 발효군과 DAC를 생성하는 에스터레이즈 처리된 발효군의 비교를 표 3에 밝힌다.

[표 3]

표 4는 세팔로스포린 C 당량으로 표시한 141 및 189시간에서의 DAC 역가이다.

[표 4]

Claims (1)

1. 세팔로스포린C의 비효소적 분해가 일어나기전에 생성된 모든 세팔로스포린C를 데스아세틸 세팔로스포린C로 변환시키기에 유효한 량의 아세틸 에스터레이즈 존재하에 세팔로스포린C 생성 미생물을 발효시킴을 특징으로하여 데스아세틸 세팔로스포린C를 제조하는 방법.