IT9047953A1 - Procedimento biocatalitico per la produzione di l-(-)- carnitina da crotonilbetaina e ceppi di proteeae per l'uso in tale procedimento - Google Patents
Procedimento biocatalitico per la produzione di l-(-)- carnitina da crotonilbetaina e ceppi di proteeae per l'uso in tale procedimentoInfo
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Description
Descrizione dell'Invenzione Industriale dal titolo:
"Procedimento biocatalitico per la produzione di L-(-)-carnitina da crotonoilbetaina e ceppi di Proteeae per l'uso in tale procedimento'.
RIASSUNTO
Viene descritto un procedimento per idratare stereospecificamente crotonoilbetaina a L-(-)-carnitina mediante l'azione di un'enzima prodotto da quattro nuovi ceppi di Proteus mirabilis (NRRL B-18480, NRRL B-18481, NRRL B-18482 e NRRL B-18483) in terreni di biotrasformazione contenenti dal 10 al 12% (p/v) di crotonoilbetaina sale Interno.
La presente Invenzione riguarda un procedimento per la produzione di L-(-)-carnitina (2) da crotonoilbetaina (1) mediante l'azione di un'enzima prodotto da un microorganismo, detto enzima catalizzando l'idratazione stereospecifica della crotonoilbetaina in L-(-)-carnitina.
La presente Invenzione riguarda Inoltre del ceppi di Proteeae particolarmente adatti per l'uso In tale procedimento.
Come noto, la carnitina contiene un'unico centro di asimmetria e può pertanto esistere sotto forma di due enantiomeri, designati D-(+)-carnitina e L-(-)-carnitina. Di questi, solo la L-(-)-carnitina è nota presentarsi negli organismi viventi ove funziona da carrier per il trasporto degli acidi grassi attraverso le membrane mitocondriali. Mentre è la L-(-)-carnitina l'enantiomero fisiologicamente attivo, per alcuni anni si è usato il racemo DL quale agente terapeutico. Si è dovuto tuttavia riconoscere che la D-carnitina è un Inibitore competitivo delle carnitine aciltransferasi e può abbassare i livelli di L-(-)-carnitina nel miocardio e nel muscolo scheletrico.
E' pertanto essenziale che soltanto la L-(-)-carnitina venga somministrata a pazienti sottoposti a trattamento emodialitico o che sono curati per disturbi cardiaci o del metabolismo lipidico.
Diversi procedimenti chimici sono stati proposti per produrre carnitina su scala Industriale. Questi procedimenti non sono stereospecifici e conducono pertanto a delle miscele raceme di Isomeri D ed L. Conseguentemente, devono venir Impiegati del metodi di risoluzione per separare gli enantiomeri costituenti il racemo. Questi procedimenti di sinte
Claims (17)
- si chimica sono complessi e costosi e conducono in ogni caso alla produzione di quantità uguali di D-carnitina e di L-carnitina. Sono state recentemente descritte diverse procedure microbiologiche per produrre L-(-)-carnitina, sia de novo partendo da comuni Ingredienti di fermentazione, oppure mediante trasformazioni stereospecifiche di derivati betainici achirali. Per quanto riguarda le prime, il brevetto giapponese 71567/1984 (TAKEDA) descrive la capacità della muffa Emericella quadrilineata a produrre L-(-)-carnitina quando coltivata in un brodo complesso di fermentazione. La maggior parte del secondi procedimenti sono basati sull'Idratazione stereospecifica della crotonoilbeteina (1) in L-(-)-carnitina (2), e differiscono l'uno dall'altro principalmente per il particolare microorganismo Impiegato per realizzare la biotrasformazione. La maggior parte di tali ceppi descritti nella pertinente letteratura brevettuale appartengono alla famiglia delle Enterobacteriaceae (si veda ad esempio EP 121444 (HAMARI), EP 122799 (AJIN0M0T0), DDRP 221905 (KARL-MARX-UNIVERSITÀT), la domanda JP 61/234788 (SEITET5U)), sebbene siano note delle eccezioni (si veda ad esempio EP 158194 ed EP 195944 (LONZA) che Impiegano ceppi di Achromobacter xylosoxydans, e la domanda JP 60/275181 (Biol K.K. & CHO KASEHIN K.K.) che rivendicano l'ottenimento di risultati ottimali con la muffa Penicillium citrinum. Altre sostanze che sono state utilizzate come precursori per la produzione microbiologica della L-(-)-carnitina comprendono la 3-deidrocarnitina (ad esempio JP 272086/1987 (AOINOMOTO)) e la carnitina nitrile (EP 319,344 CKYOWA HAKKO KOGYO)). Tuttavia, le procedure microbiologiche che sono state proposte non sono pratiche da realizzare su scala Industriale per uno o più del seguenti motivi: (i) la resa In L-carnitina è estremamente bassa; (ii) il precursore è estremamente Instabile; (iii) i microorganismi devono essere coltivati su mezzi nutritivi costosi; (iv) i microorganismi sopportano soltanto basse concentrazioni di crotonoilbetaina (fino al 2-3% (p/v)); (v) reazioni collaterali, quali ad esempio la riduzione della crotonoilbetaina a gamma-butirrobetaina, oppure l'ossidazione della L-(-)-carnitina a 3-deidrocarnitina, riducono la resa finale della L-(-)-carnitina. La crotonoilbetaina usata nelle procedure che verrano descritte aveva titolo di circa l'89% (p/p) di crotonoilbetaina sale interno (crotonoilbetaina desalificata) circa l'11% (p/p) di acqua (determinata con il metodo Karl Flsher), corrispondente a circa una molecola d'acqua per molecola di crotonoilbetaina. Conseguentemente, questo substrato verrà d'ora in poi Indicato con il termine "crotonoilbetaina monoidrato", sebbene con l'uso del termine "monoìdrato" non s'intenda Implicare una definita relazione strutturale fra la crotonoilbetaina e l'acqua. D'altro canto, ogni qualvolta si userà il termine "crotonoilbetaina sale Interno", ci si Intenderà riferire alla crotonoilbetaina sale interno pura al 100% (crotonoilbetaina anidra, desalinificata). Sono stati Isolati e tipizzati quattro nuovi ceppi di Proteus mirabilis (si veda nel seguito) capaci di Idratare la crotonoilbetaina a L-(-)-carnitina in terreni di biotrasformazione in cui la concentrazione della crotonoilbetaina sale interno è dell'ordine del 10-12% (p/v). Questi nuovi ceppi non richiedono la coltivazione su terreni di biotrasformazione contenenti costose sostanze nutritive e particolari additivi, ma piuttosto possono venir coltivati su terreni semplici e poco costosi. In fine, entro i limiti di sensibilità del metodi analitici Impiegati, i nuovi ceppi di Proteus mirabilis della presente invenzione non promuovono reazioni collaterali (quali quelle indicate al precedente punto (ν)), che potrebbero altrimenti Influenzare negativamente la resa finale In L-(-)-carnitina. Quattro ceppi isolati di Proteus mirabilis sono stati trovati adatti alla conversione del 12% (p/v) di crotonoilbetaina monoidrato (744,4 mM) In L-(-)-carnitina con rese molari che superano il 40%. Questi quattro ceppi Isolati di Proteus mirabilis (le cui designazioni SIGMA-TAU sono rispettivamente SP 237 subclone NACit II, BT 1IV, GP 1AVI e R 2AIX) furono depositati il 21 aprile 1989 presso l'AGRI-COLTURA!. RESEARCH SERVICE CULTURE COLLECTION (NRRL), Northern Regional Research Centre, United States Department of Agrlculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 U.S.A. con i numeri di designazione NRRL B-18480, B-18481, B-18482 e B-18483 rispettivamente. Vengono Indicate di seguito le procedure di Isolamento e le proprietà morfologiche e fisiologiche/biochimiche del quattro ceppi. (i) Proteus mirabilis NRRL B-18480 (designazione SIGMA-TAU SP237 subclone NACit II). Il microorganismo venne in origine riconosciuto morfologicamente quale contaminante di una piastra di Acinetobacter 1woffi. Il microorganismo venne successivamente purificato utilizzando un terreno (nel seguito indicato come NACit cb) consistente di brodo nutritivo 0,8% (p/v) di cloruro sodico 0,5% (p/v) di acido citrico monoidrato 1,5% (p/v) di crotonoilbetaina monoidrato 2% di agar, pH regolato a 6,8 con KOH. Il microorganismo venne mantenuto mediante trasferimenti giornalieri (37°C) su NACit cb; esso venne tipizzato nei laboratori della richiedente e dalla American Type Culture Collection (Rockvllle, Maryland) utilizzando l'esame morfologico in combinazione con i sistemi API 20 E (versione C), API ZYM (versione B), API 50 CHE (versione D) (API System S.A., Montalieu-Verd eu, France) e con altri test biochimici e fisiologici secondo quanto apparve necessario. PROPRIETÀ' MORFOLOGICHE COLORAZIONE DI GRAM: negativa FORMA: bacillo DIMENSIONI: 0,9x4p FLAGELLI: provvisto di flagelli lungo tutto il corpo MOTILITÀ': presente, con sciamatura (swarming) CROMOGENESI: negativa SPORULAZIONE: negativa PROPRIETÀ' FISIOLOGICHE/BIOCHIMICHE (37°C) NECESSITA'DI > CO2: negativa NECESSITA' DI ≥ 0,5% di NaCl: negativa VOGES-PROSKAUER (temperatura ambiente): debole VOGES-PROSKAUER (37°C): dubbia ROSSO METILE: positiva PRODUZIONE DI H2S (TSI): negativa CRESCITA SU TERRENO DI SIMMON AL CITRATO: negativa UTILIZZAZIONE DI CITRATO: negativa UTILIZZAZIONE DI L-TARTRATO: negativa UTILIZZAZIONE DI MUCATO: negativa CRESCITA SU ACETATO QUALE UNICA FONTE DI CARBONIO: negativa CRESCITA SU MALONATO QUALE UNICA FONTE DI CARBONIO: negativa CRESCITA SU AGAR MacCONKEY: positiva LIQUEFAZIONE DI GELATINA: negativa AUXOTROFIA PER AMINOACIDI: L-istidina IDROLISI DELLA PECTINA: negativa FOSFATASI ACIDA (naftolo AS-BI fosfato, pH 5,4): negativa FOSFATASI ACIDA (β-naftil fosfato, pH 5,4): positiva FOSFATASI ALCALINA (β-naftil fosfato, pH 8,5): positiva ESTERASI (β-naftil butirrato): negativa ESTERASI (β-naftil caprilato): negativa LIPASI (β-naftil miristato): negativa IDROLISI DI TWEEN 20: positiva IDROLISI DI TWEEN 80: negativa ARGININA DIIDROLASI: negativa UTILIZZAZIONE DI ARGININA (terreno di Moeller): negativa ORNITINA DECARBOSSILASI: negativa LISINA DECARBOSSILASI: negativa PRODUZIONE DI INDOLO: negativa TRIPTOFANO DEAMINASI: positiva (debole) FENILALANINA DEAMINASI: positiva UREASI: positiva TRIPSINA: negativa CHIMOTRIPSINA: negativa CISTINA ARILAMIDASI: negativa LEUCINA ARILAMIOASI: positiva VALINA ARILAMIDASI: negativa CATALASI: positiva OSSIDASI: negativa RIDUZIONE DI NITRATO A NITRITO: positiva CRESCITA IN PRESENZA DI KCN: positiva 0-F GLUCOSIO, OSSIDATIVO: positivo O-F GLUCOSIO, FERMENTATIVO: positivo α GALATTOSIDASI: negativa β-GALATTOSIDASI: negativa β-GLUCORONIDASI: negativa α-GLUCOSIDASI: negativa β-GLUCOSIDASI: negativa N-ACETIL-β-GLUCOSAMMINIDASI: negativa α-FUCOSIDASI: negativa α -MANNOSIDASI: negativa PRODUZIONE DI ACIDI E GAS DA CARBOIDRATI (24 h, 37°C) CARBOIDRATO* ACIDO GAS meso-adonitolo esculina amigdalina D-arabinosio (debole) L-arabinosio D-arabitolo L-arabitolo arbutina cellobiosio meso-dulcitolo meso-eritritolo fruitosio D-fucosio L-fucosio galattosio gentiobiosio glucosio α-metil glucoside gluconato 2-chetogluconato 5-chetogluconato N-acetilglucosammina glicerolo (debole) glicogeno mio-inositolo Inulina lattosio lixosio maltosio mannitolo mannosio α-metilmannoside melezitosio melibiosto raffinosio L-ramnosio ribosio salicina sorbitolo L-sorbosio amido saccarosio (debole) tagatosio trealosio turanosio meso-xilitolo D-xilosio L-xilosio β-metil D-xiloside * Si sottintende che tutti i carboidrati asimmetrici utilizzati in questi test, se non Indicato altrimenti, abbiano configurazione D. SENSIBILITÀ' AGLI ANTIBIOTICI Gli antibiogrammi vennero ottenuti su agar Mueller-Ηίnton modificato [Mueller, J.H., e Hinton, J., Ά protein-free medium for prlmary isolation of thè gonococcus and meningococcus", Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 48:330 (19411; Olsen, M.A., e Scott, W.J., "Influence of starch in media used for thè detection of heated bacterlal spores", Nature, 157:337 (19461] (14 h, 37°C) usando dischi di sensibilità agli antibiotici Oxoid, seguendo la procedura di Kirby-Bauer [Bauer, A.W., Klrby, W.M.M., Sherrls, K.C., e Turck, M., Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method, Amer. J. Clin. Pathol., 45:493 (19661]. ANTIBIOTICO (quantità) DIAMETRO (mm) della RISULTATO zona di Inibizione amikad na (30 μg) 17 sensibile ampicillina (10 μg) 23 sensibile benzilpenicillina (10 UI) 22 sensibile cefuroxima (30 μg) 28 sensibile cefalotina (30 μg) 18 sensibile cloramfenicolo (30 μg) 20 sensìbile colistina (10 μg) 11 sensibile gentamicina (10 μg) 17 senslbile Sulla base di questi risultati, il ceppo Isolato corrisponde ad un ceppo di Proteus mirabilis secondo lo schema di classificazione della ATCC; Inoltre, sempre secondo ATCC, il Proteus mirabilis B-18480 (designazione SIGMA-TAU SP 237 subclone NACit II) è originale e non corrisponde a nessun altro microorganismo nella loro collezione di colture. E' stato osservato che singoli cloni completamente purificati di P. mirabilis NRRL B-18480 che sono ureasi-positivi (ure<+>) danno luogo a cloni ureasi-negativi (ure<- >) a bassa frequenza. Tali cloni ure<- >presentano daltronde profilo biochimico ed antibiogramma Identici a quelli dei loro progenitori ure<+>. (Si veda, ad esempio: Farmer, J.J., III, Hickman, F.W., Brenner, D.J., Schrelber, M., and Rickenbach, D.G., "Unusual Enterobacteriaceae: 'Proteus rettgeri' that 'change' Into Providend a stuartii-, J. Clin. Microbiol., ([: 373 (19771; Collins, C.M., and Falkow, S., 'Genetic analysis of an Escherichia coli urease locus: evidence of DNA rearrangement”, J. Bacteriol., 170: 1041 (1988)). Inoltre, la capacità dei cloni ure<- >a convertire la crotonobetaina in L-(-)-carnitina risulta inalterata. La trasformazione fenotipica inversa, cioè la comparsa spontanea di una discendenza ure<+ >da un clone ure-di P. mirabilis NRRL B-18480 non è stata da noi osservata (si confronti Lewis, A.D., and Rosen, I.G., Characterization of a Proteus rettgeri that transfers genes for urease production and lactose fermentation, American Society for Mlcrobiology Annual Meeting, 1973, Abstract G 218). (ii) Proteus mirabilis NRRL B-18482 (designazione SIGMA-TAU GP 1AVI). Il microorganismo venne Inizialmente isolato dalle feci di una cavia dello stabulario della SIGMA-TAU IN-DUSTRIE FARMACEUTICHE RIUNITE S.p.A. (Pomezia, Italia). Materia fecale fresca (0,5-1,0 g) venne incubata per 24 ore senza agitazione in quattro ml di Infusione cuore-cervello sterile (In seguito BHI) 1,5% (p/v) di crotonoilbetaina monoidrato (pH 6,8; 37°C). Ansate del brodo vennero prelevate appena al disotto del menisco e strisciate su piastre del terreno descritto da Xilinas, M.E., Pepavisslliou, J.T., e Legakis, N.J. ("Selective medium for growth of Proteus", J. CH n. Mlcrobiol., 2: 459 (1975)), di seguito Indicato con il termine 'Greek agar'. Dopo 48 ore a 37°C, singole colonie vennero prelevate e purificate mediante ripetute strisciature di singoli cloni su piastre di Greek agar 1,5% (p/v) di crotonoilbetaina monoidrato (pH 6,8; 37°C; 48 ore) e di agar MacConkey CS (Difco) 1,5% (p/v) di crotonoilbetaina monoidrato, (pH 6,8; 37°C; 24 ore). Il microorganismo venne mantenuto mediante trasferimenti giornalieri (37°C) su Greek agar 1,5% (p/v) di crotonoilbetaina monoidrato. Esso venne tipizzato nel laboratori della richiedente, usando l'esame morfologico in combinazione con i sistemi API 20 E, API ZYM, API 50 CHE e con altri test biochimici e fisiologici secondo quanto apparve necessario. PROPRIETÀ' MORFOLOGICHE COLORAZIONE DI GRAM: negativa FORMA: bacillo DIMENSIONI: 0,8 x 2μ MOTILITÀ' (NACit cb; BHI 1,5% (p/v) di crotonoilbetaina monoidrato 2% di agar, pH 6,8): presente, con sciamatura (swarming) CROMOGENESI: negativa SPORULAZIONE: negativa PROPRIETÀ' FISIOLOGICHE/BIOCHIMICHE (37°C) NECESSITA' DI > CO2 : negativa VOGES-PROSKAUER: negativa PRODUZIONE DI H2S (TSI): positiva CRESCITA SUL TERRENO DI SIMMON AL CITRATO: negativa CRESCITA SU AGAR DI MacCONKEY: positiva AUXOTROFIA PER AMINOACIDI: nessuna LIQUEFAZIONE DI GELATINA: negativa FOSFATASI ACIDA (naftolo AS-BI fosfato, pH 5,4): positiva (debole) FOSFATASI ACIDA (β-naftil fosfato, pH 5,4): positiva FOSFATASI ALCALINA (β-naftil fosfato, pH 8,5): positiva ESTERASI (β-naftil butirrato): positiva (debole) ESTERASI (β-naftil caprilato): negativa LIPASI (β-naftil miristato): negativa ARGININA DIIDROLASI: negativa ORNITINA DECARBOSSILASI: positiva LISINA DECARBOSSILASI: negativa PRODUZIONE DI INDOLO: negativa TRIPTOFANO DEAMINASI: positiva FENILALANINA DEAMINASI: positiva UREASI: positiva TRIPSINA: negativa CHIMOTRIPSINA: negativa CISTINA ARILAMIDASI: negativa LEUCINA ARILAMIDASI: positiva VALINA ARILAMIDASI: negativa OSSIDASI: negativa 0-F GLUCOSIO, OSSIDATIVO: positivo 0-F GLUCOSIO, FERMENTATIVO: positivo α-GALATTOSIDASI: negativa β-GALATTOSIDASI: negativa β-GLUCURONIDASI: negativa α- GLUCOSIDASI: negativa β-GLUCOSIDASI: negativa N-ACETIL-β-GLUCOSAMMINIDASI: negativa α-FUCOSIDASI: negativa -MANNOSIDASI: negativa PRODUZIONE DI ACIDI E GAS DA CARBOIDRATI (24 h, 37°C) CARBOIDRATO* ACIDO GAS meso-adonitolo esculina amigdalina D-arabinosio (debole) L-arabinosio D-arabitolo L-arabitolo arbutina cellobiosio meso-dulcitolo meso-eritritolo fruttosio D-fucosio L-fucosio galattosio gentiobiosio glucosio α-metil glucoside gluconato 2-chetogluconato (debole) 5-chetogluconato N-acetilglucosammina glicerolo (debole) glicogeno mio-inositolo Inulina lattosio lixosio maltosio mannitolo mannosio α-metilmannoside melezitosio melibiosio raffinosio L-ramnosio ribosio salicina sorbitolo L-sorbosio amido saccarosio tagatosio trealosio turanosio meso-xilitolo D-xilosio L-xilosio β-metil D-xiloside * Si sottintende che tutti i carboidrati asimmetrici utilizzati In questi test, se non indicato altrimenti, abbiano configurazione D. SENSIBILITÀ' AGLI ANTIBIOTICI Gli antibiogrammi vennero ottenuti esattamente come descritto per P. mirabilis NRRL B-18480 (SP237 subclone NACit II). ANTIBIOTICO Cquantità) DIAMETRO (mm) della RISULTATO zona di inibizione amikacina (30 μg) 17 sensibile ampicillina (10 μg) 22 sensibile benzilpenicillina (10 UI) 18 intermedio cefuroxima (30 μg) 22 sensibile cefalotina (30 μg) 21 sensibile cloramfenicolo (30 μg) 20 sensibile colistina (10 μg) / resistente gentamicina (10 μg) 17 sensibile Sulla base di questi risultati, il ceppo Isolato corrisponde ad un ceppo di Proteus mirabilis secondo lo schema di classificazione del sistema API. (iii) Proteus mirabilis NRRL B-18481 (designazione SIGMA-TAU BT 1IV). Il microorganismo venne Inizialmente Isolato dalle feci di un coniglio dello stabulario della SIGMA-TAU INDUSTRIE FARMACEUTICHE RIUNITE S.p.A. (Pomezia, Italia), esattamente come descritto per il Proteus mirabilis NRRL B-18482 (GP 1AVI). Il microorganismo venne mantenuto mediante trasferimenti giornalieri (37°C) su Greek agar 1,5% (p/v) di crotonoilbetaina monoidrato. Esso venne tipizzato nel laboratori di microbiologia Industriale della richiedente, usando l'esame morfologico in combinazione con i sistemi API 20 E, API ZYM, API 50 CHE e con altri test biochimici e fisiologici secondo quanto apparve necessario. PROPRIETÀ' MORFOLOGICHE COLORAZIONE DI GRAM: negativa FORMA: bad ilo DIMENSIONE: 0,8 x 2μ MOTILITÀ' (NACit cb; BHI 1,5% (p/v) di crotonoilbetaina monoidrato 2% di agar, pH 6,8): presente, con sciamatura (swarming) CROMOGENESI: negativa SPORULAZIONE : negativa PROPRIETÀ' FISIOLOGICHE/BIOCHIMICHE (37°C) NECESSITA' DI > CO2: negativa VOGES-PROSKAUER: negativa PRODUZIONE DI H2S (TSI): positiva CRESCITA SU TERRENO DI SIMMON AL CITRATO: negativa CRESCITA SU AGAR MacCONKEY: positiva AUXOTROFIA PER AMINOACIDI: nessuna LIQUEFAZIONE DI GELATINA: positiva FOSFATASI ACIDA (naftolo AS-BI fosfato, pH 5,4): positiva (debole) FOSFATASI ACIDA (β-naftil fosfato, pH 5,4): positiva FOSFATASIALCALINA (β-naftil fosfato, pH 8,5): positiva ESTERASI (β-naftil butirrato): positiva (debole) ESTERASI (β-naftil caprilato): negativa LIPASI (β-naftil miristato): negativa ARGININA DIIDROLASI: negativa ORNITINA DECARBOSSILASI: positiva LISINA DECARBOSSILASI: negativa PRODUZIONE DI INDOLO: negativa TRIPTOFANO DEAMINASI: positiva FENILALANINA DEAMINASI: positiva UREASI: positiva TRIPSINA: positiva CHIMOTRIPSINA: negativa CISTINA ARILAMIDASI: negativa LEUCINA ARILAMIDASI: positiva VALINA ARILAMIDASI: negativa OSSIDASI: negativa 0-F GLUCOSIO, OSSIDATIVO: positivo 0-F GLUCOSIO, FERMENTATIVO: positivo α-GALATTOSIDASI: negativa β-GALATTOSIDASI: negativa β-GLUCURONIDASI:negativa α-GLUCOSIOASI: negativa β-GLUCOSIDASI: negativa N-ACETIL-β-GLUCOSAMMINIDASI: negativa α -FUCOSIDASI: negativa α -MANNOSIDASI: negativa PRODUZIONE DI ACIDI E GAS DA CARBOIDRATI (24 h, 37°C) CARBOIDRATO* ACIDO GAS meso-adonitolo esculina amigdalina D-arabinosio (debole) L-arabinosio D-arabitolo L-arabitolo arbutina cellobiosio meso-dulcitolo meso-eritritolo fruitosio D-fucosio L-fucosio galattosio gentiobiosio glucosio α-metil glucoside gluconato 2-chetogluconato (debole) 5-chetogluconato N-acetilglucosammina glicerolo (debole) glicogeno mio-inositolo inulina lattosio lixosio maltosio mannitolo mannosio α-metilmannoside melezitosio melibiosio raffinosio L-ramnosio ribosio salicina sorbitolo L-sorbosio amido saccarosio tagatosio trealosio turanosio meso-xilitolo D-xilosio L-xilosio 8-metil D-xiloside * SI sottintende che tutti i carboidrati asimmetrici utilizzati in questi test, se non indicato altrimenti, abbiano configurazione D. SENSIBILITÀ' AGLI ANTIBIOTICI Gli antibiogrammi vennero ottenuti esattamente come descritto per P. mirabilis NRRL B-18480 CSP237 subclone NACit II). ANTIBIOTICO (quantità) DIAMETRO (mm) della RISULTATO zona di inibizione amikacina (30 μg) 17 sensibile ampicillina (10 μg) 20 sensibile benzilpenicillina (10 UI) 16 intermedio cefuroxima (30 μg) 20 sensibile cefalotina (30 μg) 21 sensibile cloramfenicolo (30 μg) 18 sensibile colistina (10μg) / resistente gentamicina (10μg) 17 sensibile Sulla base di questi risultati, il ceppo Isolato corrisponde ad un ceppo di Proteus mirabilis secondo lo schema di classificazione del sistema API. (iv) Proteus mirabilis NRRL B-18483 (designazione SIGMA-TAU R 2AIX). Il microorganismo venne Inizialmente Isolato dalle feci di un ratto dello stabulario della SIGMA-TAU INDU-STRIE FARMACEUTICHE RIUNITE S.p.A (Pomezia, Italia), esattamente come descritto per il Proteus mirabilis NRRL B-18482 (GP 1AVI). Il microorganismo venne mantenuto mediante trasferimenti giornalieri (37°C) su Greek agar 1,5% (p/v) di crotonoilbetaina monoidrato. Esso venne tipizzato nel laboratori di microbiologia Industriale della richiedente, usando l'esame morfologico In combinazione con i sistemi API 20 E, API ZYM, API 50 CHE e con altri test biochimici e fisiologici secondo quanto apparve necessario. PROPRIETÀ' MORFOLOGICHE COLORAZIONE DI GRAM: negativa FORMA: bacillo DIMENSIONI: 0,8 x 3μ MOTILITÀ' (NACit cb; BHI 1,5% (p/v) di crotonoilbetaina monoidrato 2% di agar, pH 6,8): presente, con sciamatura (swarming) CROMOGENESI: negativa SPORULAZIONE: negativa PROPRIETÀ' FISIOLOGICHE/BIOCHIMICHE (37°C) NECESSITA' DI > CO2: negativa VOGES-PROSKAUER: negativa PRODUZIONE DI H2S (TSI): positiva CRESCITA SU TERRENO DI SIMMON AL CITRATO: negativa CRESCITA SU AGAR MacCQNKEY: positiva AUXOTROFIA PER AMINOACIDI: nessuna LIQUEFAZIONE DI GELATINA: positiva FOSFATASI ACIDA (naftolo AS-BI fosfato, pH 5,4): negativa FOSFATASI ACIDA (β-naftil fosfato, pH 5,4): positiva FOSFATASI ALCALINA (8-naftilfosfato, pH 8,5): positiva ESTERASI (β-naftil butirrato): positiva (debole) ESTERASI (β-naftil caprllato): negativa LIPASI (β-naftil miristato): negativa ARGININA DIIDROLASI: negativa ORNITINA DECARBOSSILASI: positiva LISINA DECARBOSSILASI: negativa PRODUZIONE DI INDOLO: negativa TRIPTOFANO DEAMINASI: positiva FENILALANINA DEAMINASI: positiva UREASI: positiva TRIPSINA: negativa CHIMOTRIPSINA: negativa CISTINA ARILAMIDASI: negativa LEUCINA ARILAMIDASI: positiva VALINA ARILAMIDASI: negativa OSSIDASI: negativa O-F GLUCOSIO, OSSIDATIVO: positivo 0-F GLUCOSIO, FERMENTATIVO: positivo α-GALATTOSIDASI: negativa β-GALATTOSIDASI: negativa β-GLUCURONIDASI: negativa α-GLUCOSIDASI: negativa β-GLUCOSIDASI: negativa N-ACETIL-β-GLUCOSAMMINIDASI: negativa α-FUCOSIDASI: negativa α-MANNOSIDASI: negativa PRODUZIONE DI ACIDI E GAS DA CARBOIDRATI (24 h, 37°C) CARBOIDRATO* ACIDO GAS meso-adonitolo esculina amigdalina D-arabinosio (debole) L-arabinosio 0-arabitolo L-arabitolo arbutina cellobiosio meso-dulcitolo meso-eritritolo fruttosio D-fucosio L-fucosio galattosio β-gentiobiosio glucosio α-metil glucoside gluconato 2-chetogluconato 5-chetogluconato N-acetilglucosammina glicerolo (debole) glicogeno mio-inositolo Inulina lattosio lixosio maltosio mannitolo mannosio α-metilmannoside melezitosio melibiosio raffinosio L-ramnosio ribosio salicina sorbitolo L-sorbosio amido saccarosio tagatosio trealosio turanosio meso-xilitolo D-xilosio L-xilosio β-metil D-xiloside * Si sottintende che tutti i carboidrati asimmetrici utilizzati in questi test, se non indicato altrimenti, abbiano configurazione D. SENSIBILITÀ' AGLI ANTIBIOTICI Gli antibiogrammi vennero ottenuti esattamente come descritto per P. mirabilis NRRL B-18480 (SP237 subclone NACit II). ANTIBIOTICO (quantità) DIAMETRO (mm) della RISULTATO zona di inibizione amikacina (30 μg) >30 sensibile ampicillina (10 μg) >30 sensibile benzilpenicillina (10 UI) 25 sensibile cefuroxima (30 μg) >30 sensibile cefalotina (30 μg) >30 sensibile cloramfenicolo (30 μg) / resistente colistina (10 μg) / resistente geritamicina (10 μg) >30 sensibile Sulla base di questi risultati, il ceppo isolato corrisponde ad un ceppo di Proteus mirabilis secondo lo schema di classificazione del sistema API. DATI COMPARATIVI DI BIOTRASFORMAZIONE PER LA FORMAZIONE DI L-(-)-CARNITINA DA CROTONOILBETAINA MEDIANTE CEPPI ISOLATI DI Proteus mirabilis IN BEUTE AGITATE. Proteus mirabilis NRRL B-18480 (SP 237 subclone NACit II) venne mantenuto mediante trasferimenti giornalieri su piastre di NACit cb; temperatura di incubazione, 37°C. Proteus mirabilis NRRL B-18482 (GP 1AVI), Proteus mirabilis NRRL B-18481 CBT 1IV) e Proteus mirabilis NRRL B-18483 (R 2AIX) vennero mantenuti mediante trasferimento giornaliero su piastre di Greek agar 1,5% (p/v) di crotonoilbetaina monoidrato, pH 6,8; temperatura di Incubazione, 37°C. Ansate del precedenti ceppi vennero Inoculate in beute da 250-mL contenenti 50 mL di BHI 1,5% (p/v) di crotonoilbetaina monoidrato, pM 6,8. Le beute furono agitate (200 rpm, eccentricità orbitale 1 pollice [2,54 cm], 37°C) per 17 ore; quindi le cellule furono raccolte per centrifugazione (10 minuti, 12.000 x g, 4°C), e lavate una volta con soluzione fisiologica fredda (50 mL). Le pellets delle cellule lavate vennero risospese In terreno di biotrasformazione non sterile (50mL) consistente di 25 mM di potassio fosfato 1% (p/v) di glicerolo 12% (p/v) di crotonoilbetaina monoidrato, pH 6,0. I terreni di biotrasformazione vennero mantenuti sotto agitazione come Indicato in precedenza a 33°C per 96 ore; durante questo periodo si prelevarono del campioni da 100 μL che vennero analizzati enzimaticamente per determinarne il contenuto In L-(-)-carnitina mediante il metodo di Pearson, D.J., CHASE, J.F.A. e Tubbs, P.K. ("The essay of (-)-carnitine and its 0-acyl derivatives', Meth. Enzymol. 9: 612 (1966)). Si ottennero i seguenti risultati (corretti tenendo conto dell'evaporazione durante il periodo di 0-96 ore):TRASFORMAZIONE % DI CROTONOILBETAINA ESOGENA IN L-(-)-carnitina*TERRENI COMPLESSI ALTERNATIVI CHE FAVORISCONO L'ELEVATA AT- TIVITA' DELLA CROTONOILBETAINA IDRATASI IN Proteus mirabilis NRRL B-18480 (SP237 subclone NACit II). Proteus mirabilis NRRL B-18480 (SP237 subclone NACit II) venne mantenuto mediante trasferimento giornaliero su piastre di NACit cb; temperature di Incubazione, 37°C. Ansate di questo ceppo vennero Inoculate in beute da 250 mL contenenti 50 mL di terreni diversi. (a) BHI (Difco) 1,5 (p/v) di crotonoilbetaina monoidrato, pH 6,8. (b) 0,9% di brodo nutritivo (Difco) 0,9% di estratto di lievito (Difco) 0,9% di Soytone (Difco) 0,2% di glucosio 0,5% di cloruro sodico 0,25% di sodio fosfato bibasico (anidro) 1,5% (p/v) di crotonoilbetaina monoidrato, pH 6,8. (c) 1,35% di brodo nutritivo 1,35% di Soytone 0,2% di glucosio 0,5% di cloruro sodico 0,25% di sodio fosfato bibasico (anidro) 1,5% (p/v) di crotonoilbetaina monoidrato, pH 6,8. (d) 1,35% di Soytone 1,35% di estratto di lievito 0,2% di glucosio 0,5% di cloruro sodico 0,25% di sodio fosfato bibasico (anidro) 1,5% (p/v) di crotonoilbetaina monoìdrato, pH 6,8. (e) 1,35% di brodo nutritivo 1,35% di estratto di lievito 0,2% di glucosio 0,25% di cloruro sodico 0,25% di sodio fosfato bibasico (anidro) 1,5% (p/v) di crotonollbetaina monoidrato, pH 6,8. (f) 0,9% di brodo nutritivo 0,9% di Soytone 0,9% di estratto di lievito 0,5% di cloruro sodico 0,25% di sodio fosfato bibasico (anidro) 1,5% (p/v) di crotonollbetaina monoidrato, pH 6,8. (g) 0,9% di brodo nutritivo 0,9% di Soytone ·0,9% di estratto di lievito 0,2% di glucosio 0,25% di sodio fosfato bibasico (anidro) 1,5% (p/v) di crotonoilbetaina monoidrato, pH 6,8. (h) 0,9% di brodo nutritivo 0,9% di Soytone 0,9% di estratto di lievito 0,2% di glucosio 0,5% di cloruro sodico 1,5% (p/v) di crotonoilbetaina monoidrato, pH 6,8. (i) BHI, pH 6,8. Le beute vennero Incubate a 37°C per 17 ore, su shaker rotatorio (200 rpm, eccentricità orbitale 1 pollice [2,54 cm]); quindi le cellule di ciascuna beuta vennero raccolte separatamente per centrifugazione (10 minuti, 12.000 x g, 4°C), e lavate una volta con soluzione fisiologica fredda (50 mL). Le pellets di cellule lavate furono risospese nel terreno di biotrasformazione non sterile (50 mL) consistente di 25 mM di potassio fosfato 1% (p/v) di glicerolo 12% (p/v) di crotonoilbeteina monoidrato, pH 6,0. Le miscele di biotrasforinazione vennero mantenute sotto agitazione come precedentemente indicato a 33°C per 96 ore; durante questo periodo furono prelevati dei campioni da 100 μL che vennero analizzati enzimaticamente per determinare il contenuto di carnitina come precedentemente descritto. Si ottenero 1 seguenti risultati (corretti per tener conto dell'evaporazione nel periodo di 0-96 ore): mM di L-(-)-CARNITINA ACCUMULATATRASFORMAZIONE % DI CROTONOILBETAINA ESOGENA IN L-(-)-CARNITINA ** 100% = 744,4 mM BIOTRASFORMAZIONE DI CROTONOILBETAINA IN L-(-)-CARNITINA ME-DIANTE P.mirabilis NRRL B-18480 IN UN FERMENTATORE DA BAN-CO. La biotrasformazione della crotonoilbetaina sale Interno In L-(-)-carnitina venne realizzata usando cellule di P. mirabilis NRRL B-18480 In un fermentatore da banco da 2 litri come Indicato di seguito: P. mirabilis NRRL B-18480 venne mantenuto mediante trasferimento giornaliero su slant di BHI agar (Difco) 1,5% (p/v) di crotonoilbetaina sale Interno; temperatura di Incubazione: 37°C. Con uno slant di 24 ore venne Inoculata una beuta da 1000 mL munita di dispositivo antivortice, contenente 250 mL di BHI (Difco) 1,5% (p/v) di crotonoilbetaina sale Interno. La beuta venne Incubata a 37°C su shaker rotatorio (170 rpm, eccentricità orbitale 2 pollici [5,08 cm]). Dopo 6 ore la beuta venne usata per Inoculare sei colture di secondo stadio, ciascuna contenente 250 mL di BHI In una beuta da 1000 mL provvista di dispositivo antivortice. Queste beute vennero mantenute sotto agitazione come descritto precedentemente per circa 15 ore; le cellule cosi ottenute vennero quindi separate per centrifugazione (20 minuti, 8.500 x g, 4°C) e risospese in un terreno di biotrasformazione (1 L) consistente di 25 mL di tampone fosfato potassico 0,5% (p/v) di glicerolo 10% (p/v) di crotonoilbetaina sale interno. Un fermentatore Biolafitte da 2 L venne preparato con terreno di biotrasforinazione contenente le cellule e fatto funzionare per 24 ore alle seguenti condizioni: velocità di agitazione 150 rpm portata d'aria 1 v/v/m pH iniziale circa 6,8 volume di esercizio 1 L temperatura 35°C Una soluzione al 10% (p/v) di glicerolo venne alimentata in continuo nel fermentatore ad una portata di 5 mL/ora. Le concentrazioni della crotonoilbetaina non reagita e della L-(-)-carnitina vennero controllate mediante HPLC. [Colonna a scambio cationico da 250 mm x 4 mm (10-μ Partisil SCX, PoliConsult Scientifica s.r.l., Roma); temperatura della colonna, 35°C; volume di Iniezione, 10 μL; fase mobile, 0,075 M KH2PO4-CH3CN C4:6), pH non regolato; rilevatore: Indice di rifrazione. Tempi di permanenza (min): L-carnitina, 8,52; crotonobetaina, 9,81; gamma-butirrobetalna, 12,08.]. Dopo 22 ore il terreno di biotrasformazione venne raccolto e filtrato. Si trovò che il filtrato, analizzato enzimaticamente per determinare il contenuto di L-(-)-carnitina come precedentemente descritto, conteneva 48,0 mg/mL L-(-)-carnitina e 57,3 mg/mL di crotonoilbetaina non reagita. Trasformazione molare della crotonoilbetaina in L-(-)-carnitina: 43%. Resa in L-(-)-carnitina: 100%. ISOLAMENTO DELLA L-(-)-CARNITINA DAL TERRENO DI BIOTRASFOR-MAZIONE FILTRATO. Dopo filtrazione, il terreno di biotrasformazione venne fatto passare attraverso colonne di resine scambiatrici di ioni Amberlite, resina basica IRA-402 (forma OH ) e resina acida IRC-50 (forma H<+>), per allontanare i cationi e gli anioni. L'eluato venne concentrato sotto vuoto a 50°C, e il concentrato trattato per tre volte con Isobutanolo per abbassare azeotropicamente il contenuto d'acqua al 5-10% (p/v). La risultante miscela venne cristallizzata usando 3 parti (p/v) di Isobutanolo, fornendo un precipitato consistente di 4 parti di L-(-)-carnitina per 1 parte di crotonoilbetalna (p/p) [HPLC]. Dopo 3 di tali cristallizzazioni, si ottenne un solido consistente di L-(-)-carnitina con <0,5% (p/p) [HPLC] di crotonoilbetaina. Mediante questa procedura venne ricuperato circa il 50% (p/p) della L-(-)-carnitina presente nel terreno di biotrasforinazione. [α ]D= - 31,5. Le acque madri vennero raccolte e riciclate alla successiva biotrasformazione. RIVENDICAZIONI 1. Proteus mirabilis NRRL B-18480 e suoi discendenti, mutanti e derivati.
- 2. Proteus mirabilis NRRL B-18481 e suoi discendenti, mutanti e derivati.
- 3. Proteus mirabilis NRRL B-18482 e suoi discendenti, mutanti e derivati.
- 4. Proteus mirabilis NRRL B-18483 e suoi discendenti, mutanti e derivaii.
- 5. Discendenti, mutanti e derivati di Proteus mirabilis NRRL Β-Ί8480 che conservano la sua attività di Idratare la crotonoilbetaina.
- 6. Discendenti, mutanti e derivati di Proteus mirabilis NRRL B-18481 che conservano la sua attività di Idratare la crotonoilbetaina.
- 7. Discendenti, mutanti e derivati di Proteus mirabilis NRRL B-Ì8482 che conservano la sua attività di Idratare la crotonoilbetaina.
- 8. Discendenti, mutanti e derivati di Proteus mirabilis NRRL B-18483 che conservano la sua attività di Idratare la crotonoilbetaina.
- 9. Discendenti, mutanti e derivati di Proteus mirabilis NRRL B-18480, NRRL B-18481, NRRL B-Ί8482 e NRRL B-18483 che conservano la loro attività di Idratare la crotonoilbetaina, sotto forma di cellule libere o Immobilizzate.
- 10. Procedimento microbiologico per produrre L-(-)-carnitina che comprende: (a) preparare una coltura superficiale su un terreno solido di un microorganismo capace di idratare stereoselettivamente la crotonoilbetaina a L-(-)-carnitina; (b) preparare una biomassa cataliticamente attiva Inoculando con la coltura dello stadio (a) un terreno di coltura liquido contenente crotonoilbetaina; (c) separare la biomassa dal terreno di coltura liquido; (d) sospendere la biomassa separata in un terreno di biotrasforinazione contenente almeno il 10% (p/v) di crotonoilbetaina sale Interno; (e) ricuperare la L-(-)-carnitina dal terrreno di biotrasformazione, in cui detto microorganismo è scelto nel gruppo consistente di Proteus mirabilis NRRL B-18480, Proteus mirabilis NRRL B-18481, Proteus mirabilis NRRL B-18482 e Proteus mirabilis NRRL B-18483.
- 11. Procedimento secondo la rivendicazione 10, in cui il terreno di biotrasforinazione contiene il 10-12% (p/v) di crotonoilbetaina sale interno.
- 12. Procedimento secondo la rivendicazione 10, in cui nello stadio (a) il terreno solido contiene crotonoilbetaina.
- 13. Procedimento secondo la rivendicazione 10, in cui lo stadio di separazione CO è realizzato mediante centrifugazione.
- 14. Procedimento secondo la rivendicazione 10, in cui lo stadio di separazione (c) è realizzato mediante ultrafiltrazione.
- 15. Enzima crotonoilbetaina Idratasi Isolato da Proteus mirabilis NRRL B-18480, Proteus mirabilis NRRL B-18481, Proteus mirabilis NRRL B-18482 e Proteus mirabilis NRRL B-18483 e dai loro discendenti, mutanti e derivati.
- 16. Enzima crotonoilbetaina Idratasi secondo la rivendicazione 15, in forma libera o Immobilizzata.
- 17. Vettori e microorganismi contenenti l'enzima crotonoilbetaina Idratasi della rivendicazione 15.
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