KR0135116B1 - 크로토노베타인으로부터 l-(-)-카르니틴의 생체촉매에 의한 제조방법 및 이 방법에 사용되는 프로테에 균주 - Google Patents
크로토노베타인으로부터 l-(-)-카르니틴의 생체촉매에 의한 제조방법 및 이 방법에 사용되는 프로테에 균주Info
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Abstract
프로테우스 미라빌리스 (NRRL B-18480, NRRL B-18481, NRRL B-18482 및 NRRL B-18483)의 4가지 신균주에 의해 생성된 효소를 10 ∼ 12%(W/V)의 크로토노베타인 내부염을 함유한 생체내 변환반응 매체중에서 작용시켜 크로토노베타인을 입체특이성으로 수화시켜 L-(-)-카르니틴을 제조하는 방법.
Description
본 발명은 미생물에 의해 생성된 효소로 크로토노베타인의 L-(-)-카르니틴으로의 입체특이성 수화반응을 촉진시켜 크로토노베타인 (1)으로부터 L-(-)-카르니틴 (2)을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이 제조방법에 사용하기에 적합한 신규의 프로테에균주(Proteeae strain)에 관한 것이다. 공지로 되어 있는 바와 같이 카르니틴은 비대칭 중심이 하나뿐이므로 D-(+)-카르니틴과 L-(-)-카르니틴의 두가지 거울상 이성체로 존재한다. 이들 거울상 이성체중에서 L-(-)-카르니틴만이 생존 미생물중에서 발견되었는데 이것은 생체중에서 미토콘트리아막을 통해 지방산을 운반하는 매체로 작용하는 기능을 하고 있다. L-(-)-카르니틴은 생리학적 활성이 있는 거울상 이성체인데 수년동안 라세미체인 DL-카르니틴이 치료제로 사용되었다. 그러나 확인된 바로는 D-(+)-카르니틴은 카르니틴 아실트란스퍼라아제(acyltransferase)의 경쟁 억제물제이고 심금층과 골격근에 있는 L-(-)-카르니틴의 함량을 감소시킨다는 점이다. 따라서 L-(-)-카르니틴만을 심장 장애 또는 지질대사 장애가 있는 환자에게 투여하여 혈액투석 치료를 하여야만 한다.
카르니틴의 공업적 규모의 생산에 관하여 각종 화학적 방법이 제안되어 있는데, 이들 방법은 입체특이성이 있는 방법이 아니어서 D-(+)- 및 L-(-)- 이성체의 라세미 혼합물이 생성된다. 따라서 라미세체의 거울상 이성체 성분을 분리하기 위한 분할(resolution)방법을 적용해야만 하는 것이다. 위에 나온 화학적 합성방법은 복잡하고 경비가 많이 소요되므로 어떤 경우에 있어서도 등몰량의 D-(+)-카르니틴과 L-(-)-카르니틴이 생성될 뿐이다. 최근 보편적인 발효 성분들로부터 새로이 L-(-)-카르니틴을 제조하거나 대칭 베타인 유도체의 입체특이성 변환을 통해 L-(-)-카르니틴을 제조하는 미생물학적인 방법 몇가지가 제안되어 있다. 전자의 방법에 관해서는 일본국 특허 제 71567/1984 (TAKEDA)호에 곰팡이인 에메리셀라 콰드릴리네아타(Emericella quadrilineata)를 복합 배지에서 배양하여 L-(-)-카르니틴을 제조하는 방법이 개시(開示)되어 있다. 후자의 방법들 대부분은 크로토노베타인을 입체특이성 수화반응 처리하여 L-(-)-카르니틴으로 전환시키는 방법인데 이 경우 생체내 변환을 일으키기 위해 특수한 미생물을 사용한다는 점에서 주로 차이가 있다. 위의 관련 특허문헌에 기재된 미생물 대부분은 엔테로박테리아세에(Enterobacteriaceae)과(科)에 속하며 [예 : EP 122, 444 (HAMARI), EP 122,799 (AJINOMOTO), DDRP 221, 905 (KARL-MARX-UNIVERSITAT), 일본 특허 출원 제61/234788호 (SETTETSU)], 한편으로는 비엔테로박테리아(non-enterobacteria)도 사용되고 있다. [예 : EP 158, 194 및 EP 195,944 (LONZA) 에서는 아크로모박테르 크실로속시단스 (Achromobacter xylosoxydans)를 이용하고 있고 일본국 특허 출원 제 60/275181호 (Biol K.K. CHO KASEHIN K.K.)에서는 곰팡이인 페니실륨 시트리늄 (Penicillium citrinum)을 이용하여 적정한 결과를 얻었다고 하고 있음].
미생물에 의한 L-(-)-카르니틴의 제조 선구물질로서 사용된 크로토노베타인이외의 물질로는 3-데히드로카르니틴(deydrocarnitine) [예:JP 272086/1987 (AJINOMOTO)]과 카르니틴 니트릴[EP 319, 344 (KYOWA HAKKO KOGYO)]가 있다. 그러나 이제까지 제안된 미생물학적 반응은 다음의 이유중 한가지 이상의 이유로해서 L-(-)-카르니틴의 공업적 규모의 제조에는 실용적이지 못한 것이 밝혀졌다.
(가) L-(-)-카르니틴의 수득율이 극히 작다.
(나) 선구물질이 극히 불안정하다.
(다) 미생물을 고가의 영양 배지에서 배양해야만 한다.
(라) 미생물은 저농도[2-3%(W/V)까지]의 크로토노베타인에서만 견디어 낼 수 있다.
(마) 크로토노베타인이 환원되어 가맘-부티로베타인을 생성하거나, L-(-)-카르니틴이 산화되어 3-데히드로카르니틴을 생성하는 등의 부반응이 일어나서 L-(-)-카르니틴의 최종수율을 저하시킨다.
다음에 나온 방법들에 사용된 크로토노베타인은 약 89%(W/W)의 크로토노베타인 내부염(탈염된 크로토노베타인)과 약 11%(W/W)의 수분(Karl Fischer 시약을 사용하여 측정)로 된 것인데 크로토노베타인 1분자당 수분 약 1분자에 상용한 것이다. 따라서 1 수화물'은 크로토노베타인과 수분과의 사이에 명확한 구조적인 관계를 나타내는 것으로 볼 수 없다하더라도 이 기질(substrate)을 이후부터는 크로토노베타인 1 수화물이라 부르기로 한다. 또한 크로토노베타인 내부염이란 것은 100% 순수한 크로토노베타인 내부염(탈염된 무수 크로토노베타인)을 뜻한다. 크로토노베타인 내부염의 농도가 약 10-12%(w/v)인 생체내변환 매체에서 크로토노베타인을 수화시켜 L-(-)-카르니틴을 생성할 수 있는 프로테우스 미라빌리스(proteus mirabilis)의 신균주 4가지를 분리하여 생물형으로 분류하였다(아래 참조). 이들 신균주는 성장이나 생체내 변환을 위해 값비싼 영양소나 첨가제를 필요로 하지 않고, 오히려 간단하고도 저렴한 배지를 사용하여 세포 성장과 생체내 변환을 달성할 수 있다.
사용된 분석방법에 이어서 검출가능한 한도내에서 본 발명의 신균주인 P.미라빌리스는 앞서 지적한 바와 같이 L-(-)-카르니틴의 최종 수득율을 저하시키는 부반응을 일으키지 않는다. 분리된 4가지의 P.미라빌리스 신균주는 12%(w/v)의 크로토노베타인 1수화물(744.4mM)을 40%이상의 몰 수득율(molar yield)로 L-(-)-카르니틴으로 전환시킬수 있음을 확인하였다. 분리된 4가지의 P.미라빌리스 신균주(sigma-tau SP 237 서블클론(subclone) NACit I1, Sigma-Tau BT 1IV, Sigma- Tau GP 1AVI 및 Sigma-Tau R 2AIX로 각각 자체 명명)들은 1989년 4월 21일 국제 공인 기탁 기관(the Argricultural Rescarch Service Culture Collection, Northern Regional Research Centre, United States Department Of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 U.S.A)에 기탁되어 각각 NRRL B-18480, NRRL B-18481, NRRL B-18482 및 NRRL B-18483의 코우드(code)를 부여받았다.
이들 4가지 균주의 분리방법과 형태학적, 생리학적 및 생화학적인 특성은 아래와 같다.
(1) 프로테우스 미라빌리스 NRRL B-18480(Sigma-Tau SP 237 서브클론 NACit I1) 이 미생물은 원래 아시네토박테르 르오피(Acinetobacter lwoffi)의 플레이트에서 형태학적으로 오염물로 확인된 것이다. 확인한 다음, 영양육즙 +0.8%(w/v) 염화나트륨+0.5%(w/v)시트르산 1수화물+1.5%(w/v) 크로토노베타인 1수화물+2% 한천으로 있고 으로 되어 있고 수산화칼륨으로 pH 6.8로 조절된 배지(이후 NACit + cb라 함)를 사용하여 이 미생물을 정제하였다. 이 미생물을 매일 NACit + cb에서 일일 전이(daily transfer, 37℃)로 유지하고 API 시스템 [API 20E (version C), API ZYM(version B) 및 API 50 CHE(version D)등의 strip : API System S.A., Montalieu-vercieu, France)]과 관련한 형태학적 관찰과 기타 필요로 하는 생화학적 및 생리학적 시험법을 사용하여 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A.) 및 자체기준(Industrial Microbiology Laboratories At Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A., Pomezia, Italy)에 따라 특정화하였다.
항생물질의 감수성
Kirby-Bauer 법 [Bauer, A.W., Kirby, W. M.M., Sherris, K.C. and Turck, M., Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method., Amer. J, Clin. Pathol., 45 : 493(1966)]에 따라 옥소이드 항생물질 감수성 디스크를 사용하여 0.15% 전분[Olsen, M.A., and Scott, W.J., Influence of starch in media used for ther detection of heated bacterial spores, Nature, 157 : 337 (1946)]을 보충한 뮐러-힌튼 한천 [Mueller, J.H. and Hinton, J., A protein - free mediun for primary isolation of the gonococcus and meningococcus, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 48 : 330 (1941) ]
(14시간, 37℃)에서 앤티바이오그램(antibiogramme)을 얻었다.
위에 나온 결과로부터 분리균은 ATCC의 분류기준에 따른 프로테우스 미라빌리스 균주에 상응한 것임을 알 수 있고, 더욱이 ATCC에 의할 것 같으면 프로테우스 미라빌리스 NRRL B-18480 (Sigma-Tau SP237 서브클론 NACit I1)은 특이한 것으로서 ATCC의 기타 어떠한 미생물에도 해당되지 아니한다. 이제까지 관찰된 바로는 P.미라빌리스 NRRL B-18480의 철저히 정제된 우레아제-양성(ure+)인 단일 클론(clone)은 저주파에서 우레아제-음성(ure-)클론의 생성원인이 되고 있다는 것인데, 이들 ure- 변종의 형태학적, 생리학적 및 생화학적 성상과 그 앤티바이오그램은 이들의 ure+ 선대(先代)의 것들과 동일하다. [참조 : Farmer, J.J.,III, Hickman, F.W., Brenner,D.J., Schreiber, M., and Rickenbach, D.G., Unusual Eenterobacteriaceae : 'Proteus rettgeri' that 'change' into Providencia stuartii, J. Clin. Microbiol., 6 : 373(1977); Collins.C.M.,and Folkow, S., Genetic analysis of an Escherichaia coli urease locus : evidence of DNA rearrangement, J. Bacteriol., 170 : 1014 (1988) ]. 더욱이 ure- 변동이 크로토노베타인을 L-(-)-카르니틴으로 전환시킬수 있는 능력은 변하지 않는다. ure- 전구물로부터 P.미라빌리스 NRRL B-18480의 ure+ 균주의 역 표현형 변환 (reverse phenotypic transformation), 즉 자생적인 출현은 관찰되지 않고 있다. [참조 ; Lewis, A.D.,and Rosen, I.G., Characterization of a Proteus rettgeri that transfers genes for urease production and lactose fermentation, Anerican Society for Microbiology Annual Meeting, 1973, Abstract G 218 ],
(2)프로테우스 미라빌리스 NRRL B-18482 (Sigma-Tau GP 1AVI)
Sigma-Tau (Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.p.A)에서 수집한 동물중의 기니아피그에서 수득한 분변(faeces)에서 미생물을 분리하였다. 신선한 분변 물질(0.5 -1.0g)을 무균 뇌-심장 침출액(BHI)(Difco) + 1.5% (w/v) 크로토노베타인 1 수화물로 된 배지(pH 6.8, 37℃) 4㎖중에서 교반하지 않고 24시간 배양하고 메니스커스(meniscus) 바로 아랫부분으로부터 백금이량의 (loopful) 육즙을 채취하여 공지 배지 [Xilinas, M.E., Papavissiliou, t., and Legakis, N.J., Selective medium for growth of proteus, J. Clin, Microbiol., 2 : 459 (1975) ] (이후 그리이크 한천(Greek agar)이라 함)에서 평판 도말 배양하였다. 37℃에서 48시간 경과후 단일 군체를 취하여 그리이크 한천 + 1.5%(w/v) 크로노토베타인 1 수화물로 된 플레이트(pH 6.8 37℃, 48시간)와 맥콘키 한천 CS(Difco) + 1.5%(w/v) 크로토노베타인 1수화물로된 플레이트(pH 6.8, 37℃, 24시간)에서 단일 클론의 평판 도말 배양을 반복하여 정제하였다. 이 미생물을 그리이크 한천 + 1.5%(w/v) 크로토노베타인 1 수화물에서 일일전이(daily transter)(37℃)로 유지한 후 API 시스템(API 20E, API ZYM 및 API 50 CHE 의 strip)과 관련한 형태학적 관찰과 기타 필요로 하는 생화학적 및 생리학적 시험법을 사용하여 자체기준(Industrial Microbiology Laboratories at Sigma-Tau Industrie Farmaccutiche Riunite S.p.A)에 따라 특정화하였다.
항생물질 감수성
앞서나온 P.미라빌리스 NRRL B-18480(Sigma-Tau SP237 서브클론 NACit I1)에 대하여 기재된바 그대로 하여 앤티바이오그램을 얻었다.
위에 나온 결과로부터 분리된 미생물은 API 시스템의 분류 기준에 따른 프로테우스 미라빌리스의 균주에 상응한 것임을 알 수 있다.
(3)프로테우스 미라빌리스 NRRL B-18481(Sigma-Tau BT 1IV)
앞서 나온 프로테우스 미라빌리스 NRRN B-18482(Sigma-Tau GP 1AVI)의 경우와 똑같이 하여 Sigma-Tau(Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.p.A)에서 수집한 동물중의 토끼에서 수득한 분변에서 미생물을 분리하였다. 이 미생물을 그리이크 한천 + 1.5%(w/v) 크로토노베타인 1 수화물에서 37℃(daily transfer)로 유지한 후 API 시스템(API 20E, API ZYM 및 API 50 CHE의 strip)과 관련된 형태학적 관찰과 기타 필요로 하는 생화학적 및 생리학적 시험법을 사용하여 자체 기준(Industrial Microbology Laboratories Of Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.p.A)에 따라 특정화하였다.
항생물질 감수성
앞서나온 P.미라빌리스 NRRL B-18480(Sigma-Tau SP237 서브클론 NACit I1)에 대하여 기재된바 그대로 하여 앤티바이오그램을 얻었다.
위에 나온 결과로부터 분리된 미생물은 API 시스템의 분류기준에 따른 프로테우스 미라빌리스의 균주에 상응한 것임을 알 수 있다.
(4) 프레테우스 미라빌리스 NRRL B-18483 (Sigma-Tau R2AIX)
앞서 나온 프로테우스 미라빌리스 NRRN B-18482(Sigma-Tau GP 1AVI)의 경우와 똑같이 하여 Sigma-Tau(Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.p.A)에서 수집한 동물중의 쥐로부터 수득한 분변에서 미생물을 분리하였다. 이 미생물을 그리이크 한천 + 1.5%(w/v) 크로토노베타인 1 수화물에서 37℃에서 일일 전이(daily transfer)로 유지한 후 API 시스템(API 20E, API ZYM 및 API 50 CHE의 strip)과 관련한 형태학적 관찰과 기타 필요로 하는 생화학적 및 생리학적 시험법을 사용하여 자체 기준(Industrial Microbology Laboratories Of Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.p.A)에 따라 특정화하였다.
항생물질 감수성
앞서나온 P.미라빌리스 NRRL B-18480(Sigma-Tau SP237 서브클론 NACit I1)에 대하여 기재된바 그대로 하여 앤티바이오그램을 얻었다.
위에 나온 결과로부터 분리된 미생물은 API 시스템의 분류기준에 따른 프로테우스 미라빌리스의 균주에 상응한 것임을 알 수 있다.
크로토노베타인으로부터 프로테우스 미라빌리스 분리균에 의한 L-(-)-카르니틴의 진탕 플라스크내 합성에 관한 생체내 변환 데이터 비교
프로테우스 미라빌리스 NRRL B-18480(Sigma-Tau SP237 서브클론 NACit I1)을 NACit + cb 플레이트에서 일일 전이(daily transfer)로 유지(배양온도 : 37℃) 시켰고, 프로테우스 미라빌리스 NRRL B-18481(Sigma-Tau BT 1VI), P.미라빌리스 NRRL B-18482(Sigma-Tau GP 1AVI) 및 P. 미라빌리스 NRRL B-18483(Sigma-Tau R 2AIX)을 그리이크 한천 + 1.5%(w/v) 크로토노베타인 1 수화물의 플레이트 (pH 6.8)에서 일일전이로 유지 (배양온도 37℃) 시켰다. 위의 균주들의 백금이량(loopful)을 뇌-심장 침출액 + 1.5%(w/v) 크로토노베타인 1 수화물의 혼합물(pH 6.8) 50㎖가 각각 들어있는 250㎖ 용량의 에를렌마이어 플라스크에 각각 접종하고 각 플라스크를 17시간 동안 진탕 [200rpm, 1인치 궤도 이심율(orbital eccentricity), 37℃] 한 다음 각 세포를 원심분리 (10분, 12,000 xg, 4℃)하여 수거한 후 차거운 생리식염수(50㎖)로 1회 세척하였다. 세척된 세포 펠릿(cell pellet)을 25mM 포타슘 포스 페이트 + 1%(w/v) 글리세롤 + 12%(w/v) 크로토노베타인 1 수화물을 함유한 비멸균 생체내 변환매체 (50㎖)(pH 6.0) 중에 다시 현탁시켰다. 생체내 변환 반응물을 위와 마찬가지로 하여 33℃에서 96시간 진탕시켰다. 진탕시키는 동안 100㎕을 분취하여 공지방법 [Pearson, D.J., Chase, J.F.A. and Tubbs, P.K. (The assay of (-)-carnitine and its O-acyl derivatives, Meth. Enzymol., 9:612 (1966)]에 따라 L-(-)-카르니틴에 대해 효소 분석하여 다음과 같은 결과를 얻었다. (0∼96 시간동안발생한 증발에 대해 보정을 하였음)
L-(-)-카르니틴 축적량(mM)
프로테우스 미라빌리스 NRRL B-18480(Sigma-Tau SP237 서브클론 NATit I1)에 있어서 큰 크로토노베타인 수화효소(hydratase) 활성을 나타내는 또다른 복합 배지
프로테우스 미라빌리스 NRRL B-18480(Sigma-Tau SP237 서브클론 NATit I1)을 NACit + cb 플레이트에서 일일전이로 유지(배양온도 37℃)하고 이 균주 백금이량(白金耳量)을 아래와 같은 각종 배지 50㎖이 들어있는 250㎖-플라스크속에 접종하였다.
(a) 뇌-심장 침출액(Difco) + 1.5%(w/v) 크로토노베타인 1 수화물, pH 6.8
(b) 0.9% 영양육즙(Difco) + 0.9% 효모 추출물(Difco) + 0.9% Soytone(Difco) + 0.2% 글루코오스 + 0.5% NaCl + 0.25 이염기성 인산 나트륨(무수물) + 1.5%(w/v) 크로토노베타인 1 수화물, pH 6.8
(c) 1.35% 영양육즙 + 1.35% Soytone + 0.2% 글루코오스 + 0.5% NaCl + 0.25 이염기성 인산 나트륨(무수물) + 1.5%(w/v) 크로토노베타인 1 수화물, pH 6.8
(d) 1.35% Soytone + 1.35% 호소 추출물 + 0.2% 글루코오스 + 0.5% NaCl + 0.25 이염기성 인산 나트륨(무수물) + 1.5%(w/v) 크로토노베타인 1 수화물, pH 6.8
(e) 1.35% 영양육즙 + 1.35% 효모 추출물 + 0.2% 글루코오스 + 0.5% NaCl + 0.25 이염기성 인산 나트륨(무수물) + 1.5%(w/v) 크로토노베타인 1 수화물, pH 6.8
(f) 0.9% 영양육즙 + 0.9% Soytone + 0.9% 효모 추출물 + 0.5% NaCl + 0.25 이염기성 인산 나트륨(무수물) + 1.5%(w/v) 크로토노베타인 1 수화물, pH 6.8
(g) 0.9% 영양육즙 + 0.9% Soytone + 0.9% 효모 추출물 + 0.2% 글루코오스 + 0.25 이염기성 인산 나트륨(무수물) + 1.5%(w/v) 크로토노베타인 1 수화물, pH 6.8
(h) 0.9% 영양육즙 + 0.9% Soytone + 0.9% 효모 추출물 + 0.2% 글루코오스 + 0.5% NaCl + 1.5%(w/v) 크로토노베타인 1 수화물, pH 6.8
(i) 뇌-심장 침출액, pH 6.8
각 플라스크를 17시간 진탕(200rpm, 1인치 궤도 이심율, 37℃)한 후 원심분리(10분, 12,000xg, 4℃)하여 각 플라스크로부터 세포를 각각 수거하여 차가운 생리식염부(50㎖)로 1회 세척하였다. 세척된 세포 펠릿을 25mM 포타슘 포스페이트 + 1%(w/v) 글리세롤 + 12%(w/v) 크로토노베타인 1 수화물로 된 비무균 생체내 변환매체(50㎖), (pH 6.0)중에 다시 현탁시키고 위에서와 마찬가지로 이 생체내 변환 반응 혼합물을 33℃에서 96시간 진탕하였다. 진탕시키는 동안 100㎕을 분취하여 위에 나온 바와 같이 L-(-)-카르니틴에 대해 효소분석하여 다음과 같은 결과를 얻었다. (0∼96 시간동안 발생한 증발에 대해 보정을 하였음)
[L-(-)-카르니틴 축적량(mM)]
벤치톱 발효기(Benchtop Fermentor)에서의 프로테우스 미라빌리스 NRRL B-18480에 의한 크로토노베타인의 L-(-)-카르니틴으로의 생체내 변환
2ℓ 용량의 벤치톱 발효기 중에서 P.미라빌리스 NRRL B-18480 세포를 이용하여 크로토노베타인 내부염을 L-(-)-카르니틴으로 생체내 변환시켰다. 박테리아를 뇌-심장 침출액 한천(Difco) +1.5%(w/v) 크로토노베타인 내부염으로 된 사면(斜面) 배지에서 일일전이로 유지(배양온도 37℃) 하였다. 24시간 사면 배양한 것을 뇌-심장 침출액(Difco) + 1.5%(w/v) 크로토노베타인 내부염의 혼합물 250㎖이 들어있는 배플(baffle) 부착 1000㎖-에를렌마이어 플라스크 속에 접종하고 이 플라스크를 계속하여 6시간 진탕(170rpm, 2인치 궤도 이심율, 37℃)한 후 육즙을 사용하여 뇌-심장 침출액 + 1.5%(w/v) 크로토노베타인 내부염을 각각 함유한 6개의 2단계 배양물을 위의 1000㎖-에를렌마이어 플라스크 중에서 접종하였다. 이들 플라스크를 위에서와 마찬가지로 약 15시간 진탕한 다음 원심분리(20분, 8500xg, 4℃) 하여 세포를 회수하여 25mM 포타슘 포스페이트 + 0.5%(w/v) 글리세롤 + 10%(w/v) 크로토노베타인 내부염으로 된 생체내 변환 반응매체(1ℓ)중에 다시 현탁시켰다.
2ℓ 용량의 발효기(Biolafitte fermentor)에 세포함유 생체내 변환 반응 매체를 후 다음 건조하에서 24시간 조작하였다.
교반 속도 : 150rpm
공기 유속 : 1 v/v/m
초기 pH : ∼ 6.8
처리 체적 : 1ℓ
온도 : 35℃
발효기 속으로 10%(w/v) 글리세롤 용액을 계속해서 5㎖/h의 속도로 펌핑하여 공급하였다. 미반응 크로토노베타인과 L-(-)-카르니틴 농도를 아래의 조건하에 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)로 모니터링하였다.
칼럼 : 10μ Partisil SCX, 4mm × 250mm
(PoliConsult Scientifica s.r.l., Rome, Italy)
칼럼 온도 : 35℃
주입 체적 : 10㎕
이동상 : 75mM KH2PO4 - CH3CN(4:6), pH 조절없음
검출기 : 굴절율
체류시간(분) : L(-)-카라니틴, 8.52
크로토노베타인, 9.81
감마-부티로베타인, 12.08
22시간 되었을 때 생체내 변환 반응 매체를 수거하여 여과하였다. 여액을 앞서나온 바와 같이 하여 L-(-)-카르니틴 48.0㎎/㎖와 미반응 크로토노베타인 57.3㎎/㎖을 함유하고 있음을 확인하였다.
크로토노베타인의 L-(-)-카르니틴으로의 전환율 : 43%
L-(-)-카르니틴의 수득율 : 100%
생체내 변환 반응액으로부터 L-(-)-카르니틴의 분리
여과된 생체내 반응액을 Amberlite R 이온교환 수지 [IRA-402 염기성 수지(OH-형) 및 IRC-50 산성수지(H+형)] 의 칼럼속을 연속적으로 통과시켜 무기 양이온과 음이온을 제거하였다. 용출물을 감압하에 농축(50℃) 한 것을 이소부탄올로 3회 처리하여 수분함량을 공비(共沸) 식으로 5∼10%(w/w)까지 저하시켰다. 수득한 혼합물을 이소부탄올 3부(w/w)를 사용하여 결정화해서 L-(-)-카르니틴 4부와 크로토노베타인 1부(w/w)(HPLC)를 함유한 침전물을 얻었다. 계속해서 3회 결정화하여 L-(-)-카르니틴과 ＜0.5%(w/w)의 크로토노베타인(HPLC)을 함유한 고체를 얻었다. 이 방법에 의하여 생체내 변환반응 매체중에 존재하는 약 50%(w/w)의 L-(-)-카르니틴 ([α]25 = -31.5°)을 회수하였다. 모액을 수거하여 그 다음의 생체내 변환 반응에 순환시켰다.
Claims (9)
- 프로테우스 미라빌리스 NRRL B-18480, 또는 크로토노베타인으로부터의 L-(-)-카르니틴 생성능을 가진 그 돌연변이체.
- 프로테우스 미라빌리스 NRRL B-18481, 또는 크로토노베타인으로부터의 L-(-)-카르니틴 생성능을 가진 그 돌연변이체.
- 프로테우스 미라빌리스 NRRL B-18482, 또는 크로토노베타인으로부터의 L-(-)-카르니틴 생성능을 가진 그 돌연변이체.
- 프로테우스 미라빌리스 NRRL B-18483, 또는 크로토노베타인으로부터의 L-(-)-카르니틴 생성능을 가진 그 돌연변이체.
- (가) 크로토노베타인을 입체선택적으로 수화시켜 L-(-)-카르니틴으로 변환시킬 수 있는 미생물의 고체 배지에서 표면 배양물을 제조하고, (나) 크로토노베타인을 함유한 액체 배지에 위의 (가) 단계에서 수득한 배양물을 접종시켜 촉매활성의 바이오매스(biomass)를 제조하여, (다) 액체 배지로부터 바이오매스를 분리한 후, (라) 분리된 바이오매쓰를 최소한 10%(w/w)의 크로토노베타인 내부염을 함유한 생체내 변환 반응 매체중에 분리된 바이오매쓰를 현탁시켜, (마) 생체내 변환 반응액으로부터 L-(-)-카르니틴을 회수하는 단계로 되어있고, 미생물이 프로테우스 미라빌리스 NRRL B-18480, 프로테우스 미라빌리스 NRRL B-18481, 프로테우스 미라빌리스 NRRL B-18482 및 프로테우스 미라빌리스 NRRL B-18483으로 된 군으로부터 선택되는 L-(-)-카르니틴의 미생물학적 제조방법.
- 제5항에 있어서, 생체내 변환 반응매체중에 크로토노베타인 내부염을 10∼12%(w/v) 함유하는 제조방법.
- 제5항에 있어서, (가)단계의 고체 배지중에 크로토노베타인을 함유하는 제조방법.
- 제5항에 있어서, 분리단계 (다)를 원심분리법으로 실시하는 제조방법.
- 제5항에 있어서, 분리단계 (다)를 한외여과법(ultrafiltration)으로 실시하는 제조방법.
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