DE3027380C2

DE3027380C2 -

Info

Publication number: DE3027380C2
Application number: DE3027380A
Authority: DE
Inventors: Alan Ulverston Cumbria Gb Smith; Peter John Sparkbridge Ulverston Cumbria Gb Bailey
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1979-07-19
Filing date: 1980-07-18
Publication date: 1988-12-08
Also published as: SE8005266L; AT378003B; BE884385A; US4533632A; IT8049269A0; ZA804357B; AU541351B2; ATA374780A; NL8004151A; ES8106760A1; JPS5642596A; FR2461753B1; GB2060610A; AU6065080A; ES493506A0; DK310880A; FR2461753A1; CH651589A5; JPH0154998B2; IT1146184B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Desacetyl-Cephalasporin C.

Cephalosporin C-Fermentierungen sind eine Hauptquelle für die Gewinnung von Cephalosporinkernen, welche in großen Mengen zur Herstellung einer Vielzahl von semi-synthetischen Cephalosporin-Antibiotika verwendet werden. Derartige Fermentierungen erfolgen im allgemeinen während einiger Tage und es wurde beobachtet, daß aufgrund der Tatsache, daß Cephalosporin C in wäßriger Lösung durch β-Lactam-Hydrolyse einem nichtenzymatischen Abbau unterliegt, bei einem typischen industriellen Fermentierungsverfahren etwa 25% des festgestellten Cephalosporin C-Gehaltes verlorengehen.

Es wurde auch allgemein beobachtet, daß etwa 15% des während der Fermentierung hergestellten Cephalosporinkernes als Desacetyl-Cephalosporin C vorliegen. Wenngleich diese Verbindung ebenfalls als Ausgangsmaterial für den Cephalosporinkern brauchbar ist, ist es im allgemeinen umständlich und unwirtschaftlich, die Menge an Desacetyl-Cephalosporin C, die sich gebildet hat, zu isolieren, da die notwendigen Verfahrenstechniken verschieden und sehr aufwendig sind. So stellen auch die 15% des Cephalosporinkernes, die als Desacetyl-Cephalosporin C vorliegen, einen Verlust dar, so daß im allgemeinen etwa 40% des hergestellten Cephalosporinkernes nicht zur Extraktion als Cephalosporin C zur Verfügung stehen.

Es wurde nun überraschend gefunden, daß entgegen früheren Berichten (Konecny et al., J. Antib., Vol. XXVI, Nr. 3, S. 140) Desacetyl-Cephalosporin C bezüglich des nicht-enzymatischen b-Lactam-Abbaus in Kulturbrühe sehr viel stabiler ist als Cephalosporin C. Es wurde überraschenderweise kein Abbau von Desacetyl-Cephalosporin C in wäßrigen Lösungen und Kulturbrühen unter Fermentierungsbedingungen festgestellt, auch nicht mit empfindlichen Meßverfahren.

Aufgrund dieser Tatsache wurde nun ein Verfahren entwickelt, bei dem Cephalosporin C unmittelbar nach der Bildung während der Fermentierung in Desacetyl-Cephalosporin C umgewandelt wird. Ein solches Verfahren hat zweierlei Vorteile. Erstens tritt praktisch kein Verlust an Cephalosporin-Produkt aufgrund von Abbau auf, da das Desacetyl-Cephalosporin C überraschend stabil ist, und zweitens kann das Desacetyl-Cephalosporin C, das bei herkömmlichen Fermentierungen erhalten wird, ebenfalls gewonnen werden. Es wurde somit gefunden, daß eine erhebliche Zunahme der Cephalosporin-Produktausbeuten erreicht wird. Diese Zunahme beträgt typischerweise etwa 40%, kann jedoch, abhängig vom Desacetyl-Cephalosporin C-Gehalt der normalen Cephalosporin C-Fermentierung und der Kinetik der Cephalosporin C-Akkumulierung, variieren.

Darüber hinaus wurde gefunden, daß Desacetyl-Cephalosporin C weiter akkumuliert, wenn die Fermentierung länger als bei der Cephalosporin C-Herstellung üblich, fortgeführt wird. Im allgemeinen läßt die Akkumulierung von Cephalosporin C nach etwa sechs Tagen Fermentierungszeit nach, was die Standardfermentierungszeit darstellt. Es wurde jedoch gefunden, daß bis zu weiteren 50% verwertbaren Cephalosporinkernen erhalten werden können, wenn die Fermentierungszeit in Gegenwart von Acetylesterase um beispielsweise 2 Tage oder etwa ein Drittel der Zeit verlängert wird. So kann, wenn die Fermentierung verlängert wird, die Gesamtausbeute an verwertbarem Cephalosporinkern durch absichtliche Herstellung von Desacetyl-Cephalosporin C bis zu 90% größer sein als bei einer normalen Cephalosporin C Fermentierung.

Dies ist somit eine beträchtliche Zunahme der Ausbeute an verwertbarem Cephalosporinkern, die einen bedeutenden wirtschaftlichen Wert darstellt. Darüber hinaus können die Grenzen, welche durch die Instabilität des Cephalosporins C für die Herstellung und die Ausbeuten an Cephalosporinkern durch Fermentierung gesetzt sind, weitgehend abgebaut werden.

Desacetyl-Cephalosporin C kann leicht in pharmakologisch wertvolle Derivate, wie Cephalothin und Cephaloridin überführt werden.

Diese Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung von Desacetylcephalosporin C, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Cephalosporin C produzierenden Mikroorganismus in Anwesenheit von soviel Acetylesterase fermentiert, daß praktisch das gesamte erzeugte Cephalosporin C in Desacetylcephalosporin C überführt wird, bevor der nicht-enzymatische Abbau des Cephalosporin C stattfindet.

Die Acetylesterase kann entweder gleich bei Beginn der Fermentierung oder wenn die Cephalosporin C-Wachstumsphase beginnt, oder wahlweise in Intervallen während der Fermentierung zugesetzt werden. Alternativ kann die Acetylesterase während des gesamten Fermentierungsverfahrens in situ entwickelt werden.

Das Esterase-Enzym kann aus einer großen Zahl von Quellen stammen. So kann die Esterase unter anderem von höheren Pflanzen, Bakterien, Hefen und Fungi stammen. Zu geeigneten höheren Pflanzen gehören die Schalten von Citrusfrüchten, wie in der britischen Patentschrift 9 66 222 beschrieben, und Weizenkeime wie in der britischen Patentschrift 11 21 308 beschrieben. Letztere Patentschrift beschreibt auch geeignete Acetylesterase-Aktivität bei dem Bakterium des Genus Rhizobium. Geeignete Hefen sind die vom Genus Rhodotorula, wie sie in der britischen Patentschrift 14 74 519 der Anmelderin beschrieben sind. Mikroorganismen der Klasse Basidiomycetes, wie in der britischen Patentschrift 15 31 212 der Anmelderin beschrieben und Bakterien der Species B. subtilis, wie in App. Microbiol. Vol. 30, Nr. 3, S. 413 beschrieben, sind ebenfalls geeignete Ausgangsstoffe. Ein Ausgangsmaterial für das Enzym, welches sich als besonders geeignet erwiesen hat, sind die Mikroorganismen vom Genus Rhodosporidium, insbesondere die Species Rhodosporidium toruloides, beispielsweise Stamm CBS 349, wie in der oben erwähnten Patentschrift 15 31 212 der Anmelderin beschrieben.

Geeignete Auswahlverfahren zur Bestimmung brauchbarer Esterase-Grundstoffe sind in der britischen Patentschrift 15 31 121 der Anmelderin beschrieben. Wenngleich dort die Beschreibung des Verfahrens sich im allgemeinen auf die Bestimmung der Esterasespiegel bezieht, die durch Mikroorganismen der Klasse Basidiomycetes erhalten werden, kann das Verfahren leicht zur Bestimmung von Esterasen abgewandelt werden, die aus anderen Grundstoffen durch geeignete Wahl der Verfahrensbedingungen erhalten werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird zweckmäßig durch Kultivierung eines bekannten Cephalosporin C produzierenden Stammes in Gegenwart des Acetylesterase-Enzyms unter aeroben Bedingungen, bevorzugt in Submerskultur unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff, durchgeführt. Das verwendete Fermentierungsmedium sollte eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine verwertbare Stickstoffquelle und, falls gewünscht, wachstumsfördernde Substanzen sowie anorganische Salze enthalten.

Geeignete Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose, Saccharose, Stärke, lösliche Stärke, n-Paraffine, pflanzliche und tierische Öle, Essigsäure, Methanol, Glycerin, Sorbit und Äthanol.

Geeignete Stickstoffquellen sind beispielsweise natürliche, Stickstoff-enthaltende Substanzen oder Materialien, die daraus hergestellt sind, wie Fleischextrakte, Pepton, Casein, Maisquellwasser, Hefeextrakte, Sojabohnenmehl, Trypton, Baumwollsamenmehl und Weizenkleie. Es können auch Stickstoff enthaltende organische oder anorganische Verbindungen verwendet werden, beispielsweise Harnstoff, Nitrate und Ammoniumsalze, wie Ammoniumacetat, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat und Ammoniumphosphat.

Anorganische Salze, die in dem Fermentationsmedium verwendet werden können, sind beispielsweise Kalium-, Magnesium- und Calciumsulfate, -nitrate, -chloride, -carbonate und -phosphate.

Wachstumsfördernde Substanzen, die verwendet werden können, sind beispielsweise Cystein, Cystin, Thiolsulfat, Methyloleat und insbesondere Methionin, sowie auch Spurenelemente wie Eisen, Zink, Kupfer und Mangan.

Die Kulturbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert und Fermentationszeit werden so gewählt, daß der verwendete Stamm eine maximale Menge des gewünschten Cephalosporins bilden kann. Vorteilhafterweise erfolgt die Fermentierung in einem Temperaturbereich von 15 bis 45°C, vorzugsweise bei etwa 25°C, bei einen pH von 4 bis 9, beispielsweise von 5 bis 8, und vorzugsweise etwa 6, während einer Zeit von 1 bis 20 Tagen, vorzugsweise während 4 bis 10 Tagen.

Der bevorzugteste Cephalosporin C bildende Stamm ist ein Stamm von Acremonium chrysogenum (früher Cephalosporium acremonium genannt). Es wurde auch gefunden, daß einige Mutanten von Acremonium chrysogenum große Mengen an Acetylersterase in situ während der gesamten Fermentierung bilden können. Auch andere Stämme vom Genus Cephalosporium, beispielsweise Stämme von Cephalosporium polyaleurum, und einige Mikroorganismen des Genus Emericellopsis und Streptomyces, beispielsweise Stämme von Emericellopsis glabra, Emericellopsis microspora und Streptomyces lactamdurans können Cephalosporin C bilden.

Die Menge an Esterase oder Esterase-enthaltendem Material, die notwendig ist, um das bei der Fermentierung gebildete Cephalosporin C in Desacetyl-Cephalosporin C zu überführen, kann durch vorheriges Bestimmen der Enzymaktivität oder durch Probeversuche in kleinem Maßstab leicht bestimmt werden und ist abhängig von der Esterae und den verwendeten Reaktionsbedingungen. Den Verlauf der Reaktion überwacht man am besten mit Hilfe von HPLC oder Dünnschicht- oder Papier-Chromatographie unter Verwendung einer geeigneten Träger-Lösungsmittelsystem-Kombination und durch densitometrische Bestimmung. Brauchbare Verfahren sind in der britischen Patentschrift 15 31 212 der Anmelderin, auf die bereits oben Bezug genommen wurde, beschrieben. Im allgemeinen ist es angebracht, einen wesentlichen Überschuß an Esterase zu verwenden.

Das zur Isolierung des Desacetyl-Cephalosporin C Produktes verwendete Verfahren verläuft im allgemeinen wie üblich, beispielsweise wie es in der britischen Patentschrift 14 33 528 beschrieben ist. Nach Zentrifugieren oder Filtrieren der Fermentationsbrühe, z. B. durch ein Kieselgur-Bett, kann die Isolierung erfolgen, beispielsweise indem man die Lösung durch Adsorption an Aktivkohle entsalzt und anschließend mit Aceton und Wasser eluiert. Das Eluat kann dann noch weiter gereinigt werden, indem man es an einem Anionenaustauscherharz, (z. B. Amerlite IRA-68 in Acetatform) adsorbiert, das Desacetyl-Cephalosporin mit Kaliumacetatlösung aus dem Harz eluiert und das Produkt mit Aceton ausfällt.

Im allgemeinen liegt die Esterase in einer Form vor, die leicht in der Fermentierungsbrühe zur Hydrolyse des Cephalosporin C verteilt werden kann. Wenn die Esterase von einem anderen Mikroorganismus stammt, kann eine Probe der gesamten Kultur oder der abgetrennten Zellen verwendet werden, vorzugsweise nach einer Behandlung, die die Zellen nicht-lebensfähig macht, und, falls gewünscht, nach Zerstören der Zellen, z. B. durch herkömmliche Methoden, wie Ultraschallbehandlung, Behandlung mit lytischen Enzymen oder mit Detergentien. Andere Zellpräparationen, bei denen während der Lagerung die Esteraseaktivität erhalten bleibt, können ebenfalls verwendet werden, beispielsweise acetongetrocknete Pulver oder mit Aceton behandelte Zellen.

Die mikrobielle Esterase kann auch in zellfreier Form verwendet werden. So kann man ein Filtrat oder die überstehende Flüssigkeit von der Kultur verwenden. Falls gewünscht, können die Zellen von dem Filtrieren oder Zentrifugieren, beispielsweise wie oben beschrieben, zerstört werden. Alternativ kann die zellfreie Esterase auf herkömmliche Weise weiter gereinigt werden. Zu den Verfahrenstechniken, die angewendet werden können, gehören die Ausfällung des Enzyms, z. B. mit Salz oder mit organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, die Chromatographie, z. B. an Ionenaustauscher-Harzen oder an Trägermaterialien mit einer speziellen Affinität für das Enzym, und das Entsalzen, z. B. Gelfilterung oder Dialyse. Die zellfreie Esterase kann als Lösung, als Niederschlag oder als geeignetes immobilisiertes Präparat verwendet werden.

Wenn die Esterase von einer höheren Pflanze stammt, ist es wünschenswert, einen enzymhaltigen Extrakt der Pflanze zu verwenden. Ein solcher Extrakt kann auf herkömmliche Weise hergestellt werden, wobei man im allgemeinen das Enzym aus der Pflanze durch physikalische Verfahrensweisen, wie Mahlen oder Pressen, freisetzt, wie es in der britischen Patentschrift 9 66 222 beschrieben ist, oder mittels chemischer Verfahren, beispielsweise durch Behandeln der Pflanze mit einem Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel, wie Petroläther, wie es wiederum in der britischen Patentschrift 11 21 308 beschrieben ist. Das erhaltene Präparat kann dann mit oder ohne Entfernung von Zellrückständen direkt der Hydrolyselösung zugesetzt werden. Alternativ kann man, falls gewünscht, das Präparat weiter behandeln, beispielsweise unter Anwendung der oben für die mikrobiellen Enzyme beschriebenen Verfahrensweisen, wobei man dann eine zellfreie Esterase erhält, die dann, wie für die mikrobiellen Enzyme beschrieben, verwendet werden kann.

Selbstverständlich wird bei den oben beschriebenen Formen der Acetylesterase das Enzym der Fermentierungsbrühe zugesetzt. Nach einem Alternativerfahren ist es jedoch auch möglich, das Enzym in situ zu entwickeln, indem man eine Mischkultur der Cephalosporin produzierenden Organismen und einem der weiter oben beschriebenen Esterase produzierenden Organismus verwendet. Alternativ können auch Mikroorganismen, beispielsweise Mutanten von Acremonium chrysogenum, welche zusätzlich zu Cephalosporin C während der gesamten Fermentierung hohe Esterasespiegel produzieren, verwendet werden.

Solche Mutanten von Acremonium chrysogenum können nach einer Vielzahl von Verfahren hergestellt werden, einschließlich den Verfahrenstechniken, wie sie in "Techniques for the Development of Micro-Organisms" von H. I. Adler, in "Radiation and Radioisotopes for Industrial Microorganisms", Proceedings of the Symposium, Wien 1973, S. 241, International Atomic Energy Authority, beschrieben sind. Bei derartigen Verfahren verwendet man:

i) Ionisierende Strahlung, z. B. Röntgen- und γ-Strahlung, UV-Licht, UV-Licht in Anwesenheit eines photosensibiliserenden Mittels, beispielsweise 8-Methoxypsoralen; Stickstoffoxyd, Hydroxylamin; Pyrimidinbasen-Analoga, z. B. 5-Bromuracil; Acridine; Alkylierungsmittel, z. B. Äthylmethansulfonat oder Senfgas; Wasserstoffperoxid; Phenole; Formaldehyd; Hitze, und
ii) genetische Techniken, wie Rekombination, Transduktion, Transformation, Lysogenisation, lysogene Konversion und Selektiv-Techniken für spontane Mutanten.

Es wurde gefunden, daß die Verwendung von UV-Licht geeignet ist.

Die Anwesenheit eines Mutanten, gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung, kann unter Verwendung geeigneter Screeningverfahren festgestellt werden. So werden in einem ersten Verfahren Mutanten, welche während des gesamten Fermentierungsverfahrens wesentliche Mengen DAC und sehr wenig Cephalosporin C produzieren mittels Standard-Testverfahren bestimmt.

In einem zweiten Verfahren werden Mutanten, welche die Deacetylierung von zugesetztem Cephalosporin C bewirken, ebenfalls mittels Standard-Testmethoden indentifiziert. Mutanten gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung sind diejenigen, welche beiden Testverfahren genügen.

Die Erfindung wird nun noch destailierter anhand der folgenden Beispiele beschrieben, die jedoch nicht einschränkend sein sollen. Alle Temperaturen sind in °C angegeben.

Der Stamm IMI 237 183 wurde beim Commonwealth Mycological Institute, Kew, England, am 9. April 1979 hinterlegt.

Stämme dieses Typs sind unter anderem in "Cephalosporiumartige Schimmelpilze (Hyphomycetes)" von Walter Gams (Verlag, Westdeutschland) 1971, S. 109-111 beschrieben.

Beispiel 1 (a) Herstellung von Acetylesterase

Rhodosporidium toruloides CBS 349 kultiviert man in 2-l-Kolben auf einem flüssigen Medium, welches Glucose (2%), Hefe-Extrakt (1%), Pepton (1%), Kaliumdihydrogenphosphat (0,5%) und Polypropylenglykol (0,1%) enthält, während 72 Stunden. 100 ml Suspension der Hefe gibt man dann in einen sterilen Kolben und kühlt auf 4°C. Dazu gibt man 30 ml Aceton, das zuvor auf -10°C gekühlt worden war. Nachdem man kurz gerührt hat, gibt man weitere Volumenteile kaltes Aceton nacheinander zu, um die Acetonkonzentration stufenweise auf 75% (V/V) zu erhöhen. Man läßt die Hefezellen sich absetzen, dekantiert und gibt frisches, sauberes Aceton zu. Nachdem man gründlich gemischt hat, dekantiert man das überschüssige Aceton und wäscht die behandelten Zellen zweimal durch Zentrifugieren in sterilem Wasser. Die gewaschenen Zellen nimmt man erneut in eine Suspension in sterilem Wasser auf, wobei man ein Suspension mit einer Esteraseaktivität von 3,5 iu/ml erhält.

(b) Fermentierung von Desacetylcephalosporin C (DAC)

Die Fermentierung erfolgt in Schüttelkolben, welche 9,5 ml Medium der nachstehend angegebenen Zusammensetzung enthalten, denen man dann 0,4 ml der unter (a) hergestellten Esterasesuspension nach der Autoklaven-Behandlung zusetzt:

Maisquellwasser0,5% als Stickstoff Lactose46 g/l Glucose2 g/l Methionin2,3 g/l Phenylacetyläthanolamin1,5 g/l Calciumcarbonat16 g/l Harnstoff0,8 g/l Ammoniumsulfat3,4 g/l Maisöl6 Tropfen pro Kolben pH (von der Autoklavenbehandlung
mit NaOH eingestellt)6,6

Man inokuliert die Kolben mit A. chrysogenum Stamm IMI 237 183 (0,5 ml), der zuvor 48 Stunden lang in einem Medium kultiviert worden war, das Maisquellwasser (0,1% als Stickstoff), Ammoniumacetat (5,5 g/l), Saccharose (25 g/l) und Calciumcarbonat (10 g/l) enthält. Man inkubiert die Kolben 5 Tage lang bei 25° auf einem Schüttler und bestimmt den DAC-Gehalt durch HPLC. Tabelle I zeigt den Gehalt an DAC nach 3, 4 und 5 Tagen. Jede Zahl bedeutet das Mittel aus drei individuell getesteten Kolben. Zur Kontrolle wurden Kolben, welche Medium und Mikroorganismen, aber keine Esterase enthielten, gleichzeitig getestet.

Tabelle I

Beispiel 2 Inokulum-Entwicklung

Eine gefriertrocknete Ampulle A. chrysogenum IMI 237 183 wird unter Verwendung von 2 ml flüssigem Sabouraud-Medium rekonstituiert. Die erhaltene Zellsuspension verwendet man, um einen 250 ml Kolben mit abgeflachter Seite, der verfestigtes Sabouraud'sches Medium enthält, zu inokulieren. Man inkubiert die Kultur 14 Tage lang bei 25°C.

Sabouraud'sches Medium

Maltose4,0% Gew./Vol. Malzextrakt2,4% Pepton1,0% Agar2,5% mit Wasser auf100% auffüllen,

Der pH wird von der Sterilisation auf 7,5 eingestellt.

Nach beendeter Inkubation werden etwa 50 ml steriles Wasser und Glasperlen zugegeben, um die Oberflächenkultur abzuwaschen. Die suspendierten Zellen verwendet man dann um einen 500 ml Kolben mit abgeflachter Seite (Roux-Kolben) zu inokulieren, der verfestigtes Sabouraud'sches Medium enthält. Für jeden der Kolben verwendet man dann etwa 4 ml Suspension und inkubiert dann 12 Tage bei 25°C.

Man stellt eine Zellsuspension her, indem man die Oberflächenkultur mit 40 ml sterilem Wasser und Glasperlen abwäscht. Diese Suspension verwendet man zum Inokulieren der flüssigen Saatansätze in 2 Liter Kolben mit flachem Boden und Wandvorsprüngen, die 600 ml Pepton/Malzextrakt-Medium enthalten.

Pepton/Malzextrakt-Medium

Pepton1,0 Gew./Vol. Malzextrakt2,4% Yeatex Granulat2,68% Kalk0,5% Sojabohnenöl1,96% mit Wasser auf100% auffüllen.

Der pH wird vor dem Sterilisieren auf 7,5 eingestellt.

Die flüssigen Saatansätze werden jeweils mit 6 ml Zellsuspension aus dem Roux-Kolben inokuliert und dann bei 25°C auf einer Schüttelvorrichtung mit einem Ausschlag von 4,9 cm bei 110 U/min. 72 Stunden lang inkubiert. Man sammelt zwei flüssige Saatkulturen, um ein Inokulum für die Haupt-Fermentierungsstufe zu schaffen.

Es werden zwei Fermentierungsvorgänge, jeweils in einem 7-Liter-Kolben durchgeführt, wobei man bei 25°C rührt und das Fermentierungsmedium nach Beispiel 1 (b) verwendet, jedoch mit der Ausnahme, daß Maisöl in einem Anteil von 3,0% Vol/Vol enthalten ist. Der pH wird auf 6,0 ± 0,1 eingestellt, wobei man 1 M Schwefelsäure und 8 M Ammoniumhydroxyd verwendet. Während der gesamten Fermentierung wurde eine mehr als 30%ige Sättigung an gelöstem Sauerstoff aufrechterhalten. Ein Zusatz von 24%iger Ammoniumsulfatlösung wurde bei einem Teil der Fermentierung verwendet, um den Gehalt an freiem Ammoniak höher als 500 ppm zu halten.

Wenn die eingesetzten Kohlenstoffvorräte nach etwa 72 Stunden verbraucht waren, wurde während der restlichen Fermentierungszeit ein Glucosezusatz zugegeben, um die Atmungsrate aufrechtzuerhalten. Dies waren etwa 15 ml/h 55%ige Cerelose (Glucosemonohydrat).

Um den Vorteil einer Fermentierung unter Herstellung von Desacetyl-Cephalosporin C (DAC) zu veranschaulichen, wurde Acetylesterase von Rhodosporidium toruloides CBS 349 (wie in Beispiel 1 a hergestellt) zu einer der Fermentierungen beim Beginn der Cephalosporin-Akkumulierungsphase (48 Std.) zugegeben. Es wurde eine Menge äquivalent. 400 ml Hefebrühe zugesetzt.

Die Fermentierung dauerte 8 Tage, wobei täglich Proben entnommen und auf Cephalosporin C und DAC unter Verwendung von HPLC-Assays untersucht wurden.

Ein Vergleich zwischen der Vergleichsfermentierung, bei der Cephalosporin C hergestellt wurde und der mit Esterase behandelten Fermentierung zur Erzeugung von DAC ist in Tabelle III zusammengefaßt.

Tabelle IV zeigt die DAC Gehalte nach 141 und 189 Stunden, ausgedrückt in Äquivalenten Cephalosporin C.

Tabelle IV

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Desacetyl-Cephalosporin C, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Cephalosporin C produzierenden Mikroorganismus in Anwesenheit von soviel Acetylesterase fermtiert, daß praktisch das gesamte erzeugte Cephalosporin C in Desacetyl-Cephalosporin C überführt wird, bevor der nicht-anzymatische Abbau des Cephalosporin C stattfindet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentierung 25°C und einem pH von 5 bis 8 während 4 bis 10 Tagen erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Überschuß des Enzyms-Acetylesterase zugibt, bevor sich das Cephalosporin C bildet.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Acetylesterase einsetzt, die von Rhodosporidium toruloides CBS 349 stammt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Acetylesterase in situ durch Fermentierung eines Acetylesterase-produzierenden Mikroorganismus bildet.