DE3022723A1

DE3022723A1 - Verfahren zur herstellung von mildiomycin

Info

Publication number: DE3022723A1
Application number: DE19803022723
Authority: DE
Inventors: Tsunemoto Asai; Hidekazu Sawada; Takashi Suzuki
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1979-06-21
Filing date: 1980-06-18
Publication date: 1981-01-29
Also published as: GB2053214A; FR2459288B1; IN151859B; CH647258A5; GB2053214B; NL8003591A; IT8067976A0; US4334022A; FR2459288A1; JPS5933358B2; IT1129094B; JPS565100A; DE3022723C2

Description

Verfahren zur Herstellung von Mllfliomycln

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Mildiomycin durch Kultivieren eines zu Actinomycetes gehörenden, Mildiomycin bildenden Mikroorganismus in einem Kulturmedium, in dem er Mildiomycin bildet und anhäuft. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung in Gegenwart wenigstens einer N_Methylverbindung durchführt.

Mildiomycin ist eine antibiotische Substanz, die als "Antibiotikum B-98891" bezeichnet wird. Seitdem sie erstmals entdeckt wurde, sind ihre Eigenschaften untersucht und ihre nachstehend dargestellte Struktur bestimmt worden:

CH₂-OH

Inzwischen wurde die Aufmerksamkeit der Anmelderin auf die Aktivität der Verbindung, insbesondere ihre Wirkungen als Mittel zur Verhinderung und Behandlung des Mehltaus bei den verschiedensten Pflanzen und als Milbenbekämpfungsmittel oder miticides Mittel gerichtet (US-PS 4 007 267, GB-PS 1 507 193 und The Journal

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of Antibiotics, Band 31, Nr.6 (1978) 511-518 und 519-524).

In eingehenden Untersuchungen der Anmelderin angesichts des vorstehend beschriebenen Hintergrundes mit dem Ziel, Mildiomycin im großtechnischen Ausmaß mit niedrigen Kosten herzustellen, wurde nun gefunden, daß Mildiomycin in erheblicher Menge hergestellt werden kann, wenn ein zu Actinomycetes gehörender Mikroorganismus, der die Fähigkeit zur Bildung von Mildiomycin hat, in einem Kulturmedium in Gegenwart einer N-Methylverbindung gezüchtet wird. Gegenstand der Erfindung ist demgemäß die Herstellung von Mildiomycin nach einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen zu Actinomycetes gehörenden Mikroorganismus, der Mildiomycin zu bilden vermag, in einem Kulturmedium züchtet, das eine N-Methylverbindung in einer Menge von wenigstens 3 mMol enthält, wobei Mildiomycin im Kulturmedium gebildet und angehäuft wird.

Als Mikroorganimus, der zu Actinomycetes gehört und Mildiomycin zu bilden vermag, kommt für das Verfahren gemäß der Erfindung beispielsweise Actinomycetes, der zur Gattung Streptoverticillium gehört, insbesondere Streptoverticillium rimofaciens FERM-P 2549 (IFO 13592, ATCC 31120) in Frage. Dieser Mikroorganismus wurde ursprünglich nach den in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7.Auflage (US-PS 4 007 267 und GB-PS 1 507 193) beschriebenen Richtlinien für die Klassifizierung als Streptomyces rimofaciens identifiziert, jedoch wurde dieser Mikroorganismus als Folge einer späteren Änderung der Richtlinien für die Klassifizierung als zur Gattung Streptoverticillium gehörend eingestuft. Die neuen Richtlinien sind in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8.Auflage (1974) (The Journal of Antibiotics Band 31, Nr.6, Seite 511-518) beschrieben.

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Für die Zwecke der Erfindung können N-Methylverbindungen verwendet werden, in denen wenigstens ein Stickstoffatom mit 1 bis 4 Methylresten im Molekül substituiert ist. Von diesen Verbindungen werden solche, in denen ein Stickstoffatom mit Methylresten im Molekül substituiert ist, bevorzugt. Besonders bevorzugt werden quaternäre Ammoniumsalze mit einer Trimethylammoniogruppe, in der das Stickstoffatom mit drei Methylresten substituiert ist, d.h. -N (CH-)~. Ferner können Verbindungen mit einer Gruppe, die im Kulturmedium in eine Gruppe der Formel ^N-CH^ umgewandelt werden kann, z.B. N,N-Methylenbisacrylamid, ebenfalls als N-Methylverbindungen verwendet werden.

Die N-Methylverbindungen haben im allgemeinen Molekulargewichte im Bereich von etwa 50 bis 1000, vorzugsweise von 70 bis 200, wobei Molekulargewichte von 90 bis 130 besonders bevorzugt werden. Die N-Methylverbindungen können in Wasser löslich oder unlöslich sein, jedoch werden vorteilhaft wasserlösliche N-Methylverbindungen verwendet. Beispiele solcher N-Methylverbindungen sind N-Methylsäureamide, N-Methylaminoverbindungen, N-Methylamine, N-Methy!ammoniumverbindungen, Polymethylendiamine und N,N-Methylenbisacrylamid. Vorteilhaft können N-Methylsäureamide, z.B. Ν,Ν-Dimethylacetamid und N-Methylacrylamid, N-Methylaminoverbindungen, z.B. N-Methylharnstoff, 1,1,3,3-Tetramethylharnstoff und 2-Dimethylaminoäthanol, N-Methylamine, z.B. Trimethylamin und Dimethylamin, N-Methylammoniumverbindungen, z.B. Lecithin, Cholin, Betain, Tetramethylammonium und Äthylen-bis( trimethylammoniurtOchlorid , und Polymethylendiamine, z.B. Äthylendiamin, Tetrarnethylendiamin und Hexamethylendiamin, verwendet werden. Gute Ergebnisse werden mit N-Methylammoniumverbindungen, insbesondere Cholin, Betain oder Tetramethylammonium, erhalten. Diese N-Methylverbindungen können allein oder als Mi-

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schung von zwei oder mehreren Arten verwendet werden. Die Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren, bei dem man ein Material, das eine W-MethyI-verbindung enthält, beispielsweise Zuckerrübenmelasse, die Betain enthält, Sojabohnenmehl, das Lecithin enthält, oder Hühnereier, die sowohl Cholin als auch Lecithin enthalten,usw. zu einem Nährmedium in einer großen Menge gibt, so daß das Medium mehr als 3 ml-Iol N-Methylverbindungen enthält. Die Konzentration der N-Methylverbindung im Nährmedium wird zweckmäßig so gewählt, daß das Wachstum des verwendeten Mikroorganismus nicht gehemmt wird, und auf mehr als 3 mMol eingestellt. Vorzugsweise beträgt die Konzentration 4 bis 200 mMol, insbesondere 7 bis 50 mMol. Bei einer 200 mMol übersteigenden Konzentration ist der erzielte Effekt des Zusatzes der N-Methylverbindungen nicht so bemerkenswert wie der unterhalb von 200 mMol erzielte Effekt. Die Menge der natürlich vorkommenden Materialien, die N-Methylverbindungen enthalten, kann so gewählt werden, daß die vorstehend genannte Konzentration der N-Methylverbindung eingestellt wird, jedoch würde diese Konzentration natürliche Stoffe in einer größeren Menge erfordern, als sie üblicherweise verwendet wird, wodurch das Wachstum des Mikroorganismus durch Komponenten, die außer den N-Methylverbindungen in den natürlich vorkommenden Substanzen enthalten sind, nachteilig beeinflußt werden kann, so daß die Bildung von Mildiomycin verhindert wird. In diesen Fällen werden vorzugsweise N—Methylverbindungen in Kombination mit den natürlichen Substanzen verwendet. Der Zeitpunkt, zu dem die N-Methylverbindung dem Nährmedium zugesetzt wird, liegt vorzugsweise im Hinblick auf die Leichtigkeit der Betriebsführung und die Wirksamkeit vor dem Impfen des Nährmediums mit den Mikroorganismen,jedoch kann die N-Methylverbindung auch zu einem

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geeigneten Zeitpunkt während der Kultivierung zugesetzt werden.

Als Kohlenstoffquellen eignen sich im Nährmedium für die Kultivierung beispielsweise Zucker, die vom verwendeten Mikroorganismus verwertet werden können, z.B. Stärke, Dextrin, Glucose, Maltose, Saccharose, Sorbit sowie Melasse, Maissirup und Hirsegelee, und organische Säuren, z.B. Essigsäure und Bernsteinsäure, und Fette und Öle. Als Stickstoffquellen eignen sich verschiedene Ammoniumsalze, Nitrate, Harnstoff sowie organische natürlich vorkommende Substanzen wie Hefeextrakt, Casein, Fleischextrakt, Baumwollsaatmehl, Maisquellwasser und Sojabohnenmehl. Das Medium kann ferner als anorganische Salze, falls erforderlich, Salze von Eisen, Magnesium, Mangan, Kobalt, Kupfer, Natrium, Kalium, Calcium, Zink usw. enthalten. Ferner werden dem Nährmedium zweckmäßig spezielle Nährstoffe wie Aminosäuren, Vitamine, Purin- und Pyrimidinbasen u.dgl. zugesetzt, wenn der Mikroorganismus solche Nährstoffe benötigt.

Die Kultivierung kann nach Belieben stationär, als aerobe Submerskultur, als Schüttelkultur oder nach anderen Kulturverfahren durchgeführt werden, jedoch wird im allgemeinen die aerobe Submerskultur bevorzugt.

Die Kultivierungstemperatur kann im Bereich von 20° bis 40°C liegen, beträgt jedoch vorzugsweise 24° bis 34°C. Das Kulturmedium wird vorzugsweise bei einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 9 gehalten. Zu diesem Zweck wird der pH-Wert des Mediums mit einer verdünnten wässrigen Lösung von Ätzalkali oder wässrigem Ammonium oder einer verdünnten wässrigen Lösung von Schwefelsäure, Salzsäure o.dgl. während der Kultivierung eingestellt. Alkalisalze wie Kaliumcarbonat und Natriumcarbonat können dem Medium ebenfalls zugesetzt werden.

Beim Verfahren gemäß der Erfindung wird die Kultivie-

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-tr-

rung fortgesetzt, bis eine wesentliche Menge Mildiomycin gebildet und im Kulturmedium angehäuft worden ist. Im allgemeinen kann die maximale Ausbeute an Mildiomycin in 4 bis 12 Tagen erreicht werden.

Aus dem in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltenen Kulturmedium kann das Mildiomycin, falls erforderlich, nach üblichen Methoden, die normalerweise für die Isolierung von basischen wasserlöslichen Antibiotika angewandt werden, isoliert werden. Beispielsweise wird nach der Entfernung der Mikrobien— zellen und anderer unlöslicher Stoffe aus dem Kulturmedium nach einem Verfahren wie Filtration, Zentrifugieren ο.dgl. das Filtrat oder der Überstand mit Aktiv kohle oder adsorptionsfähigen Harzen in Berührung gebracht, um das Mildiomycin zu adsorbieren, worauf das Mildiomycin mit einem wässrigen organischen Lösungsmittel, einer wässrigen Salz- oder Säurelösung, einer Pufferlösung o.dgl. eluiert werden kann. Da das gemäß der Erfindung gebildete Antibiotikum eine basische Substanz ist, wird sie an einem Kationenaustauscherharz gut adsorbiert und kann mit geeigneten Säuren, Alkalien oder Pufferlösungen eluiert werden. Diese Methoden können allein und in Kombination angewandt werden. Anschließend wird das Eluat zur Gewinnung von Mildiomycin eingeengt und kristallisiert. Das hierbei erhaltene Mildiomycin kann unbedenklich als Wirkstoff von antibakteriellen und miticiden Mitteln für Pflanzen verwendet werden, wie in der US-PS 4 007 267 und in der GB-PS 1 507 193 beschrieben.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. In diesen Beispielen bedeuten die Zahlen hinter den Abkürzungen IFO, FERM-P und ATCC die Hinterlegungsnummern beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan, beim Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology, Chiba,

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3Q22123

■I

Japan, bzw. bei der American Type Culture Collection, USA.

Beispiel 1

1) Zu 25 ml eines Nährmediums, das 10% Glucose, 3% Baumwollsaatmehl (Handelsbezeichnung "Proflo", Hersteller Oil Mill Co., USA), 1% Maisquellwasser, 0,5% Natriumchlorid, 0,001% Eisendl)-sulfat und 0,5% CaI-ciumcarbonat enthielt, wurde Cholin in der in Tabelle genannten Konzentration gegeben, worauf eine 20%ige wässrige Natriumhydroxidlösung dem Gemisch zugetropft wurde, um den pH-Wert auf 7,0 einzustellen. Das Nährmedium wurde dann sterilisiert und mit einer Platinschleifenmenge einer Schrägkultur von Streptoverticillium rimofaciens FERM-P 2549 (IFO 13592, ATCC 31120) geimpft, worauf 120 Stunden bei 28°C auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei 200 UpM kultiviert wurde. Die quantitative Bestimmung des Kulturmediums auf Mildiomycin nach der Methode, die in The Journal of Antibiotics, Band 31, Nr.6 (1978) 511-518 und 519-524 beschrieben wird, hatte die nachstehend in Tabelle genannten Ergebnisse.

Tabelle 1

Zugesetzte Cholinmenge, mMol

0.35

1.40

3.5

14,0

70.0

Relativer Titer von Mildiomycin, Gew.-Verhältnis

100 113 133 180

193 200 200

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■/ΙΟ-

2) 1 1 des Kulturmediums, das auf die in Abschnitt (1) beschriebene Weise unter Verwendung eines Nährmediums erhalten wurde, dem Cholin in einer Konzentration von 14 mMol zugesetzt worden war·, wurde entnommen und zentrifugiert, wobei ein Überstand erhalten wurde,der durch eine Säule geleitet wurde, die mit 500 ml eines Ionenaustauscherharzes der Handelsbezeichnung "Amberlite IRC-50" (H⁺-Form) (Rohm & Haas Co., USA) gefüllt war. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen, worauf unter Verwendung von 500 ml 0,5%igem wässrigem Ammoniak eluiert wurde. Die aktiven Fraktionen wurden adsorbiert, indem das Eluat durch eine mit 50 ml Aktivkohle für Chromatographiezwecke (hergestellt von der Anmelderin) gefüllte Säule geleitet wurde. Die mit 250 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Aceton und Wasser (3:7) eluierten aktiven Fraktionen wurden aufgefangen und eingeengt. Dem Konzentrat wurde Aceton zugetropft, wobei rohes Mildiomycin ausgefällt wurde. Das hierbei erhaltene rohe Pulver (1,3 g) wurde in Wasser gelöst. Die Lösung wurde durch eine Säule von 25 ml des Ionenaustauscherharzes der Handelsbezeichnung "Amberlite CG-50" (H⁺-F_Orm) (Rohm & Haas Co., USA) geleitet. Die Säule wurde mit 10 ml Wasser gewaschen, worauf mit 250 ml 0,5%igem wässrigem Ammoniak eluiert wurde. Die aktiven Fraktionen wurden aufgefangen und adsorbiert, indem sie durch eine Säule von 50 ml Aktivkohle geleitet wurden. Die fraktionierte Elution wurde mit 250 ml Aceton-0,1N-Ameisensäure (2:8) durchgeführt. Die aktiven Fraktionen wurden eingeengt. Dem Konzentrat wurde Methanol zugesetzt, um das Mildiomycin auszufällen. Die erhaltene Fällung wurde unter vermindertem Druck getrocknet, wobei 1,1 g Mildiomycinformiat erhalten wurden. Von den physikalischen und chemischen Kennzahlen stimmten der Schmelzpunkt, die optische

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Drehung /a__/ bei c = 1,0 in H₃O und c = 1,0 in 0,1-

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N-HCl und die UV-Extinktionsindices bei 271 nm und 280 nm sehr gut mit den Literaturwerten überein (The Journal of Antibiotics, Band 31, Nr.6 (1978) 523).

Beispiel 2

Ein Mildiomycin bildender Mikroorganismus wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise kultiviert, wobei jedoch die nachstehend in Tabelle 2 genannten verschiedenen N-Methylverbindungen dem Kulturmedium in einer Konzentration von 7 mMol an Stelle von 14 mMol Cholin zugesetzt wurden. Die durch quantitative Bestimmung von Mildiomycin erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 genannt.

Tabelle 2

Zusatzstoff (7 mMol) Relativer Titer von Mildiomycin (Gewichtsverhältnis)

Kein Zusatz 100

Cholin. 187

Betain 186

Lecithin 161

Trimethylamin< 175

Tetramethylammonium 187

Ν,Ν-Methylen.blsacrylamid 170

Beispiel 3

Die Kultivierung wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise durchgeführt, wobei jedoch Betain in den in Tabelle 3 genannten verschiedenen Konzentrationen an Stelle von Cholin dem Nährmedium zugesetzt wurde. Die durch quantitative Bestimmung von Mildiomycin ermittel ten Ergebnisse sind in Tabelle 3 genannt.

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ORIGINAL INSPECTED

Tabelle 3

Zugesetzte Betainmenqe, mMol	Relativer Titer von Mildiomycin (Gew.—Verhältnis)	100
Kein Zusatz		110
0.35		129
I» 40		160
3.5		185
14.0		194
35.0		200
70.0
Beispie.1 4

Die Kultivierung wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise durchgeführt, wobei jedoch Cholin und Tetramethylammoniumhydrochlorid in verschiedenen Kombinationen in den in Tabelle 4 genannten Konzentrationen dem Nährmedium an Stelle von Cholin zugesetzt wurden. Die durch quantitative Bestimmung von Mildiomycin ermittelten Ergebnisse sind in Tabelle 4 genannt.

Tabelle 4
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Zusatz von Cholin, mMol	Zusatz von Tetra- methylairanoniumhydro- chlorid, mMol	Relativer Titer von Mildiomycin (Gew.-Verhältnis)
kein Zusatz	kein Zusatz	100
7	0	187
6	1	187
5	2	185
4	3	186
3	4	188
2	5	187
1	6	188
0	7	187

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Beispiel 5

Die Kultivierung wurde auf die in Beispiel 1 beschrie bene Weise durchgeführt, wobei jedoch 1,1,3,3-Tetramethylharnstoff an Stelle von Cholin dem Nährmedium zugesetzt und der Zeitpunkt der Zugabe in der in Tabelle 5 genannten Weise variiert wurde. Die durch quantitative Bestimmung von Mildiomycin ermittelten Ergebnisse sind in Tabelle 5 genannt.

Tabelle 5

Kultivierungszeit, nach der Relativer Titer von 1,1,3,3-Tetramethylharηstoff Mildiomycin zugesetzt wurde (Stunden): (Gewichtsverhältnis)

O 140

10 140

kein Zusatz 100

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Claims

Patentansprüche

. Verfahren zur Herstellung von Mildiomycin durch Kultivieren eines zur Gattung Streptoverticillium gehörenden, Mildiomycin bildenden Mikroorganismus in einem NMhrmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung in Gegenwart einer N-Methylverbindung in einer Menge von wenigstens 3 mMol durchführt und hierdurch die Bildung und Anhäufung von Mildiomycin im Kulturmedium veranlaßt.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine N-Methylverbindung verwendet, in der wenigstens ein Stickstoffatom mit 1 bis 4 Methylresten im Molekül substituiert ist.

Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine N-Methylverbindung, die ein Molekulargewicht im Bereich von 50 bis 1000 hat und aus N-Methylsäureamiden, N-Methylaminoverbindungen, N-Methylaminen, N-Methylammoniumverbindungen und Verbindungen, die eine Gruppe enthalten, die im Kulturmedium in eine Gruppe der Formel /N-CH- umwandelbar ist, ausgewählt ist, verwendet.

Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine N-Methylverbindung mit einem Molekulargewicht im Bereich von 90 bis 130 verwendet.

Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine N-Methylverbindung verwendet, die ein Molekulargewicht von 50 bis 1000 hat und aus N-Methylaminen, N-Methylammoniumverbindungen und Verbindungen, die eine Gruppe enthalten, die im Kulturmedium in eine Gruppe der Formel /N-CH- umwandelbar ist, ausgewählt ist.

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OWGINAL INSPECTED

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,

daß man als N-Methylverbindung Trimethylamin, Lecithin, Cholin, Betain oder Tetramethylammonium verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als N-Methylverbindung eine N-Methylammoniumverbindung verwendet, die eine Trimethylammoniumgruppe enthält und ein Molekulargewicht im Bereich von 70 bis 200 hat.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als N-Methylammoniumverbindung Cholin verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einer Konzentration der N-Methylverbindung im Kulturmedium von 4 bis 200 mMol arbeitet.

10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einer Konzentration der N-Methylverbindung im Kulturmedium von 7 bis 50 mMol arbeitet.

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