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Verfahren zur Trennung des Antibiotikums Kanamycin
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Trennung des Antibiotikums Kanamycin in zwei Komponenten, nämlich Kanamycin A und Kanamycin B.
Kanamycin wird durch Züchtung eines Stammes von Streptomyces kanamyceticus, eine aus einer in der Nagano-Präfektur, Japan, gesammelten Erdprobe isolierte neue Spezies der Gattung Streptomyces, in einer wässerigen Kohlehydratlösung mit einem Gehalt an einer stickstoffhaltigen Nährsubstanz unter Belüftung hergestellt.
Streptomyces kanamyceticus wurde unter der Laboratoriumsbezeichnung K2-J in der American Type Culture Collection, Washington, D. C., deponiert und deren dauernder Sammlung von Mikroorganismen als A. T. C. C. 12853 einverleibt.
Das Verfahren gemäss der Erfindung zur Trennung des Antibiotikums Kanamycinin die zwei Komponenten KanamycinA undKanamycinB bestehtdarin, dass maneine Kanamycin-enthaltendeKulturflüssigkeitentwe-
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inihrer Gesamtheit oder nach Klärung mit Natriumdodecylbenzolsulfonat unter Bildung einer F ällungfelsäure unter Bildung von KanamycinB-sulfatbehandelt und dasKanamycin A aus der ersten Lösung gewinnt.
Eine Kanamycin enthaltende Fermentationsflüssigkeit wird durch Impfung eines geeigneten Nährmediums mit Sporen oder Mycelen des Kanamycin bildenden Streptomyces kanamyceticus und anschlie- ssender Züchtung unter aeroben Bedingungen gewonnen. Für die Gewinnung von Kanamycin ist die Verwendung fester Nährböden zwar möglich, jedoch ist für die Herstellung grösserer Mengen die Züchtung in flüssigem Medium vorzuziehen. Die Züchiungstemperatur kann in einem weiten Bereich, z. B. zwi- schen 25 und 35 C, variiert werden, doch ist eine Temperatur im Bereich von 27 bis 320C vorzuziehen.
Bei der submersen belüfteten Kultur des Organismus zur Herstellung von Kanamycin enthält das Nährmedium als Kohlenstoff liefernde Substanz handelsübliches Glyceridöl oder Kohlehydrate, wie Stärke,
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mehl, Baumwollsaatmehl, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Hefeextrakt, Getreideweichwasser usw., und, falls erwünscht, anorganische Stickstoffquellen, wie Nitrate und Ammoniumsalze, und Mineralsalze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Magnesiumsulfat, sowie Puffersubstanzen, wie Kalziumcarbonat oder Phosphate, und Spuren von Schwermetallsalzen. Bei der Submerskultur wird ein die Schaumbildung verhinderndes Mittel, wie flüssiges Paraffin, fettes Öl oder ein Silicon angewendet. Im allgemeinen wird die Züchtung so lange fortgesetzt, bis sich eine genügende Menge Kanamycin im Medium gebildet hat.
Bei einer Submerskultur werden dazu im allgemeinen 2 - 7 Tage benötigt. Das Kanamycin findet sich im flüssigen Teil der Fermentationsflüssigkeit.
Die Fermentationsflüssigkeit kann sowohl Kanamycin A als auch Kanamycin B enthalten, da beide Substanzen wasserlöslich und in n-Butanol. Äthylacetat, Butylacetat, Äther, Chloroform und Benzol praktisch unlöslich sind ; beide bilden mit Säuren Salze und zeigen im Bereich zwischen 220 mg und 400 mg keine Absorption im Ultraviolett ; in Pyridin gelöst zeigen sie eine positive Ninhydrin-Reaktion, positive Molisch- und Elson-Morgan-Reaktionen, negative Reaktionen nach Tollens, Sakaguchi, Fehling, Selinwanoff und eine negative Reaktion mit Maltol.
Sie enthalten nur die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff,
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Sauerstoff und Stickstoff, ferner freie primäre Aminogruppen ; sie sind in wässeriger Lösung rechtsdrehend und zeigen im Infrarotbereich als freie Base in Kaliumbromid bei folgenden Wellenlängen charakteristi-
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schmilzt, ergibt bei stark saurer Hydrolyse Desoxystreptamin, ein Produkt mit einem dem Furfurol gleichen UV-Absorptionsspektrum nach 100 Minuten dauernder Behandlung bei 1000C mit 40% luger Schwefelsäure und zeigt bei folgenden Wellenlängen (ausgedrückt in Mikron) zusätzliche charakteristische Ab-
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der Behandlung mit 40%iger Schwefelsäure bei 1000C keine dem Furfurol gleichende UV-Absorption und zeigt zusätzliche charakteristische Absorptionsbanden im Infrarotbereich (freie Base mit Kaliumbromid zu Tabletten verpresst)
bei folgenden Wellenlängen (in Mikron) : 3, 44, 6, 74, 8, 28, 8, 76, 9, 55 und 11, 15.
Kanamycin kann beispielsweise wie folgt hergestellt werden : 200 l Nährmedium werden in einem 400 1-Behälter aus rostfreiem Stahl mit Streptomyces kanamyceticus beimpft und fermentiert. Das Mediumenthält2%Stärke, 1%Glucose,1,2%Sojabohnenmehl,0,3%NaCl,0,05%KCl,0,05%MgSO4.7H2O, 0,1%K2HPO4.0,2% CaCO3 und 0,3% Pepton. Der PH-Wert des Mediums beträgt nach der Sterilisation 7, 0.
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1 % Sojabohnenöl zugesetzt. Nach 65 Stunden Submerskultur enthält diedes Filtrats erhalten werden (210 g/ml).Diese werden durch eine mit Kationenaustauscherharz (6 l IRC-50- Harz in Natriumform) gefüllte Säule geschickt. Die Durchlaufgeschwindigkeit beträgt 30 l/Std. Danach werden 30 1 Wasser mit einer Geschwindigkeit von 30 l/Std. durch die Säule geschickt.
Das vom Harz absorbierte Kanamycin wird dann mit in-cl eluiert. Das erste Eluat (6, 5 l) enthält keine aktive Substanz, das folgende enthält Kanamycin, 90% des adsorbierten Kanamycins ist im Eluat mit einem PH-Wert von
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auf 80 1 verdünnt. Die Ausbeute aus dem Filtrat beträgt jetzt 83%. Die verdünnte Lösung wird wiederum über einen Kationenaustauscher geführt, worauf die Säule mit 20 l Wasser ausgewaschen wird. Dann wird das adsorbierte Kanamycin mit In-HCl eluiert. Wie vorher tritt Kanamycin im Eluat auf, dessen PH-Wert mehr als 2, 0 beträgt. Das aktive Eluat (4, 5 l) wird durch Zufügen von Anionenaustauscherharz (Amberlite IR-43 in der Hydroxylform) auf PH 6, 0 eingestellt und bei etwa 400C im Vakuum auf 500 ml eingeengt.
Die so erhaltene konzentrierte Lösung wird mit etwa 5 l Methanol versetzt und der unlösliche Teil entfernt. Das Filtrat wird im Vakuum bei etwa 400C auf 250 ml eingeengt und der konzentrierten Lösung 2, 51 Aceton zugesetzt. Es werden 65 g Kanamycin als hellbraunes Pulver erhalten. Die Aktivität dieses Pulvers beträgt 350/Jg/mg.
Normalerweise überwiegt Kanamycin A in den Fermentationsflüssigkeiten ; jedoch sind darin auch merkliche Mengen Kanamycin B enthalten. Wesentlich grössere Mengen Kanamycin B wurden erhalten, wenn 360 l Impfflüssigkeit des Streptomyces kanamyceticus in 3600 I eines Mediums, das 4, 5 % Saccha- rose, 2,25% Sojabohnenmehl, 1,7% Pharamedia (Baumwollsamenendospermenmehl), 0,225% ent-
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einer Luftzufuhr von 14001/min enthielt die Flüssigkeit 300 jug Kanamycin/ml (biologischer Test), welches zum überwiegenden Teil aus Kanamycin B bestand.
Isolierung und Reinigung des Kanamycin A : Kanamycin A-Sulfat.
Kanamycin A wird aus Fermentationsflüssigkeiten durch Adsorption an einemKationenaustauscherharz (IRC-50 ; Natriumform) und Elution mit verdünnter Salzsäure isoliert. Das Eluat wird neutralisiert, ver- dünnt, und wieder an einem Kationenaustauscherharz (IRC-50), das mit Ammoniumhydroxyd regeneriert worden war, adsorbiert. Die Austauschersäule wird dann mit 0, 2 n-NH4OH eluiert, das Eluat im Vakuum auf eine Kanamycin-Aktivität von annähernd 50 bis 100 mg/ml eingeengt, mit 0, 8 - 1 Vol. -Teilen
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in kleinen, unregelmässigen, blassgelben, prismatischen Kristallen aus.
Das kristallinische KanamycinA-Sulfat wird durch wiederholte Umkristallisation aus Methanol/Wasser bei pH 7, 8-8, 2 gereinigt und ergibt unregelmässige, prismatische, farblose Kristalle. Mit dieser Darstellung ist eine Feuchtigkeitsaufnahme verbunden, die nur schwierig rückgängig zu machen ist. Proben für
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analytische Bestimmungen wurden bei 1700C im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Analyse : C18H36N4O11.H2SO4.
Berechnet : C=37,13%
H = 6, 58 %
N = 9, 62%
S= 5, 50% SO4= 16,6 % Neutralisationszahl : 145, 6.
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<tb> Gefunden <SEP> : <SEP> C=37,3, <SEP> 37,4 <SEP> 37,3%
<tb> H <SEP> = <SEP> 6, <SEP> 8, <SEP> 6, <SEP> 6, <SEP> 6, <SEP> 3% <SEP>
<tb> N= <SEP> 9, <SEP> 3, <SEP> 9, <SEP> 6, <SEP> 5, <SEP> 50/0 <SEP>
<tb> SO <SEP> = <SEP> 16, <SEP> 8%
<tb>
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Es wird eine Kanamycinlösung (1500., cm5 vom PH 6 verwendet, die durch Eluieren eines Kanamycin enthaltenden Kationenaustauscherharzes mit Schwefelsäure erhalten worden ist. Der so erhaltenen Lösung werden zwecks Fällung von Kanamycin B-dodecylbenzolsufonat 45g Natriumdodecylbenzolsufonat(Ultrawet K) zugesetzt. Die Fällung wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und in Methanol aufgelöst.
Die methanolische Lösung wird dann mit Schwefelsäure angesäuert, wobei Dodecylbenzolsulfonsäure in Lösung bleibt, während mehr als 8, 5 g Kanamycin B-Sulfat ausfallen, welches, wie durch biologischen Test (732 Einheiten/mg) und Ultraviolett-(Furfurol-)-Probe (45 Einheiten/mg) ermittelt wurde, frei von Kanamycin A ist.
Bei einem andern Versuch werden 50 g festes Kanamycin [456 Einheiten/mg (biologischer Test) ; 131 Einheiten/mg (Ultraviolett-Furfurol-Probe), Verhältnis : 0, 287] bei PH 6 in 21 Wasser aufgelöst, worauf 60 g Natriumdodecylbenzolsulfonat zugefügt werden. Der Niederschlag wird abgetrennt, mit Wasser gewaschen und in Methanol aufgelöst ; die methanolische Lösung wird mit Schwefelsäure angesäuert, wobei gereinigtes KanamycinB-Sulfat ausfält.Nach Wiederholung der Fällung werden 9, 5 g festes Kanamycin B-Sulfat [630 Einheiten/mg (biologischer Test); 51 Einheiten/mg (Furfurol-Ultra violett-Probe), Verhältnis : 0, 081] erhalten.
Die Kanamycin B-Base zerfällt bereits bei einer beträchtlich niedrigeren Temperatur als die Kanamycin A-Base. So färbt sich die Kanamycin B-Base bei 1700C dunkel und bildet beim Trocknen im Vakuum beim Siedepunkt des Cymols (1760C) eine dunkle, gummiartige Substanz. Die Kanamycin B-Base zeigt ein [a]D= + 1350 (c= 0, 63, in Wasser) und ergibt bei der Analyse 44, 69% C, 7, 48'% H und 12, 65 bzw. 13, 62% N nach der Korrektur für die 10, 3% Gewichtsverlust beim Trocknen einer Probe bei 100 C.
Die nachstehenden charakteristischenInfrarot-Absorptionsmaxima derKanamycinB-Base (in Mikron), die auch der Zeichnung zu entnehmen sind, wurden ermittelt, nachdem die Substanz mit Kaliumbromid tablettiert sowie 15 Stunden unter Vakuum bei 1370C getrocknet wurde : 2, 96, 3, 44, 6, 35, 6, 48 (breite Bande) 6, 74, 6, 85 (breite Bande) 7, 25, 7, 45, 7, 86, 8, 08, 8, 28, 8, 76, 9, 55, 9, 65, 10, 4 und 11, 15.
Etwa 2 g Kanamycin B-Base wurden mit 4 ml Essigsäureanhydrid in 20 ml Methanol behandelt. Nach Stehenlassen über Nacht bildeten sich Kristalle. Die Abscheidung wurde durch Zugabe von Äther vervollständigt und das gebildete Tetra-N-acetyl-Kanamycin B wurde mit Äther gewaschen und aus wässerigem Äthanol umkristallisiert. Es wurde festgestellt, dass sich diese Verbindung bei 1800C dunkel färbt, dass sie iedoch nicht unter 280 C schmilzt.
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Analyse <SEP> : <SEP> Gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> = <SEP> 48, <SEP> 64, <SEP> 48, <SEP> 66 <SEP> % <SEP>
<tb> H= <SEP> 6, <SEP> 64, <SEP> 6, <SEP> 73% <SEP>
<tb> N= <SEP> 9, <SEP> 82, <SEP> 9, <SEP> 79%. <SEP>
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Die beidenKomponenten desKanamycins reagieren in den angegebenen qualitativen Tests wie folgt :
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<tb>
<tb> Reaktion <SEP> : <SEP> A <SEP> : <SEP> B <SEP> :
<SEP>
<tb> Konzentrierte <SEP> Schwefelsäure <SEP> farblos <SEP> farblos
<tb> Molisch <SEP> langsame <SEP> Farbbildung <SEP> schnelle <SEP> Farbbildung
<tb> Elson-Morgan <SEP> schwach <SEP> schwach
<tb> positiv <SEP> positiv
<tb> Seliwanoff <SEP> negativ
<tb> Folin <SEP> und <SEP> Ciocalteav <SEP> schwach <SEP> schwach
<tb> positiv <SEP> positiv
<tb> Fishbach <SEP> und <SEP> Levin <SEP> negativ
<tb> (HCl, <SEP> MeCO)
<tb> Ninhydrin <SEP> positiv
<tb> Reduzierender <SEP> Zucker <SEP> (ammoniakalisches <SEP> Silbernitrat) <SEP> negativ
<tb> Sakaguchi <SEP> negativ
<tb> Maltol <SEP> negativ
<tb> saure <SEP> Hydrolyse <SEP> zu <SEP> "Furfurol" <SEP> positiv <SEP> negativ.
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Die nach dem Verfahren gemäss der Erfindung hergestellten Komponenten des Kanamycins können auch in Form ihrer sauren Additionssalze mit organischen und anorganischen Säuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Bromwasserstoffsäure, Jodwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Citronensäure, Malonsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Ascorbinsäure, Essigsäure, Pantothensäure, Pikrinsäure, Phytinsäure, Laevopimarsäure, 6, 8-ct-cis-endobernsteinsäure, Sulfaminsäure, Glykolsäure und Mandelsäure, gewonnen werden.
Für therapeutische Zwecke werden Salze ungiftiger Säuren verwendet ; die Salze giftiger Säuren, wie beispielsweise jene der Pikrinsäure, können bei der Isolierung von Nutzen sein, z. B. als Fällungsmittel aus wässeriger Lösung oder für Desinfektionszwecke, wo die Giftigkeit ohne Bedeutung ist.
Ist es für besondere Zwecke erwünscht und pharmazeutisch vertretbar, so können die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltenen Verbindungen mit andern Heilmitteln, wie beispielsweise Antihistamine, Sulfonamiden, lipotropen Mitteln, Stimulantien, Lokalanästhetika ; Analgetika, Sedativa, Antibiotika, Vitaminen, Hormonen, anabolischen und fungiciden Mitteln, vermischt werden.