DE2621615C3

DE2621615C3 - Dihydromocimycin, seine Salze, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung als Futtermittelzusatz

Info

Publication number: DE2621615C3
Application number: DE19762621615
Authority: DE
Inventors: Hendrik Marten Delft; Kooreman Hermanus Jacobus Maassluis; Os Jan Lambert van Voorburg; Vos Cornells Pijnacker; Jongsma (Niederlande)
Original assignee: Gist Brocades NV
Current assignee: Gist Brocades NV
Priority date: 1975-05-16
Filing date: 1976-05-14
Publication date: 1978-02-16

Description

Die Erfindung betrifft den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand

Aus der DE-OS 2140 674 ist ein Verfahren zur Herstellung von Mocimycin bekannt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Mikroorganismen des Stammes Streptomyces ramocissimus (CBS 190 69) oder nach üblichen Methoden daraus erhaltene, das Antibiotikum bildende Mutanten oder Varianten in einem wäßrigen, verwertbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium züchtet und das entstandene Antibiotikum aus der Gärmaische durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln bei pH-Werten von etwa 5 bis 8 isoliert und gewünschtenfalls weiter reinigt Die Struktur von Mocimycin wurde von V ο s und V e r w i e 1, Tetrahedron Letters, Bd. 52 (1973), S. 5173 bis 5176, angegeben.

Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß Mikroorganismen des Stammes Streptomyces nmocissimus (CBS 190 69) oder nach üblichen Methoden daraus erhaltene, das Antibiotikum bildende Mutanten oder Varianten bei der Züchtung in einem wäßrigen, verwertbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium außer zur Bildung von Mocimycin auch zur Bildung von Dihydromocimycin imstande sind.

Dihydromocimycin ist eine schwache Säure und bildet Salze, z. B. Alkalimetall-, Ammonium- und Aminsalze. Es hat folgende physikalische und chemische Eigenschaften:

Löslichkeit:

Die Verbindung ist gut löslich in Chloroform, Methylisobutylketon, Essigsäureäthylester, Essigsäurebutylester. Aceton, Dioxan, Methanol, Äthanol, Tetrahydrofuran und schwach alkalischen, wäßrigen Lösungen. Sie ist mäßig löslich in Tetrachlorkohlenstoff und Benzol und unlöslich in Diäthyläther, Wasser, schwach sauren wäßrigen Lösungen, Cyclohexan und Petroläther.

.to Optische Drehung:

[«]' = —85° (Iprozentige Lösung in Methanol).
Schmelzpunkt:

Die Verbindung schmilzt nicht. Ab 123°C tritt -¹⁵ Zersetzung ein.

Elementaranalyse:

C₄₃H₆₂N₂O₁, ■ 2 H₂O
Ber.:

C 61,8, H 8,0, N 3,3, O (Differenz) 26,8;
gef.:
C 61,8, H 7,5, N 3,4, O (Differenz) 27,2.

45

60

('S UV-Spektrum:

Das UV-Spektrum von Dihydromocimycin in einem 1 : 1-Gemisch aus Wasser und Methanol bei verschiedenen pH-Werten ist in Fig. 1 wiedergegeben. Die Konzentration der Lösungen beträgt 18,3μg/ml. Das UV-Spektrum ist vom pH-Wert abhängig. Es lassen sich folgende Maxima feststellen (der molare Extinktionskoeffizient ist jeweils in runden Klammern angegeben):
Methanol — Wasser:

233,5 nm (ε = 63 000); 267 nm (p = 23 000);

291 nm (ε = 19 000) und 333 nm (ε =18 000);

Kurve 1;
Methanol -0,5 n-NaOH:

235 nm (ε=62 000); 277 nm (ε = 25 000) und

308 nm(8 = 29 000); Kurve 2;
Methanol-0,5 n-HCl:

233,5 nm (ε = 65 000); 268 nm (ε = 25 000) und

338 nm (ε = 14 000); Kurve 3.

IR-Spektrum:

Das IR-Spektrum von Dihydromocimycin in Chloroform und als Kaliumbromid-Preßling ist in F i g. 2 bzw. 3 wiedergegeben. Die wichtigsten Absorptionsmaxima in Chloroform liegen bei ±3445 (sh), 3430, 2979, 2941,

Testkeim

2886, 1662-1653, 1458, 1100, 1080, 1040, 998, 944, 893, 870 und 840 cm -'. Im Kaliumbromid-Preßling liegen die Absorptionsmaxima bei ±3400-3320,2972,2935,2880, 1650, 1535, 1455, 1099, 1040, 990, 943, 860, 840 und 790 cm-'.

PMR-Spektrum:

Das PMR-Spektrum von Dihydromocimycin in Deuterochloroform unter Verwendung von Tetramethylsilan als internem Standard ist in Fig.4 (60 iviHz) wiedergegeben.

Dünnschichtchromatographie:

Das Dünnschichtchromatogramm von Dihydromocimycin wird an K ieselgel-F 254-Platten aufgenommen. Nach dem Trocknen werden die Flecken durch Fluoreszenz, Extinktionsmessung oder Verkohlung nach Besprühen mit einem Gemisch aus Diäthyläther und Schwefelsäure nachgewiesen. Auch hochgereinigte Präparate von Dihydromocimycin ergeben neben einem Hauptflecken einen kleinen zusätzlichen Flecken. Dies ist auf ein Tautomerie-Gleichgewicht zurückzuführen, wie durch ein zweidimensionales Chromatogramm gezeigt werden kann.

Es ergeben sich folgende Ri-Werte für Dihydromocimycin in verschiedenen Laufmitteln (in runden Klammern ist der R,-Wert für den zusätzlichen Flecken angegeben):

50 :45 :5-Gemisch aus Methylisobutylketon, Aceton und Wasser: 0,44 (etwa 0,44);
70 :20:10 :0,5-Gemisch aus Essigsäureäthylester, Methanol, Wasser und 25prozentiger Ammoniaklösung: 0,29 (0,36);

65 :40 :9-Gemisch aus Benzol, lOOprozentigem Äthanol und 33prozentiger Ammoniaklösung: 0,16 (0,22);

60 :42 :10-Gemisch aus Chloroform, 96prozentigem Äthanol und ?5prozentiger Ammoniaklösung: 0,4.

Aufgrund folgender Tatsachen ergibt sich für

Dihydromocimycin die eingangs angegebene Struktur-

formel: Die PMR-Spektren (220 MHz) von Mocimycin Testkeim (vgl. Tetrahedron Letters, Bd. 52 [1973], S. 5173-5176, wo die Strukturformel von Mocimycin angegeben ist) und Dihydromocimycin zeigen, daß beide Verbindungen

sehr ähnlich sinU, wobei zwei Dubletts bei 0 = 5,9 und

7,3 ppm (Tetramethylsilan wird als Standard verwendet) im Spektrum von Mocimycin auftreten und im Spektrum von Dihydromocimycin nicht vorhanden sind. Diese Signale werden durch die Protonen des fünften und sechsten Kohlenstoffatoms im Pyridonkern hervorgerufen. Im Spektrum von Dihydromocimycin treten dagegen zwei Tripletts bei ö = 2,5 und 3,4 ppm auf. Dies ist ein Anzeichen dafür, daß die Bindung zwischen dem fünften und sechsten Kohlenstoffatom im Pyridonkern von Dihydromocimycin gesättigt ist. Diese Interpretation läßt sich durch 5minütige Ozonisierung einer wäßrigen Lösung von Dihydromocimycin bei 0°C und einem pH-Wert von 12 bestätigen. Nach Reduktion des erhaltenen Reaktionsgemisches mit Wasserstoff unter Verwendung von PtO2 ais Katalysator und nach Hydrolyse mit konzentrierter Salzsäure läßt sich jS-Alanin nachweisen, was darauf schließen läßt, daß die Bindung zwischen dem fünften und sechsten Kohlenstoffatom des Pyridonkern: von Dihydromocimycin gesättigt ist.

Dihydromocimycin ist in vielen Eigenschaften Mocimycin ähnlich. Ein wichtiger Unterschied zwischen diesen beiden Verbindungen besteht jedoch darin, daß Mocimycin als Futterzusatz in geringen Mengen bei Tieren, wie Hühnern und Schweinen eine Gewichtszunahme und eine Steigerung im Größenwachstum und in der Futterverwertung bewirkt Demgegenüber bewirkt Dihydromocimycin bei diesen Tieren kein gesteigertes Wachstum oder eine verbesserte Futterverwertung. Dies ist überraschend, da beide Verbindungen in vitro gegen die gleichen Mikroorganismen wirksam sind. Dihydromocimycin ist in zahlreichen Fällen noch wirksamer als Mocimycin. Die MHK-Werte der beiden Antibiotika gegenüber verschiedenen Keimen sind in Tabelle I (Agar-Verdünnungstest) und Tabelle Il (Röhrchenverdünnu ngstest) zusammengefaßt

Tabelle I

MHK,

Mocimycin Dihydromocimy cin

Staphylococcus aureus A 2000 > 100 > 100

Staphylococcus aureus A 2001 > 100 >100

Diplococcus pneumoniae L 54 1,5 < 0,75

Salmonella typhiniurium Rl 72 > 100 > 100

Escherichia coli U 20 > 100 100

Listeria monocytogenes A 2130 6 1,5

Listeria monocytogenes A 2131 6 6

Listeria mcnocytogenes A 2132 6 6

Clostridium perfringens A 738 >100 > 100

Clostridium septicum A 2152 10 10

-¹⁵ Streptococcus zooepidemicus 6 6 A 2144

R-Streptococcen A 2148 6 3

Brucella suis (smooth) A 2126 0,75 0,4

Pasteureüa haemolytica A 2136 3 1,5

Treponema spec. A 2275 30 10

Tabelle II

MHK, <x&/m\

Mocimycin Dihydromocimy-

Bacillus subtilis ATCC 6633 100 50.

Bacillus subtilis ATCC 6051 100 50

Bacillus subtilis 6346 Dl 67 1,2 0,9

Bacillus subtilis 220 Dl 78 75 75

Bacillus subtilis TH 10 100 50

Bacillus ceraus Dl 66 0,6 0,6

Bacillus cereus D 261 0,9 0,6

Bacillus cereus D 220 1,2 0,9

Bacillus cereus B 569 2,5 1,2

Bacillus cereus TH 1 1,8 1,2

Bacillus thuringiensis W 11 1,2 0,9

Bacillus mesenterium D 169 100 50

Bacillus cereus var. mycoides 1,2 0,45

Streptococcus haemolyticus 0.45 0,45 A 266

Streptococcus haemolyticus 0,25 0,12 A 2182

Mycoplasma hyorhinus A 2230 1 0,3

Streptomyces viridochromogenes 2,5 0,9

Die Züchtung der Mikroorganismen kann in flüssigen Nährmedien, die übliche Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphor, Calcium, Eisen, Schwefel, Magnesium, Kalium, Vitamine und Spurenelemente enthalten, erfolgen. Beispielsweise können Medien verwendet werden, die Rübenmelasse, Malzpaste, Erdnußmehl, Lactose, Kartoffelstärke, Maisquellwasserfeststoffe und Hefeextrakt enthalten. Die Züchtungstemperatur beträgt 20 bis 40⁰C, vorzugsweise 26 bis 34°C, und der pH-Wert 5 bis 9, vorzugsweise 6,5 bis 8. ι ο

Überraschenderweise läßt sich die Ausbeute an Dihydromocimycin im Vergleich zur Ausbeute an Mocimycin durch Erhöhung des Sauerstoffpartialdrucks im Nährmedium steigern, aus der Struktur von Dihydromocimycin ist an sich anzunehmen, daß durch einen höheren Sauerstoffpartialdruck im Nährmedium die Ausbeute an Dihydromocimycin im Vergleich zu Mocimycin abnimmt. Es tritt jedoch der vorerwähnte Effekt auf, daß Dihydromocimycin im Vergleich zu Mocimycin durch eine bessere Belüftung des Nährmediums in größeren Mengen gebildet wird. Die Belüftung kann in an sich bekannter Weise vorgenommen werden. Beispielsweise wird die Belüftungsgeschwindigkeit (Volumteil Luft pro Volumteil Nährmedium pro Zeiteinheit) oder die Rührgeschwindigkeit des Nährmediums im Fermenter erhöht. Geeignete Belüftungsgeschwindigkeiten des Nährmediums, dessen Volumen beispielsweise 2 Liter beträgt, liegen bei 1 bis 3 Liter Luft, vorzugsweise 1,5 bis 2,5 Liter Luft, pro Minute. Eine weitere Verbesserung der Ausbeute an Dihydromocimycin läßt sich durch Zusatz von bestimmten Metallsalzen in niedrigen Konzentrationen, beispielsweise durch Zusatz von Eisen-, Kobalt- oder Nickelsalzen, zum Nährmedium erzielen.

Zur Trennung von Dihydromocimycin von Mocimyein benützt man die Löslichkeitsunterschiede dieser Verbindungen in alkalischem Medium. Beim Einleiten von gasförmigem Ammoniak in eine Lösung, die durch Extraktion einer auf einen pH-Wert von 5 bis 6 angesäuerten Kulturflüssigkeit mit Methylisobutylketon erhalten worden ist, fällt zunächst das Mocimycin praktisch vollständig aus. Das Dihydromocymycin bleibt dabei praktisch vollständig in Lösung. Nach dem Abtrennen, beispielsweise durch Abfiltrieren, des Mocimycinniederschlags aus der Lösung wird weiter Ammoniak eingeleitet, bis das Dihydromocimycin praktisch vollständig ausgefällt ist. Das Dihydromocimycin kann anschließend ebenfalls abgetrennt werden, beispielsweise durch Filtrieren. Ammoniak wird dabei beispielsweise etwa 1 bis 4 Minuten mit einer Geschwindigkeit von 150 Liter pro Liter Lösung pro Stunde (d.h. etwa 2,5 bis etwa 10 Liter gasförmiges Ammoniak pro Liter Lösung) bei einer Temperatur von etwa —12 bis etwa +15° C, vorzugsweise -5 bis +8⁰C, eingeleitet Durch weiteres Einleiten von gasförmigem Ammoniak nimmt die Wasserstoffionenkonzentration so weit ab, daß Dihydromocimycin unlöslich wird. Beispielsweise leitet man unter den vorgenannten Bedingungen 10 bis 15 Minuten lang ein (entsprechend etwa 25 bis etwa 40 Liter gasförmiges Ammoniak). Neben Ammoniak können allgemein alle alkalisch reagierenden Verbindungen zur Abtrennung von Mocimycin und Dihydromocimycin verwendet werden. Als Beispiele seien Natriummethylat und Triäthylamin genannt

Das auf diese Weise abgetrennte Dihydromocimycin kann von Verunreinigungen an Mocimycin weiter gereinigt werden, indem man den Niederschlag in einer stark verdünnten ammoniakalischen Lösung vom pH-Wert 9 löst und diese Lösung mit einem Lösungsmittel, wie Chloroform oder Methylenchlorid, extrahiert. In derartigen Lösungsmitteln ist Mocimycin nur wenig löslich. Gießt man den dabei erhaltenen Extrakt in ein im Überschuß vorhandenes unpolares Lösungsmittel, wie Petroläther, Cyclohexan oder Pentan, so bildet sich ein Dihydromocimycinniederschlag, der weniger als 5% Mocimycin enthält.

Hochgereinigtes Dihydromocimycin erhält man durch Chromatographie an dreidimensional vernetztem Dextran, wobei man sich der Adsorptionsunterschiede von Mocimycin und Dihydromocimycin bedient. Dabei wird das Dextran in lOOprozentigem Methanol suspendiert und vorsichtig in die Säule geschüttet. Nach Verdrängung des Methanols durch Chloroform wird der Dihydromocimycinniederschlag auf die Säule aufgebracht. Als Elutionsmittel wird Chloroform verwendet. Dabei erhält man zunächst Dihydromocimycin und anschließend Mocimycin. Beide Verbindungen können im Eluat nachgewiesen werden, da sie im UV-Bereich bei 350 nm absorbieren. Die reinen Verbindungen können aus der Chloroformlösung durch Fällung mit einem unpolaren Lösungsmittel, wie Cyclohexan oder Pentan, gewonnen werden.

Die Identität der Verbindungen läßt sich dünnschichtchromatographisch bestätigen. Dazu werden Kieselgel-F 254-Platten der Abmessungen 20 χ 5 cm verwendet. Als Laufmittel dient ein 60 :42 :10-Gemisch aus Chloroform, Äthanol und 25prozentigem Ammoniak. Die Laufzeit beträgt 2 Stunden. Mocimycin zeigt einen RrWert von 0,3 (Haupttautomeres) und Dihydromocimycin von 0,4 (Haupitautomeres).

Aufgrund frührer Untersuchungen wurde angenommen, daß Mocimycin, das ein ähnliches antimikrobielles Wirkungsspektrum wie Tylosin (vgl. Merck Index, 8. Aufl., S. 1089) aufweist, gegen Treponema hyodysenteriae, den Erreger von Treponema-Dysentrie oder Vibrio Doyle, eine der häufigsten Krankheiten bei Schweinen, wirksam ist. Untersuchungen haben jedoch ergeben, daß die Wirkung von Mocimycin nicht größer ist als die von Tylosin.

Aus den Tabellen I und II ergibt sich, daß Dihydromocimycin gegenüber einer Reihe von Problemkeimen wirksamer ist als Mocimycin. Bei Untersuchungen über die Wirksamkeit gegenüber dem Erreger von Treponema-Dysenterie wurde festgestellt, daß Dihydromocimycin gegenüber diesem Mikroorganismus wesentlich wirksamer als Tylosin ist und außerdem auch gegen Tylosin-resistente Stämme wirksam ist. Somit ist Dihydromocimycin für die Behandlung von Treponema-Dysenterie Tylosin und somit auch Mocimycin überlegen.

Die Erfindung betrifft somit auch die Verwendung von Dihydromocimycin oder dessen Salzen, beispielsweise das Natriumsalz, als Futtermittelzusatz für Schweine. Das Antibiotikum oder dessen Alkalimetall-, Ammonium- oder Aminsalz kann auch in einem entsprechenden inerten, physiologisch unbedenklichen Träger oder Verdünnungsmittel, die an Schweine oral verabfolgt werden können, mit dem Antibiotikum nicht reagieren und für Schweine bei oraler Verabfolgung unbedenklich sind, dispergiert oder vermischt werden. Wirksame Mengen an Dihydromocimycin, die zur Prophylaxe oder Therapie von Treponema-Dysentrie dem Futter beigemengt werden, liegen bei etwa 10 bis etwa 200 T.p.M, vorzugsweise 20 bis 40 TIpAl, bezogen auf das Futtergewicht

Das erfindungsgemäß erhaltene Dihydromocimycin ist ein feines, leicht stäubendes Pulver. Da dies unter Umständen zu Schwierigkeiten beim Vermischen mit dem Futter führen kann, wird vorzugsweise ein Vorgemisch mit einem oder mehreren Bestandteilen des Schweinefutters hergestellt. Dieses Vorgemisch enthält beispielsweise das 9- bis 99fache der gewünschten Menge an Dihydromocimycin. Vorgemische können beispielsweise mit Maismehl, Kartoffelmehl oder Sojamehl hergestellt werden. Untersuchungen haben ergeben, daß Dihydromocimycin sich auch beim Pelletisieren, d. h. Granulieren unter hohem Druck und hohen Temperaturen unter Verwendung von Wasserdampf, als stabil erweist.

Wenn Schweine so stark von Treponema- Dysenterie befallen sind, daß sie ihren Appetit verloren iiaben oder von gesunden Tieren von der Futterstelle weggestoßen werden, wird Dihydromocimycin vorzugsweise mit dem Trinkwasser verabfolgt, vorzugsweise zusammen mit einem geschmacksverbessernden Mittel. Dazu wird Dihydromocimycin in wasserlöslicher Form, beispielsweise als Kalium-, Natrium- oder Aminsalz verwendet.

Sehr stark von Dysentrie befallene Schweine können mit Injektionen von Dihydromocimycin oder einem entsprechenden wasserlöslichen Salz behandelt werden. Der Wirkstoff wird dabei in einer üblichen Injekiionsflüssigkeit, beispielsweise einer Kochsalzlösung, Propylenglykol oder Gemischen aus Glycerin und Wasser, suspendiert oder gelöst.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Mikroorganismen des Stammes Streptomyces ramocissimus (CBS 190 69) werden in 2000 Liter eines Nährmediums, das pro Liter 20 g Gerstenmalzpaste, 10 g Hefeextrakt und 5 g Maisquellwasserstoffe enthält, bei einem pH-Wert von etwa 7 unter Rühren und Belüftung gezüchtet. Nach der Züchtung wird die Kulturflüssigkeit mit etwa 2% expandiertem Perlite als Filtrierhilfe versetzt und filtriert. Das Filtrat wird mit 8 η-Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 6,0 angesäuert und zweimal mit einem Fünftel seines Volumens an Methylisobutylketon (MIBK) extrahiert. Die entstandenen Emulsionen werden mit Diatomeenerde als Filtrierhilfe gebrochen. Die organischen Phasen werden vereinigt und unter vermindertem Druck in einem Rotationsverdampfer auf ein Volumen von etwa 1 Liter eingeengt. Das Konzentrat wird langsam zu 5 Liter Petroläther (Siedebereich 40 bis 60⁰C) gegeben. Der dabei entstandene Niederschlag wird mit einer Glasfilterfritte (G 3) abfiltriert. Der Filterrückstand wird mit frischem Petroläther gewaschen und getrocknet. Man erhält ein gelbgefärbtes Pulver, das Mocimycin und Dihydromocimycin enthält

Gereinigtes Dihydromocimycin mit einem Mocimycingehalt von höchstens 5 Prozent wird auf folgende Weise erhalten: In das Konzentrat wird 1 Minute lang bei einer Temperatur von 2° C gasförmiges Ammoniak mit einer Geschwindigkeit von 150 Liter/Liter Konzentrat/Stunde eingeleitet. Dabei entsteht ein Niederschlag, der Mocimycin enthält Das nach dem Abfiltrieren des Niederschlags erhaltene Filtrat wird weitere 10 bis 15 Minuten mit gasförmigem Ammoniak behandelt Der nunmehr gebildete Niederschlag wird abfiltriert und in verdünnter Ammoniaklösung vom pH-Wert 9,0 gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit dem gleichen Volumen Methylenchlorid extrahiert Der Extrakt wird in die 3-bis 5fäehe Volumenmenge Cyclohexan gegossen. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert, getrocknet und pulverisiert.

Zur Herstellung des Natriumsalzes von Dihydromocimycin löst man Dihydromocimycin in Wasser und s versetzt mit 0,1 η-Natronlauge auf den pH-Wert 9, wobei eine gesättigte Lösung entsteht. Die Lösung wird abfiltriert und unter Zusatz von Butanol unter vermindertem Druck bei etwa 45°C unter azeotropen Bedingungen eingedampft. Der Butanolrückstand wird

ίο in einer kleinen Menge wasserfreiem Butanol aufgenommen. Sodann wird die Lösung unter Rühren tropfenweise mit Petroläther versetzt, bis das Salz vollständig ausgefällt ist. Der Niederschlag wird abfiltriert, gewaschen und getrocknet. Man erhält das Natriumsalz von Dihydromocimycin. Auf analoge Weise können auch das Ämmoniumsaiz und Aminsalze von Dihydromocimycin hergestellt werden.

Beispiel 2

Eine lyophilisierte Kultur von Mikroorganismen des Stammes Streptomyces ramocissimus (CBS 190 69) oder eine gut sporulierende Agar-Kultur dieser Mikroorganismen wird in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben überimpft, der 100 ml eines sterilisierten Nährmediums folgender Zusammensetzung enthält: 20 g Gerstenmalzpaste, 10 g Hefeextrakt und 5 g Maisquellwasser-Feststoffe pro Liter Leitungswasser (pH-Wert 7,0).
Nach 3tägiger Inkubation bei 30⁰C auf einer Drehschüttelmaschine (300 U/min, Hub 2,5 cm) wird die erhaltene Kultur in kleine Fermenter überimpft, die 2000 ml des Nährmediums und zusätzlich 20 mg C0CI2 · 6 H2O pro Liter enthalten. Zur Verbesserung der Bildung von Dihydromocimycin wird diese Wachstumsphase bei 30⁰C unter sehr guter Belüftung durchgeführt. Dazu werden mindestens 2 Liter sterilisierte Luft pro Minute bei einer Rührgeschwindigkeit von 1000 U/min eingeleitet. Die Bildung von Dihydromocimycin setzt etwa 12 Stunden nach Züchtigungsbeginn ein und erreicht nach etwa 120 Stunden das Maximum, Eine Züchtung in größerem Maßstab ist möglich, indem man eine 48 Stunden lang in den kleinen Fermentern gezüchtete Kultur als Inokulum für große Fermenter verwendet.

Aus der Kulturflüssigkeit wird Dihydromocimycin auf folgende Weise gewonnen: Nach Zusatz von 2% Diatomeenerde als Filtrierhilfe wird die Kulturflüssigkeit abfiltriert Das Filtrat wird mit 8 n-Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 5 bis 6 angesäuert und zweimal mit einem Fünftel seines Volumens an MIBK extrahiert. Eine gegebenenfalls entstandene Emulsion wird mit Diatomeenerde als Filtrierhilfe gebrochen. Die organischen Phasen werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf etwa ein Zehnte! des ursprünglichen Volumens eingeengt Sodann wird in das Filtrat 1 Minute lang gasförmiges Ammoniak mit einer Geschwindigkeit von 150 Liter/Liter Konzentrat/Stunde eingeleitet Der dabei entstandene Niederschlag wird abfiltriert Das Filtrat wird weitere 10 bis 15 Minuten mit gasförmigem Ammoniak behandelt Die dabei erhaltene Niederschlag wird in verdünnter Ammoniaklösung vom pH-Wert 9,0 gelöst Durch Extraktion der Ammoniaklösung mit einem gleichen Volumen Methylenchlorid wird gereinigtes Dihydromocimycin (mit einem Gehalt an Mocimycin von höchstens 5%) erhalten. Der Extrakt wird in das 3- bis 5fache Volumen Cyclohexan gegossen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert, getrocknet und pulverisiert

Beispiel 3 Wirkung von Dihydromocimycin gegen Treponema-Dysentrie

20 Schweine im Alter von 3 Monaten werden mit dem Erreger der Treponema-Dysentrie infiziert, indem man ihnen ein Futter gibt, dem ein homogenes Gemisch aus Darminhalt und Darmschleimhaut von 2 an dieser Krankheit leidenden Tieren beigemischt ist. Die infizierten Schweine werden in 4 Gruppen von jeweils 5 Tieren eingeteilt. Die Tiere erhalten 1 Woche ein mit Wasser im Verhältnis 1 :1 verdünntes breiartiges Futter. Die gesamte Futtermenge pro Tier und Tag beträgt 1,2 kg und wird in 2 Portionen gegeben.

Nach 5 Tagen treten die ersten Krankheitssymptome in Form von dünnem Kot auf. Die Krankheit läßt sich durch eine mikrobiologische Untersuchung der Faeces bestätigen. Nach 1 Woche werden die Tiere folgendermaßen behandelt:
Gruppe 1:

Kein Zusatz von Antibiotikum zum Futter; Gruppe 2:

Zusatz von 100 ppm Tylosin zum Futter; Gruppe 3:

Zusatz von 25 ppm Dihydromocimycin zum Futter; Gruppe 4:

Zusatz von 50 ppm Dihydromocimycin zum Futter. Das gegebenenfalls mit Antibiotikum angereicherte Futter wird I Woche verfüttert. Anschließend wird wieder normales Futter ohne Zusatz von Antibiotikum gegeben. Um festzustellen, ob sich die Tiere von der Infektion erholt haben, wird das Körpergewicht festgestellt und der Kot makroskopisch auf seine

ίο Beschaffenheit und mikroskopisch nach einem speziellen Immunofluoreszenzverfahren untersucht.

Während der Untersuchung stirbt jeweils 1 Tier der Gruppen 1, 3 und 4. Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt. Die Gewichtsangaben sind

i_s Durchschnittsgewichte der zum jeweiligen Zeitpunkt lebenden Tiere. Die Beschaffenheit des Kots wird folgendermaßen bewertet:
+ Dünnflüssig; ± dickflüssig; - normal.
Bei der Immunofluoreszenzuntersuchung wird die Treponema-Anzahl im Gesichtsfeld folgendermaßen angegeben:
5: sehr dicht,
4: zahlreich,
3: etwa lOTreponemen,

2.S 2: 1 oder2Treponemen,

1: mehrere Gesichtsfelder sind notwendig, um 1

Treponema zu finden,
—: negativ.

Tabelle III

Unmittelbar vor
der Infektion

Nach 1 Woche¹)
Nach 2 Wochen
Nach 3 Wochen

Nach 1 Woche
Nach 2 Wochen
Nach 3 Wochen

Gruppe 1 Gewicht in kg

Gruppe 2

Gruppe 3

Gruppe 4

24,6

23,7
20,9
19,8

Kotbeschaffenheit

24,4 24,2 23,4

22,2 21,3 21,6

21,4 20,2 21,2

23,2 24,0 23,0

Nach 1 Woche
Nach 2 Wochen
Nach 3 Wochen

Immunofluoreszenz	4	4	4	5	4	4	3	4	- 5	4	5	5	X 5	- 5	3	3
4	4	4	-	4	4	4	2	2	- 4	4	3	1	2	- X	4	1
4	2	2	2	X	3	_	_	2	_ _	_	_	1	_	—	_
2

'): Beginn der Behandlung mit den Antibiotika. X : Ein Tier geht ein.

Aus der Kotbeschaffenheit und aus der Immunofluoreszenzuntersuchung ergibt sich, daß die mit Dihydromocimycin behandelten Tiere wesentlich schneller' gesund werden als mit Tylosin behandelte Tiere. Berücksichtigt man auch die Menge des verabreichten Antibiotikums, so kann daraus angenommen werden, daß Dihydromocimycin mindestens 4mal so wirksam wie Tylosin ist.

Beispiel 4

Wirkung von Dihydromocimycin gegen
Treponema-Dysentrie

Unter tierärztlicher Aufsicht werden Schweine in einer Zuchtanstalt, in der die Schweine an schwerem Durchfall litten, behandelt. Die Schweine werden in 4

Gruppen eingeteilt und 4 Tage auf folgende Weise behandelt:

Gruppe 1:

66 Schweine erhalten Futter mit 100 ppmTylosin; Gruppe 2:

34 Schweine erhalten Futter mit 25 ppm Dihydro-

mocimycin;
Gruppe 3:

40 Schweine erhalten Futter mit 50 ppm Dihydro-

mocimycin; n>

Gruppe 4:

40 Schweine erhalten Futter mit 100 ppm Dihydromocimycin.

Der Kot sämtlicher Tiere vor Behandlungsbeginn ist dünn oder sehr dünn. Kotproben erweisen sich als is

Treponema-positiv und Salmonella-negativ. Gelegentlich werden Wurmeier festgestellt.

1 Tag nach Behandlungsbeginn ist der Kot der Schweine von Gruppe 4 normal. Die Tiere von Gruppe 1 sind erst nach 3 bis 4 Tagen geheilt. Bei den Tieren der Gruppen 2 und 3 tritt der Behandlungserfolg nach einer Zeit ein, die zwischen den entsprechenden Zeiten von Gruppe 1 und Gruppe 4 liegt. Die mit Dihydromocimycin behandelten Tiere machen einen lebhafteren Eindruck als vor der Behandlung. Die Tiere zeigen keine Abneigung gegen Futter mit einem Gehalt an Dihydromocimycin. Insgesamt läßt sich feststellen, daß zur Behandlung von Treponena-Dysentrie eine Dosis von 25 ppm Dihydromocimycin günstiger ist als eine Dosis von 100 ppm Tylosin.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Dihydromocimycin der Formel

und dessen Salze.

2. Verfahren zur Herstellung von Dihydromocimycin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen des Stammes Streptomyces rarnocissimus (CBS 19069) oder nach üblichen Methoden daraus erhaltene, das Antibiotikum bildende Mutanten oder Varianten in einem wäßrigen, verwertbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium in an sich bekannter Weise züchtet, die Kulturbrühe abfiltriert, das Filtrat auf einen pH-Wert von 5 bis 6 ansäuert, das angesäuerte

OH

Filtrat mit Methylisobutylketon extrahiert, den Extrakt mit einer Base behandelt, das dabei ausgefällte Mocimycin abtrennt und die Mutterlauge auf Dihydromocimycin aufarbeitet und gewünschtenfalls in ein Salz überführt

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Extrakt mit Hilfe von Ammoniak, Natriummethylat oder Triethylamin als Base behandelt

4. Verwendung des Dihydromocimycins gemäß Anspruch 1 als Futtermittelzusatz.