DE2219713C3

DE2219713C3 - Verfahren zur Herstellung von Glucose Isomerase

Info

Publication number: DE2219713C3
Application number: DE2219713A
Authority: DE
Inventors: Charles Edward Elkhart Ind. Brownewell; Bernard William Niles Mich. Streets Jun.
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1971-04-22
Filing date: 1972-04-21
Publication date: 1973-10-04
Also published as: NL7203491A; DE2219713A1; JPS5345392B1; BE782508A; FR2133984B1; GB1376787A; IL38715A; IL38715A0; LU65203A1; FR2133984A1; IT972324B; DE2219713B2

Description

Eir> neues Glucose-Isomerase-Enzym, das zur Umwandlung von Glucose in Fructose geeignet ist, kann hergestellt werden, indem man Streptomyces olivaceus NRRL 3916 in einem Medium, das geeignete Nährstoffe enthält, züchtet und dann das Enzym hieraus gewinnt.

Süße Sirupe sind weitverbreitet und werden z. B. beim Backen, bei der Herstellung von Konditoreiwaren und in der Getränkeindustrie veiwendet. Diese Sirupe bestehen im allgemeinen aus Saccharose (Rohrzucker) oder Dextrose enthaltenden Produkten, die bei der Stärkehydrolyse erhalten werden, als Hauptsüßungsmittel. Wenn ein Sirup benötigt wird, der süßer ist als derjenige, der aus Saccharose erhalten wird, wird ein Invertzucker-Sirup verwendet. Dieser wird durch saure Hydrolyse von Saccharose hergestellt, wobei em Gemisch aus ungefähr 50% Glucose (Dextrose) und ungefähr 50°;'_o Fructose (Levulose) entsteht. Während Glucose etwas weniger süß ist als Saccharose, ist die Fructose süßer als Saccharose, so daß die Gesamtsüße, verglichen mit Saccharose, zunimmt.

Es ist bekannt, daß Dextrose unter alkalischen Bedingungen in Fructose umgewandelt werden kann. Diese Umwandlung hat große potentielle Bedeutung für die Herstellung von süßem Sirup. Die alkalische Umwandlung hat jedoch keinen kommerziellen Erfoig gehabt, da die alkalische Reaktion zu einem unerwünscht hohen Gehalt von Aschen in dem entstehenden Sirup führt, der nur unwirtschaftlich zu entfernen ist. Der Sirup kann, ohne daß diese Aschen entfernt werden, nicht verwendet werden.

Man wandte sich dann der enzymatischen Umwandlung von Glucose in Fructose zu. Es zeigte sich dabei, daß Stämme von Pseudomonas hydrophilia, Streptomyces flavovireus, Streptomyces echinatur, Streptomyces achromogenus, Streptomyces albus und ähnlichen in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet werden konnten, wobei Enzyme gebildet wurden, die Glucose-Isomerase-Eigenschaften besaßen. Diese bekannten Verfahren setzten sich jedoch kommerziell nicht durch, da entweder die Ausbeuten an Enzymen während des Enzymproduktionsprozesses oder die Ausbeuten an Fructose, wenn das Enzym zur Umwandlung von Glucose verwendet wurde, zu gering waren. Es ist außerdem bekannt, daß Streptomyces olivaceus NRRL 3583 verwendet werden kann zur Bildung einer für den Handel geeigneten Glucose-Isomerase, wobei die Enzymausbeuten höher sind als diejenigen, die mit anderen bekannten Organismen erhalten worden sind (deutsche Offenlegungsschrift 2 018 058).

Die Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Herstellung von Glucose-Isomerase durch aerobes Züchten eines Stammes von Streptomyces olivaceus in einem Medium, das übliche geeignete Nährstoffe enthält, und durch Gewännung des Enzyms in an sich bekannter Weise, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Streptomyces olivaceus den Stamm Streptomyces 5 olivaceus NRRL 3916 einsetzt. Dieser Organismus führt zu noch höheren Ausbeuten an dem gewünschten Enzym als die bekannten Organismen.

Der spezielle Stamm von Streptomyces olivaceus, der für die Herstellung der neuen Glucose-Isomerase

ίο Geeignet ist, wurde bei der Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt und erhielt die Nummer NRR' 3916.

Der Stamm >treptomyces olivaceus NRRL 3916 wurde durch ultraviolette Mutation von Streptomyces olivaceus NRRL 3583 nach bekannten Verfahren hergestellt. Es war jedoch unerwartet, daß eine derartige Mutante zu höheren Ausbeuten an Glucose-

ao Isomerase führen würde als die Stammkultur.

Der Streptomyces olivaceus NRRL 3916-Organismus wird auf Agarschrägen gehalten und kann in einem Medium gezüchte werden, das geeignete Nährstoffe, wie sie z. B. aus der deutschen Offenlegungsschrift 2 018 058 bekannt sind, enthält. Das Medium enthält vorzugsweise Xylose und eine Stickstoffquelle. Günstigerweise enthält das Medium außerdem andere Kohlehydrate und anorganische Salze. Typische Kohlehydrate sind Maisstärke, Dextrose, Lactose,

Weizenkleie u. ä. Typische Stickstoffquellen sind Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Aminosäuren, Maiswasser u. ä. Typische anorganische Salze sind Natriumchlorid, Magnesiumsulfat >i. ä. Diese Kohlehydrate, Stickstoffquellen und norganischen Salze

sind bekannt. Die in dem Wachsmedium verwendete Xylose kann in gereinigter Form oder in Form eines rohen xylosehaltigen Materials vorliegen.

Der Organismus wird günstigerweise unter Bedingungen der submersen Fermentation ungefähr 20 bis ungefähr 50 Stunden bei einer Temperatur von ungefähr 15 bis ungefähr 35° C gezüchtet. Bei Temperaturen unterhalb 15°C und bei Temperaturen oberhalb ungefähr 35 C wird die Ausbeute an dem gewünschten Enzym ziemlich niedrig. Die bevorzugte Wachstumstemperatur beträgt ungefähr 25 bis ungefähr 35°C. Es wird günstigerweise Atmosphärendruck angewandt, aber Drucke oberhalb und unterhalb von Atmosphärendruck können gegebenenfalls ohne besondere Vorteile oder Nachteile angewandt werden. Der AnfangspH-Wert des Wachstumsmediums sollte ungefähr zwischen 6,8 und 7,1 liegen.

Die erfindungsgemäße Glucose-Isomerase wird innerhalb der Bakterienzellen gebildet. Die Zellen können von der Gärbrühe abfiltriert und direkt als Quelle für die Glucose-Isomerase verwendet werden. Wahlweise können die Zellen durch Filtration gewonnen und dann durch bekannte Verfahren aufgebrochen werden. Die entstehenden aufgebrochenen Zellen und ihr freigesetzter Zellinhalt können als Quelle für Glucose-Isomerase verwendet werden. Außerdem können die Zellen auch z. B. durch Ultraschall oder Homogenisierungsapparate aufgebrochen, und die Trümmer können durch Zentrifugation entfernt werden. Die überstehende Flüssigkeit kann direkt als Quelle für die Glucose-Isomerase verwendet werden, oder sie kann zu einem feinen Pulver für spätere Verwendung lyophilisiert werden. Das Enzym kann aus der oben beschriebenen überstehenden Flüssigkeit

auch durch bekannte Ausfällmittel, wie Methanol oder Ammcniumsulfat ausgefällt werden.

Die Aktivität der erfindungsgernäßen Glucose-Isomerase zur Fructoseerzeugung kann durch die folgenden beiden Bestimmungsmethoden bestimmt werden.

Bestimmung der Glucose-Isomerase-Aktivität Es wurde eine 62,5°/_oige (Gew./Vol.) wäßrige Lö-Die Erfindung wird durcn die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Eine Kultur von Streptomycesolivaceus NRRL 3916 wurden in einen Erlenmeyer-Kolben gegeben, der 50 cm³ eines wäßrigen Gemisches enthaltend 1,0 °/₀ Xylose, 0,3% Maisstärke, 1,0"/„ Peptone, 0,5% Fleischextrakt, 0,05% Hefeextrakt, 0,5% Natrium-

sung von Glucose hergestellt, indem man unter Rühren to chlorid und 0,05% Magnesiumsulfat enthielt. Alle langsam 625 g wasserfreie Glucose zu 300 ml heißem Prozentangaben beziehen sich auf Gewicht pro Volumen. Der pH-Wert des Mediums wurde mit Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt. Der beimpfte Kolben-

Rotationsschütller Nach Ablauf der

destilliertem Wasser zugab. Die Lösung wurde auf Zimmertemperatur abgekühlt, und hierzu wurden 125 ml Im wäßrige Lösung von Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan vom pH-Wert 8,5, 125 rnl Im wäßrige Lösung von Magnesiumsulfat und 50 ml 0,025 m wäßrige Lösung von Kobaltchlorid zugesetzt. Das entstehende Gemisch wurde dann mit destilliertem Wasser auf 1 1 verdünnt.

10 ml der oben angegebenen Glucoselösung wurden in einen 25-ml-Meßkolben gegeben. Es wurde eine ausreichende Menge des zu untersuchenden Enzyms zugegeben, um zu einer Reduk'ion der spezifischen Rotation von ungefähr 2,9 bis ungefähr 7,5° zu kommen, wie später beschrieben wird. Der Kolbeninhalt wurde dann mit destilliertem Wasser auf 25 ml verdünnt, und das entstehende Gemisch wurde 2 Stunden bei 60 C i.ehengelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zusatz vor ImI ?iner 0,5m wäßrigen inhalt wurde dann auf einem 24 Stunden bei 30" C bewegt.
24stündigen Inkubationszeit wurde 1 cm³ der beimpften Kultur in einen Erlenmeyer-Kolben gegeben, enthaltend 50 cm³ eines wäßrigen Gemisches, enthaltend 0,7% Xylose, 0,3% Maisstärke, 1,0% Peptone, 0,5 % Fleischextrakt; 0,25% Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid und 0,05 % Magnesiumsulfat (ebenfalls Gew./Vol.). Der pH-Wert wurde wiederum mit Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt. Der beimpfte Kolbeninhalt wurde dann auf einem Rotationsschüttler 48 Stunden bei 30 C bewegt. Die Bakterienzellen wurden von der entstehenden Fermentationsbrühe abfiltriert, und es zeigte sich, daß sie 2952 GIE pro Liter enthielten. Das oben angegebene Verfahren wurde wiederholt, wobei der bekannte Stamm Streptomyces

Lösung von Perchlorsäure abgebrochen. Das Gemisch 30 olivaceus NRRL 3583 verwendet wurde. Man erhielt wurde dann mit 15000 UpM 20 Mnuten zentrifugiert, 2561 GlE pro Liter. Das zeigt, daß mit dem erfindungs- und die optische Drehung (in Grad) der überstehenden Flüssigkeit wurde durch bekannte Verfahren bestimmt. Es wurde eine Blindprobe auf die gleiche Weise, aber ohne das Enzym, gemacht. Die optische Drehung der 35 Blindprobe wurde ebenfalls bestimmt. Die spezifische Rotation [«]? der Probe bzw. der Blindprobe betrug 2 λ oder den doppelten Wert der beobachteten optischen Drehung. Die prozentuale Umwandlung von

gemäß verwendeten Stamm ti.ie höhere Enzymausbeute erzielt wird.

Beispiel 2

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei eine Kultur von Streptomyces olivaceus NRRL 3916 verwendet wurde und man eine Enzymausbeute von 2937 GIE pro Liter erhielt, und mit dem

berechnet:

Prozentuale

Umwandlung =

L«]Bllndprobe + "2

100

Diese Bestimmungsmethode wurde auch angewandt, um die Aktivität in Glucose-Isomerase-Einheiten zu berechnen, wobei eine Glucose-Isomerase-Einheit die Menge von Enzym bedeutet, die unter den angegebenen Bedingungen in 1 Minute 1 μΜοΙ Glucose in Fructose umwandelt. Die Enzymaktivität in Glucose-Isomerase-Einheiten (GIE) der untersuchten Enzymprobe wurde nach der folgenden Formel berechnet:

45

Glucose in Fructose wurde durch die folgende Formel 40 bekannten Stamm Streptomyces olivaceus NRRL 3583

erhielt man eine Enzymausbeute von nur 2373 GIE pro Liter. Auch hier erhielt man mit dem erfindungsgemäß verwendeten Stamm eine höhere Enzymausbeute als mit dem bekannten.

Das erfindungsgemäß hergestellte Glucose-Isomerase-Enzym ist auch geeignet zur Umwandlung von Glucose in Fructose unter anderen als den Bestimmungsbedingungen.

Beispiel 3

Eine wäßrige Glucoselösung, enthaltend 49,2% (Gew./Vol.) Glucose wurde mit einigen Bakterienzellen vermischt, die nach dem im Beispiel 1 angegebenen Verfahren gezüchtet worden waren. Die Zellen wurden in einer Menge von ungefähr 4GIE pro Gramm Glucose in der Glucoselösung verwendet. Das entstehende Gemisch wurde 20 Stunden bei 6O⁰C umgesetzt, wobei der pH-Wert 7,7 bis 7,9 betrug. Die entstehende Lösung wurde auf den Fructosegehalt

GlE/gOderGIE/i =

^g gebildete Fructose · 0,0463 mg oder ml verwendetes Enzym'

wobei die μg gebildete Fructose durch Multiplikation des oben berechneten Wertes für die prozentuale Glucose-Umwandlung mit dem Faktor 6,25 · 10" be- 60 untersucht, und es zeigte sich, daß 40,2% Umwand

rechnet wurden.

lung von Glucose zu Fructose eingetreten war.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Glucose-Isomerase durch aerobes Züchten eines Stammes von Streptomyces olivaceus in einem Medium, das übliche geeignete Nährstoffe enthält, und durch Gewinnung des Enzyms in an sich bekannter Weise, dadurch gekennzeichnet, daß man als Streptomyces alivaceus den Stamm Streptomyces olivaceus NRRL 3916 einsetzt.