DE2219713B2 - Verfahren zur herstellung von glucose-isomerase - Google Patents

Description

auch durch bekannte Ausfällmittel, wie Methanol oder Ammoniumsulfat ausgefällt werden.

Die Aktivität der erfindungsgemäßen Glucose-Isomerase zur Fructoseerzeugung kann durch die folgenden beiden Bestimmungsmethoden bestimmt werden.

Bestimmung der Glucose-Isomerase-Aktivität

Es wurde eine 62,5°/_oige (Gew./Vol.) wäßrige Lösung von Glucose hergestellt, indem man unter Rühren langsam 625 g wasserfreie Glucose zu 300 ml heißem destilliertem Wasser zugab. Die Lösung wurde auf Zimmertemperatur abgekühlt, und hierzu wurden 125 ml Im wäßrige Lösung von Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan vom pH-Wert 8,5, 125 ml Im wäßrige Lösung von Magnesiumsulfat und 50 ml 0,025m wäßrige Lösung von Kobaltchlorid zugesetzt. Das entstehende Gemisch wurde dann mit destilliertem Wasser auf 11 verdünnt.

10 ml der oben angegebenen Glucoselösung wurden in einen 25-ml-Meßkolben gegeben. Es wurde eine ausreichende Menge des zu untersuchenden Enzyms zugegeben, um zu einer Reduktion der spezifischen Rotation von ungefähr 2,9 bis ungefähr 7,5° zu kommen, wie später beschrieben wird. Der Kolbeninhalt wurde dann mit destilliertem Wasser auf 25 ml verdünnt, und das entstehende Gemisch wurde 2 Gtunden bei 60⁰C stehengelassen. Dl·. Reaktion wurde dann durch Zusatz von 1 n.l einer 0,5 m wäßrigen Lösung von Perchlorsäure abgebroch n. Das Gemisch wurde dann mit 15000 UpM 20 Minuten zentrifugiert, und die optische Drehung (in Grad) der überstehenden Flüssigkeit wurde durch bekannte Verfahren bestimmt. Es wurde eine Blindprobe auf die gleiche Weise, aber ohne das Enzym, gemacht. Die optische Drehung der Blindprobe wurde ebenfalls bestimmt. Die spezifische Rotation [λ]? der Probe bzw. der Blindprobe betrug 2 λ oder den doppelten Wert der beobachteten optischen Drehung. Die prozentuale Umwandlung von Glucose in Fructose wurde durch die folgende Formel berechnet:

Prozentuale

Umwandlung =

lAjBlindprnbe + 92

100 Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Eine Kultur von Streptomyces olivaceus NR¹^L 3916 wurden in einen Erlenmeyer-Kolben gegeben, der 50 cm³ eines wäßrigen Gemisches enthaltend 1,0% Xylose, 0,3% Maisstärke, 1,0% Peptone, 0,5% Fleischextrakt, 0,05% Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid und 0,05% Magnesiumsulfat enthielt. Alle Prozentangaben beziehen sich auf Gewicht pro Volumen. Der pH-Wert des Mediums wurde mit Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt. Der beimpfte Kolbeninhalt wurde dann auf einem Rotationsschüttler 24 Stunden bei 30⁰C bewegt. Nach Ablauf der 24stündigen Inkubationszeit wurde 1 cm³ der beimpften Kultur in einen Erlenmeyer-Kolben gegeben, enthaltend 50 cm³ eines wäßrigen Gemisches, enthaltend 0,7% Xylose, 0,3% Maisstärke, 1,0% Peptone, 0,5% 1-icischextrakt, 0,25% Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid und 0,05% Magnesiumsulfat (ebenfalls Gew./Vol.). Der pH-Wert wurde wiederum mit Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt. Der beimpfte Kolbeninhalt wurde dann auf einem Rotationsschütt-

as ler 48 Stunden bei 3O⁰C bewegt. Die Bakterienzellen wurden von der entstehenden Fermentationsb^wihc abfiltriert, und e. zeigte sich, daß sie 2952 GIE pro Liter enthielten. Da? oben angegebene Verfahren wurde wiederholt, wobei der bekannte Stamm Streptomyces olivaceus NRRL 3583 verwendet wurde. Man erhielt 2561 GIF pro Liter. Das zeigt, daß mit dem erfindungsgemäß verwendeten Stamm eine höhere Enzymausbeute erzielt wird.

Diese Bestimmungsmethode wurde auch angewandt, um die Aktivität in Glucose-Isomerase-Einheiten zu berechnen, wobei eine Glucose-Isomerase-Einheit die Menge von Enzym bedeutet, die unter den angegebenen Bedingungen in 1 Minute 1 μΜοΙ Glucose in Fructose umwandelt. Die Enzymaktivität in Glucose-Isomerase-Einheiten (GIE) der untersuchten Enzymprobe wurde nach der folgenden Formel berechnet:

Beispiel 2

GIE/gOderGIE/i =

μg gebildete Fructose · 0,0463 mg oder ml verwendetes Enzym'

wobei die μg gebildete Fructose durch Multiplikation des oben berechneten Wertes für die prozentuale Glucose-Umwandlung mit dem Faktor 6,25 · 10^e berechnet wurden.

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei eine Kultur von Streptcmyces olivaceus NRRL 3916 verwendet warde und man eine Enzymausbeute von 2937 GIE pro Liter erhielt, und mit dem bekannten Stamm Streptomyces olivaceus NRRL 3583 erhielt man eine Enzymausbeute von nur 2373 GIC pro Liter. Auch hier erhielt man mit dem erfindungsgemäß verwendeten Stamm eine höhere Enzymausbeute als mit dem bekannten.

Das erfindungsgemäß hergestellte Glucose-Isomerase-Enzym ist auch geeignet zur Umwandlung von Glucose in Fructose unter anderen als den Bestimmungsbedingungen.

B e i s ρ i e 1 3

Eine wäßrige Glucoselösung, enthaltend 49,2% (Gew./Vol.) Glucose wurde mit einigen Bakterienzellen vermischt, die nach dem im Beispiel 1 angegebenen Verfahren gezüchtet worden waren. Die Zellen wurden in einer Menge von ungefähr 4 GIE pro Gramm Glucose in der Glucoselösung verwendet. Das entstehende Gemisch wurde 20 Stunden bei 60° C umgesetzt, wobei der pH-Wert 7,7 bis 7,9 betrug. Die entstehende Lösung wurde auf den Fructosegehalt untersucht, und es zeigte sich, daß 40,2% Umwandlung von Glucose zu Fructose eingetreten war.

Claims (1)

1 2

Medium, das übliche geeignete Nährstoffe enthält,

Patentanspruch: und durch Gewinnung des Enzyms in an sich bekannter Weise, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als

Verfahren zur Herstellung von Glucose-Iso- Streptomyces olivaceus den Stamm Streptomyces

merase durch aerobes Züchten eines Stammes von 5 olivaceus NRRL 3916 einsetzt. Dieser Organismus

Streptomyces olivaceus in einem Medium, das führt tu noch höheren Ausbeuten an dem gewünschten

übliche geeignete Nährstoffe enthält, und durch Enzym als die bekannten Organismen.

Gewinnung des Enzyms in an sich bekannter Der spezielle Stamm von Streptomyces olivaceus,

Weise, dadurch gekennzeichnet, daß der für die Herstellung der neuen Glucose-Isomerase

man als Streptomyces alivaceus den Stamm io geeignet ist, wurde bei der Northern Utilization

Streptomyces olivaceus NRRL 3916 einsetzt. Research and Development Division, Agricultural

Research Service of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt und erhielt die Nummer NRRL 3916.

Ein neues Glucose-Isomerase-Enzym, das zur Um- 15 Der Stamm Streptomyces olivaceus NRRL 3916

Handlung von Glucose in Fructose geeignet ist, kann wurde durch ultraviolette Mutation von Streptom>ces

hergestellt werden, indem man Streptomyces olivaceus olivaceus NRRL 3583 nach bekannten Verfahren

NRRL 3916 in einem Medium, das geeignete Nähr- hergestellt. Es war jedoch unerwartet, daß eine der-

stoffe enthält, züchtet und dann das Enzym hieraus artige Mutante zu höheren Ausbeuten an Glucose-

gewinnt. 20 Isomerase führen würde als die Stammkultur.

Süße Sirupe sind weitverbreitet und wc den z. B. Der Streptomyces olivaceus NRRL 3916-Organisbeim Backen, bei der Herstellung von Konditorei- mus wird auf Agarschrägen gehalten und kann in einem waren und in der Getränkeindustrie verwendet. Diese Medium gezüchtet werden, das geeignete Nährstoffe, Sirupe bestehen im allgemeinen aus Saccharose (Rohr- wie sie z. B. aus der deutschen Offenlegungsschrift zucker) oder Dextrose enthaltenden Produkten, die bei 25 2 018 058 bekannt sind, enthält. Das Medium enthält der Stäikehydrolyse erhalten werden, als Haupt- vorzugsweise Xylose und eine Stickstoffquelle. Günsüßungsmittel. Wenn ein Sirup benötigt wird, der stigerweise enthält das Medium außerdem andere süßer ist als derjenige, der aus Saccharose erhalten Kohlehydrate und anorganische Salze. Typische wird, "vird ein Invertzucker-Sirup verwendet. Dieser Kohlehydrate sind Maisstärke, Dextrose. Lactose, wird durch saure Hydrolyse von Saccharose hergestellt, 30 Weizenkleie u.a. Typische Stickstoff quellen sind wobei ein Gemisch aus ungefähr 50°/„ Glucose Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Aminosäuren, (Dextrose) und ungefähr 50°/₀ Fructose (Levulose) Maiswasser u. ä. Typische anorganische Salze sind entsteht. Während Glucose etwas weniger süß ist als Natriumchlorid, Magnesiumsulfat u. ä. Diese Kohle-Saccharose, ist die Fructose süßer als Saccharose, so hydrate, Stickstoffquellen und anorganischen Salze daß die Gesamtsüße, verglichen mit Saccharose, zu- 35 sind bekannt. Die in dem Wachsmedium verwendete nimmt. Xylose kann in gereinigter Form oder i» Form eines

Es ist bekannt, daß Dextrose unter alkalischen Be- rohen xylosehaltigen Materials vorliegen,
dingungen in Fructose umgewandelt werden kann. Der Organismus wird günstigerweise unter Bedin-Diese Umwandlung hat große potentielle Bedeutung gungen der submersen Fermentation ungefähr 20 bis für die Herstellung von süßem Sirup. Die alkalische 40 ungefähr 50 Stunden bei einer Temperatur von unge-Umwandlung hat jedoch keinen kommerziellen Erfolg fähr 15 bis ungefähr 35⁰C gezüchtet. Bei Temperaturen gehabt, da die alkalische Reaktion zu einem uner- unterhalb 15°C und bei Temperaturen oberhalb ungewünscht hohen Gehalt von Aschen in dem entstehen- fähr 35° C wird die Ausbeute an dem gewünschten den Sirup führt, der nur unwirtschaftlich zu entfernen Enzym ziemlich niedrig. Die bevorzugte Wachstumsist. Der Sirup kann, ohne daß diese Aschen entfernt 45 temperatur beträgt ungefähr 25 bis ungefähr 35°C. werden, nicht verwendet werden. Es wird günstigefweise Atmosphärendruck angewandt, Man wandte sich dann der enzymatischen Umwand- aber Drucke oberhalb una unterhalb von Atmosphälung von Glucose in Fructose zu. Es zeigte sich dabei, rendruck können gegebenenfalls ohne besondere Vordaß Stämme von Pseudomonas hydrophilia, Strepto- teile oder Nachteile angewandt werden. Der Anfangsmyces fiavovireus, Streptomyces echinatur, Strepto- 50 pH-Wert des Wachstumsmediums sollte ungefähr myces achromogenus, Streptomyces albus und ahn- zwischen 6,8 und 7,1 liegen.

liehen in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet Die erfindungsgemäße Glucose-Isomerase wird inwerden konnten, wobei Enzyme gebildet wurden, die nerhalb der Bakterienzellen gebildet. Die Zellen kön-Glucose-Isomerase-Eigenschaften besaßen. Diese be- nen von der Gärbrühe abfiltriert und direkt als Quelle kannten Verfahren setzten sich jedoch kommerziell 55 für die Glucose-Isomerase verwendet werden. Wahlnicht durch, da entweder die Ausbeuten an Enzymen weise können die Zellen durch Filtration gewonnen während des Enzymproduktionsprozesses oder die und dann durch bekannte Verfahren aufgebrochen Ausbeuten an Fructose, wenn das Enzym zur Umwand- werden. Die entstehenden aufgebrochenen Zellen und lung von Glucose verwendet wurde, zu gering waren. ihr freigesetzter Zellinhalt können als Quelle für Es ist außerdem bekannt, daß Streptomyces olivaceus 60 Glucose-Isomerase verwendet werden. Außerdem kön-NRRL 3583 verwendet werden kann zur Bildung einer nen die Zellen auch z.B. durch Ultraschall oder für den Handel geeigneten Glucose-Isomerase, wobei Homogenisierungsapparate aufgebrochen und die die Enzymausbeuten höher sind als diejenigen, die mit Trümmer können durch Zentrifugation entfernt weranderen bekannten Organismen erhalten worden sind Jen. Die überstehende Flüssigkeit !'^nn direkt als (deutsche Offenlegungsschrift 2 018 058). 65 Quelle für die Glucose-Isomerase verwendet werden, Die Erfindung betrifft nan ein Verfahren zur Her- oder sie kann zu einem feinen Pulver für spätere Verstellung von Glucose-Isomerase durch aerobes Züchten Wendung lyophilisiert werden. Das Enzym kann aus eines Stammes von Streptomyces olivaceus in einem der oben beschriebenen überstehenden Flüssigkeit